JPH02142490A - 組換えタンパク質の精製と再生 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、高純度の組換えタンパク質を高い収量で入手
するための新規な方法に関する。本発明の方法は、組換
えタンパク質を精製する上でＨＰＬＣ（高速液体クロマ
トグラフィー）などの通常の生物学的手段を用いる必要
がないので、特に都合がよい。

組換えＤＮＡ技術の出現によって特定のタンパク質の微
生物による生産量を増大することができるようになり、
それに応じて所望のタンパク質の発現性が増大するよう
になった。しかしながら、このようなタンパク質は、普
通、顆粒状の不溶性形態で発現される。発現される組換
えタンパク質の顆粒形態は、高レベルの発現と緩徐な折
り畳み（ｆｏｌｄｉｎｇ）に関連するものと一般に考え
られており、これにより、折り畳まれていない、および
／または部分的に折り畳まれた、不溶性かつ生物学的に
不活性なタンパク質の集団が細胞内に形成される。この
ことは、ジスルフィド架橋を含むタンパク質（ジスルフ
ィドタンパク質）が細菌内で発現される場合には、細胞
溶解の後に、空気によって、誤って折り畳まれたタンパ
ク質が酸化され、次に適切でないジスルフィド結合およ
び分子内架橋がそれに導入されてしまうことになるので
、特に重大な問題である。

種々の微生物で発現される多くの組換えタンパク質は不
溶性顆粒として発現されるので、その顆粒から指定され
たタンパク質が単離、精製できることが望ましい。本発
明は、このような精製の問題に取り組んだものであり、
不溶性かつ生物学的に不活性な顆粒として最初は発現さ
れたものでさえ、高度に精製された生物学的に活性な組
換えタンパク質としてそれを高い収量で入手するための
新規な方法を開示するものである。さらに、本発明は、
回収したタンパク質の適切な折り畳みをも保証するもの
である。適切に折り畳まれたタンパク質を入手すること
は、タンパク質というものが天然の折り畳みの立体配座
をとるまでは生物学的に活性でないという事実から鑑み
、重要な事項である。適切な折り畳みに影響を与える因
子は多く、またこのような因子は種々異なるものであり
得るが、本発明は、１つの標準的な方法を使用して、広
範なタンパク質の適切な折り畳みを達成させる方法を提
供するものである。

本発明の方法は、タンパク質の亜硫酸分解（ｓｕｌｒ　
１ｔｏｌｙｓ　ｉｓ）、その後の加温工程において、得
られたタンパク質−８−スルホネートの温度を上昇させ
、それによりタンパク質−８−スルホネートを高純度で
析出させる工程からなる。得られた沈澱物は、出発物質
と比して約り５％純度である。このような高電荷のタン
パク質−８−スルホネートの沈澱は予想外のものだった
のであり、このような高純度の沈澱物が得られることで
、必要であったであろう多（の通常の生物学的または生
化学的精製手法が必要でなくなる。さらに、タンパク質
またはタンパク質−８−スルホネートを高濃度の変性剤
によって可溶化した後、還元し、次いで希釈または透析
によって濃度を減少させることによって、そのタンパク
質溶液は、高い収率で適切な折り畳みが起こるトランジ
ション］Ｊｊｔ（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｃｏｎｃｅｎｔ
ｒａｔ　１ｏｎ）を経る。従って、本発明を採用しなか
った場合では、約１％しか適切なタンパク質の折り畳み
が起こらないが、本発明の場合は約２０％程の還元タン
パク質が適切に再生（再度の折り畳み）される。

組換えタンパク質を精製、再生させるための一般の工業
的手段、例えば米国特許第４，４２１，６８５号は、Ｓ
−スルホン化タンパク質を使用することを包含している
が、本発明では、Ｓ−スルホン化タンパク質を沈澱物と
して入手する従来知られていない手法を利用するもので
あり、これにより高純度で回収可能となる。亜硫酸分解
工程が終了した後、得られた溶液を溶媒交換し、この溶
媒交換したタンパク質−８−スルホネートの溶液を温度
約１−６℃から約ＩＬ−２５℃にまで上昇させることに
よって沈澱物を入手する。このような高純度のタンパク
沈澱物が人手されることによって、以後の初期精製とし
て、例えばイオン交換クロマトグラフィーなどの通常の
方法を採用する必要が無くなる。

タンパク質が折り畳むことに関してどのように、または
どの段階で生物学的に活性な、正しい立体配置になるの
かが殆ど知られていない点で、本発明は特に意義がある
［クレイトン（ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、　Ｔ、　Ｅ。

）、プロテインズ（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、　ｖ、　Ｈ，
Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｏ、　。

ニューヨーク、　１９８４を参照］。従来、適切な折り
畳み条件は、主として経験に基づいて見いだされていた
のであり、それには再生する組換えタンパク質各々に応
じたテーラ−メイドの高価なプロトコールの開発が要求
される。本発明は、微生物で産生される実質的にあらゆ
る組換えタンパク質に適用可能な折り畳みプロトコール
を提供することによって、この問題を解決するものであ
る。従って、本発明は、高価なテーラ−メイドの精製お
よび再生のプロトコールを開発する必要がないので、価
格が抑えられる一方で、組換えタンパク質の生産効率を
増大させるものである。

本明細書において本発明を開示し、特許請求するため、
以下に用語の意味を定義する。

生物学的活性−目的とする生体内反応を起こす能力。

折り畳み一タンパク質が安定、および／または生物学的
に活性であり得る立体配置に復帰するための工程。

顆粒−適切に折り畳まれたタンパク質、部分的に折り畳
まれたタンパク質、および／または折り畳まれていない
タンパク質と、種々の量の細胞不純物との混合物を含有
するタンパク質の集合体。

組換えＤＮＡクローニングベクター−付加的なりＮＡを
付加し得るか、または既に付加されているＤＮＡ分子を
含有する、選択可能な、かつ自立的に複製可能な、また
は染色体に組込み可能な物質であって、プラスミドおよ
びファージがあるが、これらに限定されない。

宿主細胞−組換えタンパク質を発現するために既に形質
転換されているか、あるいは形質転換され得る細胞。

形質転換−生存プロトブラスト宿主細胞などの受容宿主
細胞にＤＮＡを導入し、受容細胞の遺伝子型を変化させ
ること。

発現ベクター−挿入された外来遺伝子が宿主微生物内で
発現するように設計された組換えＤＮＡクローニングベ
クター 本発明は、組換えタンパク質を精製するための新規な方
法であって、 ■）不溶性の、システィンを含む組換えタンパク質の顆
粒であって、細胞不純物をも内包する該顆粒を含有する
宿主細胞の細胞壁を破壊し、該顆粒を細胞残骸から単離
し、 ２）亜硫酸分解試薬を含有する変性剤中に該顆粒を可溶
化して亜硫酸分解された組換えタンパク質および上記細
胞不純物を含有する溶液を裂し、３）亜硫酸分解した組
換えタンパク質を含有する該溶液を溶媒変換し、溶媒変
換した該溶液の温度を約１℃から約６℃の範囲から約１
８℃から約２８℃の範囲にまで上昇させ、タンパク質−
Ｓ−スルホネートを沈澱させ、そして ４）タンパク沈澱物を得られた上清中の細胞不純物から
単離すること、 を特徴とする方法を提供するものである。

本発明はさらに、システィンを含む組換えタンパク質を
折り畳むための方法であって、さらなる工程として： ５）工程（４）の沈澱物を変性剤中で可溶化し、次いで
１元剤を添加して還元することによって還元タンパク質
の溶液を調製し、そして ６）工程（５）の溶液を折り畳みに適した条件下で希釈
すること、 を包含する方法をも提供するものである。

本発明の最良の例示は、組換えインターロイキン−２（
ＩＬ−２）の調製である。ＩＬ−２の調製は、適当な宿
主細胞を、通常の遺伝子工学的手法によってＩ　Ｌ−２
構造遺伝子を含有するベクターで形質転換することによ
って行われる。これらの常法には、所望のタンパク質を
コードしている遺伝子を入手すること、その遺伝子を適
当な発現ベクターの遺伝子発現を許容する場所に挿入す
ること、感応宿主細胞をそのベクターで形質転換するこ
と、得られた形質転換体を同定すること、および該形質
転換体を適当な増殖培地で培養することなどがある。こ
れらの通常の遺伝子工学的工程は当業界周知であり、詳
細は、マニアチス（ＭａｎｉａｔｉＳ）らのモレキュラ
ー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ）　（コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ
−）、１９８２に開示されている。

本発明は、組換えタンパク質、例えばＩ　Ｌ−２の調製
に特に有用である。Ｉ　Ｌ−２は、活性化Ｔ細胞の増殖
促進に関与するＴ−リンパ球のある種のサブセソ＋−か
ら産生される免疫変調因子（ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａ
ｔｏｒｙ　ｆａｃｔｏｒ）である。そのＩＬ−２遺伝子
のクローニング、および大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）におけ
るその高レベルの発現により、他の天然のリンホカイン
に汚染されていない大量の精製タンパク質を生産するこ
とができる。他の多くのタンパク質がそうであるように
、Ｉ　Ｌ−２も大腸菌内において顆粒形態で発現するこ
とが可能であり、従って本発明の目的にとって特に適し
たものである。

