FI88308B - Foerfarande foer rengoering av tpa fraon raoapreparat - Google Patents

Description

1 883C3

Menetelmä tPA:n puhdistamiseksi raakavalmisteista Tämä keksintö kohdistuu menetelmään kudosplasminogeeniaktivaat-torin (tPA) puhdistamiseksi, tarkemmin sanoen menetelmään tPA:n puhdistamiseksi tPA:n raakavalmisteesta, joka sisältää useita tPA-lajeja erilaisilla molekyylipainoilla ja muita proteiinipi-toisia epäpuhtauksia, saattamalla tPA:n raakavalmiste kosketuksiin hydroksiapatiitin kanssa, sekä eristämällä ja puhdistamalla eri molekyylipainoisia tPA-lajeja eluenteilla, joiden pH ja/tai suolakonsentraatiot on säädetty etukäteen, ja joihin tarpeen vaatiessa voidaan lisätä yhtä tai useampaa lisäainetta.

Hydroksiapatiitin käyttö tPA:n puhdistamiseksi on sinänsä tunnettua. Menetelmässä, jossa käytetään hydroksiapatiittia tPA:n saamiseksi tPA:n raakavalmisteesta, tPA adsorboidaan hydroksiapatiittiin, jonka jälkeen se eluoidaan tPA-kantavasta hydroksiapatiitista ammoniakkipitoisella liuoksella (ks. esim.

'·· julkinen japanilainen patenttijulkaisu nro. 76419/1986). Yllä ···· kuvatussa eluoinnissa käytetyt olosuhteet eivät mahdollistaneet • ·' eri molekyylipainoisten tPA-lajien erottamisen toisistaan ja lisäksi tPA:n aktiviteetti saattoi laskea.

Tämän keksinnön tarkoituksena on tarjota menetelmä jokaisen tPA-lajin eristämiseksi tPA:n raakavalmisteista - joilla on erilaiset molekyylipainot ja jotka reagoivat anti-humaanison tPA:n vasta-aineen kanssa, jolloin tPA:N aktiviteetti ei muutu koko puhdistusprosessin aikana, poiketen näin yllämainitusta konventionaalisesta menetelmästä. Näihin tPA-lajeihin kuuluvat 2 883C3 tPA, tPA:n aktiiviset hajoamistuotteet, tPA:n polymeerit, tPA:n kompleksit ja muut proteiinit ym.

Kun tPA-tuottavia soluja viljellään tPA:n saamiseksi, on todettu että muodostunut viljelyliemi, anti-humaanisten tPA-vasta-aineiden kanssa reaktiivisia olevina proteiineina, sisältää laajan joukon tPA-lajeja joilla on erilaiset molekyylipai-not, mihin joukkoon kuuluvat sellaiset tPA-lajit joiden mole-kyylipainot vaihtelevat 30000 - noin 45000 dalton:iin, tPA-lajit joiden molekyylipainot vaihtelevat noin 50000 noin 70000 daltonriin sekä tPA-lajit joiden molekyylipainot ovat noin 100000 daltonia tai korkeampia.

Tämän vuoksi keksinnön kohteena olevan menetelmän tarkoituksena on tarjota menetelmä tietyn molekyylipainon omaavan tPA:n eristämiseksi ja puhdistamiseksi joukosta tPA-lajeja, joiden molekyylipainot vaihtelevat, sekä eri olomuodoissa olevista pro-teiinipitoisista epäpuhtauksista, kuten yllä mainittiin.

Kyseessä olevat keksijät ovat suorittaneet laajan tutkimustyön saavuttaakseen yllä mainitun tavoitteen. Tuloksena on että tPA:n adsorptioaste hydroksiapatiittin riippuu pH:sta ja/tai suolakonsentraatiosta sekä myös vaihtelee tPA:n molekyylipainon mukaan. tPA:n sidosvoimakkuus hydroksiapatiittiin kasvaa nimittäin pH:n laskiessa tai suolakonsentraation pienentyessä. Samalla pH:lla ja samalla suolakonsentraatiolla korkeamman molekyylipainon omaava tPA adsorboituu tiiviimmin.

Yllä mainittu löytö on sitten johtanut tämän keksinnön mukaisen 3 88303 menetelmän loppuunsaatamiseen, missä keksinnössä joukko tPA-lajeja, joiden molekyylipainot vaihtelevat adsorboidaan hydrok-siepatiittiin jonka jälkeen tämä käsitellään eluenteilla, joiden pH:t ja/tai suolakonsentraatiot vaihtelevat, jotta tiettyjen tPA-lajien eristäminen puhtaassa muodossa onnistuisi.

