CN116925208A - 重组人pai-1蛋白包涵体复性的复性缓冲液以及方法 - Google Patents
重组人pai-1蛋白包涵体复性的复性缓冲液以及方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116925208A CN116925208A CN202310958007.3A CN202310958007A CN116925208A CN 116925208 A CN116925208 A CN 116925208A CN 202310958007 A CN202310958007 A CN 202310958007A CN 116925208 A CN116925208 A CN 116925208A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- renaturation
- protein
- pai
- inclusion body
- buffer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 title claims abstract description 88
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 title claims abstract description 74
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 title claims abstract description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 101000609255 Homo sapiens Plasminogen activator inhibitor 1 Proteins 0.000 title claims abstract description 14
- 102000043283 human SERPINE1 Human genes 0.000 title claims abstract description 14
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 45
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 30
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 20
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 claims abstract description 20
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 claims abstract description 20
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 15
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 claims abstract description 13
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 claims abstract description 13
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims abstract description 12
- IEQAICDLOKRSRL-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-dodecoxyethoxy)ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethanol Chemical compound CCCCCCCCCCCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO IEQAICDLOKRSRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 9
- 108010022233 Plasminogen Activator Inhibitor 1 Proteins 0.000 claims abstract 6
- 102000012335 Plasminogen Activator Inhibitor 1 Human genes 0.000 claims abstract 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 46
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 45
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 33
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 24
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 23
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 20
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 20
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 17
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 14
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 13
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 11
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims description 10
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 9
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 7