Ｉ　Ｌ−２の例示に当たって、発現は、Ｅ、ｃｏｌｉ　
Ｋ１２　ＲＶ３０８をプラスミドｐＩＬ２３６５で形質
転換することによって行った。プラスミドｐＩＬ２３６
５の構築に関しては、以下の実施例１から実施例１０ま
でに詳細に説明すると共に、制限部位地図を第１３図と
して添付する。

組換えタンパク質を高レベルで生産させることに共通し
ているように、大腸菌で発現されるＩＬ−２は不溶性顆
粒の形態をとっている。顆粒は目立っており、細胞に十
分に充満するので、光学顕微鏡によって観察することが
できる。細胞溶解後の顆粒は、濾過などの常法によって
単離することができる。次いで、得られた単離顆粒を４
−６Ｍ塩酸グアニジンに溶解し、亜硫酸分解する。■Ｌ
−２−３−スルホネートは５ＤＳ（ドデシル硫酸ナトリ
ウム）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはＨＰＬ
Ｃ，またはあらゆる同様の同定手段によって同定するこ
とができる。亜硫酸分解工程が終了した後、得られた溶
液を溶媒変換し、その温度を約１−４℃から約１８−２
８℃に上昇させることで、所望の生成物を柔毛性の沈澱
物として析出させる。

このような高電荷を有するＩ　Ｌ−２−３−スルホネー
トの沈澱が上記の条件下で入手されることは、予期され
なかったことであり、大規模な初期精製工程を要せずに
高純度のＩ　Ｌ−２生成物を得ることができる。組換え
タンパク質を精製する従来の方法は、クロマトグラフィ
ーなどの標準的な方法に依存していた。これらの工程は
時間がかかるばかりでなく、高価である。変性タンパク
質の純度が高い程に、再生反応がより良好にかつより効
率的となるので、変性タンパク質の精製は復元をも招来
させる。上記の沈澱工程は、ｐＨを調節し、エタノール
を添加すること、および当業者には周知の他の方法によ
って改変することができ、速度が速められる。

本発明以前では、個々のタンパク質の適切な折り畳み条
件は経験的に見いだされていた。いずれのタンパク質の
折り畳み反応であってもその目的は、反応速度を速める
ことによって、さらには犠牲となる収量が無く、より高
いタンパク質濃度をも使用することによって、タンパク
質を効率的に折り畳むことである。生体内（インビボ）
におけるｐＨ，イオン強度、およびイオン濃度のりボゾ
ーム（ここで、タンパク質は合成される）に対する条件
が確かに、インビトロにおける折り畳み反応を支配する
パラメーターを決定している。さらに、いずれのタンパ
ク質も、折り畳み状態および非折り畳み状態間に独自の
トランジションを受けるものと考えられる。本発明のタ
ンパク質−８−スルホネート沈澱物を高濃度の変性剤に
溶解し、還元した後、１０　１００ｍＭ　　ｌ−リスで
の希釈または透析１こよって濃度を薄めることによって
、得られたタンパク質溶液は、適切な折り畳みが高い収
率で起こるトランジション濃度を経ることになる。

従って、適切な折り畳みが感受的である多くのパラメー
ターにも拘わらず、本発明の方法は、実質的にあらゆる
タンパク質の適切な折り畳みを行わしめるのに使用する
ことができる。

本発明の目的に使用できる個々の組換えタンパク質は、
重要でなく、確立された遺伝子工学的手法によって調製
され得るものである。このような常法には、所望のタン
パク質をコードしている遺伝子を入手すること、その遺
伝子を適当な発現ベクターの遺伝子発現を許容する場所
に挿入すること、感応宿主細胞をそのベクターで形質転
換すること、正しい形質転換体を同定すること、および
該形質転換体を適当な増殖培地で培養することなどがあ
る。本発明で使用される生物学的手法および試薬の選択
は、第１義的に重要なものでなく、タンパク１−８−ス
ルホネートの高純度の沈澱、および何等かの方法によっ
て種々のタンパク質を適切に再生すること、が非常に重
要であり、本発明の１つの利点である。

当業者ならば、本発明で使用される多くの遺伝子工学手
法および試薬は既述したものに限定されるものでないこ
とは理解できるであろう。例えば、形質転換された細胞
は、通常の機械的方法、化学的方法または酵素的方法に
よって破裂させることができ、顆粒が遊離される。機械
的方法には、例えば、音波処理またはホモジネートがあ
る。化学的方法には、アルカリによる細胞溶解などがあ
り、酵素的方法には、リゾチームでの処理などがある。

個々の形質転換宿主から顆粒を遊離させる通常のいずれ
の方法をも使用することができる。細胞を破裂させれば
、遠心または濾過などの種々の常法によって顆粒を回収
し、細胞残骸を除去することができる。さらに、タンパ
ク質−８−スルホネートを形成させるために０．０５−
０．２５Ｍ亜硫酸ナトリウムと共に使用される具体的な
試薬としては、実施例１２で説明するような、］　−１
０ｍＭチオ硫酸ナトリウムおよび１　１０ｍＭ　システ
ィンに限定されるものでなく、さらに５−１０ｍＭ四チ
オン酸ナトリウム、または０．１　１ｍＭ硫酸銅などを
挙げることができる。当業者であれば、さらに池の試薬
を使用しても所望の結果を得ることができることは容易
に理解されるであろう。さらには、変性剤も４−６Ｍ塩
酸グアニジンに限られず、６−８Ｍ尿素も使用すること
ができる。変性剤は、再生、および同一タンパク質分子
のそれ自身との架橋または２つの別のタンパク質分子相
互の架橋を妨害する。変性剤においては、それが生物活
性の不可逆的な喪失および不可逆的な変性を招来してし
まう程に強力であるべきでないこと、が唯一の制限であ
る。

当業者ならば、可溶化タンパク質の同定は、５ＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動法などの電気場における
挙動の差異に基づく分子の分離、および標準的なりロフ
トグラフィー法によっても行えることは理解しているで
あろう。沈澱化の条件下における温度は、約１８−２８
℃の範囲であり、好ましくは２５℃である。さらに、沈
澱物の回収は、遠心分離のような高い重力による作用ば
かりでなく、濾過法によっても行えることは当業者なら
ば理解しているであろう。また、還元反応も、２−２０
ｍＭ　システィンの使用に限定されない。当業者ならば
、２０−１００倍過剰のジチオトレイトール、２０−１
００倍過剰のメルカプトエタノール、および２−２０ｍ
Ｍのグルタチオンをも使用できることは理解されるであ
ろう。以下の計算式によって、前で説明した過剰メルカ
プトエタノールおよびジチオトレイトールを計算するこ
とができるが、これは単なる説明を意図するものであっ
て、これに限定されるものでない：本）Ｓ−３ｏ、／モ
ル ＄１）２０倍過剰 本発明の方法は、タンパク質Ｓ−スルホネートの沈澱に
関連しているので、本方法は、システィンを含むタンパ
ク質に対してのみ使用することができる。システィンは
、極めて近接したシスティン分子間にジスルフィド架橋
が形成されることによってタンパク質の３次構造に寄与
するイオウ含有アミノ酸である。多（の周知のタンパク
質は、このようなジスルフィド架橋を形成しており、こ
れはタンパク質の形状および生物活性に関与している。

−例としては、システィン残基間のジスルフィド架橋に
よって連結された２つのポリペプチド鎖ＡおよびＢから
構成されるヒトインスリンが挙げられる。ヒト成長ホル
モン（ｈＧＨ）およびウシ成長ホルモン（ｂＧ　Ｈ）は
、システィンをともに含有する２つの異なるタンパク質
である。本発明はさらに、ヒトプロインスリン、ヒトイ
ンスリンＡ鎖、ヒトインスリンＢ鎖、ヒトインスリン様
増殖因子１（ＩＧＦＩ）、ヒトインスリン様増殖因子Ｉ
　Ｉ（ＩＧＦ　Ｉ　Ｉ）、ヒト組織プラスミノーゲンア
クチベーター、ヒトインターフェロン、曲孔類タンパク
質、ヒトタンパク質、ならびに研究および商品価値のあ
る他の各種タンパク質などの他の組換えタンパク質を精
製し、再生させるのに使用することができる。

本発明の目的に使用することができる組換えタンパク質
は、確立された遺伝子工学手法によって調製することが
できる。このような方法のいくつかは、マニアチスらの
モレキュラー・クローニング（コールド・スプリング・
ハーバ−・ラボラトリ−，１９８２）に記載されている
。本発明が組換え１．Ｌ−２顆粒の精製に限定されない
のと同様に、本発明で有用な宿主細胞は大腸菌（Ｅ、　
ｃｏｌｉ）に限定されない。例えば、本発明の目的とし
て、バシルス（Ｂａｃｉ　ｆｌｕｓ）、ストレプトマイ
セス（Ｓｔｒｅｐｔ。

ｍｙｃｅｓ）、酵母、および形質転換されてタン／ｆり
質を顆粒形態で発現できる多の微生物などの宿主を使用
することができる。

以下に実施例を挙げ、本発明を例示してさらに詳細に説
明するが、これらは本発明の範囲の限定を意図するもの
ではない。これらには、本発明の説明および実際の操作
法をも適宜挿入している。