Yksi tämän keksinnön tarkoituksista on täten tarjota menetelmä tPA:n puhdistamiseksi tPA:n raakavalmisteesta, joka sisältää joukon tPA-lajeja joiden molekyylipainot vaihtelevat, missä menetelmässä ensin saatetaan tPA:n raakavalmiste kosketuksiin hydroksiapatiitin kanssa jolloin eri tPA-lajit adsorboituvat hydroksiapatiittiin jonka jälkeen tPA-lajit eluoidaan eluenteilla, joiden pH:t ja/tai suolakonsentraatiot vaihtelevat, jolloin saadaan eri molekyylipainoja omaavat tPA-lajit eristetyksi toisistaan.

Vaikkakin hydroksiapatiitin käyttö proteiinien puhdistamiseksi on tullut tunnetuksi, ei ole ilmoitettu että olisi voitu eristää tietty tPA-laji joukosta tPA-lajeja, niin kuin tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä.

Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä tPA voidaan saada talteen jopa 90 - 100 %:isesti aktiviteettina mitattuna ja se voidaan myös eristää yksilöllisiin tPA-lajeihin joiden molekyy lipainot vaihtelevat käyttämättä nestemäistä ammoniakkia eluenttina tPA:n adsorboimiseksi hydroksiapatiittiin, konventionaalisista menetelmistä poiketen.

Kudosplasminogeeniaktivaattoria (tPA) tuotetaan korkeampien eläinten kudoksissa, ja se on proteiini joka aktivoi plasmino- geenin, plasmiinin pr i'ku r sor .in joka on fibrii.nille spesifinen p ro t eo1yy 11 inon entsyymi.

4 88303

Kyseessä oleva tPA tuotetaan viljelyväliäineessa viljelemällä ihmisen melanoomnsoluja, normaaleja ihmissoluja, tai soluja jotka kantavat ihmisen tPA-geenin integroituna rekombinantti DNA-teknologian mukaisesti. tPA jota saadaan muodostuneesta vi1jelyliemestä käsittää laajan joukon tPA-lajeja joiden mole-kyylipainot vaihtelevat.

tPA:n raakavalmiste, johon kyseessä olevan keksinnön mukainen menetelmä voidaan tehokkaasti soveltaa, sisältää useita mole-kyylilajeja joita on valmistettu yllä olevan esimerkin mukaisesti. Se voi esiintyä muodossa joka sisältyy viljelyliemeen tai se voi esiintyä muodossa joka saadaan osittain puhdistamalla valmiste tällaisesta viljelyliemestä. Keksintö ei kuitenkaan rajoitu näihin. Keksinnön mukaista menetelmää voidaan soveltaa jokaiseen vesipitoiseen väliaineeseen joka sisältää useita tPA-lajeja joiden molekyylipainot vaihtelevat ja jotka on valmistettu erilaisilla menetelmillä.

Tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä tällainen raaka tPA-valmiste saatetaan ensin kosketuksiin hydroksiapatiitin kanssa ,-ri tPA-lajien adsorboi mi seksi hyd r oksi.apat i i 11 i i n.

Käytetyn hydroks i apat. i iti n suhteen ei ole rajoituksia. Yleensä on mahdollista käyttää kal.siuinf osf natista koostuvaa hydreksia- p ; ;i j 'oka on vai ».i s! oi 1 n '..>hi>nk i n toi \ ottajan muotoon eri- 5 8 8 3 L 3 i laisia valmistusmenetelmiä käyttäen. Kromatografiaa varten valmistettu hydroksiapatiitti on erityisen suositeltavaa moniin tarkoituksiin.

Vesipitoinen väliaine, joka sisältää useita eri tPA-lajeja t.PA:n raakavalmisteena saatetaan kosketuksiin sellaisen hydrok siapatiitin kanssa, että eri molekyylipainon omaavat tPA-lajit adsorboituvat. Mitkään tietyt rajoitukset eivät määrää olosuhteita yllä mainitun kosketuksen aikaansaamiseksi. Kosketus voidaan näin ollen saada aikaan yleisellä kolonnimenetelmällä tai panosmenetelmällä. Kolonnimenetelmässä vesipitoinen, tPA-lajeja sisältävä väliaine saatetaan virtaamaan joko ylä- tai alavirtaan kolonnin läpi, joka on täytetty hydroksiapatiitilla siten että tPA-lajit saatetaan kosketuksiin hydroksiapatiitin kanssa, jolloin se adsorboituu hydroksiapatiittiin. Panosmene-telmässä toisaalta, hydroksiapatiittia ja useita eri tPA-lajej sisältävää vesipitoista väliainetta sekoitetaan keskenään, jotta tPA-lajit joutuisivat kosketuksiin hydroksiapatiitin kanssa. Erilaiset tPA-lajit, joiden molekyylipainot vaihteleva ja jotka ovat adsorboituneet hydroksiapatiittin eristetään tämän jälkeen toisistaan.

Tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä eluenttien pH-arvot ja/tai suolakonsentraatiot muunnellaan sen mukaan minkälainen, halutun molekyylipainon omaava tPA-laji halutaan eluoida. Saa* taa olla kannattavaa lisätä eluentteihin lisäaine eluoinnin jr eri molekyylilajien eristämisen kiihdyttämiseksi ja edesautta mi.ueksi.

