JPS63317082A - ｔＰＡの精製 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、調整培地からヒト組織プラスミノーゲンアク
チベーターを精製する方法に関する。

発明の背景 組織プラスミノーゲンアクチベータ−（ｔＰＡ）は、約
７００００の分子量の大きくて複雑な糖タンパク質であ
る。その構造的特徴は、その複雑な形状の原因となる１
７のジスルフィド架橋を含む。

該タンパク質の適切な摺曲が、その活性に必須であると
考えられる。このため、組換え体イー・コリにより産生
じたｔＰＡは、はとんど不活性である。イー・コリ由来
ｔＰＡの再摺曲の試みは、該再摺曲が指令および調節困
難であり、不完全および／または不正確な再摺曲となる
ためあまり成功していない。

リケンら、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル
・アクタ（Ｒｉｊｋｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ）、５８０−１１４０（１
９７９）は、（ａ）ｐＨ４、２における抽出、（ｂ）硫
酸アンモニウム沈澱、（Ｃ）亜鉛キレートアガロースク
口マトグラフィー（ｐＨ７，５）、（ｄ）ｎ−ブチルア
ガロースクロマトグラフィー（ｐＨ７、５）、（ｅ）コ
ンカナバリンＡアガロースクロマトグラフィー（ｐＨ７
、５）および（ｆ）セファデックス０Ｇ−１５０上ゲル
濾過による子宮細胞培養からのｔＰＡの精製を報告して
いる。

メイハックら（Ｍｅｙｈａｃｋ　ｅｔ　ａｔ、）、ＥＰ
−Ａ−１４３０８１号、１９〜２０頁は、塩沈澱、ゲル
電気泳動、透析、イオン交換クロマトグラフィー、サイ
ズ排除クロマトグラフィー、ＨＰＬＣまたは逆相ＨＰＬ
Ｃ１適当なセファデックス０力ラム上分子分粒などのよ
うな通常の手段による酵母細胞培養からのｔＰＡの精製
を示唆している。硫酸アンモニウム沈澱および抗ｔＰＡ
抗体およびエリスリナ・ラチシマ（Ｅｒｙｔｈｒｉｎａ
　　ｌａｔｉｓｓｉｍａ）　）リブシン・インヒビター
（ＤＥ−３）を用いたアフイニティクロマトグラフィー
を特に実施例２０および２１に示している。

コレン（Ｃｏｌｌｅｎ　ｅｔ　ａｔ、）、ＥＰ″Ａ−４
１７６６号は、（ａ）イミダゾールで溶出する亜鉛キレ
ートアガロース上クロマトグラフィー（ｐＨ７、５）、
（ｂ）α−Ｄ−メチルマンノシド（０、３Ｍ）およびチ
オシアナート（ＩＭ）で溶出するレクチンアガロース上
クロマトグラフィー（コンカナバリンＡセファロース０
ＸｐＨ７、５）および（Ｃ）架橋デキストラン上ゲル濾
過（セファデックス０Ｇ−１５０）によるメラノーマ細
胞培養からのｔＰＡの精製を開示している。

クルイトフら、バイオケミカル・ジャーナル（Ｋｒｕｉ
ｔｈｏｆ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｃｈｅｓ、　Ｊ　、
）、２２６．６３１〜６３６（１９８５）は、（ａ）調
整培地の遠心分離、（ｂ）該上清へのツイーン”８０お
よびＮａＮ、の添加および６Ｍ　ＨＣｌ２を用いるｐＨ
の４．５への調整、（Ｃ）該溶液のＳＰ−セファデック
ス０カラム上への通過および（ｄ）ｐＨ４、５にて酢酸
ナトリウム緩衝液中のＮａＣｅを用いたｔＰＡの溶出の
工程を含む血清独立ボウズメラノーマ細胞により産生じ
たｔＰＡに関する精製法を開示している。

トッドら、（Ｄｏｄｄ　ｅｔ　ａｌ、）、ＦＥＢＳＳ　
２０９−（１）、１３（１９８６）は、亜鉛キレートお
よびリジンカラムクロマトグラフィーによるｔＰＡの精
製を報告している。

コレンら、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケ
ミストリー（Ｗａｌｌｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｅｕｒ、
　Ｊ　。

Ｂ　１ｏｃｈｅｓ、）、上３３．６８１（１９８３）は
、（ａ）チオシアナート（３Ｍ）で溶出するセファロー
ス■に結合した抗−ブタｔＰＡを用（またアフイニテイ
クロマトグラフィー（ｐＨ７，３）、（ｂ）塩化グアニ
ジン（ＩＭ）で溶出するアルギニン−セファロース■上
アフィニテイクロマトグラフイ−（ｐＨ７゜３）および
（Ｃ）セファデックス　Ｇ−１５０上ゲル濾過によるメ
ラノーマ細胞培養からのｔＰＡの精製を報告している。

ムラカミら（Ｍｕｒａｋａｍｔ　ｅｔ　ａｌ、）、米国
特許第４５５２７６０号は、フィブリンアガロース（フ
ィブリンセファロースＱ）、レクチンアガロース、亜鉛
キレートアガロースまたは抗ｔＰＡ抗体を用いたアブイ
ニテイクロマトグラフイー、カルボキシメチルアガロー
ス（０Ｍセファロース０）上イオン交換およびゲル濾過
によるｔＰＡの精製を示唆している。代表的な精製は、
（ａ）硫酸アンモニウム沈澱、（ｂ）０Ｍセファロース
上イオン交換クロマトグラフィー、　（Ｃ）リジンセフ
ァロース０上アフイニテイクロマトグラフイーおよび（
ｄ）ゲル濾過（セファクリルＯ８−２００）であると述
べられている。例として、ムラカミらは、抗ウロキナー
ゼ抗体を用いたアフィニティクロマトグラフィー、つい
でフィブリンセファロース０上、その後コンカナバリン
Ａセファロース■およびゲル濾過（セファデックス’Ｇ
−１５０）による肺組織細胞培養からの精製を開示して
いる。

ウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ）、ＥＰ−Ａ−１１３３１９
号は、１５〜１７頁に前記の操作のいくつかならびにア
りイーゲル０ブルー上クロマトグラフィーおよびアルギ
ノベンズアミジンセファロースＯ上クロマトグラフィー
を包含するいくつかのｔｐＡ精製法を報告している。Ｄ
Ｅ−３セフアロース０を用いたアフィニティクロマトグ
ラフイーを特に例示している。実施例５をも参照。

ウェイら（Ｗｅｉ、　ｅｔ　ａｌ、）、ＥＰ−Ａ−１７
８１０５号は、（ａ）デキストラン−ポリエチレングリ
コール抽出、（ｂ）色素を用いたアフィニティクロマト
グラフィー、（ｃ）抗ｔＰＡ抗体を用いたアフィニティ
クロマトグラフィーおよび（ｄ）ゲル濾過によるｔＰＡ
の精製を開示している。

マレフィトら（Ｍａｌｅｆｙｔ　ｅｔ　ａｌ、）、ヨー
ロッパ特許出願第８６３０５７９４．９号は、ｐＨ３、
５〜５．５における緩衝液中のｔＰＡからなるｔＰＡの
製剤処方を開示している。

ハセガワら（Ｈａｓｅｇａｗａ　ｅｔ　ａｌ、）、米国
特許出願第４５６８５４４号は、溶出のためにｐＨ８，
９緩衝液を用いたＣＭセファロースＯ上イオン交換クロ
マトグラフィーからなることを特徴とする処理による細
胞培養からのｔＰＡの精製を開示している。

ラドクリフら、アルカリ土類・オブ・バイオケミストリ
ー・アンド・バイオフィジークス（ＲａｄｃｌｉｆＴｅ
　ｅｔ　ａｔ、、　Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ、）、１８９−１１８５（＋９７８）は、Ｎ
ａＣ＋２を…いて溶出するｐＨ７、５におけるセファロ
ース０４Ｂに結合したリジン上アフィニティクロマトグ
ラフィー、ついでセファデックス０Ｇ−１５０上ゲル濾
過（ｐＨ７，５）による血漿からのｔＰＡの精製を開示
している。

光胛ｏ２祢 本発明は、細胞培養からのｔＰＡを精製するために用い
うる処理工程および好ましい完全処理の新しい知見に関
する。特に、１つの態様において、本発明は、まず、ｔ
ＰＡを調整培地から単離するための「捕捉工程」に関す
る。この態様において、本発明は、該培地とｔＰＡを吸
着する固体担体を接触させ、該担体を＜ｐｔ−ｔｓに緩
衝した水で洗浄し、かつ、該ｔＰＡを、＜ｐＨ５に緩衝
したアルカリまたはアルカリ土類金属塩またはカオトロ
ープの水溶液で溶出することからなる。

もう１つの態様において、本発明は、ｔＰＡ含有不純水
溶液と固体疎水性担体を接触させ、それによりｔＰＡを
該担体に吸着させ、ついで極性有機溶媒で該担体から該
吸着ｔＰＡを溶出することを特徴とするｔＰＡ含有不純
水溶液からｔＰＡを精製する方法に関する。

さらにもう１つの態様において、本発明は、粒子の大き
さが５０μ買以下であり、かつ、分子量１０００〜３０
００００の分離範囲を有するサイズ排除ゲルにｔＰＡ含
有不純溶液を流し、かつ、ｔＰＡを収集することを特徴
とするｔＰＡ含有不純溶液からｔＰＡを精製する方法に
関する。

もう１つの態様において、本発明は、 （ｉ）ｔＰＡを産生ずる細胞培養からの調整培地とｔＰ
Ａを吸着する固体担体を接触させ、＜ｐＨ５に緩衝した
水で該担体を洗浄し、ついで＜ｐＨ５に緩衝したアルカ
リまたはアルカリ土類金属塩および／またはカオトロー
プの水溶液でｔＰＡを溶出し、 （ｉｉ）工程（ｉ）の溶出液からのｔＰＡを選択的に沈
澱させ、かつ、ｐＨ２〜５．５にて該沈澱をカオトロー
プ含有水溶液中に再溶解し、 （ｉｉｉ）工程（ｉｉ）からの再溶解沈澱とアフィニテ
ィ担体を接触させ、かつ、＜ｐＨ５にてカオトロープ含
有水溶液でｔＰＡを溶出させ、 （ｉｖ）工程（ｉｉｉ）の溶出液と疎水性担体を接触さ
せ、それによってｔＰＡを該担体に吸着させ、ついで、
ｐＨ２〜５．５にて極性有機溶媒で該担体から吸着ｔＰ
Ａを溶出し、 （ｖ）工程（ｉｖ）の溶出液とイオン交換樹脂を接触さ
せ、ｔＰＡを＜ｐＨ５にてカオトロープ含有水溶液で収
集し、 （ｖｉ）工程（ｖ）からのｔＰＡの溶液を、粒子寸法が
５０μｍ以下であり、かつ、ゲルの分離範囲が分子量１
０００〜３０００００であるサイズ排除ゲルに通し、か
つ、該精製ｔＰＡを収集することを特徴とするｔＰＡを
産生ずる細胞培養からの調整培地からｔＰＡを精製する
方法に関する。

発明の詳細 な説明は、ｔＰＡの不純溶液からｔＰＡを単離し、かつ
、精製するための方法に用いうる３つの処理工程からな
る。これらは、「第１捕捉工程」、逆相クロマトグラフ
ィー法およびサイズ排除クロマトグラフィー法である。

