JPH02128687A - 限外濾過膜を用いた不活性形蛋白質の処理方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （）１業１−のｆり用分野） 本発明は、限外濾過膜を用いた不活性形蛋白質の処理方
法に関するものである。詳しくは、限４濾過膜を用いた
不活性形蛋白質を活性形蛋白質として？１？る方法又は
限外濾過膜を用いた不活性形蛋白質の精製方法に関する
ものである。

（従来の技術とその課題点） 近年のいわゆる遺伝子操作技術の発達により、ヒト等に
有用な蛋白質を、その蛋白質をコードする遺伝子を微生
物等に組入れることで製造することが可能である。

このような、本来、宿主が製造することのない異種の蛋
白質は、宿主中で不活性形蛋白質として凝集塊を形成す
ることがある。凝集塊を形成した不活性形蛋白質を利用
するためには、該蛋白質を一旦可溶化し、折畳む、いわ
ゆるリフォールディング操作が必要である。

リフォールディング操作については、例えば特開昭５９
−１６１３２１号、特開昭６０−５００８９３号等の方
法か知られている。リフォールディング操作は、蛋白質
変性剤を用いた不活性形蛋白質の可溶化（脱折畳み）と
、該蛋白質変性剤強度の低下による折畳みの工程からな
るが、折畳みの工程において、可溶化された不活性形蛋
白質を含む可溶化溶液中の蛋白質濃度が低い程、再活性
化率が向上することが知られている（特開昭６１−５０
２１．６７号明細書第４頁）。従って、菌体破砕物から
得られる不溶性画分中には大腸菌に由来する蛋白質が多
量に含まれているため、リフォールディング操作にあっ
ては、蛋白質変性剤強度を低下させる操作を１にねて前
記可溶化溶液を希釈する操作を行うことが多い（特開昭
５９−１６１−３２１号）が、希釈を行うことで可溶化
溶液中ｋ中の蛋白質７０度を減少させる方法にあっても
、［１的外蛋白質をＤ　＜ｉする溶液を十分に希釈しよ
うとすれば、リフォールディング後の溶液量が増加する
ために、その後の目的とする蛋白質についての精製二丁
、程に時間がかかり、また、大型の装置等が必要となる
等の課題がある。しかも、この方法にあっては希釈によ
り蛋白質濃度は低下するものの、なお目的とする不活性
蛋白質以外の蛋白質等が多量に存在することから、活性
化率は完全ではないという課題もある。

不活性形蛋白質は菌体破砕物の不溶性画分に１１、；ら
れる。該画分には多量の菌体に由来する蛋白質が含まれ
ていることから精製の操作が必要であり、特に、遺伝子
操作により製造されるヒト等の蛋白質が医薬品等に用い
られている現状を考慮するならば、製造される「１的蛋
白質への［二１的外蛋白質の混入は防がなくてはならな
い。

従来、不活性形蛋白質についてリフォールディングした
後に、例えばゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー
、限濾過膜等を用いて精製する方法が知られている。１
．かじ、リフォールディング操作が前記したように希釈
を伴うものである場合には大量の溶液について処理しな
ければならず、時間がかかり、また例えばゲルや濾過膜
の処理能力の低下を招き品い等の課題がある。また例え
ばりフォールディング操作が前記のように希釈を（＋わ
ない場合にも、溶液中に含まれる大量の目的蛋白質以外
の蛋白質を分離する間にゲル、濾過膜等の処理能力の低
下を招くことから、処理開始直後の精製の度合いと処理
終了直前の精製の度合いが変化し易く、厳重な監視を行
う必要がある。

しかし、不活性形蛋白質を不溶性画分に得た段階で精製
を行うとするならば、該蛋白質が本来の立体構造を有し
ていないことからアフィニティークロマトグラフィー　
イオン交換クロマトグラフィ等の手法を使用することは
難しく、更には、ゲル濾過、限外濾過膜を用いた分子量
分画によっても凝集塊を形成している該蛋白質と菌体断
片等の分離が不十分であるという課題がある。