6 88303 Tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä alin pH-arvo eiuentille on yhtä kuin alin pH-arvo jolloin käytetty hydroksiapatiitti ei vielä liukene. Toisaalta pH-arvon yläraja on korkein pH-arvo jolloin eri molekyylipainon omaavat tPA-lajit, jotka reagoivat anti-humaani sen tPA-vasta-aineen kanssa, voidaan vielä eristää toisistaan. Mikä tahansa eluentti näiden pH-rajojen sisällä voidaan näin ollen käyttää, mutta pH on edullisesti 5 - 10, edullisimmin 6-9.

Tämän lisäksi käytetään suolaa tPA:n eristämiseksi hydroksiapa-tiitista. Tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä käytetty suola on sellainen suola jolla ei ole kelaatiokykyä. Siten on mahdollista käyttää esimerkiksi suolaa joka sisältää kaotroop-pisen ionin kuten tiosyanaatti tai perkloraatti, tai kloridi, fluoridi, fosfaatti, karbonaatti, sulfaatti, nitraatti, boraat-ti, asetaatti tai joku muu vastaava. Edullisista suoloista voidaan mainita natriumfosfaatti, kaliumfosfaatti, natriumklo-ridi, kaliumkloridi, ammoniumtiosyanaatti, natriumsulfaatti, natriumboraatti, natriumasetaatti jne.

Lisäaineena voidaan käyttää emäksisiä aminohappoja tai niiden johdannaisia kuten arginiinia, lysiinia, ornitiinia tai amtnokaproehappoa, pitoisuuksissa jotka ovat 1 mM - 0,5 M, (•(lull isosti 5 mM - 0,3 M eluenttiin nähden. Käyttämällä tällaista lisäainetta sisältävää eleuenttia eluointi helpottuu vielä enemmän, ja se sallii myös tehokkaamman eristämisen tPa-lajeihin joilla on eri molekyylipainot.

Jotta saadaan haluttu tPA-laji eristetyksi niistä useista eri 7 883C3 tPA-lajeista, jotka ovat adsorboituneet hydroksiapatiittin, on välttämätöntä käyttää eluenttia , jonka pH ja/tai suolakonscn-traatio on säädetty siten, että halutut tPA-lajit eluoituvat selektiivisesti kuten yllä on esitetty. Eluenttiin voidaan tarpeen vaatiessa lisätä lisäaine.

Ne tPA-lajit joiden molekyylipainot ovat alhaiset eluoituvat ensin, jonka jälkeen seuraavat peräkkäin eri tPA-lajit molekyy lipainon kasvaessa sitä mukaa kun eluentin pH kasvaa alemmalta tasolta ylemmälle tasolle. Käytetty suolakonsentraatio ei riipu pelkästään suolan laadusta vaan myös eluentin pH-arvosta.

Seuraava yhteys on voimassa pH:n, suolakonsentraation ja eristettävän tPA-lajin molekyylipainon välillä:

Kun eluentti sisältää 0,02 - 0,1 M fosfaattia ja sen pH on 6 -9, voidaan eluoida ne tPA-lajit, joiden molekyylipainot vaihte-levat 30000 - noin 45000 daltonin välillä. Toisin sanoen, jotta saadaan eristettyä ne tPA-lajit joiden molekyylipainot vaihte-levat 30000 daltonin - noin 45000 daltonin välillä eluointi tapahtuu edullisesti sellaisten optimiolosuhteiden vallitessa, että fosfaattikonsentraatio on 0,02 - 0,1 M ja pH on 6 - 9. Tämän jälkeen voidaan eluoida ne tPA-lajit, joiden molekyyli-painot vaihtelevat 45000 daltonin ja noin 70000 daltonin välillä, pH-arvon ollessa 7 - 9 ja fosfaatl ikonsentraation ollessa 0,03 - 0,1 M. tPA-lajit joiden molekyylipainot liikkuvat 70000 daltonin lähellä voidaaan eluoida pH:n ollessa 6 - 9 ja fosfaat. ikonsentraation ollessa 0,04- 0,3 M. Lopuksi voidaan eluoida ne tPA-lajit joiden molekyylipainot ovat 70000 daltonin 8 8 8 3 G 8 ja 100000 dal tönin välillä tai 100000 daltonin yläpuolella, pH:n ollessa 6 - 10 ja fosfaattikonsentraation ollessa 0.04 -0.5 M.