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 238000005457 optimization Methods 0.000 claims description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 7
- 239000003761 preservation solution Substances 0.000 claims description 6
- 239000013578 denaturing buffer Substances 0.000 claims description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000005336 cracking Methods 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 5
- 108010077971 Plasminogen Inactivators Proteins 0.000 description 56
- 102000010752 Plasminogen Inactivators Human genes 0.000 description 52
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 42
- 239000002797 plasminogen activator inhibitor Substances 0.000 description 26
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 14
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 6
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical group CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 5
- 102100033571 Tissue-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 4
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 4
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 4
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 4
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 4
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 4
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 4
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 4
- -1 salt ions Chemical class 0.000 description 4
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 4
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 4
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 4
- 108050006955 Tissue-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 3
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 2
- SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N Dodecane Natural products CCCCCCCCCCCC SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 2
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 2
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010088842 Fibrinolysin Proteins 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 2
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N diethylene glycol Chemical compound OCCOCCO MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000003438 dodecyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 2
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 2
- 230000020764 fibrinolysis Effects 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 2
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 230000007026 protein scission Effects 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- 206010001052 Acute respiratory distress syndrome Diseases 0.000 description 1
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 101000605403 Homo sapiens Plasminogen Proteins 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000008104 Reoviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 101710102218 Serine protease inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 101710177459 Snake venom metalloproteinase fibrolase Proteins 0.000 description 1