これらの各工程は、産生じた組換え体または天然の原核
または真核生物細胞培養からのｔＰＡを単離し、かつ、
精製する全ての処理に到達するための本発明の他の処理
工程を包含する他の処理工程と組合せうる。

これらのおよび他の有用な処理工程を、「第１捕捉工程
」、逆相クロマトグラフィー法、イオン交換クロマトグ
ラフィー法およびサイズ排除クロマトグラフィー法から
なることを特徴とする本発明の代表的全処理に関連して
以下に記載する。以下のこの処理の記載において、「第
１捕捉工程」および逆相クロマトグラフィーの間に、選
択的沈澱および第２吸着クロマトグラフィー工程が包含
される。本発明のこの処理は、調整培地、すなわち、ｔ
ＰＡを産生ずる細胞培養から収獲した培地からの生物活
性ｔＰＡの単離および回収のために行なわれる。かかる
処理は、血清または血清成分、特にアルブミンを含有す
る培地の場合に特に有用である。したがって、かかる処
理は、組換え体チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）
細胞、組換え体ハムスター腎臓細胞、組換え体マウスま
たはラットメラノーマ細胞、メラノーマ細胞培養および
組換え体昆虫細胞培養を包含する組換え体または他の細
胞培養によって発現されたｔＰＡの精製に用いうる。

調整培地は、パッチ培養系からデカンテーションするこ
とによりまたは流通系から培地を収集することにより収
獲する。該培地は、所望により、濾過および／または遠
心分離などによって清澄化し、ｔＰＡを、まず、吸着ク
ロマトグラフィーによって単離する。この工程は、それ
以上の処理のための培地の容積を実質的に減じるが、ｔ
ＰＡの大部分を単離するので、「第１捕捉工程」と称す
る。

そのような吸着クロマトグラフィーは、高流速、かっ、
高効率にて大量の培地を処理しうる固体担体を用いる。

そのような吸着クロマトグラフィーの例としては、ポリ
クローナルまたはモノクローナル抗体、金属キレート化
剤、リジン、アルギニン、フィブリン、ＤＥ−３、種々
の染料、ホウ酸、フェニルボロネート、コンカナバリン
Ａ、ｐ−アミノベンズアミジンおよびベンズアミジンの
ようなアフィニティリガンドを用いたクロマトグラフィ
ーが挙げられる。好ましい捕捉工程は、金属キレートク
ロマトグラフィー、特に亜鉛キレートクロマトグラフィ
ーである。そのような方法は、一般に、ポラスら（Ｐｏ
ｒａｔｈ　ｅｔ　ａｌ、）、ネイチャー、１５８．５９
８（１９７５）に記載されている。該担体は、例えば、
デキストラン、アガロースまたはポリアクリルアミドゲ
ルのような軟質ゲル、フラクトゲル０ビニルポリマーゲ
ル、３２〜６３μ肩サイズ［ピース・ケミカル・コーポ
レーション、ロックフォード、イリノイ（Ｐｉｅｒｃｅ
　　ＣｈｅｓｉｃａｌＣｏ、、　Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、　
　Ｉ　１ｌｉｎｏｉｓ）］またはｐＨ５以下で安定であ
るｔＰＡ吸着可能ないずれもの他の担体でありうる。

ｔＰＡ溶出前にｐ）１５以下に緩衝した水で該吸着担体
を洗浄し、かつ、ｐＨ５以下にてｔＰＡをアルカリまた
はアルカリ土類金属、例えば、ＮａＣＱ、ＫＣＱ、Ｍｇ
ＣＱｔまたはＣａＣ１２ｔまたはカオトロープ、例えば
、グアニジン、塩化グアニジン、チオシアナート、尿素
またはエチレングリコールの水溶液で溶出することによ
り、該捕捉工程が強化され、実際に、精製に著しく効果
があるという知見を得た。

例えば、標準的方法に従い、約中性ｐＨで亜鉛キレート
カラムを洗浄すると調整培地からかなりの量の不純物が
除去されるが、＜ｐＨ５での第２洗浄は、予期しないこ
とに、それ以上の顕著な量の不純物を除去する。例えば
、代表的な実験において、亜鉛キレートカラムを、酢酸
アンモニウムでｐＨ４、５に緩衝した０、２５ＭＮａ０
ｆｆで溶出する前に、まず、酢酸アンモニウムでｐＨ６
に緩衝した水、ついで酢酸アンモニウムでｐＨ４，５に
緩衝した水で完全に洗浄した場合、第１洗浄は、回収し
たｔＰＡの量にほぼ等しい量の不純物を除去し、第２洗
浄は、２８０ｎ−における吸光度を示すクロマトグラム
のピークの比較により測定した場合、ｔＰＡの量の約ｌ
Ｏ％に等しい予期しないほど大量の不純物を除去した。

該捕捉工程を実施する際、洗浄は、まず、ｐｉ５より大
、例えば、ｐＨ６〜８、好ましくは約ｐＨ６で行ない、
その後、該ｐＨを＜ｐＨ５、例えば、ＰＨ４，０〜４．
９、好ましくは約ｐＨ４、５に下げる。該緩衝剤は、い
ずれのもの水溶性酸／塩、例えば、酢酸、アジピン酸、
クエン酸、乳酸、酒石酸、アスパラギン酸およびグルタ
ミン酸ならびにそれらの塩でありうる。好ましい緩衝剤
は酢酸アンモニウムである。