Kun eluointi tapahtuu natriumkloridia sisältävällä eluentilla on edullista suorittaa tPA-lajien adsorptio hyd roks.i apat i. i tt i in NaCl-konsentraation ollessa 0.03 M tai alempi ja pH-alueella 6 - 8. tPA-lajit joiden molekyy1ipainot vaihtelevat 30000 daltonin ja noin 45000 daltonin välillä voidaan eluoida pHrssa 6-9 ja NaCl-konsentraatiolla 0.03 - 0.15 M. Tämän jälkeen voidaan eluoida ne tPA-lajit, joiden molekyylipainot vaihtelevat 45000 daltonista noin 70000 daltoniin, pH-arvon ollessa 7 - 9 ja NaCl-konsentraation ollessa 0.05 - 0.15 M. tPA-lajit joiden molekyylipainot liikkuvat noin 70000 daltonin lähellä voidaan sitten eluoida pH:ssa 6 - 9 ja NaCl-konsentraatiolla 0.07 - 0.7 M. Lopuksi ne tPA-lajit, joiden molekyylipainot ovat 70000 daltonin ja 100000 daltonin välillä sekä 100000 daltonin yläpuolella voidaan eluoida pH:n ollessa 6 - 10 ja NaCl-konsentraation ollessa 0.07 - 1.0 M.

Kuten yllä on esitetty voidaan eristää ja saada halutun mole-kyylipainon omaava tPA-laji joko peräkkäisellä eluoinnilla tai selektiivisesti käyttämällä tiettyä suolaa, tiettyä suolakon-sontraatiota ja tiettyä pH:ta.

Kyseessä oleva keksintö kuvataan seuraavilla esimerkeillä.

Esi iner kki 1 : IV.wonin me 1 a nooma soi u ja viljellään RPMI 1 640 vil jely väl i ai nees- i 9 883C3 sa (Gibco) täydennettynä 10 % termoinaktivoitua (56eC, 30 minuuttia) vasikkasikiöseerumia (FCS, Gibco), jonka jälkeen solut kerätään ja pestään kerran. Pestyt solut viljellään sitten 24 tunnin ajan seerumivapaassa väliaineessa ja muodostunut viljelysupernatantti otetaan talteen.

Anmoniumsulfaattia lisättiin nopeudella 300 g/1 2 l:aan vilje-lysupernatanttia. Muodostuneen seoksen pH säädettiin 7,0 ja annettiin seistä yön yli 4eC:ssa.

Muodostunut saostuma kerättiin sentrifugoimalla, liuotettiin 0,01 M fosfaattipuskuria (pH 6,0) ja dialysoitiin sitten samaa puskuria vastaan suolan poistamiseksi. Dialysoitunut liuos syötettiin tämän jälkeen kolonniin jossa oli 5 ml:aa hydroksi-apatiittia, jota oli tasapainotettu 0.01 M fosfaattipuskurilla (pH 6,0).

Kolonnineste kerättiin talteen ja sen plasminogeeniriippuvaine! fibrinolyyttinen aktiviteetti mitattiin. Mitään aktiivisuutta ei havaittu.

Adsorboituneet proteiinit eluoitiin käyttämällä 0,03 M fosfaat tipuskuria (pH 6,0).

Eluaatin plasminogeeniriippuvainen fibrinolyyttinen aktiviteet ti mitattiin. Tulokseksi saatiin 2 % kolonniin syöteystä aktiviteetista.

Tälle eluoidulle fraktiolle tehtiin elektroforeesi SDS-poly- ίο 8 8 3 C 3 akryyliamidigeelillä ja se analysoitiin symografialla. Plas-minogoeniaktivaattorina nauhat tulivat näkyviin välillä 30000 -45000 daltonia.

Kolonni pestiin tämän jälkeen 0,05 M fosfaattipuskurilla (pH 7,5). Eluaatin plasminogeeniriippuvainen fibrinolyyttinen aktiviteetti mitattiin. Tulokseksi saatiin 3 % kolonniin syötetystä aktiviteetista.

Tälle eluoidulle fraktiolle tehtiin elektroforeesi SDS-poly-akryyliamidigeelillä ja se analysoitiin symografialla. Plas-minogeeniaktivaattorina nauhat tulivat näkyviin välillä 45000 -70000 daltonia.

Tämän jälkeen hydroksiapatiittikolonni käsiteltiin 0,02 M fosfaattipuskurilla (pH 7,0).

Eluaatin plasminogeeniriippuvainen fibrinolyyttinen aktiviteetti mitattiin. Tulokseksi saatiin 85 % kolonniin syötetystä aktiviteetista.

Tälle eluoidulle fraktiolle tehtiin elektroforeesi SDS-poly-akryyliamidigeelillä ja se analysoitiin symografialla. Plas-minogeeniaktivaattorina nauhat tulivat näkyviin noin 70000 daltonin molekyylipainolla.

Jäljellä olevat adsorboituneet proteiinit eluoitiin 0,4 M fosfaattipuskurilla (pH 7,5).

11 883C3

Eluaatin plasminogeeniriippuvainen fibrinolyyttinen aktiviteet ti mitattiin. Tulokseksi saatiin 5 % kolonniin syötetystä akti viteetista.