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 208000015294 blood coagulation disease Diseases 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000009852 coagulant defect Effects 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000003805 procoagulant Substances 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
- C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
- C07K14/8121—Serpins
- C07K14/8132—Plasminogen activator inhibitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/185—Escherichia
- C12R2001/19—Escherichia coli
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明提供了一种重组人PAI‑1蛋白包涵体复性的复性缓冲液以及方法，复性缓冲液包括：10～50mM乙酸钠，100～500mM NaCl，1～10mM Triton X‑100，1～10％甘油，0.5～1.5M葡萄糖，0.01％～0.05％Brij‑35，且pH为5.0～5.8。本发明解决了现有重组人PAI‑1蛋白分子复性产率低，导致生产成本高的技术问题，实现了提升PAI‑1蛋白包涵体的复性产率，节约生产成本的技术效果。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体而言，涉及一种重组人PAI-1蛋白包涵体复性的复性缓冲液以及方法。
背景技术
PAI-1是丝氨酸蛋白酶抑制剂基因家族的成员，是细胞周围蛋白水解微环境的负调节因子之一。天然的PAI-1是由379个氨基酸组成的糖蛋白，不含半胱氨酸，分子量是50.0KD，等电点是pH4.5～5.0。正常情况下，机体血凝块中纤维蛋白溶解与细胞外周蛋白水解的作用受组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)和尿激酶型纤维蛋白酶原激活剂(u-PA)调控。t-PA和u-PA通过激活纤维蛋白溶解蛋白酶(简称纤溶酶)对纤维蛋白、细胞外基质进行降解，防止血栓的产生。PAI-1是促凝血剂，是t-PA和u-PA的生理性抑制因子，在纤维蛋白溶解的过程中是非常重要的一个调节点，可抑制纤溶酶的活性和细胞外基质的降解，并活化纤维蛋白，保证正常的凝血功能。最新研究表明，PAI-1过表达在新冠病毒(CoronaVirus2019)相关性凝血障碍导致急性呼吸窘迫综合征(ARDS)中起重要作用，研究人员总结了现有的数据，表明PAI-1是治疗严重新冠病毒感染引发的肺炎病例的一个有前途的靶点。因此，不管是继续深入研究PAI-1蛋白质性质，还是将来生产PAI-1蛋白，都需要有效的进行重组人PAI-1蛋白制备。
存在的问题是：大肠杆菌表达重组人PAI-1蛋白形式一直是以低水平可溶表达和高水平包涵体表达存在。虽然PAI-1蛋白分子中没有二硫键的存在，但由于蛋白疏水性较强，使得其复性产率低，成本提升，也造成了蛋白资源浪费。
因此，找到一种高效的PAI-1蛋白包涵体复性的方法，是节省生产成本，提高研发效率的有效途径。
发明内容
本发明解决了现有重组人PAI-1蛋白分子复性产率低，导致生产成本高的技术问题，实现了提升PAI-1蛋白包涵体的复性产率，节约生产成本的技术效果。
为解决上述问题，本发明提供一种重组人PAI-1蛋白包涵体复性的复性缓冲液，包括：10～50mM乙酸钠，100～500mM NaCl，1～10mM Triton X-100，1～10％甘油，0.5～1.5M葡萄糖，0.01％～0.05％ Brij-35，且pH为5.0～5.8。
与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：本发明提供的复性缓冲液能够提升蛋白复性效果，其中，乙酸钠能够用于调节溶液的pH值；NaCl中一定的盐离子可降低某些带电基团间的斥力，改变溶液的电荷条件，提高复性产率；Triton X-100和Brij-35(十二烷基聚乙二醇醚)作为去污剂，能够捕获非天然状态的蛋白质，形成蛋白质去污剂复合物，从而阻止蛋白质的聚集失活；Triton X-100作为表面活性剂，可稳定折叠中间体，有效辅助蛋白质的折叠复性；甘油能够大大降低复性中间态蛋白分子的扩散能力，从而降低具有疏水基团的过渡态的聚合机会，还可以与部分复性的蛋白中间体相互作用，从而抑制中间体的相互凝聚；葡萄糖能够提高蛋白质的复性收率。因此，采用本申请提供的复性缓冲液对包涵体进行复性，成本低，且蛋白产量高。
本发明还提供一种重组人PAI-1蛋白包涵体复性的方法，包括以下步骤：S10：制备PAI-1蛋白的包涵体；S20：采用变性缓冲液溶解包涵体，获得包含裂解蛋白的包涵体变性液；S30：将包涵体变性液与上述任一实例的复性缓冲液混合后，对包涵体进行蛋白复性，获得复性后的PAI-1蛋白。
与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：利用复性缓冲液对包涵体进行复性，操作简单，成本低，且能够显著提升PAI-1蛋白包涵体的复性产率。本实施例提供的包涵体复性的方法采用上述实例的复性缓冲液，具有复性缓冲液的所有有益效果，在此不再赘述。
在本发明的一个实例中，S10包括以下步骤：S11：获取PAI-1的CDS序列，对CDS序列进行密码子优化，优化后的序列如SEQ ID NO：1所示；
S12：构建表达载体：将优化后的PAI-1基因序列插入质粒，获得重组表达载体；S13：将重组表达载体转化至大肠杆菌宿主细胞中，得到菌体细胞，诱导重组表达载体在大肠杆菌宿主细胞中表达；S14：离心收集菌体细胞，用缓冲液悬浮菌体细胞，裂解大肠杆菌宿主细胞，离心后获得包涵体。