実施例１−１０では、いくつかのプラスミド中間体を介
したプラスミドｐｌＬ２３６５の構築について、実施例
１１−１３では、不溶性Ｉ　Ｌ−２顆粒を適切に折り畳
まれたタンパク質に変換することについて説明する。実
施例中、制限酵素消化、ＤＮＡフラグメントの単離およ
び精製、ライゲート（連結）、ならびに形質転換などの
通常の組換えＤＮＡ操作にかかる反応条件、緩衝液、お
よびプロトコールは、特に明記しない限り、マニアチス
らのモレキュラー・クローニング（コールド・スプリン
グ・ハーバ−・ラボラトリ−，１９８２）に記載されて
いるように行う。プラスミドｐｌＬ２３６５は、大腸菌
における高いレベルのＩＬ−２の発現をコードしている
ので、例示タンパク質顆粒の出発物質を生成させるには
好ましいプラスミドである。プラスミドｐｌＬ２３６５
の構築を概略水したフロー図式を以下の第１表に示す。

瓜土嚢 プラスミドｐｌＬ２３６５の構築フロー図式％式％ プラスミドｐｌＬ２３６５お′よびＥ、ｃｏｌｉ　　Ｋ
　１実施例１ プラスミドｐＫＣ２８３の単離 Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２　　ＢＥ１２０１／ｐＫＣ２８３
の凍結乾燥品は、受託番号ＮＲＲＬ　　Ｂ−１５８３０
の下に７−ザン・リージオナル・リサーチ・ラボラトリ
−［Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｒｅｇｉｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅａ
ｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ペオリア、イリノイス
６１６０４］から入手できる。この凍結乾燥品を、ＬＢ
培地（１リツトル中、バクトートリプトン１０ｇ、バク
トー酵母エキス５ｇ、およびＮａＣｌ２１０ｇ、ｐＨ７
，５に調節）１０Ｈσを加えた試験管中にデカントし、
３２℃で２時間インキュベートし、この間、培養物のア
ンピシリン濃度を５０μｇ／ｘ（ｌに調節シ、次いで３
２℃で一晩インキニベートする。Ｅ、ｃｏｌｉＫ１２　
　ＢＥ１２０１／ｐＫＣ２８３細胞は細胞ＤＮＡに組み
込まれた温度感受性ＣＩ抑制遺伝子（リプレッサー）を
含有しているので、その培養は３２℃で行う。本明細書
において以下の実施例で説明するように、λｐＬプロモ
ーターを含有しないか、または野生型λｐｔ、抑制遺伝
子を含有する細胞をこのプラスミドの単離操作に使用し
た場合、インキュベート温度は３７℃に調節する。

Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２　　ＢＥ１２’０１／ｐＫＣ２８
３の単一のコロニー単離体が入手されるように、得られ
た一晩培養物の少量を、５０μｇ／ｘＱアンピシリンを
含むＬＢ−寒天（１５ｇ／（Ｉハクトー寒天を加えたＬ
Ｂ培地）平板に置く。得られた単一のコロニーを、５０
μｇ／１ｘ（ｌアンピシリンを含有するＬＢ培地１０ｘ
１２に接種し、激しく振盪させながら３２℃で一晩イン
キユベートした。この−晩培養物１０肩ａを、５０μｇ
／ｍＱアンピシリンを含有するＬＢ培地５００酎に接種
し、激しく振盪させながら３２℃でインキュベートし、
培養の定常期に到達させた。

４℃における１０分間の４０００ｇ遠心によって、細胞
を採取し、上清を捨てた。得られた細胞ペレットを水冷
ＳＴＥ緩衝液（０，１Ｍ　ＮａＣＱ。

１０ｍＭ１−リス−ＨＣｌ２ｐＨ７，８、および１ｍＭ
ＥＤＴＡ）１００Ｆ１ｇで洗浄した。洗浄後、この細胞
ベレットを、５１１ｇ／ＭＩ２　リゾチームを含有する
溶液１（５，０ｍＭ　グルコース、２５ｍＭ　　トリス
−ＨＣ（ｌ　ｐＨ８，ｏ、およびｌｏｍＭ　ＥＤＴＡ）
１０ｉ（！に再：ひ濁し、室温で１０分間放置した。

次いで、溶液２　（０，２Ｎ　ＮａＯＨおよび１％ＳＤ
Ｓ）２Ｍをこのリゾチーム処理細胞に加え、得られた溶
液を反転させて穏やかに混合した。この混合物を氷上で
１０分間インキュベートした。

水冷５Ｍ酢酸カリウム（ｐＨ４，８）１５酎を細胞溶解
した細胞混合物に加え、得られた溶液を反転させて混合
した。この溶液を水上で１０分間インキュベートした。

氷酢酸１１．ＦＭ！を水２８．５ｚ（ｌおよび５Ｍ酢酸
カリウム６０ＲＱに加えて５Ｍ酢酸カリウム溶液を調製
した（得られた溶液は、カリウムに関して３Ｍであり、
また酢酸に関して５Ｍである）。

細胞溶解した細胞混合物を４℃で２０分間２０゜０００
　ｒｐｍで遠心したしベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）　
Ｓ　Ｗ２７（またはそれと同等の装置）コ。細胞ＤＮＡ
および残骸によって、試験管の底にペレットが形成され
た。上清約３６Ｊ１１２を回収し、イソプロパツール０
．６容量を加え、混合し、そして得られた溶液を室温に
１５分間放置した。プラスミドＤＮＡを遠心（室温、１
２，０ＯＯ９，３０分間）によって採取した。上清を捨
て、室温において、得られたＤＮＡペレットを７０％エ
タノールで洗浄した。エタノール洗液をデカントし、ペ
レットを減圧乾燥器で乾燥させた。次いで、そのペレッ
トをＴＥ緩衝液（１０＋＋＋Ｍトリス−ＨＣｌ２ｐＨ８
，０、および１ｍＭ　ＥＤＴＡ）８ｍＱに再懸濁した。

Ｃ５（Ｊ！８ｇをそのＤＮＡ溶液に加えた。臭化エチジ
ウムの１０Ｍｇ／Ｒ１２水溶液約０．８＊（！を各々１
０ＭＱのＣｓＣ１２−ＤＮＡ溶液に加えた。溶液の最終
密度は約１．５５ｇ／抑であり、臭化エチジウムの濃度
は約６００μｇ／ｍＱであった。この溶液をベックマン
５０型遠心管に移し、パラフィン油で上端まで満たし、
栓をし、遠心した（２０℃１４５，ＯＯＯｒｐｍ、２４
時間）。遠心した後に、２つのＤＮＡバンドが普通光で
認められた（肉眼）。

その管から栓を取り除き、＃２１注射針を付けた注射器
を遠心管の側面に挿入することによって、下部のＤＮＡ
バンドを取り出した。

水飽和１−ブタノールで数回抽出して臭化エチジウムを
除去した。ＴＥ緩衝液に対して透析することでＣ５ＣＱ
を除去した。緩衝化フェ／−ル、次ぎにクロロホルムで
抽出した後、ＤＮＡを沈澱させ、７０％エタノールで洗
浄し、乾燥した。プラスミドｐＫＣ２８３約ＩＪ！ｇを
入手し、ＴＥ緩衝液中に濃度的ｌμｇ／μσで保存した
（４℃）。

プラスミドｐＫＣ２８３の制限部位および機能地図を添
付の第１図に示す。

実施例２ プラスミドｐＫＣ２８３ＰＸの構築 実施例１で調製したプラスミドｐＫＣ２８３ＤＮＡ約１
０μＱをｉ０Ｘ培地−塩制限緩衝液（５００ｍＭ　Ｎａ
Ｃ（１，１００ｍＭ　　トリス−ＨＣｌ２ｐＨ７，５，
１００ｍＭ　ＭｇＣｌ２ｔ−および１０＋ｎＭＤＴＴ）
２０ｕＱ、１ｍｇ／ｘ（２Ｂ５Ａ２０μ＋２、制限酵素
ＰｖｕＩｌ（〜５０単位、ベセスダ・リサーチ・ラボラ
トリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。

ＢＲＬ）が規定、本明細書で使用している制限酵素はす
べてここから入手した）５μＣ１および水１４５μＱと
混合し、得られた反応物を３７℃で２時間インキュベー
トした。本明細書で記載している制限酵素反応は、フェ
ノール、次いでクロロホルム抽出することによって常法
どおりに停止させ、次いで得られたＤＮＡ沈澱物をエタ
ノール洗浄し、ＴＥ緩衝液に再懸濁した。既述のように
ＰｖｕｌＩ消化反応を停止させた後、ＰｖｕＩＩ消化プ
ラスミドｐＫＣ２８３ＤＮＡを沈澱させ、次いでＴＥ緩
衝液５μＣに再懸濁した。

５×キナーゼ緩衝？ＩＬ（３００ｍＭ　　トリフ、、−
ＨＣＱ　ｐＨ７，８，５０ｍＭ　ＭｇＣＱ、、および２
５ｍＭＤＴＴ）　１０１１Ｑ、　５ｍＭ　ＡＴＰ５μ１
２．水２４μｍ２．Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（約
２．５単位、Ｐ−Ｌバイオケミカルズ（Ｐ−Ｌ　Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｃａｌｓ））　０゜５１１Ｑ、　１ｍｇ／ｘ
１２Ｂ　Ｓ　Ａ　５　ａＱ、および１０ｍＭスペルミジ
ン５μＱの混合物中、ＸｈｏＩリンカー：ＧＧＡＧＣＴ
ＣＣ 約６００ピコモル（ｐＭ）の混合物を３７℃で３０分間
インキュベートすることによって、そのリンカ−をキナ
ーゼ処理した。