Tälle eluoidulle fraktiolle tehtiin elektroforeesi SDS-poly-akryyliamidigeelillä ja se analysoitiin symografiällä. Plas-minogeeniaktivaattorina nauhat tulivat näkyviin välillä 70000 -100000 daltonia sekä sen yläpuolella.

Esimerkki 2: 2 1 viljelysupernatanttia, joka oli valmistettu ihmissikiön esinahkasoluviljelmästä, mikä viljelyväliaine sisälsi 10 % termoinaktivoitua (56°C, 30 minuuttia) vasikkasikiöseerumia ja 20 KIU/ml aprotiinia (Bayer), stabiloitiin 0,02 % "Tween 80":11a (Junsei Chemicals), jonka jälkeen se syötettiin kolonniin joka sisälsi anti-humaanista urokinaasia.

Kolonnin läpi mennyt liuos kerättiin ja sen plasminogeeniriippuvainen fibrinolyyttinen aktiviteetti mitattiin. Noin 60 % kolonniin syötetystä aktiviteetista oli jäljellä.

Tämä liuosfraktio analysoitiin symografiällä sen jälkeen kun sitä oli analysoitu SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla Useita eri nauhoja todettiin plasminogeeniaktivaattoreina mole kyylipainoalueella 30000 daltonista noin 150000 daltoniin.

Todettiin että nämä nauhat vastasivat tPA:ta koska ne eivät muuttuneet käsiteltäessä anti-humaaniseila urokinaasilla mutta hävisivät käsiteltäessä anti-humaanisella tPA-vasta-aineella.

12 883C8

Ammoniumsulfaattia lisättiin tähän liuosfraktioon nopeudella 300 g/1. Muodostuneen liuoksen pH säädettiin 7,0 ja sen annettiin seistä yön yli 4°C:ssa.

Tällöin muodostunut saostuma kerättiin sentrifugoimalla, jonka jälkeen seurasi dialyysi 0,03 M fosfaattipuskuria (pH 6,8) vastaan.

Dialysoitu liuos syötettiin tämän jälkeen kolonniin jossa oli 5 ml hydroksiapatiittia 0,03 M fosfaattipuskurilla (pH 6,8) tasapainotettuna . Kolonnil iuos kerättiin ja sen plasminogeeniriip-puvainen fibrinolyyttinen aktiviteetti mitattiin. Tulokseksi saatiin 2 % kolonniin syöteystä aktiviteetista. Tälle eluoi-dulle fraktiolle tehtiin elektroforeesi SDS-polyakryyliamidi-goelillä ja se analysoitiin symografiällä. Plasminogeeniakti-vaattorina nauhat tulivat näkyviin välillä 30000 - 45000 dalto-nia.

Kolonni pestiin 0,05 M fosfaattipuskurilla (pH 7,8). Eluaatin plasminogeeniriippuvainen fibrinolyyttinen aktiviteetti mitattiin. Tulokseksi saatiin 5 % kolonniin syötetystä aktiviteetista. Symograafilla saatiin näkyviin ne tPA-lajit joiden molekyy-lipainot ovat välillä 45000 - 70000 daltonia.

Adsorboituneet proteiinit eluoitiin 0,25 M fosfaattipuskurilla (pH 6,0). Eluaatin plasminogeeniriippuvainen fibrinolyyttinen aktiviteetti oli noin 80 % kolonniin syötetystä aktiviteetista.

Sen molekyylipainoksi saatiin noin 70000 daltonia symograafil- 13 883C3 la.

Jäljelle jääneet adsorboituneet proteiinit eluoitiin 0,3 M Na2HP0^ puskurilla (pH 10,0).

Eluaatin plasminogeeniriippuvainen fibrinolyyttinen aktiviteet. ti mitattiin. Tulokseksi saatiin noin 10 % kolonniin syötetyst aktiviteetista. Molekyylipainot liikkuivat 70000 ja 100000 daltonin välillä sekä sen yläpuolella symograafilla mitattuina .

Esimerkki 3: 2 1 viljelysupernatanttia, joka oli valmistettu kiinalaisen hamsterin munasarjasoluviljelmästä (CHO) integroituna ihmisen tPA-geenin kanssa (CHO Kl ATCC CCL 61), mikä viljelyväliaine sisälsi 10 % termoinaktivoitua (56°C, 30 minuuttia) vasikka-sikiöseerumia ja 40 KIU/ml aprotiinia stabiloitiin 0,02 % "Tween 80":lla, jonka jälkeen sen pH säädettiin 5,0 fosfori-hapolla.

Muodostunut liuos syötettiin kolonniin jossa oli 50 ml karb-oksimetyyli (CM) Sepharoosia (Pharmacia AB) tasapainotettuna 0,05 M natriumdivetyfosfaattipuskurilla (pH 5,0), joka sisälsi 0,15 M natriumkloridia ja "Tween 80" (0,02 %).