与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：首先针对大肠杆菌细胞进行密码子优化，将优化后的PAI-1基因序列连接到载体上；再将该载体转化至大肠杆菌宿主细胞中，培养宿主细胞后，加入诱导剂继续培养进而诱导PAI-1蛋白在大肠杆菌宿主细胞中表达；培养结束后，离心收集菌体，裂解细胞，离心获得沉淀，沉淀即为PAI-1蛋白的包涵体。其中，诱导剂可以是IPTG，诱导剂在细菌在对数生长期(0.6KD左右)加入。
在本发明的一个实例中，变性缓冲液包括：6～8M尿素，10～50mM乙酸钠，100～500mM NaCl，1～2.5mM EDTA，1～10mM Triton X-100，1～10％甘油，1～25mM DTT，且pH为5.0～5.8。
与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：尿素能够洗掉包涵体表面的不溶性杂蛋白；乙酸钠能够用于调节溶液的pH值；NaCl中一定的盐离子可降低某些带电基团间的斥力；EDTA能够防止蛋白降解；Triton X-100能够除去其他细菌成分，如膜外蛋白，质粒DNA和其他杂质；甘油能够大大降低复性中间态蛋白分子的扩散能力，从而降低具有疏水基团的过渡态的聚合机会，还可以与部分复性的蛋白中间体相互作用，从而抑制中间体的相互凝聚；DTT能够促进蛋白质裂解。
在本发明的一个实例中，包涵体与变性缓冲液的质量体积比为1g：(10～15)mL。
与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：采用上述质量体积比，能够更好地溶解PAI-1蛋白的包涵体，进而提高复性产率。
在本发明的一个实例中，包涵体变性液与复性缓冲液的比例为1：(5～20)。
与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：通过将包涵体变性液与复性缓冲液的体积比控制在上述范围内，能够将混合后的溶液中的尿素的含量控制在1M以下，进而有利于PAI-1蛋白的复性。
在本发明的一个实例中，包涵体变性液与复性缓冲液的比例为1：8。
与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：作为优选，包涵体变性液与复性缓冲液的比例为1：8。
在本发明的一个实例中，蛋白复性的条件为：温度2～8℃，时间为12～24h。
与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：上述条件有利于PAI-1蛋白的复性。
在本发明的一个实例中，复性后的PAI-1蛋白保存于保存液中，保存液由20mM乙酸钠，1.15M葡萄糖，0.02％Brij-35，0.1％NaN3组成。
与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：将复性后的PAI-1蛋白保存于上述保存液中，能够将其稳定保存，以便用于后续实验。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1为本发明实施例提供的包涵体表达的电泳图；
图2为本发明实施例提供的蛋白复性液的电泳图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面对本发明的具体实施例做详细的说明。
实施例一：
本发明提供一种重组人PAI-1蛋白包涵体复性的复性缓冲液，包括：10～50mM乙酸钠，100～500mM NaCl，1～10mM Triton X-100，1～10％甘油，0.5～1.5M葡萄糖，0.01％～0.05％ Brij-35，且pH为5.0～5.8。
优选的，复性缓冲液包括：20mM乙酸钠，500mM NaCl，2mM Triton X-100，5％甘油，1.15M葡萄糖，0.02％Brij-35，且pH为5.6。
本发明提供的复性缓冲液能够提升蛋白复性效果，其中，乙酸钠能够用于调节溶液的pH值；NaCl中一定的盐离子可降低某些带电基团间的斥力，改变溶液的电荷条件，提高复性产率；Triton X-100和Brij-35(十二烷基聚乙二醇醚)作为去污剂，能够捕获非天然状态的蛋白质，形成蛋白质去污剂复合物，从而阻止蛋白质的聚集失活；而且Triton X-100作为表面活性剂，可稳定折叠中间体，有效辅助蛋白质的折叠复性；甘油能够大大降低复性中间态蛋白分子的扩散能力，从而降低具有疏水基团的过渡态的聚合机会，还可以与部分复性的蛋白中间体相互作用，从而抑制中间体的相互凝聚；葡萄糖能够提高蛋白质的复性收率。因此，采用本实例提供的复性缓冲液对包涵体进行复性，成本低，且蛋白产量高。
实施例二：
本实施例提供一种重组人PAI-1蛋白包涵体复性的方法，包括以下步骤：
S10：制备PAI-1蛋白的包涵体；
S20：采用变性缓冲液溶解包涵体，获得包含裂解蛋白的包涵体变性液；
S30：将包涵体变性液与上述实例的复性缓冲液混合后，对包涵体进行蛋白复性，获得复性后的PAI-1蛋白。
具体的，利用复性缓冲液对包涵体进行复性的操作简单，成本低，重组蛋白产量高。本实施例提供的包涵体复性的方法采用上述实例的复性缓冲液，具有复性缓冲液的所有有益效果，在此不再赘述。
进一步的，S10包括以下步骤：
S11：获取PAI-1的CDS序列，对CDS序列进行密码子优化，优化后的序列如SEQ IDNO：1所示；
S12：构建表达载体：将优化后的PAI-1基因序列插入质粒，获得重组表达载体；
S13：将重组表达载体转化至大肠杆菌宿主细胞中，得到菌体细胞，诱导重组表达载体在大肠杆菌宿主细胞中表达；
S14：离心收集菌体细胞，用缓冲液悬浮菌体细胞，采用超声破碎仪裂解大肠杆菌宿主细胞，离心后获得包涵体。
具体的，首先针对大肠杆菌细胞进行密码子优化，将优化后的PAI-1基因序列连接到载体上；再将该载体转化至大肠杆菌宿主细胞中，培养宿主细胞后，加入诱导剂继续培养进而诱导PAI-1蛋白在大肠杆菌宿主细胞中表达；培养结束后，离心收集菌体，裂解细胞，离心获得沉淀，沉淀即为PAI-1蛋白的包涵体。其中，诱导剂可以是IPTG，诱导剂在细菌在对数生长期(0.6KD左右)加入。
进一步的，变性缓冲液包括：6～8M尿素，10～50mM乙酸钠，100～500mM NaCl，1～2.5mM EDTA，1～10mM Triton X-100，1～10％甘油，1～25mM DTT，且pH为5.0～5.8。
具体的，尿素能够洗掉包涵体表面的不溶性杂蛋白；乙酸钠能够用于调节溶液的pH值；NaCl中一定的盐离子可降低某些带电基团间的斥力；EDTA能够防止蛋白降解；TritonX-100能够除去其他细菌成分，如膜外蛋白，质粒DNA和其他杂质；甘油能够大大降低复性中间态蛋白分子的扩散能力，从而降低具有疏水基团的过渡态的聚合机会，还可以与部分复性的蛋白中间体相互作用，从而抑制中间体的相互凝聚；DTT能够促进蛋白质裂解。