キナーゼ処理したＸｈｏｌリンカ−約１２．５μＱをＰ
ｖｕＵ消化プラスミドｐＫＣ２８３ＤＮＡ５μＱに加え
、次いでそのＤＮＡに、１０×リガーゼ緩衝液（３００
ｍＭトリス−ＨＣＩ２　ｐＨ７，６，１００ｍＭ　Ｍｇ
ＣＱ＝、および５０ｍＭ　ＤＴＴ）２゜５μｆｆ、１　
ｘｇ／ｘ（ｌ　Ｂ　Ｓ　Ａ　２．５１１（１，５ｔｇ／
ｍ（ＩＡＴＰ７μＩＪ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（約２．５
単位、Ｐ−、Ｌバイオケミカルズで規定）２．５μｆ２
，１０ｍＭスペルミジン２．５μＱ、および水３μρを
加えた。得られたライゲート反応物を４℃で一晩インキ
ユベートした。このライゲート反応の後、得られた反応
混合物を調節して高塩緩衝液（０，１ＭＮａＣｌ２．０
．０５Ｍ　　トリス−ＨＣＱ　ｐＨ７，５、ｌ　Ｑ、Ｑ
ｍＭ　ＭｇＣＱｔ、および１ｍＭＤＴＴ）の組成を有す
るようにした。制限酵素Ｘｈｏｌ約１０μＱ（ｔｏｏ単
位）をこのｌ昆合物に加え、得られた反応物を３７℃で
２時間インキュベートした。

この反応を停止させ、Ｘｈｏｌリンカ−をライゲート混
合物に加えないことを除いては既述のようにしてＸｈｏ
ｌ消化ＤＮＡを沈澱させ、再懸濁し、連結させた。この
連結ＤＮＡは、所望のプラスミドｐＫＣ２８３ＰＸを構
成していた。添付の第２図に、プラスミドｐＫＣ２８３
ＰＸの制限部位および機能地図を示す。

実施例３ Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ　１２　ＭＯ（λ”）／ｐＫＣ２８３
ＰＸの接菌 Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ　１２　ＭＯ（λ°）は、受託番号Ｎ
ＲＲＬＢ、−１５９９３の下に、凍結乾燥体としてノー
ザン・リージオナル・リサーチ・ラボラトリ−から入手
可能である。Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ　１２　ＭＯ（λ°）は
、野生型λｐＬｃＩリプレッサー遺伝子を含有している
ので、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ　１２　ＭＯ（λ゛）細胞では
バイブリドｐＬ−１ｐｐプロモーター由来の転写は起こ
らない。インキュベート温度を３７６Ｃにし、増殖培地
にアンピシリンを加えない以外は実施例１に記載した操
作法に実質的にしたがって、この凍結乾燥品を再構成し
、ＭＯ（λ°）の単一コロニーを単離し、ＭＯ（λ°）
細胞の一晩培養物１０スＱを調製した。

この−晩培養物５０μＱを、これもｌＱｍＭＭｇ　Ｓ　
Ｏａおよび１０　ｍＭ　ＭｇＧ　（１，を含有するＬＢ
培地５Ｗ（ｌに接種した。この培養物を激しく振盪させ
ながら３７℃で１６時間インキュベートした。

次いで、得られた培養物を、１０ｍＭ　ＭｇＳＯ４およ
び１０　ｍＭ　ＭｇＣＱ＊を含有するＬＢ培地で２００
ｄまで希釈した。この希釈した培養物を激しく振盪させ
ながら、細胞密度約ｌ×１０１１細胞／肩Ｑを示す５５
０ｎｍ吸光度（Ａ５ｓｏ）が約０，５になるまでインキ
ュベートした。得られた培養物を氷水浴中で１０分間冷
却し、次いで遠心（４０００９，４℃１１０分間）によ
って細胞を採取した。

得られた細胞ペレットを冷１０ｍＭ　ＭｇＳＯ４１００
村に再懸濁し、次いで遠心によって素早く再ペレット化
した。この細胞ペレットを３０ｍＭＣａｃＱｖ　１００
ＭＱに再懸濁し、水上で２０分間インキュベートした。

遠心によって細胞を再び採取し、３ＱｍＭＣａＣム１０
３！１２に再懸濁した。この細胞標本１．５スＱを、実
施例２で調製した連結ＤＮＡに加えた［このＤＮＡは、
ＣａＣＱＲ中、３Ｃ）＋Ｍに調製しておいたコ。得られ
た細胞−ＤＮＡ混合物を水上で１時間インキュベートし
、４２℃で９０秒間、熱ショックを与えた後、水上で約
２分間冷却した。得られた細胞−ＤＮＡ混合物を１２５
ｍ＋２フラスコ中ＬＢ培地ｌＯｍＱ中で希釈し、３７℃
で１時間インキュベートした。ｌＯＯμａ部分量を、ア
ンピシリンを含有するＬＢ−培地にプレートし、コロニ
ーが現れるまで３７℃でインキュベートした。

得られたコロニーを個々に培養し、その個々のコロニー
のプラスミドＤＮＡを制限酵素分析およびゲル電気泳動
法によって調査した。所望のＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ　１２　
ＭＯ（λ”）／ｐＫＣ２８３ＰＸ形質転換体が同定され
るまではＣ８Ｃρ勾配工程を行わず、それ以外は実施例
１の操作法に従って小規模にプラスミドＤＮＡを単離し
た。プラスミドｐＫｃ２８３ＰＸの制限部位および機能
地図を添付の第２図に示す。

実施例４ Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ　ｌ　２　ＭＯ（λ’）／ｐＫＣ２８
３−Ｌの微筆 実施例１の操作法に従って調製したプラスミドｐＫＣ２
８３ＰＸ　ＤＮＡリンカｇをｌＯＸ高塩高面緩衝液２０
ｕρＪ１ｇ／ｍ（ｌ　Ｂ５Ａ２０．ｉｎ、制限酵素Ｂｇ
１■５μＱ（〜５０単位）、制限酵素Ｘｈｏ＋５μＱ（
〜５０単位）、および水１５０μρに溶解し、得られた
反応物を３７℃で２時間インキュベートシた。この反応
を停止させ、ＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩ消化ＤＮＡを沈澱さ
せた後、このＤＮＡをＴＥ緩衝液５μｅに再懸濁した。

ＢｇｌＩＩおよびＸｈｏｒ制限酵素開裂が特徴である１
本鎖ＤＮＡ末端を有するＤＮＡを合成し、キナーゼ処理
した。このリンカ−のキナーゼ処理は、実施例２の操作
法に実質的に従った。このＤＮＡリンカ−は以下の構造
を有していた： このリンカ−は、当業界周知の方法によって１本鎖デオ
キシオリゴヌクレオチドから合成した。その１本鎖デオ
キシオリゴヌクレオチドは、アプライド・バイオシステ
ムズ［（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｃ
Ａ　９４４０４、フォスター・シティ−、リンカーン・
セントラ・ドライブ８５０番］から売り出されている、
ホスホルアミダイト化学を利用する３８０ＡＤ　Ｎ　Ａ
　　シンセサイザーなどの市販の装置から合成すること
ができる。ＤＮＡを合成する方法は他にも当業界周知で
ある。１本鎖ＤＮＡを合成するための通常の改変ホスホ
トリエステル法は、イタクラ（Ｉｔａｋｕｒａ）らのサ
イエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）１９１３：１０５６（１９
７７）、およびフレア（ｃｒｅａ）らのプロシーディン
グ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オプ・サイエンス
Ｕ　Ｓ　Ａ　（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、＾ｃａｄ、　Ｓｃ
ｉ、　ＵＳＡ）７５：５７６５（１９７８）に記載され
ている。さらに、特に好ましいＤＮＡ合成法は、シング
（Ｈｓｉｕｎｇ）らのヌクレイツク・アシッド・リサー
チ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）１
１：３２２７（１９８３）、およびナラング（Ｎａｒａ
ｎｇ）らのメソノズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍ。

１ｏｇｙ）６８：９０（１９８０）に開示されている。

上記リンカ−とＢｇｌＩ［−Ｘｈｏｌ消化プラスミドｐ
ＫＣ２８３ＰＸとを実施例２の操作法に実質的に従って
連結した。得られた連結ＤＮＡは所望のプラスミドｐＫ
Ｃ２８３−Ｌを構成していた。プラスミドｐＫＣ２８３
−Ｌの制限部位および機能地図を添付の第３図に示す。

このプラスミドｐＫＣ２８３−Ｌ　ＤＮＡを使用してＥ
、ｃｏｌｉ　Ｋ　１２Ｍ０（λ°）を形質転換し、得ら
れたＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ　１２Ｍ０（λ゛）形質転換体を
実施例３の操作法に実質的に従って同定した。

の構築 実施例１の操作法に実質的に従って調製したプラスミド
ｐＫＣ２８３−Ｌ　　ＤＮＡ約１０８ｇを、１０Ｘ高塩
緩衝液２０ａ（１，１Ｍｇ／ＪＢＳＡ２０μＱ、制限酵
素Ｘｈｏｌ　　５μＱ（〜５０５０℃、および水１５５
μＱに溶解し、得られた反応物を３７℃で２時間インキ
ュベートした。次いで、この反応混合物に９５％エタノ
ール３容量および３Ｍ酢酸ナトリウム１／１０容量を添
加してＸｈｏｌ消化ＤＮＡを沈澱させ、ドライアイス−
エタノール浴中で５分間インキュベートし、遠心した。

得られたＤＮＡペレットを７０％エタノールで洗浄し、
乾燥し、ｌＯ×ニック−トランスレーション緩衝液（０
，５Ｍ　　トリス−ＨＣＱ　ｐＨ７，２，０９１ＭＭｇ
５ｏ、、および１＋＋Ｍ　ＤＴＴ）２μ（１，デオキシ
ヌクレオチド三リン酸の各２ｍＭ溶液ｌμＱ１水１５ｕ
（１，Ｅ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼ■の大きなフ
ラグメントであるクレノー１μｍ２　（Ｐ−Ｌバイオケ
ミカルズで規定された〜６単位）、および１ｕｇ／ｚＱ
　ＢＳＡ　ｌμＱ中に懸濁した。得られた反応物を２５
℃で３０分間インキュベートし、次いでその溶液を７０
℃で５分間インキュベートすることで反応を停止させた
。

実施例２に記載の操作法に実質的に従って、ＢａｍＨＩ
リンカ−をキナーゼ処理し、ＸｈｏＩ消化クレノり処理
プラスミドｐＫＣ２８３−Ｌ　　ＤＮＡと連結させた。

このライゲート反応の後、高面緩衝液中、３７℃で２時
間、得られたＤＮＡをＢａｍＨＩ約ｌＯＯ単位で消化さ
せた。ＢａｍＨＩ消化の後、実施例２の操作法における
ライゲート反応を行うためのＤＮＡを調製した。

実施例２および３に記載の操作法に実質的に従って、〜
５．９　ｋｂ　ＢａｍＨＩ　制限フラグメントを連結さ
せて環状化し、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ　１２　ＭＯ（λ゛）
に形質転換した。Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ　１２　ＭＯ（λ’
）／　ｐ　Ｋ　Ｃ２８３−ＬＢ形質転換体を同定し、次
いでプラスミドｐＫＣ２８３−ＬＢ　　ＤＮＡを実施例
１の操作法に実質的に従って調製した。プラスミドｐＫ
Ｃ２８３−ＬＢの制限部位および機能地図を添付の第４
図に示す。

実施例６ Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ　１２　ＭＯ（λ’）／ｐＬ３２の構
築使用する出発プラスミド、制限酵素およびリンカ−以
外は、実施例５の操作法に実質的に従って、プラスミド
ｐＫＣ２８３ＰＸ約１０μｇを高面緩衝液中で制限酵素
５ａｉｌで消化し、クレノーで処理し、ＥｃｏＲＩ　　
リンカー： と連結させた。制限酵素ＥｃｏＲＩで消化して〜２゜１
ｋｂＤＮＡを切除した後、連結によって〜４．Ｏｋｂ　
ＥｃｏＲＴ制限フラグメントを環状化し、プラスミドｐ
ＫＣ２８３ＰＲ８を得た。実施例３の操作法に従い、こ
の連結ＤＮＡでＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ　Ｉ　２Ｍ０（λ゛）
を形質転換した。実施例１の操作法に従って、Ｅ、ｃｏ
ｌｉ　Ｋ　１２　ＭＯ（λ’）／ｐＫＣ２８３ＰＲ３形
質転換体を同定した後、プラスミドｐＫＣ２８３ＰＲＳ
　　ＤＮＡを調製した。プラスミドｐＫＣ２８３ＰＲ３
の制限部位および機能地図を添付の第５図に示す。

プラスミドｐＫＣ２８３ＰＲ３約１０μｇを、各々約５
０単位のＰｓｔｒおよびｓ　ｐｈ　Ｉを含む高面緩衝液
２００μρ中で消化した。この反応物を３７℃で約２時
間インキュベートした後、得られた反応混合物を０．６
％低ゲル化温度アガロース（ＦＭＣコーポレーション、
マリン・コロイズ・デイビジョン、ロックビレ、メイン
０４８４１）ゲルの電気泳動にかけた［トリス−アセテ
ート緩衝液中、〜１３０Ｖ、〜７５ＩＩＩＡ、２−３時
間］。

得られたゲルを臭化エチジウムの希釈溶液中で染色し、
長波長ＵＶ光で視覚化される、〜０．８５ｋｂ　Ｐｓｔ
ｌ−３ｐｈｌ制限フラグメントを構成するＤＮＡバンド
を小さいセグメントとしてゲルから切除した。このセグ
メントの容量を重量および密度から算定し、これと同容
量のｌ　ＯｎＭトＩＪス−ＨＣＱ　ｐＨ７，６を、セグ
メントを入れた試験管中に加えた。次いで、このセグメ
ントを７２℃でインキュベートして融解した。プラスミ
ドｐＫＣ２８３ＰＲ３の〜０．８５ｋｂ　Ｐｓｔ　［−
３ｐｈｒ制限フラグメント約１μｇを約ｌＯＯμＱ容量
として得た。同様にしてプラスミドｐＫＣ２８３−ＬＢ
を制限酵素ＰｓｔｌおよびＳ　ｐｈ　Ｉで消化し、ライ
ゲート反応用に、〜３．Ｏｋｂ制限フラグメントをアガ
ロースゲル電気泳動によって単離調製した。

実施例２の操作法に従って、プラスミドｐＫＣ２８３Ｐ
Ｒ３の〜０．８５ｋｂ　ＰｓｔＩ−３ｐｈｌ制限フラグ
メントをプラスミドｐＫＣ２８３−ＬＢの〜３．Ｏｋｂ
　Ｐｓｔｌ−Ｓｐｈｌ制限フラグメントと連結させた。

得られた連結ＤＮＡは所望のプラスミドｐＬ３２を構成
していた。プラスミドｐＬ３２の制限部位および機能地
図を添付の第６図に示す。

実施例３の操作法に従って、プラスミドｐＬ３２をＥ、
ｃｏｌｉ　Ｋ　１２　ＭＯ（λ°）細胞に形質転換した
。

実施例１の操作法に従って、このＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ　１
２Ｍ０（λ’）／ｐＬ３２形質転換体からプラスミド１
）Ｌ３２ＤＮＡを調製した。プラスミドｐＬ３２ＤＮＡ
を分析することによって、１つよりも多い数のＥｃｏＲ
Ｉリンカ−がプラスミドｐＫＣ２８３ＰＸのクレノー処
理５ａｌｌ末端に結合していることが判明した。Ｅｃｏ
ＲＩリンカ−が１つよりも多く存在しても、プラスミド
ｐＬ３２またはその誘導体の有用性が損なわれることは
なく、これは、２つのＥｃｏＲ＋リンカ−を共に連結し
た場合には必ず生成されるＸｈｏｌ制限部位の存在性に
よって検出することができる。あるいは、プラスミドｐ
Ｌ３２は、プラスミドｐＫＣ２８３−ｔ、Ｂに関する本
実施例の最初の段落に記載した５ａｉｌ　−Ｅｃ。

Ｒ１切除、および連結反応を行うことによっても構築す
ることができる。

実施例７ Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ　１２　ＭＯ（λ’）／ｐＬ４２の構
築Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ　１２　　ＲＶ３０８／ｐＮＭ７８
９は、ノーザン・リージオナル・リサーチ・ラボラトリ
−から受託番号ＮＲＲＬ　　Ｂ−１８２１６の下に凍結
乾燥品として入手可能である。ｐＮＭ７８９の制限部位
および機能地図を添付の第７図に示す。

インキュベート’（７４度を３７℃にする以外は、実施
例１の教示に実質的に従い、この培養物からプラスミド
ＤＮＡを抽出する。ｐＮＭ７８９の１０μｇをＰｖｕｎ
緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣＱ　ｐＨ７，５，５Ｑｎ
＋ＭＮａＣｇ、および６　ｍＭ　ＭｇＣＱｆｉ）２００
μａ中に懸濁する。ＰｖｕＩ［１単位を加え、得られた
反応ミックスを３７℃で５分間インキュベートする。こ
の酵素を、６５℃で１０分間加熱することによって失活
させる。次ぎに、ＩＯＸＢａｍＨＩ緩衝）夜（２００ｍ
Ｍ　　トリス−ＨＣｇｐＨ８０、ＩＭ　Ｎａ（Ｊ！およ
び７０ｍＭ　ＭｇＣＱｌ）　３０μｇ、水７０μＣ１お
よびＢａｍＨ１１０単位を加え、得られた反応物を３７
℃で１時間インキュベートする。その後、アルカリホス
ファターゼ５単位を加え、６５℃で１時間インキュベー
トする。得られたＤＮＡフラグメント群を１％アガロー
スケル上で分離し、ＤＮＡフラグメント（第８図）１カ
所切断の大きさのフラグメントを精製する。