本発明者は以上のような現状に鑑み、従来の不活性形蛋
白質のりフォールディング及び精製方法がａする課題点
を解決する方法について研究を行った結果、限外濾過膜
を用いることで前記課題点を解決できることを見出だし
、本発明を完成させた。即ち本発明は、第１に遺伝子組
換菌内に蓄積された不活性形蛋白質を活性形蛋白質とし
て得る方法であって、次の工程からなる方法である。

［１］、菌体を破砕する工程、 ［２］、［１］で得られる破砕物から不溶性画分を青る
工程、 ［３］、［２］で得られる不溶性画分と蛋白質変性剤を
接触させる工程、 ［４］、［３］で得られる水溶液を限外濾過膜を用いて
分子量分画する工程、及び、 ［５］、水溶液中の蛋白質変性剤の強度を低下させる工
程。

また、本発明は、第２に遺伝子組換菌内に蓄積された不
活性形蛋白質を精製する方法であって、次の工程からな
る方法である。

［１］、菌体を破砕する工程、 ［２］、［１］で１′１られる破砕物から不溶性画分を
得る工程、 ［３］、［２］で得られる不溶性画分と蛋白質変性剤を
接触させる工程、及び、 ［４］、［３］で得られる水溶液を限外濾過膜を用いて
分子量分画する工程。

以下本発明の詳細な説明する。

（課題点を解決するための手段） 遺伝子組換菌内に蓄積された不活性形蛋白質とは、遺伝
子工学的手法により例えば大腸菌、枯苧菌、酵母菌等の
微生物菌体を宿主として製造されたヒトやその他、微生
物とは異種の生物の蛋白質であって、該宿主中では不溶
性の凝集塊として蓄積されるものを意味する。宿主、蛋
白質自体には（１１１等限定はなく、遺伝子工学的手法
自体は公知のＴ−法か使用することができる。例えば、
大腸菌で製造されたプロウロキナーゼ、神経成長因子、
成長ホルモン、インターフェロン、インターロイキン２
等が例示できる。

菌体を破砕する工程は、例えば圧力、超音波等を用いた
物理的な破砕方法が使用できる。界面活性剤等の薬品を
用いた化学的破砕方法については、該薬品が目的とする
不活性形蛋白質に不過逆的な変性をり、えないものであ
れば良いが、工程の簡略化のためには、前記した物理的
方法が好ましい。

菌体を破砕して得られる菌体破砕物から不溶性画分を得
る工程は、例えば遠心分離、ゲル濾過、限外濾過膜を使
用した分子量分画等の方法により行うことができる。目
的とする不活性形蛋白質はこれまで述べてきたように、
不溶性であるため不溶性画分に得ることができる。

以上のようにして得られた、目的とする不活性形蛋白質
を含有する不溶性画分を、続いて蛋白質変性剤と接触さ
せるが、この工程は、例えば蛋白質変性剤溶液に該不溶
性画分を添加しても良いし、又は該不溶性画分を懸濁し
ておき、蛋白質変性剤を添加するか若しくは蛋白質変性
剤溶液を添加すれば良い。蛋白質変性剤としては、例え
ば塩酸グアニジン、尿素、種々のアルカリ性物質等を用
いれば良い。アルカリ性物質としては、例えば水酸化ナ
トリウム、アンモニア、有機アミン類等を例示できる。

このような蛋白質変性剤の中にあって、塩酸グアニジン
は強力な変性剤であり、本発明の方法に好ましく使用で
きる。使用する変性剤は目的とする不活性蛋白質を変性
できる濃度になるように調整すればよいが、一般に塩酸
グアニジンでは４Ｍ〜８Ｍ程度、尿素では６Ｍ〜１２Ｍ
程度、アルカリ性物質ではｐＨ１０〜ｐＩ（１２程度と
なるようにすれば良い。