优选的，变性缓冲液包括：8M尿素，20mM乙酸钠，500mM NaCl，1mM EDTA，2mMTriton X-100，5％甘油，4mM DTT，且pH为5.6。
进一步的，包涵体与变性缓冲液的质量体积比为1g：(10～15)mL。
具体的，采用上述质量体积比，能够更好地溶解PAI-1蛋白的包涵体，进而提高复性产率。包涵体与变性缓冲液的质量体积比可以为1g：10mL、1g：11mL、1g：12mL、1g：13mL、1g：14mL、1g：15mL。
优选的，包涵体与变性缓冲液的质量体积比为1g：10mL。
进一步的，包涵体变性液与复性缓冲液的比例为1：(5～20)。
具体的，包涵体变性液与复性缓冲液的比例可以为1:5、1：6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20。
具体的，通过将包涵体变性液与复性缓冲液的体积比控制在上述范围内，能够将混合后的溶液中的尿素的含量控制在1M以下，进而有利于PAI-1蛋白的复性。
优选的，包涵体变性液与复性缓冲液的比例为1：8。
进一步的，蛋白复性的条件为：温度2～8℃，时间为12～24h。
具体的，上述条件有利于PAI-1蛋白的复性。
优选的，蛋白变性的条件为：温度5℃，时间为12h。
进一步的，复性后的PAI-1蛋白保存于保存液中，保存液包括：20mM乙酸钠，1.15M葡萄糖，0.02％Brij-35，0.1％NaN3。
具体的，PAI-1抗原样品在上述保存液中，2～8℃可稳定保存3个月，-20℃可稳定保存3年。
实施例三：
在实施例一和实施例二的基础上，在一个具体实施例中，PAI-1蛋白包涵体复性包括以下步骤：
一、PAI-1蛋白包涵体的制备
从NCBI基因库中找到人纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1)序列(NM_000602.5)，并摘取其中的CDS序列，针对大肠杆菌细胞进行密码子优化，密码子优化后的序列如SEQ ID NO：1所示。
将PAI-1基因连接到PET-28a载体上构建表达载体，并将构建的表达载体转化导入到大肠杆菌TOP10感受态细胞中，涂板，挑取单克隆测序。将测序序列与合成序列进行比对，序列完全正确的单克隆细胞扩大培养，并调取PAI-1/PET-28a质粒。将PAI-1/28A质粒转化到BL21感受态，并逐步扩增至500ml培养体积，220rpm 37℃摇菌3h，用紫外分光光度计检测细菌，在对数生长期(0.6KD左右)加入0.4mmol IPTG，加入诱导剂后继续摇菌培养5h，离心收集菌体细胞。
用缓冲液A(20mM乙酸钠，pH5.6)悬浮菌体细胞，用超声破碎仪220V超声5s间隔5s超声30min，用超速离心机12000rpm 4℃离心40min，弃上清，留沉淀，该沉淀即为PAI-1包涵体。
参见图1，图1为包涵体表达的电泳图(M：Marker；1:PAI-1/BL21菌液IPTG诱导前；2:PAI-1/BL21菌液IPTG诱导后；3:PAI-1/BL21菌破碎上清液；4：PAI-1/BL21菌破碎沉淀)。可以清楚知道，包涵体已成功表达。
二、PAI-1包涵体复性
PAI-1包涵体用变性缓冲液进行重悬，变性缓冲液由8M尿素、20mM乙酸钠、500mM的NaCl、1mM EDTA、2mM Triton X-100、5％甘油、4mM DTT组成，pH为5.6，PAI-1包涵体与变性缓冲液的质量体积比为1g：10ml。将重悬缓冲液用离心机离心，收集上清，获得PAI-1包涵体变性液。
将PAI-1包涵体变性液缓慢滴加至复性缓冲液中，复性缓冲液由20mM乙酸钠、500mM NaCl、2mM Triton X-100、5％甘油、1.15M葡萄糖、0.02％Brij-35组成，pH为5.6，边加边搅拌，对蛋白进行稀释复性，获得蛋白复性液，包涵体变性液与复性缓冲液的体积比为1:8。蛋白复性液在2～8℃静置放置12h，取液跑12％SDS-PAGE电泳胶，电泳结果参见图2(M：Marker；1：PAI-1蛋白复性液)。
值得注意的是，如果PAI-1包涵体变性液过快加入至复性缓冲液中,容易形成絮状沉淀，可能是蛋白质重新凝聚的缘故。因此，PAI-1包涵体变性液需要缓慢加入，使变性蛋白在复性液中始终处于低浓度状态。
蛋白复性后蛋白复性液中含有1M尿素，避免影响后续实验，可将蛋白透析至保存基础缓冲液20mM乙酸钠(pH5.6)中，收液后保存缓冲液中加1.15M葡萄糖、0.02％Brij-35、0.1％NaN3。PAI-1抗原样品2～8℃可稳定保存3个月，-20℃可稳定保存3年。
虽然本发明披露如上，但本发明并非限定于此。任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种更动与修改，因此本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。
Claims (9)
1.一种重组人PAI-1蛋白包涵体复性的复性缓冲液，其特征在于，包括：10～50mM乙酸钠，100～500mM NaCl，1～10mM Triton X-100，1～10％甘油，0.5～1.5M葡萄糖，0.01％～0.05％Brij-35，且pH为5.0～5.8。
2.一种重组人PAI-1蛋白包涵体复性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S10：制备PAI-1蛋白的包涵体；
S20：采用变性缓冲液溶解所述包涵体，获得包含裂解蛋白的包涵体变性液；
S30：将所述包涵体变性液与如权利要求1所述的复性缓冲液混合后，对所述包涵体进行蛋白复性，获得复性后的PAI-1蛋白。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述S10包括以下步骤：
S11：获取PAI-1的CDS序列，对所述CDS序列进行密码子优化，优化后的序列如SEQ IDNO：1所示；
S12：构建表达载体：将优化后的PAI-1基因序列插入质粒，获得重组表达载体；
S13：将所述重组表达载体转化至所述大肠杆菌宿主细胞中，得到菌体细胞，诱导所述重组表达载体在所述大肠杆菌宿主细胞中表达；
S14：离心收集所述菌体细胞，用缓冲液悬浮所述菌体细胞，裂解所述大肠杆菌宿主细胞，离心后获得所述包涵体。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述变性缓冲液包括：6～8M尿素，10～50mM乙酸钠，100～500mM NaCl，1～2.5mM EDTA，1～10mM Triton X-100，1～10％甘油，1～25mM DTT，且pH为5.0～5.8。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述包涵体与所述变性缓冲液的质量体积比为1g：(10～15)mL。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述包涵体变性液与所述复性缓冲液的比例为1：(5～20)。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述包涵体变性液与所述复性缓冲液的比例为1：8。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述蛋白复性的条件为：温度2～8℃，时间为12～24h。