ｔＰＡを溶出させるために、＜ｐＨ５、例えば、１）８
４．０〜４．９にて無機アルカリまたはアルカリ土類金
属塩またはカオトロープの溶液を用いる。

好ましい溶出溶液は、０．１Ｍ酢酸アンモニウム（ＰＨ
４，５）中０．１〜１．０Ｍ１好ましくは０．２５Ｍ塩
化ナトリウムである。

該捕捉工程から得られた不純溶液は、好ましくは逆相ク
ロマトグラフィー前にさらに部分的に精製する。該部分
的精製は、例えば、選択的沈澱、イオン交換、アフィニ
ティクロマトグラフィー、濾過、順相クロマトグラフィ
ーおよびサイズ排除またはこれらのいずれもの組合せま
たは他の工程を包含するいずれもの手段によって実施し
うる。

好ましくは、該不純溶液は部分的に精製して、ｔＰＡが
、逆相操作前に全タンパク質含量に基づいて、少なくと
も約５０％、好ましくは約７５〜９５％の純度であるよ
うにする。

逆相操作前に好ましい純度の度合いを達成するための処
理工程の例としては、選択的沈澱、例えば、塩沈澱また
は他の選択的沈澱操作および少なくともｌ吸着工程、例
えば、アフィニティクロマトグラフィーまたはイムノア
フィニティクロマトグラフィーが挙げられる。

塩析は、例えば、硫酸塩、リン酸塩またはクエン酸塩と
アンモニウム、カリウムまたはナトリウムのような１価
カチオンを段階的濃度勾配法にて加えることにより行な
う。洗浄後、ｔｐＡｉｔｌ含有フラクションを低ｐＨ１
例えばｐＨ２〜５．５にて再懸濁する。選択的沈澱のた
めの他の薬剤としては、炭素数１〜３のアルコール、ア
セトン、アセトニトリルまたはテトラヒドロフランのよ
うな有機溶媒、ポリエチレングリコールのような有機ポ
リマー、ポリアクリレートのような多価電解質、カプリ
ル酸塩およびリバノールが挙げられる。

第２吸着クロマトグラフィー工程については、種々のリ
ガンドを用いうる。これらは、前記のアフィニティリガ
ンドを包含する。溶出は特異的、すなわちアフィニティ
溶出であるか、またはｐａｌもしくはイオン強度の変更
またはそうでなくｔｐＡの形態の変更によるような一般
的なものでありうる。

例えば、ベンズアミジン担体、例えば、ベンズアミジン
−アガロースを用いるのが有用であることが判明した。

そのような操作については、硫酸アンモニウムペレット
を、カオトロープおよびデタージェント、例えば、０．
０１％ツイーン８゜の存在下に約ＰＨ５にて緩衝溶液、
例えば、０゜１Ｍ酢酸アンモニウム中に再溶解するのが
好ましい。

該溶液を、２８０ｎｓにて、好ましくは、約５〜６ユニ
ツトの吸光度に希釈し、ゲル１ｚ（ｌ当り８〜１５Ａｔ
＊ｏユニツト、好ましくは、約１２Ａ＊ｓｏユニツトの
量にて該担体に付す。好ましくは、カオトロープの濃度
は低く、例えば、４Ｍグアニジンまたは塩化グアニジン
まで、５０％（ｖ／Ｖ）エチレングリコールまで、６Ｍ
尿素までまたは２Ｍチオシアン酸カリウムまでである。

最も好ましいカオトロープは、約０．１〜０．４Ｍ塩化
グアニジンである。

溶出は、ｐＨを＜ｐＨ５、例えば、約ｐＨ４に下げるこ
とにより行なう。

本発明の好ましい処理において、選択的沈澱および第２
吸着クロマトグラフィー工程によって処理した第１捕捉
工程からの部分的精製溶液を、ついで逆相クロマトグラ
フィーにより処理する。

逆相クロマトグラフィーは疎水性担体を用い、水性溶媒
からタンパク質を吸着し、ついで極性有機溶媒、代表的
にはアルコール−水混合にて選択的に溶出する。該極性
有機溶媒は、ポリペプチド上の疎水性領域を置換するこ
とによって溶出させる。タンパク質、特に、該活性が形
態依存であるタンパク質の活性を減少せしめる苛酷な条
件を用いるため、多くのタンパク質はこの方法で精製で
きない。

逆相クロマトグラフィーは、いずれの疎水性担体、例え
ば、アルキル置換炭化水素またはアルミナゲルを用いう
るが、代表的にはアルキルシリカ担体を用いて行なう。

好ましい担体は、２〜１８個、好ましくは４個の炭素結
合シリカである。他のシランとしては、オクチルジメチ
ル、オクタデシルジメチル、フェニルジメチル、オクチ
ル、オクタデシルおよびフェニルシランが挙げられる。

粒子サイズは５〜１００μｍ、好ましくは、約１５〜２
０μ肩でありうる。代表的な孔サイズは２００〜５００
人である。

逆相工程前の不純溶液は、好ましくは、例えば、ヘプタ
フルオロ酪酸、酢酸、リン酸またはトリフルオロ酢酸で
非常に低いｐＨ，例えば、１．５〜３゜５に調整する。

不純溶液中に含まれるカオトロープまたは有機溶媒、例
えば、０．１〜０．４Ｍ塩化グアニジンは、明らかに、
ｔＰＡ集合体を解離させることにより分離を改善する。

溶出は、代表的には、増加最の有機溶媒、例えば、アセ
トニトリル、ジオキサン、テトラヒドロフランまたは水
混和性アルコール、例えば、エタノール、メタノール、
ｎ−プロパツールまたはイソプロパツールを加え、疎水
性相互作用を減少させる。好ましい溶出濃度勾配法は、
０．１％トリフルオロ酢酸を含有する０〜３０％イソプ
ロパツールである。

逆相クロマトグラフィー後、１またはそれ以上の最終精
製工程が、医療縁ｔＰＡである生成物を生産するのに好
ましい。好ましくは、これらは、標準イオン交換樹脂ま
たは機能性担体を用い、カオトロープの存在下、低ｐＨ
１すなわち、ｐＨ２〜５．５にて溶出するイオン交換ク
ロマトグラフィーおよびその後のサイズ排除である。

イオン交換工程は、ｔＰＡを濃縮し、かつ、有機溶媒を
除去する役割をする。好ましくは、この操作は、カルボ
キシメチルまたはスルホプロピル担体のようなカチオン
交換担体を用いて行なう。

別法として、ジエチルアミノエチルまたは４級アミノエ
チル担体のようなアニオン交換担体を用いうる。ついで
、ｔＰＡを含有するイオン交換カラムから収集したフラ
クションをサイズ排除により処理しうる。

該サイズ排除工程は、分子量１０００〜３００Ｏ００の
分離範囲を有する小粒子、例えば、約５０μ肩以下の充
填を用いて行なう。そのようなゲルの使用により、残留
する痕跡の高分子量不純物を除去しうろことが見出され
た。例えば、２０〜４０μ肩の平均粒子サイズおよび分
子量１０００〜３０００００の分離範囲を有するスペロ
ース０１２架橋アガロース［ファルマシア、ピスカタウ
ェイ、ニューシャーシー（Ｐ　ｈａｒａａｃｉａ、　Ｐ
　ｉｓｃａｔａｗａｙ。

Ｎ　ｅ＊　　Ｊ　ｅｒｓｅｙ）］は、サイズ排除前に前
記操作を行なった後、血清を含有する調整培地からのｔ
ｐＡ調製物中に存在する高分子量（〈約９００００ＭＷ
）不純物から約７００００の分子量を有するｔＰＡを容
易に分離しうろことを見出した。そのようなサイズ排除
による物理的に同等なタンパク質の分離は予期しないも
のであった。この操作は、また、ダイマーを含むｔＰＡ
集合体および核酸ならびに存在する場合にはウィルス粒
子を除去する。

該サイズ排除工程は、好ましくは、カオトロープ、好ま
しくは２Ｍ塩化グアニジンの存在下に＜ｐＨ５に調整し
て行なう。カオトロープは集合体を破壊し、この工程に
おいて認識されている有効な分離を可能にする。通常、
ｔＰＡは、そのようなカオトロープを含有する溶出緩衝
液を用いて該カチオン交換樹脂から溶出しうる。これは
解離を促進し、ｔＰＡ集合体の形成を最小限にする。

ｔＰＡを含有するサイズ排除工程からのフラクションを
、最終処方、滅菌処方およびバッキングのために収集す
る。最終処方前に、塩を、例えば、堺析、透析濾過、蒸
発または、例えば、セフアデックス　Ｇ−２５、バイオ
ゲルＯＰ２またはバイオゲルＯＰ４上緩衝液交換（ｂｕ
ｔｔｅｒ　ｅｘｃｈａｎｇｅ）により除去しうる。

前記のごとく、本発明の各処理工程は、本発明の処理工
程であるかそうではない他の処理工程と組合せうる。好
ましくは、本発明の処理工程は、以下の式Ｉに例示した
ごとく組合せる。

式Ｉ 調整培地 ↓　　Ｚｎキレートフラクトゲル０ 溶出液 ↓　　硫酸アンモニウム 沈澱 ↓　　洗浄／溶解／ａ過 濾液 ↓　　ベンズアミジンアガロース 溶出液 ↓　　ＨＰＬＣ（逆相） フラクション ↓　　ＣＭ−セファロースＯ 溶出液 ↓　　スペロース■１２ フラクション ↓　　緩衝液交換／透析濾過濃縮 濃縮 ↓　　　０．２μｍフイルター バルクｔＰＡ生成物 式Ｉに示した処理は、大規模処理に適したクロマトグラ
フィーカラムを用いる。全操作を通じて低ｐ）［を用い
ることは、ｔＰＡの安定性および溶解度が増大するため
に有利であり、かつ、予期しないことに、低ｐＨはより
効率的な分離を可能にする。また、低１）Ｈは、調整培
地におけるタンパク質加水分解酵素を抑制する傾向があ
る。また、該処理の条件は、可能なウィルス不純物を不
活化するようなものである。最も重要なことには、高収
率の未変性な完全に活性な純粋ｔＰＡが、この処理を用
いることにより得られる。

該精製後、純粋ｔＰＡ溶液を滅菌濾過し、その後の医薬
投与のため、マレフットら、ヨーロッパ特許出願第８６
３０５７９４．９号に記載されているごとく処方する。

寒叛牲 つぎに実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが
、これらに限定されるものではない。該処理を前記式Ｉ
に要約する。調整培地は、胎児ウシ血清（５％ｖ／ｖ）
、ゲンタマイシン（０，０５９／ρ）、メトトレキセイ
ト（２００ｎＭ）、デキサメタシン（１８Ｍ）およびＮ
　ａＨＣＯｓ（２、２９／　（２）を補足したヌクレオ
シド含有最少必須培地（ＭＥＭ）アルファ（１）の収穫
培地［ハゼルトン・リサーチ・プロダクツ、デンバー、
ペンシルベニア（）（ａｚｅｌｔｏｎＲｅｓｅａｒｃｈ
、　Ｄｅｎｖｅｒ、　Ｐｅｎｎ５ｙｌｖａｎｉａ）コに
て増殖した組換え体チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨ
Ｏ）細胞から収穫した。

１　亜鉛キレートカラム 亜鉛キレートフラクトゲルのカラム（１，５〜７Ｑ）は
、亜鉛イオンが溶出液中に検出しえなくなるまで、５倍
カラム容量の０．０５ＭＥＤＴＡ、５倍カラム容量の０
．０５Ｍ炭酸水素アンモニウム、５倍カラムの容量の脱
イオン水、５倍カラムの容量の７．：３ｔＭ　ＺｎＣ１
２ｔおよび１０倍カラム容量の平衡緩衝液（ＩＭ　Ｎａ
Ｃ（！、２０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ２）でフラクトゲル
ＴＳＫＨＷ−６５Ｆ上に固定化したイミノジ酢酸のカラ
ムの平衡を行なうことにより、用いる１日前以内に調製
する。カラムの大きさにより６〜５０１２／ｈｒの流速
にて該カラム上に調整培地（１００〜５００ｆｆ）をポ
ンプで汲み上げる。該カラムを５倍カラム容量の平衡緩
衝液、５倍カラム容量の０．１Ｍ酢酸アンモニウム（ｐ
Ｈ６。

０）および２倍カラム容量の０．１Ｍ酢酸アンモニウム
（ｐＨ４、５）で洗浄する。ついで、該生成物を５倍カ
ラム容量の溶出緩衝液（０，１Ｍ酢酸アンモニウム、０
．２５Ｍ　ＮａＣｆｆ、ｐＨ４，５）で溶出する。Ｓ−
２２５１検定［ウニインベルブら、ジャーナル・オブ・
イムノロジカル・メソッズ（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ　ｅｔ　
ａ＋、、　　Ｊ、　　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈ、）
、７−号−１２８９（１９８４）コにより測定したｔＰ
Ａ含有フラクションをそれ以上の処理のために貯蔵する
。

２、硫酸アンモニウム沈澱 硫酸アンモニウム細粒を該亜鉛キレートカラムからの貯
蔵フラクションの溶液に徐々にに加え、５２％飽和終濃
度とする。該懸濁液を４℃で３０分間撹拌し、少なくと
も４℃で１２時間放置する。

該スラリーをベックマンＪ６Ｂ遠心分離機［ベックマン
・インスツルメンツ、フラートン、カリホルニアＣＢｅ
ｃｋｍａｎ　　Ｉｎ５ｔｒｕｔｒｒｅｎｔｓ、　ＦｕＩ
Ｉｅｒｔｏｎ。

Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）］にて４℃、３０分間４０００
　ｒｐｍで遠心分離し、次工程に用いるまで一７０℃で
貯蔵する。

Ｓ−２２５１検定によって測定した約１２〜１６９のｔ
ＰＡを含有する溶解硫酸アンモニウムペレット（２００
〜３００９）を５２％飽和硫酸アンモニウム２〜３Ｑ中
に再懸濁し、該スラリーを４°Ｃ１３０分間、ベックマ
ンＪＡＩＯローター中、約９０００ｘｇにて遠心分離し
て、さらに処理するための洗浄ペレットを得る。

３、ベンズアミジンアガロースカラム 前記工程にて得た洗浄硫酸アンモニウムペレツ）を、０
．２Ｍ塩化グアニジンおよび０．０１％ツイーン８０含
有０．１Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ５゜０）中に溶解し
、該溶液を５〜６のＯＤ　ｔ　＠。に希釈する（終容積
約７ｅ）。該溶液を０．２２μｍフイルターで濾過し、
２１２のベンズアミジンアガロース［（６−アミノカプ
ロン酸を介して架橋４％ビーズ状アガロースに結合した
固定化ｐ−アミノベンズアミジン（ピース・ケミカル・
カンパニー、ロックフォード、イリノイ（Ｐ　１ｅｒｃ
ｅ　　ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ、　Ｒｏｃｋｆ
ｏｒｄ、　　Ｉ　１ｌｉｎｏｉｓ）］で充填したカラム
に、３１２／ｈｒの流速にて付す。該カラムを、８１２
／ｈｒの流速にて０．１Ｍ酢酸アンモニウム、０゜３Ｍ
塩化グアニジン、０．３Ｍチオシアン酸カリウム、０，
０１％ツイーン８０（ｐＨ５，０）含有溶液８１２で洗
浄した。ｔＰＡは、８１２／ｈｒの流速にて０．２Ｍ塩
化グアニジンおよび０．０１％ツイーン８０含有０．１
Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ４，０）で該カラムから溶出
する。２８０ｎｍにて該溶出液のＵＶ吸光度をモニター
することにより測定したｔＰＡ含有フラクションを約５
Ｑの容量までプールする。

４、逆相クロマトグラフィー 該ベンズアミジンアガロースカラムからのプールしたフ
ラクションの溶液、４℃でトリフルオロ酢酸（Ｔ　Ｆ　
Ａ）を用い、２．１“／−０，１のｐＨに調整し、０．
１％トリフルオロ酢酸水溶液で前平衡した５、ｌＸ２５
ｃｍカラム中に充填したヴイダク（ｖｙｄａｃ）２１４
ＴＰ、　３００ＡＣ−４（１５〜２０μｍシリカ）［セ
パレーションズ・グループ、ヘスペリア、カルホルニア
（Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ　　Ｇｒｏｕｐ。

Ｈｅ５ｐｅｒｉａ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）］上約１
９ずつをＢｏｘ（１／分の流速にて０．１％トリフルオ
ロ酢酸含有θ〜３０％イソプロパツール濃度勾配法を用
いてクロマトグラフィーに付す。所望の生成物は、２２
０ｎｓで溶出液のＵＶ吸光度をモニターすることにより
検出した場合、約２７％イソプロパツールで溶出する。

５、ＣＭセファロースクロマトグラフィー該逆相クロマ
トグラフィーからのｔＰＡを含有する合したフラクショ
ンの溶液を等容量の１Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ４，５
）で希釈し、１００ｍ１２／分の流速にて４００ｚＱの
０Ｍセファロース（ファルマシア、ビスカタウエイ、ニ
ューシャーシー）のカラム上にポンプで汲み上げる。該
カラムを約１．２１２の０．５Ｍ酢酸アンモニウム（ｐ
Ｈ４、５）、１．２１２の１Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ
４、５）で洗浄し、所望の生成物を２Ｍ塩化グアニジン
含有０゜１Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ４，０）で溶出す
る。該溶出液中のｔＰＡは、２８０ｎｍでＵＶ吸光度を
モニターすることにより検出する。ｔＰＡ含有フラクシ
ョン（約６００〜８００ｘＱ中）をそれ以上の処理のた
めにプールする。

６、スペロースー１２クロマトグラフィー該ＣＭセファ
ロースカラムから分離した生成物を、スペロース１２プ
レツブ級の８Ｑカラム上、２Ｍ塩化グアニジン含有０．
１Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ４、０）を用いて２００〜
３００ｍ（ずつ３〜４回クロマトグラフィーに付す。フ
ラクションをＨＰＬＣ分析により測定した純度に基づい
てプールする。

７、緩衝液交換 ０．１Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ４）を用い、所望の生
成物を含有するスペロースー１２カラムからのフラクシ
ョンのプールをセファデックスＧ−２５の８Ｑカラム上
、２〜３回ずつクロマトグラフィーに付し、緩衝液交換
を行なう。該溶出液を２８０ｎｓにてＵＶでモニターし
、所望の生成物を含有するフラクションをプールし、Ｐ
Ｍ−３０膜を取付けた限外濾過で２２”／−１のＯＤｌ
、。まで撹拌細胞を濃縮する。該濃縮溶液を０．２２μ
肩カートリツジで濾過して、純粋な処方用バルクｔＰＡ
を得る。

別法として、合したスペロースー１２生成物をＰＭ−３
０膜を取付けた限外濾過で２２“／」のＯＤｌ、。まで
濃縮し、ＩＯ容の０．１Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ４）
に対して透析濾過する。濃縮した溶液を０．２２μｍカ
ートリツジで濾過して純粋な処方用バルクｔＰＡの溶液
を得る。

アメリカン・ダイアグツステイカ（ＡｍｅｒｉｃａｎＤ
　ｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）活性標準（アメリカン・ダイ
アグツステイカ、グリーンウィッチ、コネチカット）を
用い、７０００００１Ｕ／１ｇと仮定したＳ−２２５１
検定により測定した約２０９のｔＰＡを含有する１　６
６７１２の調整培地から始めた代表的生産実験の結果を
第１表に示す。

第１表の第１ｓは、アメリカン・ダイアグツステイカ活
性標準を用いたＳ−２２５１検定により測定した該処理
の各工程に存在する生物活性の全量を１０億の国際単位
（Ｂ　Ｉ　Ｕ）で示している。

第１表の第２欄は、該精製の過程の間の生物活性の累積
回収％を示している。生物活性の全回収は３７％であっ
た。第３欄は、工程当りの回収％を示す。

該処理の間のｔＰＡの質量回収は、ＨＰＬＣ分析で測定
した。該亜鉛キレート捕捉カラム後の工程についての各
段階に存在するダラムで表わしたｔＰＡの水準を第４欄
に示す。調整培地に存在するｔＰＡの量は、この検定で
は測定しえない。第５欄は、ＨＰＬＣ分析により検定し
たそれらの工程についての工程当りのｔＰＡの回収％を
示す。

第６欄は、精製処理の各工程における全タンパク質含量
を示す。５％胎児ウシ血清（ＦＣＳ）含有調整培地中の
全タンパク質水準は、Ｆ’ＣＳが４０Ｉ１９／１１Ｑタ
ンパク質を含有しているので２９膜ｇと算定しうる。調
整培地のタンパク質含量の大部分は、添加したＦＣＳに
由来する。各精製工程において存在する全タンパク質（
ｔＰＡ十不純物）の全量は、１．８Ａ＊ｓ。ユニットが
１ｙｉｇ／ｘＱタンパク質に相当すると仮定して、２８
０ｎｓにてＵＶで算定した。

該処理の各工程の比活性は、ＩＵで示したＳ−２２５１
活性（第１欄）を全タンパク質含量（第６ｍ）で割るこ
とにより算出し、ＩＵ／ｘ９で示す。

１、アメリカン・ダイアグツステイカ活性標準２．ＢＩ
ｔＪ＝１０”夏Ｕ ３．２９／Ｃ全タンパク質であると算出される調整培地
（５％血清）以外、！、８０Ｄ＝１次ｇ／１ｘ（ｌ全タ
ンパク質と仮定。

４、比活性は、各工程の全Ｓ−２２５１活性（第１ＩＩ
ｌｌＩ）を全タンパク質含虫（第６欄）で割ることによ
り算出した。

痕跡量の核酸不純物を測定するのは技術的に困難である
ため、ＤＮＡの除去は、各工程について約５００塩基対
の３２Ｐ−標識ＤＮＡを用いて浄化因子により測定した
。全処理についての算定した全浄化因子は６Ｘ１０”で
ある。

前記処理によるウィルス不活化は、該処理の各工程のそ
れらと実質的に同様の時間および条件下のレトロウィル
スのインキュベーションにより示す。該逆相およびイオ
ン交換工程についての全不活化因子は、３．７ｘｌＯ”
以上であると推定される。

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. （１）ｔＰＡを産生する細胞培養からの調整培地とｔＰ
   Ａを吸着する固体担体を接触させ、該担体を＜ｐＨ５に
   緩衝した水で洗浄し、ついで該ｔＰＡを＜ｐＨ５に緩衝
   したアルカリまたはアルカリ土類金属塩またはカオトロ
   ープの水溶液で溶出することを特徴とするｔＰＡを産生
   する細胞培養からの調整培地からｔＰＡを精製する方法
   。
2. （２）該洗浄工程を、まず、＞ｐＨ５にて行ない、その
   後、該ｐＨ４．０〜４．９に下げる前記第（１）項の方
   法。
3. （３）該担体が金属キレートリガンドを含有する前記第
   （１）項の方法。
4. （４）該担体が亜鉛キレートカラムであり、かつ、その
   中の該担体をｐＨ４．０〜４．９にて洗浄する前記第（
   ３）項の方法。
5. （５）該ｔＰＡを０．１〜１．０ＭＮａＣｌにて溶出す
   る前記第（４）項の方法。
6. （６）該洗浄工程を、まず、０．１Ｍ酢酸アンモニウム
   中約ｐＨ６にて行ない、その後、該ｐＨを約ｐＨ４．５
   に下げ、かつ、該ｔＰＡをｐＨ４．５にて０．１Ｍ酢酸
   アンモニウム中０．２５ＭＮａＣｌで溶出する前記第（
   ５）項の方法。
7. （７）ｔＰＡ含有不純水溶液と疎水性担体を接触させ、
   それによりｔＰＡを該担体に吸着させ、ついで、ｐＨ２
   〜５．５にて極性有機溶媒で該担体から該吸着ｔＰＡを
   溶出することを特徴とするｔＰＡ含有不純水溶液からｔ
   ＰＡを精製する方法。
8. （８）該不純溶液が、該溶液と該疎水性担体を接触させ
   る前に少なくとも約５０％の純度であり、かつ、該疎水
   性担体が炭素数２〜１８のアルキルシリカである前記第
   （７）項の方法。
9. （９）該溶液と該疎水性担体を接触させる前に、該不純
   溶液をｐＨ１．５〜３．５に調整し、かつ、グアニジン
   、塩化グアニジン、尿素、チオシアナートまたはエチレ
   ングリコールを該不純溶液に添加する前記第（８）項の
   方法。
10. （１０）該不純溶液を、少なくとも１吸着クロマトグラ
    フィー工程により、ｔＰＡを産生する細胞培養からの調
    整培地から得る前記第（８）項の方法。
11. （１１）該調整培地を、該溶液と該疎水性担体を接触さ
    せる前に、（ｉ）亜鉛キレート担体を用い、かつ、ｐＨ
    ５以下にて塩で溶出する吸着クロマトグラフィー、（ｉ
    ｉ）硫酸アンモニウム沈澱、ついで（ｉｉｉ）吸着クロ
    マトグラフィーにより部分的に精製する前記第（１０）
    項の方法。
12. （１２）ベンズアミジン担体を用い、かつ、＜ｐＨ５に
    て溶出することにより該第２吸着クロマトグラフィーを
    行なう前記第（１１）項の方法。
13. （１３）該疎水性担体からの該吸着ｔＰＡの溶出後、該
    精製溶液をイオン交換樹脂と接触させ、グアニジン、塩
    化グアニジン、尿素、チオシアナートまたはエチレング
    リコールの存在下にｐＨ２〜５．５にて溶出する前記第
    （１１）項の方法。
14. （１４）粒子の大きさが５０μｍ以下であり、かつ、ゲ
    ルの分離範囲が分子量１０００〜３０００００であるサ
    イズ排除ゲルに溶液を通し、かつ、ｔＰＡを収集するこ
    とを特徴とするｔＰＡ含有不純溶液からｔＰＡを精製す
    る方法。
15. （１５）該溶液がグアニジン、塩化グアニジン、尿素、
    チオシアナートまたはエチレングリコールを含有し、か
    つ、サイズ排除前に＜ｐＨ５に調整する前記第（１４）
    項の方法。
16. （１６）含有サイズ排除ゲルがスペロース＾（＾Ｒ＾）
    １２である前記第（１５）項の方法。
17. （１７）該溶液が０．１Ｍ酢酸アンモニウムおよび２Ｍ
    塩化グアニジンを含有し、かつ、サイズ排除前に約ｐＨ
    ４である前記第（１６）項の方法。
18. （１８）（ｉ）ｔＰＡを産生する細胞培養からの調整培
    地とｔＰＡを吸着する固体担体を接触させ、＜ｐＨ５に
    緩衝した水で該担体を洗浄し、ついで＜ｐＨ５に緩衝し
    たアルカリまたはアルカリ土類金属塩および／またはカ
    オトロープの水溶液でｔＰＡを溶出し、 （ｉｉ）工程（ｉ）の溶出液からのｔＰＡを選択的に沈
    澱させ、かつ、ｐＨ２〜５．５にて該沈澱をカオトロー
    プ、塩化グアニジン、尿素、チオシアナートまたはエチ
    レングリコール含有水溶液中に再溶解し、 （ｉｉｉ）工程（ｉｉ）からの再溶解沈澱と吸着担体を
    接触させ、かつ、＜ｐＨ５にてカオトロープ含有水溶液
    でｔＰＡを溶出させ、 （ｉｖ）工程（ｉｉｉ）からの溶出液と疎水性担体を接
    触させ、それによってｔＰＡを該担体に吸着させ、つい
    でｐＨ２〜５．５にて極性有機溶媒で該担体から吸着ｔ
    ＰＡを溶出し、 （ｖ）工程（ｉｖ）からの溶出液とイオン交換樹脂を接
    触させ、＜ｐＨ５にてカオトロープ含有水溶液でｔＰＡ
    を収集し、 （ｖｉ）工程（ｖ）からのｔＰＡの溶液を、粒子寸法が
    ５０μｍ以下であり、かつ、ゲルの分離範囲が分子量１
    ０００〜３０００００であるサイズ排除ゲルに通し、か
    つ、該精製ｔＰＡを収集する工程からなることを特徴と
    するｔＰＡを産生する細胞培養からの調整培地からｔＰ
    Ａを精製する方法。