平滑末端とＢａｍＨＩ末端を有するＤ　Ｎ　Ａ　’Ｊン
カーを実施例４の教示に従って合成する。このリンカ−
（第８図の１１８に示す）は以下の構造を有する： ＧＡＣＡＣＧＧＡＡＧＡＴＣＣＴＡＧ−５’実施例２の
教示に従い、このリンカ−をキナーゼ処理し、ＢａｍＨ
Ｉ　−Ｐｖｕｌｌ消化プラスミドｐＮＭ７８９に連結す
る。このライゲート混合物をＥ、Ｃｏ１１　Ｋ１２　Ｒ
Ｖ３０８細胞に形質転換し、実施例３の教示に実質的に
従って、得られた形質転換体からプラスミドを単離する
。適当な大きさのＰｖｕＩＩフラグメント（４９４ｂｐ
）およびＸｂａｌ　−ＢａｎＨｌフラグメント（６２８
ｂｐ）を含有する幾つかのプラスミドを選択する。これ
らの内生なくとも２つの配列を、Ｂａ＋ｍＨ１部位から
唯一のＳ　ｍａ　１部位まで配列決定し、所望の配列に
ついて１つのクローンを選択する。この中間プラスミド
をプラスミド１２０と命名する。この操作法の概略、お
よびプラスミド１２０の制限部位および機能地図を添付
の第８図に示す。

次いで、プラスミド１２０約１０μｇを、制限酵素Ｘｂ
ａＴおよびＢａｍＨ［をそれぞれ５０単位含有する高面
緩衝液２００μρ中で消化した。この消化生成物をアガ
ロースゲル電気泳動法によって分離し、〜０．６ｋｂ　
Ｘｂａｌ　−ＢａｍＨＩ制限フラグメントを単離し、実
施例６に記載の操作法によってライゲート用に調製した
。

プラスミドｐＬ３２も制限酵素ＸｂａｌおよびＢａｍＨ
Ｉで消化し、〜３．９ｋｂ制限フラグメントを単離して
ライゲート用に調製した。プラスミドｐＬ３２の〜３．
９ｋｂ　Ｘｂａｒ　−ＢａｍＨＩ制限フラグメントを実
施例２の操作法に実質的に従ってプラスミド１２０の〜
０．６ｋｂ　ＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ制限フラグメントに
連結させ、プラスミドｐＬ４７を調製した。プラスミド
ｐＬ４７の制限部位および機能地図を添付の第９図に示
す。実施例３に記載の操作法に従って、プラスミドｐＬ
４７をＥ、ｃｏｌｉＫ１２Ｍｏ（λ°）に形質転換し、
Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ　１２　ＭＯ（λ”）／ｐＬ４７形質
転換体を同定した。

実施例１の操作法に従って、得られた形質転換体からプ
ラスミドｐＬ４７ＤＮＡを調製した。

実施例８ Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２　　ＲＶ３０８／ｐＰＲ１２ＡＲ
１の構築 プラスミドｐＰＲ１２は、温度感受性ｐ　Ｌ　ｌ）ブレ
ッサー遺伝子ｃ１８５７およびプラスミドｐＢＲ３２２
テトラサイクリン耐性付与遺伝子を含有している。プラ
スミドｐＰＲ１２は米国特許＃４゜４３６．８１５（１
９８４年３月１３日発行）に記載され、特許請求されて
いる。プラスミドｐＰＲ１２の制限部位および機能地図
を添付の第１０図に示す。

プラスミドｐＰＲ１２約ＩＯμｇを、高面緩衝液２００
μ（！中、制限酵素ＥｃｏＲＩ約５０単位で消化した（
３７℃、２時間）。得られたＥｃｏＲＩ消化プラスミド
ｐＰＲ１２ＤＮＡを沈澱させ、実施例５に記載の操作法
に従ってクレノーで処理した。このクレノー反応の後、
ＥｃｏＲ■消化したクレノー処理プラスミドｐＰ　Ｒ１
２Ｄ　Ｎ　Ａを実施例２に記載のライゲート反応によっ
て再度環状化した。選択をアンピシリン耐性でなく、テ
トラサイクリン（５μｇ／ｊ１１２）耐性で行う以外は
、実施例３に記載の操作法に従い、所望のプラスミドｐ
ＰＲ１２△Ｒ１を構成した、得られた連結ＤＮＡを、Ｅ
、ｃｏｌｉ　Ｋ　１２　ＲＶ３０８に形質転換した。Ｅ
。

ｃｏｌｉ　Ｋ　１２　ＲＶ３０８は受託番号ＮＲＲＬ　
　Ｂ−１５６２４の下にＮＲＲＬから人手可能である。

Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２　　ＲＶ３０８／ｐＰＲ１２ΔＲ
１形質転換体を同定した後、実施例１の操作法に実質的
に従い、得られた形質転換体からプラスミドｐＰＲ１２
△ＲＩＤＮＡを調製した。

プラスミドｐＰＲ１２△Ｒ１約ＩＯμｇを、培地−塩緩
衝液２００μＱ中、制限酵素ＡｖａＩ約５０単位で消化
した（３７℃，２時間）。実施例５の操作法に実質的に
従って、このＡｖａｌ消化プラスミドｐＰＲ１２△Ｒ１
を沈澱させ、クレノーで処理した。このクレノー反応の
後、Ａｖａ！−消化クレノー処理プラスミドｐＰＲ１２
△ＲＩＤＮＡを、実施例２の操作法に実質的に従って、
リンカと連結させた。このリンカ一連結反応の後、得ら
れたＤＮＡを沈澱させ、次いで制限酵素ＥｃｏＲＩ約５
０単位を含有する高面緩衝成約２００μＱに再懸濁した
。得られた反応物を３７℃で約２時間インキュベートし
た。このＥｃｏＲＩ消化の後、実施例６の操作法に従っ
て、得られた反応混合物をアガロースゲル上に置き、〜
５．　ｌｋｂ　ＥｃｏＲＩ制限フラグメントを精製した
。実施例２の操作法に従って、ライゲート反応により、
得られた〜５゜１ｋｂＥｃｏＲＩ制限フラグメントを環
状化した。

この連結ＤＮＡは所望のプラスミドｐＰＲ１２ＡＲ１を
構成していた。選択をアンピシリン耐性でなく、テトラ
サイクリン耐性で行う以外は、実施例３に記載の操作法
に従い、プラスミドｐＰＲ１２ＡＲ］　　ＤＮＡをＥ、
ｃｏｌｉ　Ｋ１２　ＲＶ３０８に形質転換した。得られ
たＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２　　ＲＶ３０８／ｐＰＲ１２Ａ
Ｒｌ形質転換体を同定した後、実施例１の操作法に実質
的に従い、プラスミドｐＰＲ１２ＡＲＩ　　ＤＮＡを調
製した。

プラスミドｐＰＲ１２ＡＲ１の制限部位および機能地図
を添付の第１１図に示す。

実施例９ Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ　１２　ＲＶ３０８／ｐＬ　１１０の
構築プラスミドｐＰＲ１２ＡＲｌＤＮＡ約１０μｇを、
制限酵素ＰｓｔｌおよびＥｃｏＲＩをそれぞれ約５０単
位含有する高面緩衝成約２００村中に懸濁し、この消化
反応物を３７℃で約２時間インキュベートした。次いで
、この反応混合物をアガロースゲル上に重層し、実施例
６の操作法に実質的に従って、プラスミドｐＰＲ１２Ａ
Ｒ１の〜２．９ｋｂ　Ｐｓｔｌ　−ＥｃｏＲＩ制限フラ
グメントをライゲート反応用に単離し、調製した。

プラスミドｐＬ４７約１０μｇを、高面緩衝液２００μ
１２中、３７℃１２時間、制限酵素ＰｓｔｌおよびＢａ
ｍＨＩで消化した。実施例６に記載の操作法に実質的に
従って、得られたＰｓｔｌ　　ＢａｍＨＩ−消化ＤＮＡ
をアガロースゲル上に重層し、複製起点およびアンピシ
リン耐性付与遺伝子部分を含有する〜２．７ｋｂ　Ｐｓ
ｔｌ　−ＢａｍＨＩ制限フラグメントをライゲート用に
単離し、調製した。分離反応では、高面緩衝液２００μ
ｅ中、プラスミドｐＬ４７ＤＮＡ１０μｇを制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化しく３７℃１２時間）
、実施例６に記載のように、〜１．０３ｋｂ　ＥｃｏＲ
Ｉ　−ＢａｍＨ［制限フラグメントをライゲート反応用
に単離し、調製した。得られた〜１．０３ｋｂ　Ｅｃｏ
ＲＩ　−Ｂａｍｌ−１１制限フラグメントをプラスミド
ｐＬ１１０の構築に使用した。

プラスミドｐＬ４７の〜２．７ｋｂ　ＰｓＬＩ　−Ｂａ
ｍＨｌおよび〜１．０３ｋｂ　ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ
制限フラグメントを、プラスミドｐＰＲ１２ＡＲ１の〜
２．９ｋｌ＋　Ｐｓｔｌ　−ＥｃｏＲＩ制限フラグメン
トに連結し、プラスミドｐＬ１１０を構築し、次いでこ
の連結ＤＮＡを使用し、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ　１２　　Ｒ
Ｖ３０８を形質転換した。ただし、この形質転換に当た
っては、形質転換体の選択をアンピシリン耐性でなく、
テトラサイクリン耐性を使用して行う以外は、実施例２
に記載の方法に従い行った。プラスミドｐＬ１１０の制
限部位および機能地図を添付の第１２図に示す。

実施例ＩＯ プラスミドｃｌ　Ｌ　　２（ＮＲＲＬ　　Ｂ　　１８３
８１）は、成熟ＩＬ−２のＮ−末端１００残基およびシ
グナルペプチドをコードしているｃ　Ｄ　Ｎ　Ａフラグ
メントを含有している。

実施例１の教示に従って単離したプラスミドＣＩＬ−２
ＤＮＡをＨｇ１Ａ１５単位（ベセスダ・リサーチ・ラボ
ラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒ　１ｅｓ）で規定された単位。本明細
書で使用している制限酵素はすべてここから入手した）
およびＰｓｔｌ制限酵素５単位、およびＩＯＸ標準制限
緩衝液（５０ｍＭ　ＮａＣｌ２．１０ｍＭ　　トリス−
ＨＣ（！　ｐＨ７，５，１０ｍＭ　ＭｇＣＱ、、１ｍＭ
　　ジチオトレイトール）５μｇ、以下の培地塩緩衝液
で消化した。約２９１塩基対のフラグメントを単離し、
ポリアクリルアミドゲルの電気泳動法によって精製した
。

次いで、Ｔ４ポリメラーゼ２単位を加え、培地塩緩衝液
中、５ａｕ３Ａ制限酵素で消化することによって、上記
のＩ　Ｌ−２７ラグメントを平滑末端化した。次いで、
平滑末端にしたＩ　Ｌ−２フラグメントを合成リンカー
： と連結させるに当たり、キナーゼ処理したリンカ−約１
μｇおよびＩ　Ｌ−２フラグメント２００ｎｇを加え、
得られた混合物を４℃で２０時間インキュベートした。

次いで、その配列を、培地塩緩衝液中でＢｇｌＩＩ制限
酵素５単位および５３ｕ３Ａ制限酵素５単位で消化し、
得られたフラグメントをベクターｐＬ１１０　（これは
、ここでも培地塩制限緩衝液中で、予め、ＢｇｌＩｒ制
限酵素４単位で消化し、ＢａｍＨＩ制限酵素２単位で部
分消化しておいた）中に連結させた。

次いで、得られたプラスミドｐＧＡＤ２を既述のように
ＢａｍＨＩ制限酵素２単位で部分消化した。

実施例１に従って単離したプラスミドｐＭ１３ｍｐ８ク
ローン４２６　（ＮＲＲＬ−Ｂ−１８３８０）を既述の
ように制限酵素５ａｕ３Ａで消化した。次いで、ＩＬ−
２のＣ−末端３３残基をコードしている２４２塩基対５
ａｕ３Ａフラグメントを常法によって単離し、部分消化
ｐＧＡＤ２中に連結させてプラスミドｐｌＬ２３６５を
調製した。次いで、ＩＬ−２の全コード化配列を発現可
能な位置に含有しているプラスミドｐ　Ｉ　Ｌ２３６５
を、実施例３の教示に従ってＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ　１２　
ＲＶ３０８　（ＮＲＲＬ　Ｂ−１５６２４）に形質転換
した。得られた形質転換体を常法によって培養し、［、
−２を不溶性顆粒の形態として産生させた。プラスミド
ｐ　Ｉ　Ｌ２３６５の制限部位および機能地図を添付の
第１３図に示す。

実施例１１ インターロイキン−２顆粒の単離 湿潤し、ぎっしり詰まったＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ　１２　　
ＲＶ３０８／ｐ　ＩＬ２３６５細胞約３００ｇを０゜０
５Ｍ　　トリス−ＨＣＱ（ｐ　Ｈ８，０）２４００だＱ
中に懸濁させ、Ｑ、Ｑ５Ｍ　ＥＤＴＡ　（エチレン−ジ
アミン四酢酸）３００ｍ１２中、リゾチーム（シグマ■
級）１．２ｇを添加して細胞溶解した。撹拌して細胞を
分散させ、次いで手短に音波処理して粘性ＤＮＡを剪断
した。細胞溶解が完了したら（これは１時間後に顕微鏡
観察して判定した）、撹拌下に、ＤＥＡＥ　（ジエチル
アミノエチル）セルロース（ワットマン（Ｗｈａｔｍａ
ｎ）Ｄ　Ｅ　５２）　６００　ｇを加えた。次いで、こ
の懸濁液を濾過し、所望のＩＬ−２顆粒を含有する混濁
した濾液を得た。洗液が清澄化するまで、得られた応過
ケーキをトリフ、−ＨＣ１２緩衝液（ｐＨ８，０）３０
００ｉＩ２で洗浄し、濾液とこの洗液をまとめ、１０，
０ＯＯＸ９で３０分間遠心した。遠心後、沈澱物を採取
し、これをトリス−ＨＣｆ２緩衝液中、３０％アセトニ
トリル、ＩＭＫＯｆｆ、および水で連続して洗浄した。

次いで、洗浄して得られた顆粒を水１リットル中に懸濁
した。ビューレット法［コロウィックら（ｃｏｌｏｗｉ
ｃｈ、　Ｓ、　Ｐ、およびＮ、　０．Ｋａｐｌａｎ）ｍ
Ｗ、ＭｅｔｈｏｄｓＩｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　３
巻、４５０−４５１頁］により、タンパク質顆粒の収量
を測定すると、５．５ｇであった。以後に使用するため
、この顆粒調製物を一２０′Ｃで凍結させた。

実施例１２ ＩＬ−２−３−スルホネートの調製 実施例１１で得られた顆粒約５．５ｇを６Ｍ塩酸グアニ
ジン（Ｇｕ−ＨＣ（り５００ｘＱ中に溶解した。この５
００＋１２中に、０．１Ｍ亜硫酸ナトリウム（６，３ｇ
）、０．０５Ｍ　　トリス（３，０３ｇ）、０．００５
Ｍチオ硫酸ナトリウム（６２０＋ｇ）、０．００５Ｍ　
システィン（３０３ｘｇ）、およびｌＸｌ０−’Ｍ硫酸
銅溶液５０μＱを加えた。そのｐＨを７．８に調節した
後、亜硫酸分解反応を撹拌下に４℃で４８時間行った。

得られた混合物を遠心によって清澄化し、次いでセファ
デックスＧ−７５［ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
）、ビスカッタウェイ、Ｎ　、　Ｊ　、　０８５５４−
９９３２］の１０リツトルカラムで、７Ｍ尿素、０．１
Ｍ　　トリス（ｐＨ８，５）、および０．１Ｍ亜硫酸ナ
トリウムに溶媒変換した。カラム流出液を２８０ｎｍの
吸収でモニターし、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動法によってＩ　Ｌ−２−Ｓ−スルホネートを含有
するピークを同定した。このＧ−７５カラムはさらに、
高分子量タンパク質のピークを分離した。ＩＬ−２−ｓ
−スルホネートを含有するフラクションを約２５℃にま
で暖め、所望の生成物を綿状沈澱物として析出させた。

任意であるが、塩酸によってｐＨを７，５に低下させ、
エタノールを１０％まで加えることによってこの沈澱反
応工程を速めることができる。遠心によって、所望のＩ
　Ｌ−２−８−スルホネート沈澱物を回収し、水で２回
洗浄して約１．３ｇを得た。

実施例１３ Ｉ　Ｌ−２の可溶化および折り畳み 実施例１２で得たＩＬ−２３−Ｓｏ、沈澱物約４０ｘｇ
を４℃で５ＭＧｕ−ＨＣ（ｌ約６６、Ｍ。

システィン８０．７＋ｇ、およびシスチン３．２ｇｇ中
に溶解した。次いで、固形トリスを添加してそのｐＨを
８に調節した。その溶液を連続して撹拌させながら、総
量２００１（ｌの冷水を１　、６　ｉｆｆ／分で注いだ
。次いで、この溶液をカバーし、４℃で一晩インキユベ
ートした。次ぎに、得られた溶液をスペクトラポラ−（
ＳｐｅｃｔｒａＰｏｒ）＃　１　　［スペクトラム・メ
ディカル・インダストリーズ、　Ｉ　ｎｃ、　（Ｓｐｅ
ｃｔｒｕｍ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、
　Ｉｎｃ、）、ロスアンジエルス、ＣＡ　９００５４］
で、０．０５Ｍ　　トリス（ｐＨ９，０）４す７）ルに
対して４時間透析した後、新しいトリスで一晩透析した
。不溶性物質を遠心によって除去し、捨てた。次いで、
酢酸約１．５ｘＱを溶液に加え、それをアミコンＹＭ−
５８［７ミコン（３ｍ１ｃｏｎ）、デンバー、Ｍａｓｓ
、］で約１０ｉＱにまで濃縮し、０．１Ｍ酢酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ４，５）で平衡化させたセファデックス
Ｇ−７５カラムに通し、凝集したタンパク質を取り出し
た。最後に、再生したｒＬ−２をＹＭ５膜で濃縮し、−
２０’Ｃで冷凍保存した。適切な再生は、逆相Ｃ−４Ｈ
ＰＬＣカラム［バイダック（Ｖｙｄａｃ、　Ｈｅ５ｐｅ
ｒｉａ）、　ＣＡ　９２３４５］のクロ７トグラフイー
によって確認した。得られたＩＬ−２は、アメリカン・
タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ
　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、
　ＣＩ　ツクビレ、メリーランド、２０８５２）　（Ａ
　Ｔ　ＣＣ）に受託番号ＴｌＢ２１４の下で入手可能な
Ｉ　Ｌ−２依存性ＣＴＬＬ−２セルラインを増殖させる
能力に基づいて測定すると、生物学的に活性であった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、プラスミドｐＫＣ２８３の制限部位および機
能地図の模式図であり、 第２図は、プラスミドｐＫＣ２８３ＰＸの制限部位およ
び機能地図の模式図であり、 第３図は、プラスミドｐＫＣ２８３−Ｌの制限部位およ
び機能地図の模式図であり、 第４図は、プラスミドｐＫＣ２８３−ＬＢの制限部位お
よび機能地図の模式図であり、第５図は、プラスミドｐ
ＫＣ２８３ＰＲ３の制限部位および機能地図の模式図で
ありぐ第６図は、プラスミドｐＬ３２の制限部位および
機能地図の模式図であり、 第７図は、プラスミドｐＮＭ７８９の制限部位および機
能地図の模式図であり、 第８図は、プラスミド１２０の構築模式図であり、 第９図は、プラスミドｐＬ４７の制限部位および機能地
図の模式図であり、 第１０図は、プラスミドｐＰＲ１２の制限部位および機
能地図の模式図であり、 第１１図は、プラスミドｐＰＲ１２ＡＲｌの制限部位お
よび機能地図の模式図であり、第１２図は、プラスミド
ｐＬ１１０の制限部位および機能地図の模式図であり、 第１３図は、プラスミドｐｌＬ２３６５の制限部位およ
び機能地図の模式図である。 特許出願人　イーライ・リリー・アンド・カンパニー代
　理　人　弁理士　青白　葆　（外１名）ＦＩＧ、１ ｐＫ０２８３ （〜９．１　ｋｂ） ａｃ　Ｉ ＦＩＧ、３ （〜５．９　ｋｂ） ＦＩＧ、２ （〜６．１　ｋｂ） ＦＩＧ、４ ＦＩＧ、５ ＦＩＧ、７ ＮＭ７８９ （〜１．０ｋｂ） Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ δａｌＩ ＦＩＧ、６ Ｌ３２ （〜３．９　ｋｂ） ＦＩＧ、８ ａｌ　ｌ ＦＩＧ、９ （〜４．５　ｋｂ） ＦＩＧ、Ｉｌ ｄｅ　Ｉ ＦＩＧ、ｌｏ ＦＩＧ、＋２

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、システイン含有組換えタンパク質の精製法であって
   、 ａ）細胞不純物を内包する不溶性の、システイン含有組
   換えタンパク質顆粒を含有する宿主細胞の細胞壁を破壊
   し、該顆粒を細胞残骸から分離し、ｂ）亜硫酸分解試薬
   を含有する変性剤に該顆粒を可溶化して亜硫酸分解され
   た組換えタンパク質および上記細胞不純物を含有する溶
   液を製し、ｃ）亜硫酸分解した組換えタンパク質を含有
   する該溶液を溶媒変換し、溶媒変換した該溶液の温度を
   約１℃から約６℃の範囲から約１８℃から約２８℃の範
   囲にまで上昇させてタンパク質−Ｓ−スルホネートを沈
   澱させ、 ｄ）得られたタンパク沈澱物を上清中の細胞不純物から
   分離すること、 を特徴とする方法。 ２、工程（ｃ）における温度を約２５℃に上昇させる請
   求項１に記載の方法。 ３、変性剤が塩酸グアニジンまたは尿素である請求項１
   または請求項２に記載の方法。 ４、顆粒を約４−６Ｍ塩酸グアニジン中で可溶化する請
   求項３に記載の方法。 ５、顆粒を約６−８Ｍ尿素中で可溶化する請求項３に記
   載の方法。 ６、亜硫酸分解試薬が亜硫酸ナトリウムと、第２の成分
   としてチオ硫酸ナトリウム、システイン、四チオン酸ナ
   トリウム、または硫酸銅とを含有する請求項１から請求
   項５までのいずれかに記載の方法。 ７、亜硫酸ナトリウムが約２５−２５０ｍＭの濃度であ
   る請求項６に記載の方法。 ８、亜硫酸ナトリウムが約１００ｍＭの濃度である請求
   項７に記載の方法。 ９、第２の成分が、 ａ）濃度２−２０ｍＭで存在するシステイン、ｂ）濃度
   約１０ｍＭで存在する四チオン酸ナトリウム、 ｃ）濃度１−１０ｍＭで存在するチオ硫酸ナトリウム、 ｄ）濃度０．１−１ｍＭで存在する硫酸銅 である請求項６、７または８に記載の方法。 １０、第２の成分が、 ａ）濃度約５ｍＭで存在するシステイン、 ｂ）濃度約１０ｍＭで存在する四チオン酸ナトリウム、 ｃ）濃度約５ｍＭで存在するチオ硫酸ナトリウム、 ｄ）濃度約０．５ｍＭで存在する硫酸銅 である請求項９に記載の方法。 １１、組換えタンパク質がＩＬ−２、ヒトＩＬ−２、ヒ
   トインスリンＡ鎖、ヒトインスリンＢ鎖、ヒトプロイン
   スリン、ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター、ヒ
   ト成長ホルモン、ヒトインターフェロン、ヒトインスリ
   ン様増殖因子 I （ＩＧＦ− I ）、ヒトインスリン様増
   殖因子II（ＩＧＦ−II）、またはウシ成長ホルモンであ
   る請求項１から請求項１０までのいずれかに記載の方法
   。 １２、組換えタンパク質がヒトＩＬ−２である請求項１
   １に記載の方法。 １３、システインを含む組換えタンパク質の折り畳み方
   法であって、 ａ）請求項１から請求項１２までのいずれかに記載の方
   法によって得られたタンパク質−５−スルホネート沈澱
   物を、変性剤中で可溶化し、次いで還元剤を加え、可溶
   化した沈澱物を還元し、ｂ）工程（ａ）によって調製さ
   れた溶液を折り畳みに適当な条件下で希釈することを特
   徴とする方法。 １４、変性剤が塩酸グアニジンまたは尿素である請求項
   １３に記載の方法。 １５、変性剤溶液が約４−６Ｍ塩酸グアニジンを含有す
   る請求項１４に記載の方法。 １６、工程（ａ）で調製された溶液に１０−１００ｍＭ
   トリスを加えて希釈し、塩酸グアニジンの濃度を約６Ｍ
   から約１．５Ｍに変化させる請求項１５に記載の方法。 １７、変性剤溶液が約４−６Ｍ尿素を含有する請求項１
   ４に記載の方法。 １８、還元剤がメルカプトエタノール、システイン、グ
   ルタチオン、またはジチオトレイトールである請求項１
   ３から請求項１７までのいずれかに記載の方法。 １９、還元剤が、 ａ）約１０−１００倍過剰に存在するメルカプトエタノ
   ール、 ｂ）濃度約２−２０ｍＭで存在するシステイン、ｃ）濃
   度約２−２０ｍＭで存在するグルタチオン、または ｄ）２０−１００倍過剰に存在するジチオトレイトール である請求項１８に記載の方法。 ２０、還元剤が、 ａ）約２０倍過剰に存在するメルカプトエタノール、 ｂ）約１０ｍＭで存在するシステイン、 ｃ）約１０ｍＭで存在するグルタチオン、または ｄ）約２０倍過剰に存在するジチオトレイトール である請求項１９に記載の方法。 ２１、組換えヒト−ＩＬ−２を精製し、折り畳む方法で
   あつて、 ａ）不溶性の組換えヒトＩＬ−２顆粒であって、細胞不
   純物をも内包する該顆粒を含有する宿主細胞の細胞壁を
   破壊し、該顆粒を細胞残骸から単離し、 ｂ）約６Ｍ塩酸グアニジン、および約０．１Ｍ亜硫酸ナ
   トリウムを含有する亜硫酸試薬中で該顆粒を可溶化し、
   亜硫酸分解されたＩＬ−２タンパク質を含有する溶液を
   製し、 ｃ）亜硫酸分解されたＩＬ−２タンパク質を含有する該
   溶液を、約７Ｍ尿素、０．１Ｍトリス（ｐＨ８．５）、
   および０．１Ｍ亜硫酸ナトリウムを含有する溶液に溶媒
   変換し、この溶媒変換した該溶液の温度を約２５℃にま
   で上昇させ、ＩＬ−２−Ｓ−スルホネート沈澱物を調製
   し、 ｄ）該ＩＬ−２−Ｓ−スルホネート沈澱物４０ｍｇを、
   ６Ｍ塩酸グアニジン、システイン８０ｍｇ、シスチン３
   ｍｇを含有する溶液中で可溶化し、還元することによっ
   て該還元タンパク質の溶液を調製し、 ｅ）工程（ｄ）の溶液に十分量の０．０１Ｍトリスを加
   え、塩酸グアニジンの濃度を約６Ｍから約１．５Ｍに変
   化させること を特徴とする方法。