9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述复性后的PAI-1蛋白保存于保存液中，所述保存液包括：20mM乙酸钠，1.15M葡萄糖，0.02％Brij-35，0.1％NaN3。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310958007.3A CN116925208A (zh) | 2023-08-01 | 2023-08-01 | 重组人pai-1蛋白包涵体复性的复性缓冲液以及方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310958007.3A CN116925208A (zh) | 2023-08-01 | 2023-08-01 | 重组人pai-1蛋白包涵体复性的复性缓冲液以及方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116925208A true CN116925208A (zh) | 2023-10-24 |
Family
ID=88392303
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310958007.3A Pending CN116925208A (zh) | 2023-08-01 | 2023-08-01 | 重组人pai-1蛋白包涵体复性的复性缓冲液以及方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116925208A (zh) |
-
2023
- 2023-08-01 CN CN202310958007.3A patent/CN116925208A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Hart et al. | Large scale, in situ isolation of periplasmic IGF–I from E. coli | |
| EP3211077B1 (en) | Methods of purifying recombinant adamts13 and other proteins and compositions thereof | |
| JP2017209117A (ja) | コラーゲン７及び関連する方法 | |
| JPH0284186A (ja) | プラスミノーゲンアクチベーター蛋白質をコードするポリデオキシリボヌクレオチド、それを含むベクター及びそれを含む形質転換体 | |
| JPH06102034B2 (ja) | タンパク質の生産方法 | |
| JPH02142490A (ja) | 組換えタンパク質の精製と再生 | |
| EP0112849A1 (en) | PROCESS FOR THE PREPARATION OF CHYMOSINE. | |
| US20100144622A1 (en) | Methods for production of recombinant plasminogen and plasmin polypeptides | |
| JPS6277332A (ja) | 蛋白質の回収 | |
| JP4239412B2 (ja) | トランスグルタミナーゼの製造方法 | |
| Lin et al. | Enhanced protein renaturation by temperature‐responsive polymers | |
| FI98642C (fi) | Menetelmiä mikrobiologisesti tuotetun kymosiinin talteenottamiseksi | |
| JPS6342687A (ja) | 粗ｔＰＡの精製方法 | |
| CN116925208A (zh) | 重组人pai-1蛋白包涵体复性的复性缓冲液以及方法 | |
| US20130060007A1 (en) | Method of protein refolding with ion exchange resins and the application of the same | |
| Zhu et al. | In situ extraction of intracellular l-asparaginase using thermoseparating aqueous two-phase systems | |
| Kee et al. | Incorporation of electric fields to ionic liquids-based aqueous biphasic system for enhanced recovery of extracellular Kytococcus sedentarius TWHKC01 keratinase | |
| CN106636024A (zh) | 一种l‑天冬氨酸氧化酶包涵体纯化复性方法 | |
| OSMUNDSVAG et al. | Cellulases from Sporocytophaga myxococcoides: Purification and properties | |
| JP3550409B2 (ja) | ジクチオステリウムのジペプチジルアミノペプチダーゼ | |
| CN108424441B (zh) | 一种核糖核酸酶抑制剂包涵体的复性方法 | |
| CN101280001A (zh) | 人SDF-1α的制备及由此获得的人SDF-1α及其用途 | |
| CN104962570A (zh) | 一种高均一性单价链霉亲和素四聚体的制备方法 | |
| CN110437331B (zh) | 提高光滑鳖甲丝氨酸蛋白酶抑制剂包涵体蛋白复性方法 | |
| JP2000500023A (ja) | 正しく折畳まれた生物学的に活性の組換えタンパク質の製造方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |