FI87793B - Foerfarande foer rengoering av oren tpa - Google Patents

Foerfarande foer rengoering av oren tpa Download PDF

Info

Publication number
FI87793B
FI87793B FI863111A FI863111A FI87793B FI 87793 B FI87793 B FI 87793B FI 863111 A FI863111 A FI 863111A FI 863111 A FI863111 A FI 863111A FI 87793 B FI87793 B FI 87793B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
tpa
human
cells
derived
column
Prior art date
Application number
FI863111A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI87793C (fi
FI863111A (fi
FI863111A0 (fi
Inventor
Mitsuyoshi Morii
Masaharu Ohoka
Toshihiko Suzuki
Nobuhiro Kawashima
Noriko Morii
Original Assignee
Mitsui Toatsu Chemicals
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Mitsui Toatsu Chemicals filed Critical Mitsui Toatsu Chemicals
Publication of FI863111A0 publication Critical patent/FI863111A0/fi
Publication of FI863111A publication Critical patent/FI863111A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI87793B publication Critical patent/FI87793B/fi
Publication of FI87793C publication Critical patent/FI87793C/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6456—Plasminogen activators
    • C12N9/6459—Plasminogen activators t-plasminogen activator (3.4.21.68), i.e. tPA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21069—Protein C activated (3.4.21.69)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Detergent Compositions (AREA)
  • Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)

Description

1 87793
Menetelmä raa'an tPA:n puhdistamiseksi Tämän keksinnön kohteena on menetelmä kudosplasminogee-niaktivaattorin (tPA) puhdistamiseksi ja etenkin menetelmä tPA:n valmistamiseksi eristetyssä ja puhdistetussa muodossa 5 käsittelemällä raakaa tPA:ta erityisellä tPA-inhibiittorilla.
Kudosplasminogeeniaktivaattori (tPA) tarkoittaa eräänlaista proteiinia, jota tuotetaan korkeampien eläinten kudoksissa ja joka aktivoi plasminogeenin, plasmiinin esiasteen, joka on fibriinin spesifinen proteolyyttinen entsyymi.
10 tPA on monessa suhteessa samanlainen kuin urokinaasi, mutta se poikkeaa myös monessa suhteessa urokinaasista. Koska tPA on merkittävä potentiaalisesti käyttökelpoinen trom-bolyyttisenä lääkeaineena, suoritetaan nykyisin intensiivisiä tutkimuksia eri puolilla maailmaa sen valmistusmenetel-15 män suhteen.
tPA:ta on aikaisemmin saatu erottamalla se viljellystä munuaissoluliemestä. Tämä menetelmä ei kuitenkaan ole tarkoituksenmukainen tPA:n valmistamiseksi suurina määrinä. Erityisten solujen viljely, jotka erittävät tPA:ta entistä 20 suurempina määrinä, ja muodostuneen tPA:n eristys ovat tä män päivän tärkeitä tutkimuskohteita.
Tämä keksintö on yllä mainitun tutkimuksen tulosta. Tämän keksinnön tehtävänä on saada aikaan menetelmä, jolla voidaan tuottaa puhdistettua tPA:ta suurina määrinä.
25 Tämän keksinnön eräänä tehtävänä on saada aikaan mene telmä raa'an tPA:n puhdistamiseksi, joka sisältää epäpuhtautena proteiinin, joka reagoi anti-ihmis-tPA-vasta-aineen kanssa ja jonka molekyylipaino on 110.000 ± 20.000 daltonia, jossa menetelmässä raaka tPA saatetaan läheiseen kosketuk-'30 seen affiniteettireagenssin kanssa, joka sisältää immobili- soidun Kunitz-inhibiittorin, jota valmistuu Ervthrina la-tissiman ja muiden Ervthrina-kasvien siemenissä ja joka toimii trypsiinin, plasmiinin ja tPA:n inhibiittorina, mutta ei urokinaasin, niin että tPA kerätään selektiivisesti.