以上の工程で可溶化、即ち脱折畳みされた不活性形蛋白
質を含む可溶化溶液を、続いて分子量分画する。この段
階で分子量分画することは、蛋白質変性剤の働きにより
可溶化された目的とする本活性蛋白質と例えば菌体断片
等を純粋にその分子−瓜の差により分画するものである
。使用する限外濾過膜と１２では、目的とする不活性蛋
白質の分子−瓜を考慮して決定すれば良い。限外濾過膜
は、その材質等に特別の制限はないが、使用する蛋白質
変性剤との関係によってはその耐久性等の問題が生じる
ため、条件を考慮して選択することが好ましい。例えば
変性剤として塩酸グアニジンを使用する場合には、ポリ
スルホン製の濾過膜を用いることか好ましい。

前記の分子量分画の操作において、目的とする不活性蛋
白質の分子量より大きな分画分子量及び小さな分画分子
量を白“する２種類以上の濾過膜を用いることで、より
精度の高い精製が可能となる。また、このように２種類
以」二の濾過膜を用いることにより、時には濃縮等の操
作としても実施することができる。

限外濾過膜を用いた分子量分画の後、可溶化溶液中の蛋
白質変性剤強度を低下させることで不活性形蛋白質を活
性形蛋白質として得ることができる。蛋白質変性剤強度
を低下させる操作は、例えば塩酸グアニジンや尿素の場
合には溶液を希釈することによりその濃度を低下させた
り、また例えばアルカリ性物質の場合には酸性物質を添
加することにより行えば良い。この時、例えば特開昭５
９−１６１３２１号等に示されるように、ＳＳ結合の保
護剤として例えばグルタチオン等を使用することに格別
の制限はない。

更に、［」的とする不活性形蛋白質を該蛋白質より小さ
な分画分子量を有する限外濾過膜を用いて分画する工程
を採用する場合には、分画の工程と同時に、目的とする
不活性形蛋白質が存在する分画を蛋白質変性剤を含まな
い又は変性剤強度を低下させた溶液で希釈することで、
膜の目づまり等を防止し、目的とする不活性形蛋白質が
膜に吸着することも防止できるうえ、変性剤強度を低下
させて折畳みの工程をも実施することができる。

（発明の効果） 本発明により、菌体内に蓄積された不活性形蛋白質を活
性形蛋白質として得ることができる。

本発明では、可溶化溶液中の蛋白質変性剤濃度を低下さ
せ、不活性形蛋白質の立体構造を活性を発現ｉ’ｉＪ能
な状態に折畳む工程に先立って限外濾過膜を用いて分子
ｍ分画することで、該溶液中の蛋白質濃度を低下させ、
従って折畳み率を向上させることができる。更に、折畳
み後の溶液中の目的外蛋白質は除去されているのである
から、該溶液についていえば、溶液中の総蛋白質あたり
の目的とする蛋白質に由来する生理活性を向上させるこ
とが可能である。この場合に、例えば希釈操作により活
性化を行うときに、その希釈の度合いを従来の方法と比
べて少なくできるから、該操作後の液量を少なくするこ
とが可能である。従って、本発明の方法に従った場合に
は、リフォールディング後の精製操作が比較的簡便に実
施可能である。

本発明により、菌体内に蓄積された不活性形蛋白質を簡
単な操作で精製することができる。この精製方法にあっ
ては、後にリフォールディングを行う不活性形蛋白質に
おいても、又は後にリフす−ルディングを行なわない不
活性形蛋白質おいてもその可溶化溶液中の純度を向上さ
せることができる。この方法は、リフォールディング後
には精製が困難な蛋白質や、例えばリフォールディング
を行うことなくストックしておく予定の蛋白質等につい
ても有効である。この方法により可溶化溶液中の目的と
する不活性形蛋白質について精製を行っておくことで、
例えば後に更に精製操作を行う場合にもイオン交換樹脂
、アフィニティー物質等の劣化を防ぎ、安定ｌ、た精製
度を提供することが可能である。

以上説明１７た効果において、限外濾過膜として２種の
濾過膜を用いた場合には、更に可溶化溶液中の［１的外
蛋白質及びその他の物質を除去できるから、その効果は
更に向上する。

実施例 以下本発明を更に詳細に説明するために実施例を記載す
るが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない
。

（実施例　１） ヒトプロウロキナーゼをコードする遺伝子を１９人した
プラスミド（該プラスミドは工業技術院微！Ｉ物工業技
術研究所に寄託番号８３４１号として寄託された大腸菌
から取ｉすした）により形質転換された大腸菌（ニジエ
リシア・コリ）Ｋ１２株を’９　ｉ２　ｔ、、培ａ　ｉ
ｆ＆にイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添
加してプロウロキナーゼをコドする遺伝子を発現させた
。培養液を遠心分離し−（ｉ′７られた湿菌体１００ｇ
をＯ，ＩＭ）リス塩酸緩衝液（ｐ　Ｈ８，０）１１に懸
濁した後、ゴトホモシナイザー（マントンゴーリン社製
）により破砕した。破砕物を遠心分離し、不溶性画分を
ｉすだ。

（１，１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）１１てこの
不溶性画分を懸濁し、８Ｍ塩酸グアニジン溶液１１を添
加して可溶化操作を行った。該溶液中１，５１を分画分
子ｍ　３００万、膜面積０．２ｍ’−のポリスルホン製
平膜式限外濾過膜（ＵＦ３０００ＰＳ　、東ソー株式会
社製）を用い、１０１／分の循環流星及び１．５ｋｇ／
ｃｍ２−の入口操作圧力にて約１０分間濾過【７た。得
られたべ透液は約１１であった。浸透液を１時間、４０
℃にて放置した後、５ｍＭＥＤ、ＴＡ、０．２ｍＭ還元
型グルタチオン、０．０２ｍＭ酸化型グルタチオン及び
４／７Ｍ塩酸グアニジンを含む５０ｍＭ）リス塩酸緩衝
液（ｐＨ８，０）７１を添加して希釈し、その後２５℃
にて１６時間放置して活性化（折畳み）を行った。得ら
れた溶液中の総蛋白質あたりのプロプロキナーゼ活性は
、約４２００１Ｕ／ｍｇであった。尚、プロウロキナー
ゼ話性は、溶液にプラスミンを添加１７てプロウロキナ
ーゼをウロキナーゼに変換した後、ウロキナゼの合成基
質Ｓ−２４４４（第一科学薬品（株）製）の分解活性を
、Ｔ、Ｋｈｏｎｏ　　ｅｔ　　ａｌ。

（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　　２，６２８１９８４
年）の方法に従って測定１．た。又、溶液中の蛋白質濃
度は、牛血清アルブミン（ＳＩＧＭＡ社製、ＡＬＢＵＭ
ＩＮ　　Ｎｏ、Ａ−７９０６）を（票準蛋白質としてＢ
ＣＡプロティンアッセイ試１Ｗ（Ｐｉｅｒｃｅ　　Ｃｈ
ｅｍｉｃａｌ　　Ｃａｍｐａ　ｎ　ｙ　′ｆＩ製、商品
名）を使用【７て測定した。

（比較例　１） 実帷例１でｉｌＩられた可溶化溶液５００ｍ１に、５ｍ
Ｍ　　ＥＤＴＡ、０．２ｍＭ還元型グルタチオン、０．
０２ｍＭ酸化型グルタチオン及び４／７Ｍ塩酸グアニジ
ンを含む５０　ｍ　Ｍ　トリス塩酸緩衝ｉｆ＆　（ｐＨ
８，０）３．５１を添加して希釈１７、その後２５℃に
て１６時間ｈｋ装して活性化（折畳み）を行った。得ら
れた溶液中の総蛋白質あたりのプロウロキナーゼ活性は
、約２７５０ＩＵ／ｍｇであった。

（実施例　２） 実施例１と同様にして得られた湿菌体２００ｇを、実施
例１と同様の方法により粉砕し、遠心分離により不溶性
画分を得た。不溶性画分を、０、］、　Ｍ　ｌ−リス塩
酸（ｐＨ８，０）２１に懸濁し８Ｍ塩酸グアニジン溶液
２１を添加して、４０℃で１時間、可溶化処理を行った
。該溶液２１を分画分子量３万、膜面積０．２ｍ２−の
ポリスルホン製平膜式限外濾過膜（ＵＦ３０ＰＳ　；東
ソー株式会社製）を用いて１０１／分の循環流量、２ｋ
ｇ／ｃｍ２／の人口操作圧力にて約２０分間分画した。

溶液が１１になった時点で、５０　ｍ　Ｍ　ｌ−リス塩
酸緩衝ｐ　（ｐＨ８，０）１１を添加し、更に同様の条
件で約２０分間分画した。溶液が１１になった時点で、
５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８゜０）１１を添加し
て全液量を２１とし、更に分画して１１の目的とする不
活性形蛋白質を含む１１の溶液を得た。

該溶液に５　ｍ　Ｍ　　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　、　０　、２
　ｍ　Ｍ還元型グルタチオン、０．０２ｍＭ酸化型グル
タチオン、１Ｍ塩酸グアニジンを含む５０　ｍ　Ｍ　ト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）１５１を添加し、２５℃
で１６時間／ｉｋ装して活性かく折畳み）を行った。

得られた溶液中の総蛋白質あたりのプロウロキナゼ活性
は、約３８００１Ｕ／ｍｇであった。尚プロウロキナー
ゼ活性、蛋白質量のハ１定は、実施例１と同１．ｌにし
てＡ１１ｌ定した。

（比較例　２） 実施例２で１１）られた可溶化溶液２１に対し、５ｍＭ
　　ＥＤＴＡ、０．２ｍＭ還元形グルタチオン、０．０
２ｍＭ酸化形グルタチオン及び４７７Ｍ塩酸グアニジン
を含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）１４１
を添加し、２５℃で１６時間放置して活性化（折畳み）
を行った。得られた溶液中の総蛋白質あたりのプロウロ
キナーゼ活性は約２７００１　Ｕ　／　ｍ　ｇであった
。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）遺伝子組換菌内に蓄積された不活性形蛋白質を活
   性形蛋白質として得る方法であって、次の工程からなる
   方法。 ［１］、菌体を破砕する工程、 ［２］、［１］で得られる破砕物から不溶性画分を得る
   工程、 ［３］、［２］で得られる不溶性画分と蛋白質変性剤を
   接触させる工程、 ［４］、［３］で得られる水溶液を限外濾過膜を用いて
   分子量分画する工程、及び、 ［５］、水溶液中の蛋白質変性剤の強度を低下させる工
   程。
2. （２）請求項１項記載の方法において、不活性形蛋白質
   を透過させない限外濾過膜を用いて分子量分画を行う工
   程と該膜を透過しない画分に蛋白質変性剤を含まないか
   又は用いた蛋白質変性剤強度より低い蛋白質変性剤を含
   有する溶液を添加する工程を同時に行うことを特徴とす
   る方法。
3. （３）遺伝子組換菌内に蓄積された不活性形蛋白質を精
   製する方法であって、次の工程からなる方法。 ［１］、菌体を破砕する工程、 ［２］、［１］で得られる破砕物から不溶性画分を得る
   工程、 ［３］、［２］で得られる不溶性画分と蛋白質変性剤を
   接触させる工程、及び、 ［４］、［３］で得られる水溶液を限外濾過膜を用いて
   分子量分画する工程。
4. （４）限外濾過膜を用いた分子量分画が不活性形蛋白質
   の分子量より大きな分画分子量を有する限外濾過膜及び
   不活性形蛋白質の分子量より小さな分画分子量を有する
   限外濾過膜により行われることを特徴とする請求項第（
   １）項又は第（３）項記載の方法。
5. （５）不活性形蛋白質が不溶性異種蛋白質である請求項
   第（１）項〜第（４）項いずれかに記載の方法。
6. （６）蛋白質変性剤が塩酸グアニジン、尿素、アルカリ
   性物質である請求項第（１）〜第（６）項いずれかに記
   載の方法。
7. （７）蛋白質変性剤が塩酸グアニジンであり、限外濾過
   膜がポリスルホン製である請求項第（１）〜第（６）項
   いずれかに記載の方法。