Adsorboituneet hartsipitoiset proteiinit pestiin 0,05 M fos-faattipuskurilla (pH 6,4), minkä jälkeen tPA eluoitiin 0,05 M .·*: fosfaattipuskurilla (pH 6,4), joka sisälsi 0,5 M natr iumkl or i- dia. Eluaatin plasminogeeniriippuvainen fibrinolyyttinen akti- viteetti mitattiin. Noin 85 % kolonniin syötetystä aktivitee tista oli jäljellä.

I* 883C8 t

Eluoitu fraktio analysoitiin symografiällä SDS-polyakryyli-amidigeelielektroforeesin jälkeen. Useita eri tPA-nauhoja to- i dettiin molekyylipainoalueella 30000 - noin 150000 daltonia. ! i

Eluaatti laimennettiin kymmenkertaisella määrällä vettä ja syötettiin sen jälkeen 5 ml hydroksiapatiittia sisältävään kolonniin, joka oli tasapainoitettu 5 mM natriumfosfaatti-puskurilla (pH 6,4), joka sisälsi 0,05 M natriumkloridia. Kolonniliuos kerättiin ja sen plasminogeeniriippuvainen fibri-nolyyttinen aktiviteetti mitattiin. Tulokseksi saatiin 3 % kolonniin syötetystä aktiviteetista. Tälle eluoidulle fraktiolle tehtiin elektroforeesi SDS-polyakryyliamidigeelillä ja se analysoitiin symografiällä. Plasminogeeniaktivaattorina nauhat tulivat näkyviin välillä 30000 - 45000 daltonia.

Kolonni eluoitiin sitten 5 mM fosfaattipuskurilla (pH 7,4), joka sisälsi 0,08 M natriumkloridia. Noin 7 % kolonniin syötetystä aktiviteetista oli jäljellä. Symograafilla analysoitaessa tämän eluidun fraktion nauhat vastasivat 45000 - noin 70000 daltonin molekyylipainoja. Kolonni käsiteltiin tämän jälkeen 5 mM fosfaattipuskurilla (pH 7,8), joka sisälsi 0,3 M natrium-kloridia. Eluaatin aktiviteetti vastasi noin 80 % kolonniin syötetystä aktiviteetista. Symograafilla analysoitaessa eluaatin nauha vastasi noin 70000 daltonin molekyylipainoa.

Jäljelle jääneet adsorboituneet proteiinit eluoitiin 5 mM fos- is 883C8 faattipuskurilla (pH 7,8)# joka sisälsi 0,5 M natriumkloridia. Eluaatin aktiviteetti oli noin 10 % kolonniin syötetystä aktiviteetista. Symograafilla analysoitaessa tämän eluaatin nauhat vastasivat molekyylipainoja 70000 ja 100000 daltonin välillä sekä vielä sen yläpuolella.

Esimerkki 4:

Kaksi litraa viljelysupernatanttia, joka oli valmistettu hiirei fibroblastisesta soluviljelmästä (C127, ATCC CRL 1616) ja transformoitu ihmisen tPA-geenillä (Suomalainen patenttihakemu 864777), mikä viljelyväliaine sisälsi 2 % termoinaktivoitua (56°C, 30 minuuttia) vasikkasikiöseerumia ja 40 KIU/ml aprotii nia, stabiloitiin "Tween 80":lla (0,02 %).

Muodostunut liuos syötettiin kolonniin jossa oli 50 ml anti-... humaanista tPA-vasta-ainetta Sepharoosilla, tasapainotettuna ;·’ 0,1 M ammoniumbikarbonaatin vesiliuoksella (pH 8,0), joka sisälsi 0,15 M natriumkloridia ja "Tween 80 " (0,02 S).

Adsorboituneet proteiinit pestiin ensin 0,1 M vesipitoisella ammoniumbikarbonaattiliuoksella (pH 8,0), joka sisälsi 2,0 M natriumkloridia ja "Tween 80" (0,02 %), jonka jälkeen proteiinit eluoitiin 0,1 M vesipitoisella natriumbikarbonaattiliuok-sella (pH 8,0), joka sisälsi 2,0 M ammoniumtiosyanaattia ja "Tween 80" (0,02 %).

' : Eluaatin plasminogeeniriippuvainen fibrinolyyttinen aktivitect ti mitattiin. Noin 90 % kolonniin syötetystä aktiviteetista oi; :··; jäljellä.

16 8 8 3 C 8

Eluoitu fraktio analysoitiin symografiällä SDS-polyakryyli-amidigeelielektroforeesin jälkeen. Useita eri tPA-nauhoja todettiin molekyylipainoalueella 30000 - noin 150000 daltonia.

Tämä eluaatti laimennettiin kaksikymmenkertaisella määrällä vettä ja sen pH säädettiin 7,5. Muodostunut liuos syötettiin kolonniin jossa oli 5 ml hydroksiapatiittia tasapainotettuna 5 mM vesipitoisella ammoniumbikarbonaatilla (pH 7,5), joka sisälsi 0,1 M ammoniumtiosyanaattia, jonka jälkeen kolonni pestiin samalla puskurilla mitä käytettiin yllä mainittuun tasapainottamiseen .