35 Tämän keksinnön yllä mainittu tehtävä ratkaistaan tämän keksinnön mukaisella menetelmällä.
Keksinnön yllä mainitut ja muut kohteet, piirteet ja edut selviävät seuraavasta yksityiskohtaisesta selityksestä ja oheisista patenttivaatimuksista.
2 87793 Tämän keksinnön peruspiirteenä on tietyn erityisen epäpuhtauden poisto, jonka mukaantulo aiheutuu viljelyväliaineesta, johon on lisätty sikiövasikanseerumia, käyttämällä erityistä tPA-inhibiittoria.
5 Kuten yllä erityisesti esitettiin, tässä keksinnössä käy tetään immobilisoitua Kunitz-inhibiittoria, jota valmistuu Erythrina latissiman ja muiden Ervthrina-kasvien siemenissä ja joka toimii trypsiinin, plasmiinin ja tPA:n inhibiittorina, mutta ei urokinaasin.
10 Yllä mainitun inhibiittorin käyttö tPA:n puhdistamiseksi on sinänsä jo tunnettu eurooppalaisesta patenttihakemusjul-kaisusta nro 112122-A.
Yllä mainitun tekniikan tasolla ihmisen melanoomasolujen annetaan kasvaa yhtenä kerroksena RPMI (Rosswell Park Memo- 15 rial Institute) 1640 kudosviljelyväliaineessa, joka sisältää 10 % termoinaktivoitua (56 °C, 30 min.) sikiövasikanseerumia (FCS). Viljelty solu pestään kerran ja sitten se peitetään seerumivapaalla väliaineella. 24 tunnin kuluttua väliaine otetaan talteen ja käsitellään sitten affiniteettireagenssilla, 20 joka sisältäää immobilisoidun Kunitz-inhibiittorin, jota valmistuu Ervthrina latissiman ja muiden Ervthrina-kasvien siemenissä ja joka toimii trypsiinin, plasmiinin ja tPA:n inhibiittorina, mutta ei urokinaasin.
Tekniikan tason menetelmässä käytetään FCS:ä tPA- 25 valmistuksen solun kasvuvaiheessa, mutta tPA-eritysvaihe suoritetaan sen jälkeen, kun solut on pesty kerran ja FCS on poistettu. Tekniikan tason menetelmässä ei esiinny erityisten epäpuhtauksien ongelmaa, jonka ratkaisu on tämän keksinnön päämääränä.
;30 Vaikka tämä keksintö on samankaltainen kuin yllä mainit tu menetelmä, tässä keksinnössä on ratkaistu uusi tekninen ongelma, joka ei kuulu tekniikan tasoon. Tätä keksintöä ei voida siten saada helposti aikaan tekniikan tason perusteella.
35 Tämän keksinnön keksijät tutkivat tPA:n käyttäytymistä, joka on viljellyssä melanoomasoluliemessä, joka saatiin käyttämällä RPMI 1640-viljelyväliainetta, jossa oli 10 % FCS:ä, tsymografiällä SDS-polyakryyliamidigeelielektrofo-reesin jälkeen, ja vertasivat sitä tPAihan, joka oli valmis- 3 87793 tettu lisäämättä sikiövasikanseerumia.
Tämän vertailun mukaisesti havaitaan proteiinikaista, joka reagoi anti-ihmis-tPA-vasta-aineen kanssa ja jonka mo-lekyylipaino on 110.000 ± 20.000 daltonia, tPA:n lisäksi, 5 jonka molekyylipaino on 70.000 daltonia, seerumia sisältävän viljelyväliaineen yhteydessä. Tämä kaista voidaan havaita myös pelkästään jopa seerumivapaan viljelyväliaineen tapauksessa, mutta proteiinin määrä on paljon suurempi seerumia sisältävässä viljelyväliaineessa.
