JPS6342687A - 粗ｔＰＡの精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （発明の目的と産業上の利用分野） 本発明は、組織ブラスミノーゲンアクチベータ−（ｔＰ
Ａ）の精製法に関する。さらに詳しくは、特に種々のｔ
ＰＡの分子種やその外の蛋白質である不純物を含む粗製
のｔＰＡをヒドロキシアパタイトと接触させ、この後特
定の緩衝液を用いることにより分子量約７万ダルトンの
ｔＰＡを分離精製して得る方法に関する。

（従来の技術と発明が解決した問題点）ヒドロキシアパ
タイトをｔＰＡの精製に適用することそれ自体は、特開
昭６１−７６４１９において公知である。即ち、この先
行技術とは、ｔＰＡを含む液からｔＰＡを得るに際し、
上記液をヒドロキシアパタイトに吸着させ、ついでｔＰ
Ａを吸着したヒドロキシアパタイトからアンモニアを含
有する水によってｔＰＡを溶出する方法である。しかし
ながらこの溶出する条件はｔＰＡの安定性に影響を与え
る。

本発明の特徴はこの公知の方法とは異なり、粗ｔｐ＾特
には抗し）　　ｔＰＡ抗体と反応する分子種で種々であ
る不純物の中から選択的に分子量約７万ダルトンのｔＰ
Ａを取得することができる。

つまり　ｔＰＡを生産する細胞を培養し、ｔＰＡを得よ
うとする際、その培養液中には抗ヒト　ｔＰＡ抗体と反
応する蛋白質として分子量３万から４，５万ダルトンの
もの、５万から８万ダルトンのもの及び１０万ダルトン
以上のものが挟雑してくる。

本発明はこれら多種類のｔＰＡ分子分子音種のやこの外
の不純たんばくを含む液の中から分子量約７万ダルトン
のｔＰＡを分離精製することができる方法である。

ヒドロキシアパタイトが蛋白質の精製に用いられること
も知られているが、本発明で特定する緩衝液を用いて多
種類のｔＰＡ分子分子音種からある特定のｔＰＡ分子分
子音種離する方法については報告がない。

（発明の構成） ｔＰＡとは、高等動物の＆ｌｌ織で産生され、フィブリ
ンに特有な分解酵素であるプラスミンの前駆物質である
プラスミノーゲンを賦活化させる蛋白質である。

本発明に言う粗ｔＰＡとは、ヒトメラノーマ細胞培養液
、ヒト正常細胞培養液及び遺伝子組み換え技法を用いて
ヒトｔＰＡ遺伝子を組み込んだ細胞の培養液を含んでい
る。またｔＰＡを含む液としては、上記培養液を部分精
製された液をも意味する。

（問題点を解決する為の手段） 本発明者らは、ｐＨ変化に伴う　ｔＰＡのヒドロキシア
パタイトへの吸着の強さが、ｐ）ｌが低い程吸着力が高
まり、また同じｐ）Ｉの場合、ｔＰＡ分子分子音種ち分
子量が大きいものほど強く吸着されることを知り、ｐＨ
及び塩濃度を変化させ、多種類のｔＰＡ分子分子音種か
ら特に分子量約７万ダルトンのｔＰＡを精製する本発明
の方法を見出した。

