JPS63119497A - 異種蛋白質の可溶化，活性化法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は改良された異種蛋白質の可溶化、活性化の方法
に関する。

（従来の技術） 異質蛋白質の可溶化、活性化については既に下記■〜■
に例示されるいくつかの方法が知られている。

■　いくつかの酵素において塩酸グアニジン。

尿素などの蛋白質変性剤で完全変性させたのち可溶化さ
せ、希釈、透析などにより蛋白質変性剤濃度を減少させ
ることにより活性が回復すること（「蛋白質とは何か」
蛋白質核酸酵素別冊ｖｏｌ　２７　Ｎｏ、６　Ｐ９１５
−９２９共立出版１９８２年、タンパク質化学３高次構
造Ｐ５５０−６２６共立出版１９７３年など） ■　組換えＤＮＡ技術によって得られたウロキナーゼを
、４℃−晩５Ｍ塩酸グアニジンで変性、可溶化させＩＭ
塩酸グアニジン濃度迄希釈し、４℃１８〜３６時間放置
することにより活性化されること（Ｍ、Ｅ、Ｗｉｎｋｌ
ｅｒ　ｅｔ　ａｌ　：ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ　
３９９０１９８５　）■　ヒト白血球インターフェロン
と、ヒト線維芽インターフェロンを、１００℃、２．５
分煮沸して失活させた後、１％ＳＤＳ中におき希釈又は
透析で活性化させること（Ｗ、Ｂ、ＳｔｅｗａｒｔＩＩ
　　ｅｔ、ａｌ　：Ｊ、ｇｅｎ、Ｖｉｏｌ、２６．３２
７１９７５）■　ヒト白血球インターフェロンと、ヒト
線維芽インターフェロンを、１００℃、２．５分煮沸し
て失活させた後、１．５Ｍグアニジンチオシアネート（
Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ　ｔｙｏｃｙａｎａｔｅ）中におき
透析により再活性化させること（Ｒ，Ｊ、Ｊａｒｉｗａ
ｌｌａ　ｅｔ、ａｌ　：　Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ　３
６１３９０１９８０　）。

（発明が解決しようとする問題点） 組換えＤＮＡ技術によって得られた微生物を用いて異種
蛋白質を生産しようとする場合、異種蛋白質のシーフェ
ンスを有する蛋白質の固まり（以下顆粒という）を菌体
内に生産する。しかしこの顆粒自体は溶媒には不溶で実
質的に活性を有しない。また今迄用いられてきた方法に
よる活性化効率は異種蛋白質発現量からも非常に悪いも
のと思われる。このように実質的に活性を有しないある
いは失った、もしくは活性の減じた異種蛋白質の活性化
の効率上昇もしくは活性を付与する優れた方法の開発が
望まれている。

（発明を解決するための手段及び作用）異種蛋白質の活
性の向上、もしくは付与について種々検討した結果、異
種蛋白質を蛋白質変性剤で処理する際、熱処理を行なう
ことにより、異種蛋白質活性と共に比活性（蛋白質あた
り）の向上した異種蛋白質が得られることを見い出した 本発明によって使用される異種蛋白質とは組換えＤＮＡ
技術によって得られる微生物の培養によって製造される
異種蛋白質などが含まれる。

特に組換えＤＮＡ技術によって得られる微生物の培養に
よって製造される活性を有していない顆粒状のウロキナ
ーゼ蛋白質等のウロキナーゼ活性の向上に有用である。

組換えＤＮＡ技術によって得られる顆粒状のウロキナー
ゼの取得は、一般的に使用される技術、例えばマントン
−ガラリンプレス（Ｍａｎｔｏｎ−Ｇａｎｌｉｎ　ｐｒ
ｅｓｓ　）　、フレンチプレス（Ｆｒｅｎｃｈｐｒｅｓ
ｓ）もしくは超音波発信器を使用するような機゛成約方
法、或いはリゾチーム処理のような化学的もしくは酵素
的方法、或いは凍結融解をくり返すような物理的方法を
用いて溶解する。