10 Tätä taipumusta ei havaita ainoastaan melanoomasolujen viljelmässä, vaan myös solujen viljelmässä, joka on johdettu normaalista ihmisen kudoksesta tai soluista, jotka on saatu liittämällä ihmisen tPA-geeni käyttämällä rekombinantti-DNA-tekniikkaa. Nimittäin proteiinin katsotaan olevan tPA:n 15 konjugoitunut proteiini ja sitova proteiini tPA:lle, joka on johdettu viljelyväliaineeseen sisältyvästä FCS:stä. Koska proteiini on erilajin proteiinin ja tPA:n konjugoitunut proteiini, proteiinista tulee immunogeeni potilaille, jos se sekoitetaan puhdistettuun tPA-tuotteeseen. Jopa silloin, kun tämä 20 tPA-konjugoitunut proteiini on vesipitoisessa liuoksessa, se ei adsorboidu mihinkään immobilisoituun inhibiittoriin. Tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä on siten mahdollista käyttää affiniteettireagenssia tPA:n konjugoituneen proteiinin poistamiseksi yhdessä adsorboitumattomien epäpuhtauksien kanssa, kun 25 tPA sisältää epäpuhtautena tPA-konjugoituneen proteiinin.
Eräässä edullisessa suoritusmuodossa viljellään eläinso-luja rekombinantti-DNA-tekniikalla niihin liitettyjen ihmisen tPA-geenien kanssa, niin että isäntäsoluista johtuvien yhden tai useamman tPA-epäpuhtauden sekoittumisongelma voi-30 daan välttää, koska niiden sekoittuminen on huolestettuvaa aina, kun tPA:ta tuotetaan käyttämällä muita kuin ihmisten soluja.
Kun isäntäsoluiksi valitaan muita kuin ihmisen soluja ja näin valitut solut tuottavat soluille tyypillistä tPA:ta, 35 tämän erityisen tPA:n uskotaan saavan aikaan immuunireaktion potilaissa.
Affiniteettireagenssi, joka sisältää erityisen inhibiittorin, jota voidaan käyttää tässä keksinnössä, voi yllättävästi erottaa ihmisen solusta johtuvan tPA:n ja isäntäsolus- 4 S7793 ta johtuvan tPA:n toisistaan edellä mainitun tPA:n keräämiseksi tämän keksinnön menetelmän mukaisesti.
Tämä on myös piirre, mitä ei ole käsitelty yllä mainitussa tekniikan tasossa, koska tekniikan tasossa on käsitel-5 ty ainoastaan tPA:ta, joka erittyy melanoomasoluista.
Johdettaessa vesipitoinen väliaine, joka sisältää sekä rekombinantti-tPA:ta että isäntäsolusta johdettua tPA:ta af-finiteettireagenssin kerroksen läpi käytetään 0,5 - 3,0 M/1 (esimerkiksi 1,0 - 2,0 M/l, mieluummin 1,5 M/l) suolaliuos-10 ta. Tässä suolaliuoksen pH on lähes neutraalilla tasolla ja se voi haluttaessa sisältää sopivan stabiloivan määrän pinta-aktiivista ainetta (esimerkiksi "Tween" (tavaramerkki) tai "Triton X-100" (tavaramerkki) 0,1 %:n määränä). Näissä olosuhteissa rekombinantti-tPA adsorboituu affiniteettirea-15 genssin kerrokseen, mutta isäntäsolusta johdettu tPA ei ad sorboidu tähän.
tPA:n desorboimiseksi voidaan käyttää tavanomaista tunnettua menetelmää (ks. eurooppalainen patenttihakemusjulkaisu nro 112122-A).
20 Kuten yllä on esitetty, tässä keksinnössä käytetään tPA:n puhdistamiseksi affiniteettireagenssia, joka sisältää immobilisoidun Kunitz-inhibiittorin, jota valmistuu Erythri-na latissiman ja muiden Ervthrina-kasvien siemenissä ja joka toimii trypsiinin, plasmiinin ja tPA:n inhibiittorina, mutta 25 ei urokinaasin. Tämän keksinnön mukaisen uuden tekniikan an siosta on mahdollista erottaa ja poistaa kaksi epäpuhtautta, s.o. aine, joka reagoi anti-ihmis-tPA-vasta-aineen kanssa ja jonka molekyylipaino on 110.000 ± 20.000 daltonia, ja isäntäsolusta johdettu tPA, joka aiheuttaa ongelmia aina, :30 kun tPA:ta tuotetaan käyttämällä rekombinantti-DNA-tekniik- kaa.