Kolonniliuos kerättiin ja sen plasminogeeniriippuvainen fibri-nolyyttinen aktiviteetti mitattiin. Tulokseksi saatiin 5 % kolonniin syöteystä aktiviteetista. Liuos analysoitiin symo-graafilla. Plasminogeeniaktivaattorina nauhat tulivat näkyviin välillä 30000 - noin 70000 daltonia.

Kolonni käsiteltiin sitten 0,1 M vesipitoisella ammoniumbikarbonaatilla (pH 8,0), joka sisälsi 0,2 M ammoniumtiosyanaattia. Eluaatin aktiviteetti oli noin 90 % kolonniin syötetystä aktiviteetista. Symograafilla analysoitaessa eluaatin nauha vastasi noin 70000 daltonin molekyy1ipainoa.

Kolonni pestiin edelleen 0,1 M ammoniumbikarbonaatin vesiliuoksella (pH 8,0), joka sisälsi 0,5 M ammoniumtiosyanaattia. Noin 5 % kolonniin syötetystä aktiviteetista mitattiin näin saadusta eluaatista. Symograafi11a analysoitaessa eluaatin nauhat vasta- i7 8 8 3 C 8 sivat noin 70000 - 100000 daltonin ja sitä korkeampaa molekyy-lipainoa.

Esimerkki 5: 2 1 viljelysupernatanttiin, joka oli valmistettu ihmisen sikiö amnioottisesta soluviljelmästä (PL, ATCC CCL-62), joka kantoi ihmisen tPA-geenin assosioituneena ihmisen sytomegaloviruksee.n (HCMV) ihmisen tPA-ilmaisun promoottorina, mikä viljelyväliain. sisälsi 2 % termoinaktivoitua (56eC, 30 minuuttia) vasikka-sikiöseerumia ja 20 KIU/ml aprotiinia, lisättiin ammoniumsul-faattia nopeudella 300 g/1. Muodostuneen seoksen pH säädettiin arvoon 7,0 ja annettiin sen jälkeen seistä yön yli 4°C:ssa.

Näin muodostunut saostuma kerättiin sentrifugoimalla, jota seurasi dialyysi 0,04 M fosfaattipuskuria (pH 8,0) vastaan jok.· sisälsi 10 mM arginiinia saostuman suolanpoistamiseksi.

Näin saatu dialysoitu liuos syötettiin kolonniin jossa oli 5 mi hydroksiapatiittia tasapainotettuna 0,04 M fosfaattipuskurilla (pH 8,0), joka sisälsi lOmM arginiinia. Kolonni pestiin tasa-painoitukseen käytetyllä puskuriliuoksella.

Kolonniliuos kerättiin ja sen plasminogeeniriippuvainen fibri-nolyyttinen aktiviteetti mitattiin. Tulokseksi saatiin 5 % kolonniin syötetystä aktiviteetista. Liuos analysoitiin symo-graafilla. Plasminogeeniaktivaattorina nauhat tulivat näkyviin välillä 30000 - noin 70000 daltonia.

Kolonni käsiteltiin sitten 0,2 M fosfaattipuskurilla (pH 6,0), 18 88308 joka sisälsi 50 mM arginiinia. Eluaatin aktiviteetti oli noin 90 % kolonniin syötetystä aktiviteetista. Symograafilla analysoitaessa eluaatin nauha vastasi noin 70000 daltonin molekyylipa! noa.

Kolonni pestiin edelleen 0,5 M fosfaattipuskurilla (pH 7,8), joka sisälsi 50 mM arginiinia. Noin 5 % kolonniin syötetystä aktiviteetista mitattiin näin saadusta eluaatista. Symograafil-la analysoitaessa eluaatin nauhat vastasivat noin 70000 -100000 daltonin ja sitä korkeampaa molekyylipainoa.

Esimerkki 6:

Ihmisen tPA-geenillä transformoituja isäntäsoluja (Saccharomyces cerevisiae) annettiin kasvaa tunnettua menetelmää käyttäen, nimittäin sillä menetelmällä jota kuvataan teoksessa Principles and Practice of Recombinant DNA Research with Yeast in The Molecular Biology of Yeast Saccharomyces : Metabolism and Gene Expression, sivut 603-636, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1982). Muodostuneet solut jauhettiin lasihelmien kanssa. tPA uutettiin 0,01 M fosfaatti-puskurilla (pH 7,0) joka sisälsi 50 mM lysiiniä, 1,0 M natrium-kloridia ja 0,02 % "Tween 80". Muodostunut nesteseos suodatettiin suodoksen keräämiseksi.

