JPH02227076A - 遺伝子組換え菌で製造された不溶性蛋白質の活性化法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は遺伝子工学的手法により製造された菌体中の不
溶性蛋白質の活性化率を向上させるための活性化方法に
環するものである。

（発明の背景） 近年の遺伝子工学に寄る技術の進歩により、目的とする
蛋白質、ペプチド等（以下本明細書では特別の記載をし
ない限り単に蛋白質という）を大腸菌１、枯草菌、酵母
等の菌体中で製造することが可能である。目的とする蛋
白質は、通常、宿主として使用する菌体が天然には製造
することのない、いわゆる異種蛋白質であることが多い
。

いかなる理由であるかは明らかではないが、製造された
目的蛋白質は菌体中で不溶性蛋白質として「不溶性塊Ｊ
　　（ｉｎｃｌｕｓｌｏｎ　ｂｏｄｙ）と呼ばれる形態
で蓄積されることがある。不溶性塊を形成した目的蛋白
質は、本来の生理活性を発現し得る形態、即ち、高次構
造を有していないため、可溶化（脱折畳）及び再折畳と
呼ばれる活性化操作が必要である。（活性化操作として
は特開昭５９−１６１３２１号、６０−５００８９３号
等が知られている）。

本発明者らは、遺伝子工学的手法を用いて製造した蛋白
質について、宿主からの回収工程に要する時間と、該工
程から活性化操作を開始するまでに要する時間が長い程
、活性化率（即ち全目的蛋白質中の、活性化操作によっ
て活性を発現するに至った目的蛋白質の割合い）が低い
ことを知見した。この事実は、遺伝子工学的手法を用い
て、菌体にとっては異種である、例えばヒトの蛋白質を
大規模に製造する場合、 ■菌体からの目的蛋白質の回収工程を短時間で完了すべ
きこと、 ■回収された目的蛋白質について、短時間の内に活性化
操作を開始すべきこと、 を意味している。

ところで、菌体からの蛋白質の回収工程は、通常、ホモ
ジナイズ等の物理的方法による菌体破砕の操作と、菌体
破砕物を懸濁した後、遠心分離等の方法により不溶性画
分を回収する操作からなる。

この工程を短時間で完了するには、大規模な破砕設備及
び分離設備が必要となる。

活性化操作については、溶液中の蛋白質（菌体由来の挟
雑蛋白質を含む）濃度が低い程活性化率が向上すること
が知られている（特開昭６１−５０２１６７号等）。従
って、大量に製造された目的蛋白質を高い割合いで、か
つ−度に活性化させようとすると活性化操作にも大規模
な設備（例えば活性化槽等）が必要となる。

本発明者らは更に、不溶性蛋白質の回収工程の後、ただ
ちに活性化操作を行った場合にも、活性化されない蛋白
質が存在することを知見した。

以上、本発明者らの知見によれば、不溶性蛋白質を活性
を発現し得る形態にするための、一連の操作を短時間の
内に完了することで、活性化率の低下は防げること、ま
た、その際、できる限り蛋白質濃度を低くすることが活
性化率の向上のために好ましいことを示している。しか
し、この２つの要求を満たすには、−回の操作での処理
可能量が大きい設備を必要とする。

本発明者らは、自らの知見に基づき、遺伝子組換菌で製
造された不溶性蛋白質の活性化方法について研究を行っ
た結果、不溶性蛋白質に還元剤を接触させることで不溶
性蛋白質の良好な活性化が引起こされることを見出し、
本発明を完了させた。

本発明は即ち、遺伝子組換菌で製造された不溶性蛋白質
について、菌体を破砕し、不溶性画分を回収し、懸濁し
、活性化する一連の操作において、菌体の破砕から活性
化操作に至る任意の時点で不溶性蛋白質に還元剤を接触
させ、かつ活性化操作に先立って該還元剤を分離するこ
とを特徴とする遺伝子組換え菌で製造された不溶性蛋白
質の活性化方法であり、以下詳細に説明する。

（発明の構成） 本発明は、蛋白質を不溶性塊として蓄積した菌体につい
て適用される。従って、菌体自体の性質あるいは遺伝子
組換え菌の作製方法、菌体の培養方法等については同等
制限がない。

不溶性蛋白質の回収工程について説明する。

不溶性蛋白質を蓄積した菌体の破砕は、例えばホモジナ
イズ、超音波等を用いた物理的な破砕操作によれば良い
。通常の遺伝子工学的手法と同様に、この操作は水溶液
中で行うことが蛋白質の失活、をおさえる効果や操作性
の面から良い。菌体破砕物からの不溶性画分の回収操作
は、水溶液に懸濁した菌体破砕物を、例えば遠心分離、
膜濾過、硫安沈殿等の通常の手法を用いて行えば良いが
特別の制限はない。

活性化操作としては、回収された不溶性蛋白質を、変性
剤等を含有する可溶化溶液に可溶化した後、変性剤の濃
度を減少させて行う、例えば先に記載した様な特開昭５
９−１６１３２１号あるいは特開昭６０−５００８９３
号等に記載された方法が知られている。

本発明で使用する還元剤としては、例えば２−メルカプ
トエタノール、ジチオトレイトール、ジチオエリトリト
ール等の還元剤を用いることができる。

通常の菌体から不溶性蛋白質を回収する方法は、菌体を
破砕し、不溶性画分を回収し、該不溶性画分を懸濁し、
活性化することからなる。本発明は、前記した様な還元
剤を、菌体の破砕の時期から活性化操作の前に目的蛋白
質に接触させ、かつ活性化操作の前に分離することにあ
る。還元剤が残存していると活性化操作の際にジスルフ
ィド結合を開裂させる方向に作用するので還元剤を除去
する操作を実施する。具体的に、破砕操作を還元剤を含
有する溶液中で行う、菌体破砕物からの不溶性画分の分
離を還元剤を含有する溶液中で行う、活性化操作に先立
つ、分離された不溶性画分の懸濁を還元剤を含有する溶
液で行う等の操作製の点から好ましいが、還元剤と不溶
性蛋白質を接触させてから活性化操作までの時間を短く
できる、菌体破砕物からの不溶性画分；と対して還元剤
を接触させることが好ましい。

本発明では、還元剤の接触から活性化操作までの時間を
短くすることが好ましいが、驚くべきことに不溶性画分
を得た後、およそ５日後であっても、およそ８０％の活
性を回復することができることが本発明者により知見さ
れている。

活性化操作前とは、脱折畳のために蛋白質変性剤と不溶
性蛋白質を接触させる前を意味する。

ここで、還元剤の分離は、例えば遠心分離、透析、濾過
等の方法によれば良い。

還元剤を接触させ、不溶性蛋白質溶液となった段階で例
えば２−メルカプトエタノールでは０．０５％以上、好
ましくは０．５％以上となるようにすれば良く、ジチオ
トレイトールでは１ｍＭ以上、好ましくは２ｍＭ以上と
なるようにすれば良い。

（発明の効果） 本発明によれば、遺伝子組換菌で製造された不溶性蛋白
質を効率よく活性化できる。

本発明の実施は、一連の操作を連続して行ったときは勿
論、設備的な問題等により時間的に断続して一連の操作
を行った時にもま効果的である。

これは、大規模な設備を有する者には今以上の目的蛋白
質の活性化操作を実現し、又、小規模な設備しか有さな
い者には経時的な活性化率の減少を今以上に少なくする
活性化操作を提供するものである。

（実施例） 本発明を更に詳細に説明するため以下に発明の実施例を
記載するが、本発明はこれら実施例に限定されるもので
はない。

以下の実施例で用いた菌体は大腸菌（ＫＹ−１４３６株
）であり、製造させた目的蛋白質はヒトプロウロキナー
ゼである。ヒトプロウロキナーゼ（以下プロウロキナー
ゼという。）の製造は、工業技術院微生物工業研究所に
寄託番号８３４１号として寄託された大腸菌から得たプ
ラスミドを用いて、通常の方法に従って形質転換した前
記大腸菌をＭ９培地で培養して行った。

実施例１ 大腸菌の培養後、菌体を含む培養液をゴーリンホモジナ
イザー（マントンゴーリン社製）により破砕操作を行っ
た。続いて、菌体破砕物を遠心分離し、プロウロキナー
ゼを含む不溶性画分を得た。

湿菌体１ｇ相当の不溶性画分を１０ｍ１の水に懸濁し、
０．５〜１．０％になるように２−メルカプトエタノー
ルを添加し、室温で１時間放置した後遠心分離により再
び不溶性画分を得た。該不溶性画分を ２０ｍ１の０．１Ｍ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）
に懸濁した。続いて８Ｍグアニジン塩酸塩溶液を添加し
、脱折畳を行った。次に、０．０５Ｍト＋Ｊスー塩酸緩
衝液（ｐＨ８，０）を添加してグアニジン濃度をＩＭに
低下させ、折畳を行った。活性化されたプロウロキナー
ゼについてプロテアーゼ処理を行いウロキナーゼに転換
した後、ウロキナーゼの特異的基質であるピログルタミ
ンΦグリシルΦアルギニルパラニトロアニリド塩酸塩を
用いてその活性を測定した。湿菌体１ｇ相当の不溶性画
分に由来する活性と、可溶化の際の塩酸グアニジン濃度
及び２−メルカプトエタノール濃度の関係を表に示す。

一方、得られた湿菌体１、ｇ相当の不溶性画分を１０ｍ
１の水に懸濁し、２−メルカプトエタノールで処理する
ことなく同様の処理を行い、そのウロキナーゼ活性を測
定した。湿菌体１ｇ相当の不溶性画分に由来する活性を
、表に示す。

この結果、不溶性蛋白質であるプロウロキナーゼについ
ての一連の処理操作において、２−メルカプトエタノー
ルを活性化操作に先立って接触させた場合には、その活
性化率は向上した。

実施例２ 実施例１と同様にして得た湿菌体１ｇに相当する不溶性
画分を２　ｍｌの水に懸濁し、４℃で５日間放置した後
、１０ｍ１の水に懸濁した。該懸濁液に０．０５〜０．
５％となるように２−メルカプトエタノールを添加し、
遠心分離により不溶性画分を得た。実施例１と同様に活
性化操作の後、ウロキナーゼに変換しその活性を測定し
た。結果を表１に示す。

一方、得られた湿菌体１ｇに相当する不溶性画分を２　
ｍｌの水に懸濁し、４℃で５日間放置した後、ｌＱｍｌ
の水に懸濁し、２−メルカプトエタノールで処理するこ
となく同様の処理を行い、そのウロキナーゼ活性を測定
した。結果を表１に示す。

以上の結果、不溶性蛋白質であるプロウロキナーゼにつ
いての一連の処理操作を断続的に行った場合にも、活性
化操作に先立って２−メルカプトエタノールを接触させ
た場合は活性化率が向上した。

尚、表に示される実施例１及び２の結果において、２〜
メルカプトエタノールで処理していない場合の結果は２
−メルカプトエタノール「０％」として示した。

実施例３ 実施例１と同様にして得た湿菌体１ｇに相当する不溶性
画分を２　ｍｌの水に懸濁し、室温で２時間放置した後
、１０ｍ１の水に懸濁した。該懸濁液に１〜５０ｍＭと
なるようにジチオトレイトールを添加し、遠心により不
溶性画分を得た。実施例１と同様に活性化操作を実施し
た後、製造されたプロウロキナーゼをウロキナーゼに変
換し、その活性を測定した。結果を表に示す。

一方、得られた湿菌体１ｇに相当する不溶性画分を２　
ｍｌの水に懸濁し、室温で２時間放置した後１０ｍ１の
水に懸濁し、ジチオトレイトールを添加することなく不
溶性画分を遠心分離した場合についても同様の活性化操
作を実施して活性を測定した。結果をジチオトリ１°ト
ールｒＯｍＭＪとして表に示す。

以上の結果、大腸菌にて不溶性画分として製造されたプ
ロウロキナーゼについての一連の処理操作において、ジ
チオトレイトールを活性化操作に先立って接触させた場
合には、その活性化率は向上した。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）遺伝子組換え菌で製造された不溶性蛋白質につい
   て、菌体を破砕し、不溶性画分を回収し、懸濁し、活性
   化する一連の操作において、菌体の破砕から活性化操作
   に至る任意の時点で該蛋白質に還元剤を液相状態にて接
   触させ、かつ活性化操作に先立って該還元剤を分離する
   ことを特徴とする遺伝子組換菌で製造された不溶性蛋白
   質の活性化法。
2. （２）還元剤を、菌体破砕物から不溶性画分に得られた
   不溶性蛋白質に液相状態にて接触させ、次いで分離し活
   性化操作を行うことを特徴とする請求項第（１）項記載
   の方法。
3. （３）菌体が大腸菌であり、不溶性蛋白質がプロウロキ
   ナーゼであり還元剤が２−メルカプトエタノール又はジ
   チオトレイトールであることを特徴とする請求項第（１
   ）項又は第（２）項記載の方法。