Ainetta, joka reagoi anti-ihmis-tPA-vasta-aineen kanssa ja jonka molekyylipaino on 110.000 ± 20.000 daltonia, ei voida tietenkään poistaa affiniteettireagenssilla, joka 35 sisältää immobilisoidun anti-ihmis-tPA-vasta-aineen. Vieläpä käytettäessä geelisuodatusmenetelmää sitä ei voida täysin eristää, koska tPA:n reaktiivisuus hartsin suhteen vaikuttaa haitallisesti hartsin liukenemiseen.
Koska isäntäsolusta johdetulla tPA:lla on sama molekyy- 5 87793 lipaino kuin ihmisen tPArlla, ei näytä olevan muuta mahdollisuutta kuin käyttää affiniteettireagenssia monokloonisen vasta-aineen kanssa, joka pystyy tunnistamaan isäntäsolusta johdetun tPA:n, ellei tämän keksinnön mukaista menetelmää 5 käytetä. Tämän monokloonisen vasta-aineen valmistus on kui tenkin aikaavievä ja monimutkainen ja yllä mainitulla menetelmällä on käytännössä vähän käyttökelpoisuutta.
Tällä keksinnöllä on suuri merkitys siksi, että yllä mainitut vakavat ongelmat, jotka syntyvät käytettäessä 10 tPA:ta, on ratkaistu yhdellä iskulla tällä yksinkertaisella menetelmällä.
Affiniteettireagenssi, jota käytetään tässä keksinnössä tPA:n puhdistamiseksi, ei reagoi ainoastaan tPA:n kanssa, vaan myös trypsiinin ja plasmiinin kanssa ja toimii niiden 15 inhibiittorina spesifisyytensä ansiosta. Kuitenkin tästä ominaisuudesta tulee ongelma tPA:n puhdistukselle, kun tPA:ta tuottavien solujen viljelyliemi sisältää epäpuhtautena trypsiiniä ja plasmiinia. Kun sentyyppinen inhibiittori, joka toimii trypsiinin ja plasmiinin inhibiittorina, mutta 20 ei tPA:n, esimerkiksi soijapavuista johdettu trypsiini-inhi- biittori, s.o. α-2-plasmiini-inhibiittori tai aprotiniini lisätään viljelyliemeen etukäteen, trypsiini ja plasmiini liittyvät näihin inhibiittoreihin konjugoituneiden proteiinien muodostamiseksi eivätkä ne enää reagoi tässä keksinnös-25 sä käytetyn affiniteettireagenssin kanssa niiden poiston hel pottamiseksi.
Kuten yllä on esitetty, tämän keksinnön affiniteettireagenssin, joka sisältää immobilisoitua Kunitz-inhibiittoria, jota valmistuu Ervthrina latissiman ja muiden Ervthrina--30 kasvien siemenissä ja joka toimii trypsiinin, plasmiinin ja tPA:n inhibiittorina, mutta ei urokinaasin, on todettu olevan erinomainen reaktiospesifisyyden, tPA:han tapahtuvan sitoutumisen, käyttöstabiiliuden ja tPA:n puhdistusmenetelmän käyttökelpoisuuden suhteen käytettäessä monokloonista anti-35 ihmis-tPA-vasta-ainetta, kun affiniteettireagenssia käytetään tämän keksinnön mukaisen parannetun menetelmän mukaisesti. Esimerkki 1: (Affiniteettireagenssin valmistus) Tässä keksinnössä inhibiittorina käytetty affiniteettirea- 6 87793 genssi valmistettiin seuraavalla tavalla.