これを約１０００　Ｇの低速度で標準的遠心分離機によ
り遠心分離する。破砕が完全かどうか検査するには遠心
上清の蛋白質の吸収を測定する。

蛋白質変性剤としてはグアニジン塩（塩酸塩、チオシア
ン酸塩）、尿素等があげられる。

使用濃度としては４モル以上好ましくは６〜１０モルの
範囲である。

本発明で行なわれる熱処理はこれら蛋白質変性剤中で行
ない熱処理の温度としては３０℃以上９０℃以下、好ま
しくは４０℃〜６０℃の範囲である。蛋白質変性剤中で
の変性、可溶化処理と共に行なう時間は１０分以上、好
ましくは４０分〜９０分である。１８．０分を越えると
ウロキナーゼ活性が低下することがある。

次いで可溶化されない顆粒及び熱処理により変性し不溶
性となった蛋白質を遠心分離を行ない除く。この遠心分
離は重力の１０００〜２００００倍好ましくは約５００
０Ｇ以上の速度で標準的遠心分離機により、容積によっ
て適当な時間、通常約２０分〜１時間に亘って遠心分離
する。得られた上清は蛋白質変性剤によって変性、可溶
化されない顆粒及び熱処理により変性不溶化となった蛋
白質を含まない画分である。

上記画分を該蛋白質変性剤の濃度が０．５Ｍ〜２．０Ｍ
好ましくは１．０Ｍ〜１．２５Ｍになるよう酸化剤を含
む緩衝液で希釈する。酸化剤としては、例えばβ−メル
カプトエタノール還元グルチオン、システアミン又はシ
スティン及びその対応する酸化型を含有する系、好まし
くは還元型グルタチオン（ＧＳＨ）及び酸化型グルタチ
オン（ＧＳＳＧ）を含有する系を添加する。典型的には
還元型対酸化型のモル比は約２０＝１〜５：１好ましく
は約ｌＯ：１であり全グルタチオン又は他の試薬の濃度
は０．０５〜５ｍＭの範囲である。この混合物を所望蛋
白質に応じて約Ｏ〜３７℃で４〜２４時間、好ましくは
１晩インキニーベートする。

このようにして、溶液中に活性の向上した異種蛋白質を
得る。

（実施例） 以下に実施例及び参考例を示す。

実施例 参考例で得たプロ型ウロキナーゼ顆粒（菌体１ｇ相当）
に０．１Ｍトリス塩酸　（ｐＨ８，０）１０　ｍＩＬ。

８Ｍ塩酸グアニジン１０　ｍＡを加え５０℃、１時間変
性可溶化する。次いで不溶顆粒及び熱処理により変性沈
殿した夾雑タンパクをＨＬｔａｃｈ［Ｓ　ＣＲ２０Ｂ（
日立製作所■）ローターとしてＲＰＲ２０−２−２１９
０（５０ｍＩＬｘ　８本）を用い２００００ｒｐｍ２０
分の遠心を行ない上清を得る０次いで２ｍＭ還元型タル
タチオン、　０．２ｍＭ酸化型グルタチオン、　５０ｍ
ＭＥ　Ｄ　Ｔ　Ａを含０．１Ｍトリス塩酸　（ＰＨ８，
０）で塩酸グアニジンがＩＭになるように希釈する。

ウロキナーゼとして約１０ｘ　１０’　Ａｐｕ／ｇｃ胃
の溶液が得られる。

以上のようにして得られたウロキナーゼの総括性および
蛋白あたりの比活性の値を従来の方法による値と比較し
て表１に示した。

なお得られたプロ型ウロキナーゼのアミノ酸配列は１３
５番目のアミノ酸残基（リジル基）がグルタミン残基で
置換されていること以外はヒトプロつロキナーゼのアミ
ノ酸配列と同じである。

参考例 （プロ型ウロキナーゼ顆粒の調製） エシェリヒア　コリ　ｘ　　１７７Ｂ／ｐＭｔｌＰ　ｌ
ｐｍ　（微工研受託番号ｎ　ＦＥＲＭ　ＢＰ−９６９）
及びエシェリヒア　コリ　ｚ　　１７７６／ｐＭｔｌＴ
４Ｌｐｍ２（微工研受託番号：　ＦＥＲＭ　ＢＰ−９７
０）をそれぞれ、χ　１７７６培地（（Ｔ、マニアチス
ら（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、）、モレキュ
ラー　クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ）。

スプリング　ハーバ−ラボラトリ−（ＳｐｒｉｎｇＨａ
ｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）　（１９８２）　、
　６９頁））中、３７℃で２４時間培養して集菌した。

得られた菌体から常法に従ってプラスミドを抽出、精製
し、プラスミドｐＭＵＰ　Ｌｐｍ′ｇＬびｐＭＬＩＴ４
Ｌｐｍ２を得た。

１０μｇのプラスミドｐＭＵＴ４Ｌｐｍ２と５ユニツト
のｐｓｔ　Ｉを緩衝液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＧｆｆ
ｉ　ｐＨ７，５；５０ｍＭＮａＣＪｌ；１０ｍＭ　Ｍｇ
Ｃ４ｚ；１ｍＭ　ＤＴＴ）　５０μｌ中で３７℃、１時
間反応後、０．７％アガロース電気泳動法により約４．
８Ｋｂｐに相当するＤＮＡ断片を単離した。

他方、１０μｇのプラスミドｐＭＵＰ’　ｌｐｍと５０
ユニツトのｐｓｔ　Ｉを上記の緩衝液５０μ父中で完全
消化し、慣用法に従フて約１．２ＫｂｐのＤＮＡ断片を
単離した。これら２つのＤＮＡ断片はフェノール／クロ
ロホルム抽出及びエタノール沈殿を繰り返すことによっ
て精製回収した。両者を常法に従ってＴ４ＤＮＡリガー
ゼ連絡し、大腸菌ＪＭ１０３に形質転換してクローニン
グした。得られた形質転換菌をアルカリ溶菌法による迅
速単離法によってスクリーニングし、更に制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩ及びＢａｍＨＩを用いて検索し、所望のプラスミ
ドｐＭＵＴ４Ｌ　ｐｍｌを持つ形質転換株Ｅ、コリ　Ｊ
Ｍ１０３／ｐＭＵＴ４Ｌ４　ｐｍｌを得た。

こうして得られた形質転換菌を５ｍ文のレープロス中で
３７℃にて１晩培養したものを種菌とした。１００ｍＮ
のレープロスを含む５００１容据盪フラスコを５本用意
し、それぞれを滅菌後、各１　ｍｌの種菌液を添加し、
３７℃培養した。５５０ｎｍにおける吸光度が約０．５
になったときＩＰＴＧ　（イソプロピル−β−カチオガ
ラクトピラノシド）を最終濃度が１　ｍＭとなるように
添加することによって発現を誘導し、さらに３時間３７
℃にて培養することによりプロウロキナーゼ遺伝子を発
現させた。

培養液合計５００　ｍｌを高速冷却遠心沈降分離機によ
り、１万回転／分で１０分間遠心して得られた沈殿物を
菌体として回収した。収量は、湿重量として１．７ｇで
あった。

この温潤菌体を１０ｆｆｉ！の０．１　Ｍ　）−リス塩
酸（ｐＨ８，０）に懸濁し５ＥＩＫＯ７５００ｔｌＬＴ
ＲＡｓＯＮＩｃ　ＰＲＯＣＥＳＳＯＲで出力５００Ｗ　
１０分で菌体破砕し、遠心分離機としてＨｉｔａｃｈｉ
　５ＣＲ２０Ｂ　（日立製作所■）ローターとしてＲＰ
　Ｒ２０−２−２１９０（５０ｍＭｘ　８本）を用い２
０００Ｏｒｐｍ、　２０分の遠心分離を行ない沈殿を得
た。さらにこの沈殿を１０ｍＮ、０．１　Ｍトリス塩酸
（ｐＨ８，０）に懸濁し同様に菌体破砕を再度行ない、
同様の条件で遠心分離を行ない顆粒状態のウロキナーゼ
を分離した。

（発明の効果） 本発明により組換え体異種タンパクの活性、比活性共に
顕著に向上する。

活性の上昇を示す。

７０　２０．３０　４０．Ｓｏ　るＯ −３呈良頭）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 異種蛋白質を蛋白質変性剤で変性、可溶化処理を行なう
   にあたって、熱処理を加えることにより異種蛋白質を活
   性化することを特徴とする異種蛋白質の可溶化、活性化
   法。