CN1051092C

CN1051092C - 一种重组大肠杆菌培养液中分离和纯化重组人白细胞介素2的方法

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Publication number: CN1051092C
Application number: CN93111153A
Authority: CN
Inventors: 娄丹; 邹钟诚
Original assignee: MILITARY MEDICINE INST LOGISTICS DEP OF SHENYANG MILITARY COMMAND
Current assignee: MILITARY MEDICINE INST LOGISTICS DEP OF SHENYANG MILITARY COMMAND
Priority date: 1993-05-21
Filing date: 1993-05-21
Publication date: 2000-04-05
Anticipated expiration: 2013-05-21
Also published as: CN1080958A

Abstract

本发明提供了一种重组大肠杆菌培养液中分离和纯化重组人白细胞介素2(rIL－2)的方法。其特点是先进行工程菌发酵，发酵后收集菌体，然后将菌体裂解，采用盐酸胍变性剂进行抽提、纯化，并用3-6M盐酸胍进行凝胶层析，用还原型和氧化型谷胱甘肽复性，并采用HPLC层析，经乙腈梯度洗脱，收集活性峰，低温减压下快速去除乙腈后，即得到rIL－2纯品。

Description

一种重组大肠杆菌培养液中分离和纯化重组人白细胞介素2的方法

本发明涉及一种用于增强人体免疫力和抗肿瘤药物的制取方法。

白细胞介素2(InterLeukin 2，IL-2)是一种T细胞分泌的免疫调节因子，不仅能促进T细胞的增殖，还可增强NK等多种免疫活性细胞的活性，在免疫反应的产生、调节及免疫监视中起重要作用。近年来因其在肿瘤治疗中所起的重要作用而越来越受到人们的关注。自从1983年Tanig Uchi等首次克隆IL-2cDNA并成功地在猴细胞系COS-7中表达出IL-2以来，许多学者相继在E.Coli中表达成功。由于重组白细胞介素2(rIL-2)具有天然IL-2的全部功能，用基因工程方法大量生产rIL-2将满足实验室及临床应用的要求。目前rIL-2制备均遵循以下工艺路线进行：

1、包含体纯化：rIL-2基因在大肠杆菌中表达时，产生的rIL-

2以不溶性包含体形式存在于胞质中。工程菌发酵并完成表

达后，一般先用超声或匀浆法破碎细菌，离心后收取沉淀以

去除可溶性蛋白等成份，接着用4M尿素处理以溶解部分杂蛋

白。有的工艺中还用仲丁醇抽提以进一步除杂蛋白以及用正

丁醇等处理消除脂类。经上述步骤处理后，可以得到较纯净

的包含体，rIL-2纯度在70％以上。

2、凝胶层析：包含体不溶于水，需用一种变性剂将其溶解后才

能进一步纯化。包含体溶解后所产生的rIL-2单体也是疏水

性的，必须用一定浓度的变性剂维持其溶解状态才能进行凝

胶层析。目前大多数厂家均采用十二烷基磺酸钠(SDS)为变

性剂，以2％浓度溶解包含体，1％左右浓度平衡凝胶柱并洗

脱样品，凝胶柱一般使用Sephacryl S-200，使用SDS做变

性剂有很大的缺点，即SDS属于去污剂，溶解rIL-2时将在

其分子上大量束缚，一旦与蛋白质结合很难除去，对人体具

有较强的毒性作用。注入人体内达一定量时将引起溶血。即

使用各种方法较干净地除去SDS，一个rIL-2分子一般仍至

少与一个SDS分子结合，此时使用高剂量rIL-2时，仍可引

起肝脏损害。由于使用rIL-2治疗肿瘤等疾病时，一般均采

用较高浓度，所以用SDS作为变性剂必将产生许多限制。

3、复性：复性前的rIL-2分子属还原态，分子内无二硫键，不

具有生物活性，必须经过氧化作用在分子内恰当部位即半胱

氨酸之间形成二硫键，恢复其正常的分子结构才能得到有用

的rIL-2，此过程即为复性。复性是影响其回收率乃至质量

的关键步骤。目前所采用的复性方法是：先用Sephadx G-25

柱除去大部分SDS，再调整蛋白的浓度，然后加一定浓度的

铜离子做氧化剂完成复性。该方法的主要缺点是复性率较低，

一般只能达到30-35％。

4、高效液相色谱。经凝胶层析和复性后，rIL-2纯度还达不到

标准，需要进一步的精提。目前绝大多数厂家在最后一步提

纯中均采用反相高效液相色谱，主要使用碳18柱、0.1％三氟

乙酸平衡后上样，乙睛梯度洗脱，收集rIL-2洗脱峰，除去

乙睛后得到rIL-2纯品。

本发明的目的是提供一种不使用SDS，且不残留毒性杂质，复性率高的重组人白细胞介素2(rIL-2)的分离和纯化方法。本发明的目的是这样实现的，其技术方案要点是：1、挑选含有编码人IL-2的DNA序列的单菌落(人rIL-2生产菌菌株)接种于装有LB培养基的摇瓶中，在30℃下振荡培养8-10小时，转入含有合成培养基的发酵罐中，30℃下培养11-13小时，再在42℃下培养5-6小时，发酵后收集菌体；2、取菌体，用pH8.5，浓度为5mM

Tris.HCl-1mM EDTA-1mM DTT缓冲液洗两遍，沉淀物再悬于同样缓冲液中，加溶菌酶，4℃下作用30分钟，冰浴超声至完全破裂为止，离心除去可溶性杂质，沉淀悬于pH8.5，浓度为50mM Tris.HCl-1mM EDTA-2mMDTT，搅拌下缓慢滴加同体积的pH8.5，浓度为50mM Tris.HCl-1mM EDTA-8 M尿素，室温下缓慢搅拌20-40分钟，离心除去可溶性杂质，沉淀再用缓冲液洗两遍，再将沉淀溶于pH8.5，浓度为50mM Tris.HCl-10mM DTT-7-8M盐酸胍(GuHCl)，溶解1.5小时后离心取上清，在4℃保存；3、(1)凝胶层析：取上清装入Sephacryl S-200中，用pH8.5，浓度为50mM Tris.HCl-3-6M GuHCl充分平衡后上样，平衡液洗脱，结果出现三个蛋白峰，收集第三峰，4℃保存；(2)复性：取凝胶层析后样品，浓度为50mM Tris.HCl稀释三倍，加氧化型谷胱甘肽(GSSG)和还原型谷胱甘肽(GSH)至终浓度为1mM和1-10mM，调pH值为7-9，室温放置1-2小时，浓缩至10倍，过Sephadex G-25柱，用pH3.0，浓度为0.1M GlyHCl平衡并洗脱，收蛋白峰；(3)高效液相层析：用HPLC仪进行纯化，以0.1％三氟乙酸平衡C₈反相柱后，加入复性后蛋白溶液，进行乙睛梯度洗脱，收集活性峰，低温减压下快速去除乙腈，即可得到rIL-2纯品。

本发明由于采用盐酸胍(GuHCl)为变性剂，其主要优点是：GuHCl溶解包含体时不与rIL-2分子结合，可以通过各种除盐手段，诸如过Sephadex G-25柱等将其彻底除净，不使产品中残留任何微量GuHCl，使终产品的毒性大大降低，具体为用浓度为7-8M GuHCl溶解包含体(其中8M较好)。用浓度3-6M GuHCl平衡Sephacryl S 200柱并洗脱rIL-2，其中4-5M较好。

本发明在复性时，调整凝胶层析后的rIL-2蛋白浓度，使其为0.05-0.15毫克/毫升(0.05-0.10毫克/毫升最好)，GuHCl摩尔浓度1.0-4.0M(其中2-3M为最好)，pH值在7.0-9.0之间(在7.5-8.5之间最好)，加终浓度为1mM的氧化型谷胱甘肽(GSSG)和1-10mM(5-10mM为最好)的还原型谷胱甘肽(GSH)，室温放置1-2小时而完成复性，其复性率可达100％。

下面通过实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

一、工程菌发酵：在长有生产菌种菌落(pBV324/IL-2/JM103)的LB平板上，挑单菌落分别接种于8瓶有100ml LB培养基的摇瓶中，30℃振荡培养10小时后，转种于含合成培养基(Ecl培养基：酵母提取物(英国Oxoid)5克，KH₂PO₄ 5克，K₂HPO₄ 7.5克，(NH4)₂HPO₄5.5克，50％MgSO₄.7H₂O 4ml，67％葡萄糖30ml，微量元素1ml，胸腺嘧啶0.2克，加三蒸水1000ml)20立升发酵罐(NBS公司生产，Bioflo-4型)中，30℃培养12小时后，42℃培养5小时。其中所使用的合成培养基内还含有由下列成分组成的添加剂：蛋白胨/酵母提取物各30克，相当于Ecl培养基10倍量的葡萄糖和胸腺嘧啶。培养基应用时，还加50ug/ml氨苄青霉素。发酵结束后，用离心机(J6B型大容量离心机，BECKMAN公司生产)收集菌体。

二、菌体裂解与GuHCl抽提：取湿重500克菌体，用pH8.5，50mMTris.HCl-1mM EDTA-1mM DTT洗两遍，沉淀重新悬于同样缓冲液，加溶菌酶，4℃作用30分钟，再用超声粉碎器(Cole-Parmer公司生产)破碎细胞，冰浴超声(30秒/次)，镜检菌体完全破裂为止，使用离心机(BECKMAN公司生产/J2-21M型)，离心12000rpm×10分钟，沉淀悬于pH8.5，50mM Tris.HCl-1mM EDTA-2mM DTT，快速搅拌，同时缓慢滴加同体积pH8.5，50mM Tris.Hcl-1mM EDTA-8M尿素。室温下搅拌30分钟，离心12000rpm×15分钟，沉淀用pH8.5，50mM Tris.HCl-1mMEDTA-1mM DTT洗两遍，再将沉淀溶于pH8.5，50mM Tris.HCl-1mMEDTA-8M GuHCl，溶解1.5小时后离心(12000rpm×20分钟)，取上清于4℃下保存。

三、纯化

1、凝胶层析：10cm×100cm柱装入Sephacryl S-200(Pharmacia

公司生产)，用pH8.5 50mM Tris.HCl-6M GuHCl(Fluca公司

生产)充分平衡后上样，平衡液洗脱，流速800ml/小时。结果

样品经检测280nm吸光率，可见存在三个蛋白峰，分管收集并

测定活性。进一步电泳(Pharmacia公司生产，MultiphorII

型电泳仪)分析，可确定第三峰为主要rIL-2峰。合并活性峰

收获液，于4℃下保存。

2、复性：取凝胶层析后样品，用pH8.5，50mM Tris.HCl稀释三

倍，加还原型和氧化型谷胱甘肽，使终浓度分别为10mM和1mM，

室温放置2小时，用超滤器(MILLIPORE公司生产)浓缩至1/10，

上清过10cm×50cm Sephadex G-25(预先用pH3.0，0.1M

GlyHCl平衡，并用同种缓冲液洗脱)，收蛋白峰。3、高效液相层析：应用Waters公司Delta-4000制备型HPLC仪，Deltaupak C₁₈柱(直径4×30cm，孔径300A°，粒度15μ)进行纯化。以0.1％三氟乙酸(TFA)充分平衡后，泵入rIL-2样品，进行乙腈梯度洗脱(40-80％)，流速为40ml/分钟，收集活性峰，低温减压快速去除乙腈，测蛋白含量，得到rIL-2纯品。纯化结果见下表：

蛋白总量 rIL-2纯度总回收率比活性(mg) (％) (％) (μ/mg)
蛋白总量 rIL-2纯度总回收率比活性(mg) (％) (％) (μ/mg)	工程菌 7420 37.1 100包含体 1357 66.7 18.3S200 1022 91.2 13.8HPLC 250.1 98.7 3.37 1.81×10⁷

Claims

1.一种重组大肠杆菌培养液中分离和纯化重组人白细胞介素2(rIL-2)的方法，其特征在于：

(1)挑选一种表达重组人白细胞介素2的重组大肠杆菌单菌落(pBV324/IL-2/JM103)，接种于LB培养基的摇瓶中，30℃扩增培养10小时，再转种于含有合成培养基的20立升发酵罐中发酵(30℃培养12小时后，42℃培养5-6小时)。

(2)离心(4000rpm×30分钟)收集菌体，重新悬于pH8.5，50mMTris.HCl-1mM EDTA-1mM DTT缓冲液中。加溶菌酶于4℃作用30分钟，冰浴超声至菌体完全破裂为止，离心(12000rpm×10分钟)得包涵体沉淀。

(3)将沉淀悬于pH8.5，50mM Tris.HCl-1mM EDTA-2mM DTT溶液，室温下缓慢滴加等体积pH8.5，50mM Tris.HCl-1mM EDTA-8M尿素，搅拌30分钟，经12000rpm×15分钟离心，得到60-70％的包涵体沉淀。

(4)将沉淀溶于pH8.5，50mM Tris.HCl-1mM EDTA-8M GuHCl(7-8M GuHCl均可)，溶解1.5小时后离心(12000rpm×20分钟)收集上清液。

(5)取上清液进行Sephacryl S-200凝胶层析，用pH8.5，50mMTris.HCl-6M GuHCl(3-6M GuHCl均可)做平衡液及洗脱液，流速800ml/小时，收集含有重组人介素2的蛋白峰。

(6)复性：将收集的峰用pH8.5，50mM Tris.HCl稀释三倍，加终浓度为1-10mM还原型谷胱甘肽和终浓度为1mM氧化型谷胱甘肽，室温放置2小时。

(7)复性后蛋白溶液经超滤浓缩10倍，用Sepgadex G-25凝胶脱盐；收集的蛋白峰进行反相高效液相层析，用乙腈进行梯度洗脱(40-80％)，流速为40ml/分钟，收集rIL-2活性峰，低温减压快速去除乙腈，得到rIL-2纯品。

2.根据权利要求1所述的一种重组大肠杆菌培养液中分离和纯化rIL-2的方法，其特征是在破碎细胞后，用7-8M盐酸胍溶解含有大肠杆菌表达产物的包涵体沉淀；

3.根据权利要求1所述的一种重组大肠杆菌培养液中分离和纯化rIL-2的方法，其特征是用3-6M盐酸胍平衡Sephacryl S-200柱，并用该平衡液洗脱蛋白峰；

4.根据权利要求1或3所述的一种重组大肠杆菌培养液中分离和纯化rIL-2的方法，其特征是在经Sephacryl S-200凝胶层析后得到的蛋白峰中，加入终浓度为1mM的氧化型谷胱甘肽和1-10mM的还原型谷胱甘肽，室温放置1-2小时，以使产物完全复性。