Suodos laimennettiin kymmenkertaisesti fosfaattipuskurilla (pH 7,5) ja syötettiin tämän jälkeen kolonniin, joka sisälsi 5 ml hydroksiapatiittia tasapainotettuna 0,01 M fosfaattipuskurilla (pH 7,0), joka sisälsi 5 mM lysiiniä ja 0,1 M natriumkloridia. Kolonni postiin tasapainotukseen käytetyllä puskuriliuoksella.

i 19 883C8

Kolonniliuos kerättiin ja sen plasminogeeniriippuvainen fibri-nolyyttinen aktiviteetti mitattiin. Tulokseksi saatiin 15 % kolonniin syöteystä aktiviteetista. Liuos analysoitiin symo-graafilla. Plasminogeeniaktivaattorina nauhat tulivat näkyviin välillä 30000 - noin 70000 daitonia.

Adsorboituneet proteiinit eluoitiin 0,2 M fosfaattipuskurilla (pH 6,5), joka sisälsi 5 mM lysiiniä. Eluaatin aktiviteetti oi noin 80 % kolonniin syötetystä aktiviteetista. Symograafilla analysoitaessa eluaatin nauha vastasi noin 70000 daltonin mol< kyylipainoa.

Kolonni pestiin edelleen 0,5 M fosfaattipuskurilla (pH 7,8), joka sisälsi 5 mM lysiiniä. Noin 5 % kolonniin syötetystä aktiviteetista mitattiin näin saadusta eluaatista. Symograafil la analysoitaessa eluaatin nauhat vastasivat noin 70000 -100000 daltonin ja sitä korkeampaa molekyylipainoa.

Hydroksiapatiittina käytettiin ; esimerkeissä 1 & 2 HCA-100S . . (Mitsui Toatsu Chemicals, Inc.), esimerkeissä 3 & 4 HA-ultro gel (LKB) ja esimerkeissä 5 & 6 Bio gel-HT (Bio Rad).

Claims (5)

20 8 8 3 C 8

1. Menetelmä eri, vähintään 30000 daltonin molekyylipai-noisten kudosplasminogeeniaktivaattorin (tPA) lajien seoksen erottamiseksi fraktioksi (1), joka sisältää tPA-lajeja joiden 5 molekyylipaino vaihtelee noin 30000 - noin 45000 daltonin välillä, fraktioksi (2) , joka sisältää tPA-lajeja, joiden molekyylipaino vaihtelee noin 45000 - 70000 daltonin välillä, fraktioksi (3) , joka sisältää tPA-lajeja joiden molekyylipaino on noin 70000 daltonia, sekä fraktioksi (4) , joka sisältää 10 tPA-lajeja, joiden molekyylipaino on vähintään noin 100000 daltonia, tunnettu siitä, että (a) mainittu tPA-lajien seos saatetaan kosketukseen hyd-roksiapatiitin kanssa näiden eri, vähintään 30000 daltonin molekyylipainoisten tPA-lajien adsorboimiseksi, 15 (b) käsitellään hydroksiapatiittia mainittujen fraktioiden (1) - (4) eluoimiseksi peräkkäin fosfaattia tai natriumklori-dia sisältävillä eluenteilla (A) - (D) , joiden eluenttien pH, suolakonsentraatiot tai sekä pH että suolakonsentraatiot vaihtelevat mainittujen fraktioiden (1) - (4) eluoimiseksi 20 fraktioittain, siten että: eluentin (A) pH vaihtelee 6-9 välillä, fraktion (1) eluoimiseksi; eluentin (B) pH vaihtelee 7-9 välillä, fraktion (2) eluoimiseksi; 25 eluentin (C) pH vaihtelee 6-9 välillä, fraktion (3) eluoimiseksi; ja eluentin (D) pH vaihtelee 6-10 välillä, fraktion (4) eluoimiseksi; siten, että mainitun eluentin fosfaatti- tai natriumklori-30 dikonsentraatiota nostetaan selektiivisesti järjestyksessä eluentista (A) eluenttiin (D).

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä , että eluentti (A) sisältää 0,02 - 0,1 M fosfaattia, 35 eluentti (B) sisältää 0,03 - 0,1 M fosfaattia, eluentti (C) sisältää 0,04 - 0,3 M fosfaattia ja eluentti (D) sisältää 0,04 - 0,5 M fosfaattia.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että 2i 883C8 eluentti (A) sisältää 0,03 - 0,15 M natriumkloridia, eluentti (B) sisältää 0,05 - 0,15 M natriumkloridia, eluentti (C) sisältää 0,07 - 0,7 M natriumkloridia, eluentti (D) sisältää 0,07 - 1,0 M natriumkloridia.

4. Patenttivaatimuksen 1, 2 tai 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että yksi tai useampi eluenteista sisältää ainakin yhden yhdisteen valittuna joukosta johon kuuluvat emäksiset aminohapot ja niiden analogiset yhdisteet.

5. Patenttivaatimuksen 1, 2 tai 3 mukainen menetelmä, 10 tunnettu siitä, että yksi tai useampi eluenteista sisältää lysiiniä tai arginiinia. 22 8 8 308