本発明の実施について更に詳しく説明すると、ヒドロキ
シアパタイトに吸着させる為に、被処理液は弱酸性乃至
弱アルカリ性になるように予め調整しておくほうがよい
。

ｐＨの調整にはリン酸塩緩衝液を使用するのが好ましく
、リン酸塩濃度が０．０５Ｍ以下としてｐＨは６〜８に
されるのが好ましい。

ｐｏ調整の為には他の緩衝液を使用してもよい。

この条件で不純物を含むｔＰＡ液をヒドロキシアパタイ
トと接触させるとほとんどすべての分子音種のｔＰＡは
それに吸着される。

次にリン酸塩濃度が０．０２〜０．０５Ｍ以下でｐＨ６
以上７未満の緩衝液で洗うことにより分子量３万〜４万
ダルトンのｔＰＡが溶出される。

その後更に、リン酸塩濃度が０．０３以上０．０６Ｍ未
満でｐｕ　７．０〜９．０の緩衝液で洗うことにより分
子量４万から７万までのｔＰＩＩが溶出される。

次にリン酸塩濃度が０．０６〜０．２５ＭでＰＨ６，０
〜９．０の緩衝液で分子量約７万のｔＰＡが溶出される
。

尚、リン酸塩濃度が０．１〜０．４ＭでｐＨ６，０〜１
０．０の緩衝液では分子量１０万以上のｔＰＡが溶出さ
れる。

以上が本発明の構成に係わる技術上の知見の概要である
。

本発明では公知技術とは異なり、ｔＰＡの？８Ｍ溶媒に
アンモニアを使用しなくても、本精製方法により　ｔＰ
Ａを活性を基準として９０〜１００χ回収することがで
きる。

実施例１ ポウズ（Ｂｏｗｅｓ）メラノーマ細胞を１０％熱不活性
化胎児牛血清（Ｆｅ２．５６℃、３０分間）と補充した
ＲＰＭＩ−１６４０組成培養媒体中で培養後、培養物を
一度洗い、血清を含まない媒体中で２４時間培養後、媒
体を集め新しい媒体を加えた。

収穫液２Ｍに硫酸アンモニウムを３００分の割合で加え
た後、ｐＨ７，０に調整し、４℃で一晩放置した。

生じた沈澱を遠心して集め、０．０１Ｍリン酸緩衝液（
ｐＨ６，０）に溶解後、この緩衝液に対して透析し脱塩
した。この液を０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐ）Ｉ　６．
０）に平衡化したヒドロキシアパタイトカラム５ｄに適
用した。

流出液を集め、プラスミノーゲン依存フィブリン溶解活
性を測定したが検出されなかった。

吸着した蛋白質は、０．０３Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６゜
０）を用い？登山した。

溶出液のプラスミノーゲン依存フィブリン溶解活性を測
定すると適用した活性の２％を示した。

この両分をＳＯＳポリアクリルアミドゲル電気電気移動
後イモグラフィーで調べると、プラスミノーゲンアクチ
ベーターとして３万〜４万ダルトンの範囲にバンドが認
められた。

次に０．０５ＭｐＨ７，５のリン酸緩衝液でカラムを洗
った。溶出液のプラスミノーゲン依存フィブリン溶解活
性を測定すると適用した活性の３％を示した。この両分
をＳＯＳポリアクリルアミドゲル電気電気移動後イモグ
ラフ上で４万から７万ダルトン近傍までの範囲にバンド
がプラスミノーゲンアクチベーターとして認められた。

続いて０．２Ｍ程度ｐＨ７，０程度のリン酸緩衝液でヒ
ドロキシアパタイトカラムからの溶離を行なった。

溶出液のプラスミノーゲン依存フィブリン溶解活性を測
定すると適用した活性の８５％を示した。

この画分をＳＯＳポリアクリルアミドゲル電気電気移動
後イモグラフィーで調べると、分子量約７万のバンドが
プラスミノーゲンアクチベーターとして認められた。

残りの吸着蛋白は０．４Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）
を用い溶出した。

溶出液のプラスミノーゲン依存フィブリン溶解活性を測
定すると適用した活性の５％を示した。

この両分をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気電気移動
後イモグラフィーで調べると、分子量７万を越え分子量
１０万ダルトン以上のものがプラスミノーゲンアクチベ
ーターとして認められた。

実施例２ 人胎児包皮細胞培養液〔１０％熱不活性化（５６℃、３
０分間）胎児牛血清及びアプロチニン（２０ＫＩＵ／ｍ
＋）を含む）２ｎをＴｗｅｅｎ　８０（０，０２％）で
安定化後、抗ヒトウロキナーゼカラムに適用した。

流出液を集め、プラスミノーゲン依存フィブリン溶解活
性を測定した。カラムに適用された活性の約６０％が認
められた。

この両分をＳＯＳポリアクリルアミドゲル電気電気移動
後イモグラフィーで調べると、分子量約３万〜１５万ダ
ルトンの範囲で多種類のハンドがプラスミノーゲンアク
チベーターとして認められた。

これらのバンドは抗ヒトウロキナーゼ処理で影響をうけ
ず、抗ヒト　ｔＰＡ抗体処理をするとハンドが見られな
くなることがらｔＰＡと認めた。

この液に硫酸アンモニウムを３００脅の割合で加えた後
ｐｌ＋　７．０に調整し、４℃で一晩放置した。

生じた沈澱を遠心して集め、０．０３ＭＩＪン酸緩衝液
（ｐ）Ｉ　６．８）に対して透析し、脱塩した。

この液を０．０３Ｍリン酸緩衝液（ｐ）！　６．８）で
平衡化したヒドロキシアパタイトカラム５艷に適用し、
流出液を集め、プラスミノーゲン依存フィブリン溶解活
性を測定すると適用した活性の約２％を示した。この画
分をＳＯＳポリアクリルアミドゲル電気電気移動後イモ
グラフィーで調べると、ｔＰＡとして３万〜４万ダルト
ンの範囲にバンドが認められた。

次に０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，８）でカラムを
洗浄した。　溶出液のプラスミノーゲン依存フィブリン
溶解活性を測定すると適用した活性の５％を示し、４万
から７万ダルトンまでの間の分子量のものがザイモグラ
フ上で認められた。

続いて吸着蛋白を０．２５ＭＩＪン酸緩衝液（ｐＨ６，
０）を用いて溶離した。　？登山液のプラスミノーゲン
依存フィブリン溶解活性は適用した活性の約８０％を示
し、その分子量は約７万ダルトンであることがザイモグ
ラフ上で認められた。

残りの吸着蛋白は０．３Ｍリン酸１水素２ナトリウム−
カセイソーダ緩衝液（ｐ）１１０．０）で溶出した。

溶出液のプラスミノーゲン依存フィブリン溶解活性を測
定すると適用した活性の約１０％を示し、その分子量は
約７万ダルトン及び１０万ダルトン以上であるハンドが
ザイモグラフ上で認められた。

実施例３ ヒトｔＰＡ遺伝子を組み込んだチャイニーズハムスター
卵母（ＣＨＯ）細胞（ＣＨＯＫＩ　ＡＴＣＣＣＣＬ　６
１）培養液〔１０％熱不活性化（５６℃、３０分間）胎
児牛血清及びアプロチニン（４０ＫＩＵ／ｍｌ）を含む
）２ｆをＴｗｅｅｎ　８０（０，０２％）で安定化後、
リン酸でｐＨ５，０に調整した。

この液を、０．１５Ｍ食塩及びＴｗｅｅｎ　８０（０，
０２％）を含む０．０５Ｍリン酸２水素１ナトリウム（
ｐＨ５，０）で平衡化したカルホキジメチル（ＣＭ）セ
ファロースカラム５０ｍ＋！に適用した。

吸着した蛋白を含む樹脂を０．０５Ｍ食塩を含む０．０
５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，４）で洗浄後、０．５Ｍ食
塩を含む０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，４）でｔＰ
Ａを溶出した。溶出液のプラスミノーゲン依存フィブリ
ン溶解活性を測定すると適用した活性の約８５％が回収
された。

この画分をＳＯＳポリアクリルアミドゲル電気電気移動
後イモグラフィーで調べると、分子量約３万〜１５万の
範囲で多種類のバンドがｔＰＡとして認められた。

この溶出液に、硫酸アンモニウムを３００１Ｆｆ！の割
合で加えた後ｐＨ７，０に調整し、４℃で一晩放置した
。

生じた沈澱を遠心して集め、０．０５Ｍリン酸緩衝液（
ｐＨ６，０）に対して透析し、脱塩した。

この液に硫酸アンモニウムを３００脅の割合で加えた後
、４℃で一晩放置した。

生じた沈澱を遠心して集め、０．０３ＭＩＪン酸緩衝液
（ｐ）！　６．５）に対して透析し、脱塩した。

この液を０．０５ＭＩＪン酸緩衝液（ｐＨ６，０）で平
衡化したヒドロキシアパタイトカラム５＋ｎｉ’に適用
し、流出液を集め、プラスミノーゲン依存フィブリン溶
解活性を測定すると適用した活性の約３％を示した。こ
の両分をＳＯＳポリアクリルアミドゲル電気電気移動後
イモグラフィーで調べると、プラスミノーゲンアクチベ
ーターとして３万〜４万ダルトンのハンドが認められた
。

次に０．０３Ｍリン酸緩衝液（ｐ）Ｉ　８．０）でカラ
ムを洗浄したところ、適用した活性の７％が測定され、
分子量４万〜７万のバンドがザイモグラフ上で認められ
た。続いて０．１５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，８）で吸
着した蛋白を溶離した。　溶出液の活性は適用した活性
の約８０％を示し、分子量約７万ダルトンのバンドがザ
イモグラフ上で認められた。

残りの吸着蛋白は０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，８）
で溶出した。溶出液の活性は適用した活性の約１０％を
示し、分子量約７万及び１０万ダルトン以上のものがザ
イモグラフ上で認められた。

実施例４ ヒト　ｔＰＡ遺伝子を組み込んだマウス線維芽細胞（特
願昭６Ｏ−２６４９１８）培養液〔２％、Ｃ１２７細胞
、熱不活性化（５６℃、３０分間）胎児牛血清及びアプ
ロチニン（４０ＫＩＵ／ｎ＋１）を含む〕　２１をＴｗ
ｅｅｎ　８０（０゜０２χ）で安定化した。

この液を、０．１５１’１食塩及びＴｕｅｅｎ　８０（
０，０２″％）を含む０．０５Ｍ　）リス塩酸緩衝液（
ｐＨ８，０）で平衡化した抗ヒト　ｔＰＡ抗体セファロ
ースカラム５０ｍ１に適用した。

吸着した蛋白は２．０Ｍ食塩及びＴｗｅｅｎ　８０（０
，２χ）を含む０．０５Ｍ　ｌ−リス塩酸緩衝液（ｐＨ
８，０）で洗浄後、２．０Ｍチオシアン酸アンモニウム
及び↑ｗｅｅｎ８０（０，０２χ）を含む０．０５Ｍグ
リシン塩酸緩衝液を用い）各画した。

溶出液のプラスミノーゲン依存フィブリン溶解活性を測
定すると適用した活性の約９０％を示した。

この両分をＳＯＳポリアクリルアミドゲル電気電気移動
後イモグラフィーで調べると、分子量約３万〜１５万ダ
ルトンの範囲で多種類のバンドがｔＰＡとして認められ
た。

この液に硫酸アンモニウムを３００　！Ｐｊの割合で加
えた後、ｐ）ｌ　７．０に調整し４℃で一晩放置した。

生じた沈澱を遠心して集め、０．０４Ｍ＋Ｊン酸緩衝液
ｐ）ｌ　７．６に透析し脱塩した。

この液を０．０４Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，６）で平衡
化したヒドロキシアパタイトカラム（５＋ｎｉりに通用
した後、平衡化に用いた緩衝液でカラムを洗浄した。

流出液を集め、プラスミノーゲン依存フィブリン溶解活
性を測定すると適用した活性の約５％を示し、分子量約
３万〜７万ダルトンの範囲にバンドがザイモグラフ上で
認められた。

吸着した蛋白は０．２５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）
で溶離した。溶出液の活性は適用した活性の約９０％で
あり１、分子量約７万ダルトンのバンドがザイモダラフ
上で認められた。

さらに０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，８）でカラムを
洗浄すると、適用した活性の約５％が測定され、分子量
約７万及び１０万ダルトン以上のハントがザイモグラフ
上で認められた。

実施例５ ヒト　ｔＰＡ発現プロモーターとしてヒトサイトメガロ
ウィルス（ＨＣＭＶ）を用い、ヒトｔＰＡ遺伝子を組み
込んだヒト胎児羊膜細胞（ＦＬ、ＡＴＣＣＣＣＬ−６２
）培養液〔２χ熱不活性化（５６℃、３０分間）胎児牛
血清及びアプロチニン（２０ＫＩＵ／ｍ＋）含む）２Ｍ
！に硫酸アンモニウム３００分の割合で加えた後に、ｐ
Ｈ７，０に調整し４℃で一夜放置した。

生じた沈澱を遠心して集め、０．０４Ｍリン酸緩衝液ｐ
Ｈ８，０に透析し脱塩した。

この液を０．０４Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８，０）で平衡
化したヒドロキシアパタイトカラム（５ｍｌ）に適用し
た後、平衡化に用いた緩衝液でカラムを洗浄した。

流出液を集め、プラスミノーゲン依存フィブリン溶解活
性を測定すると適用した活性の約５％を示し、分子量約
３万〜７万ダルトンの範囲にバンドがザイモグラフ上で
認められた。

吸着した蛋白は０．２４Ｍリン酸緩衝液（ｐｌ（６，０
）で溶離した。溶出液の活性は適用した活性の約９０％
であり、　分子量約７万ダルトンのバンドがザイモグラ
フ上で認められた。

さらに０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，８）でカラムを
洗浄すると、適用した活性の約５％が測定され、分子量
約７万及び１０万ダルトン以上のバンドがザイモグラフ
上で認められた。

実施例６ ヒトｔＰＡ遺伝子を組み込んで形質転換された宿主酵母
細胞（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ）は、公知の方法（Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　　ａｎ
ｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ　　ｏｆＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
　ＤＮＡ　Ｒｅ５ｅｒｃｈ　　ｗｉｔｈ　Ｙｅａｓｔ　
ｉｎ　ＴｈｅＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏ
ｆ　Ｙｅａｓｔ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ：Ｍｅｔ
ａｂｏｌｉｓｍ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉ
ｏｎ、ｐｐ６０３−６３６゜Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　
１（ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　、Ｃｏ１ｄ　
ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、Ｎ、Ｙ、　（１９８２））
に記載の方法で増殖させた。

細胞はガラスピーズを用いて破砕し、ｔＰＡを１゜０Ｍ
食塩及び０．０２χＴｗｅｅｎ　８０を含む０．０５Ｍ
　リン酸緩衝液（ｐＨ７，５）で抽出し、濾過して濾液
をあっめた。

この液に硫酸アンモニウムを３００ｇ／Ｉの割合で加え
た後、ｐ）ｌ　７．０に調整し４℃で一夜放置した。

生じた沈澱物を遠心して集め、０．０４Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７，６）に透析し脱塩した。

この液を実施例４に記載のヒドロキシアパタイトカラム
によるクロマトグラフィーにより　ｔＰＡを精製した。

精製したｔｐ＾は分子量約７万ダルトンであり、カラム
にかけた活性の約９０％が回収された。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒドロキシアパタイトに、不純物を含む粗ｔＰＡを
   密接に接触させ、その後これよりｐＨ６乃至９かつその
   塩濃度が０．０６Ｍ乃至０．２５Ｍである緩衝液で溶出
   して選択的に分子量約７万ダルトンのｔｐＡを取得する
   ことを特徴とする粗ｔＰＡの精製方法。 ２、不純物が抗ヒトｔＰＡ抗体と反応し、かつ分子量約
   ７万ダルトン以外の分子量の蛋白質であることを特徴と
   する特許請求の範囲第１項に記載の粗ｔＰＡの精製方法
   。 ３、緩衝液がリン酸緩衝液であることを特徴とする特許
   請求の範囲第１項に記載の粗ｔＰＡの精製方法。 ４、溶出に先立って、粗ｔＰＡを吸着しているヒドロキ
   シアパタイトをあらかじめ塩濃度が０．０６Ｍを越えな
   いリン酸緩衝液で洗浄することを特徴とする特許請求の
   範囲第１項に記載の粗ｔＰＡの精製方法。