Joubertin et ai. ehdottaman menetelmän mukaisesti kerättiin ja valmistettiin Ervthrina latissiman siemeniä. Jauhettuja siemeniä, joista rasva oli poistettu, uutettiin yön yli 5 10 °C:ssa NaCl:n 0,5 M/l vesiliuoksella. Uute lingottiin ja haluttu aine kerättiin supernatantista saostamalla ammoniumsulfaatilla. Näin kerätty aine kromatografoitiin "Sephadex G50 (kauppanimi)", DEAE-selluloosa ja "DEAE-Sepharose" (tavaramerkki) . Lopullinen puhdistettu tuote ryhmittyi yhtenä ainoana 10 kaistana, jonka selvä molekyylipaino oli 22.000 daltonia elekt roforeesissa 15 %:sessa polyakryyliamidigeelissä, joka sisälsi 0,1 % natriumdodekyylisulfaattia (SDS).
Puhdistettu tuote (26 mg) sidottiin 5 ml:aan markkinoilta saatavaa BrCN-aktivoitua agaroosia. Affiniteettireagenssi 15 tasapainotettiin fosfaattipuskurilla, joka sisälsi 0,4 M/l
NaCl:a, 0,1 % "Triton X-100":a (tavaramerkki, markkinoilta saatava pinta-aktiivinen aine, joka käytetään tavanomaisesti nykyisessä tekniikassa) ja 0,02 % natriumatsidia stabilointiaineena ja jonka pH oli 7,4. Tämä affiniteettireagenssi pa-20 kattiin 5 ml:n pylväisiin, jotka oli muodostettu kertakäyt töisistä muoviruiskuista.
(tPA:n puhdistus raa'asta epäpuhtaasta tPA:sta, jonka mole-
Ryylipaing oli HöuööO. steltsiiial
Sen jälkeen kun oli stabiloitu 0,02 %:lla "Tween 80":ä 25 (tavaramerkki) 2 1 käytettyä väliainetta, joka oli saatu
Bowes-melanoomasoluista (ATCC CRL 1424 G 361) viljelyväliai-neen kanssa, joka sisälsi 10 % termoinaktivoitua (56 °C, 30 min.) sikiövasikanseerumia ja 20 KIU/ral aprotiniiniä, aine laitettiin yhteen yllä valmistetuista affiniteettipylväistä. 30 Pylvään effluentti kerättiin ja plasminogeenistä riippu vainen fibrinolyyttinen aktiivisuus mitattiin.
Havaittiin n. 10 % pylvääseen pannusta aktiivisuudesta.
Tämä fraktio analysoitiin tsymografiällä SDS-polyakryy-liamidigeelielektroforeesin jälkeen. Plasminogeeniaktivaat-35 toreina vahvistettiin kaksi ainetyyppiä, toisen molekyyli- paino oli 110.000 ± 20.000 daltonia ja toista oli pieni määrä ja sen molekyylipaino oli 70.000 daltonia.
_ . Kaikki käytetty väliaine johdettiin pylvään läpi, pylväs pestiin 20 tilavuusmäärällä (pylvään kapasiteetin suhteen) 7 87793 0,1 M NH4HC03-puskurilla (pH 7,5), joka sisälsi 1,0 M NaCl:a ja 0,2 % "Tween 80":ä. Tällä menetelmällä havaittiin n. 3 % pylvääseen pannusta aktiivisuudesta. Toinen kaista, joka vastasi 110.000 ± 20.000 daltonia, ja toinen kaista, joka vastasi 5 70.000 daltonia ja joka oli heikompi kuin edellinen kaista, vahvistettiin plasminogeeniaktivaattoreiksi tsymografiällä.
Näin adsorboitu proteiini eluoitiin 0,1 M glysiinihydro-kloridipuskurilla, joka sisälsi 0,1 M NaClra. Tällä tavalla eluoitiin jäljellä oleva plasminogeenista riippuvainen 10 fibrinolyyttinen aktivaattori. Se havaittiin terävänä piik kinä. Tämä piikki oli yhtäpitävä proteiinin piikin kanssa.
Tämä fraktio omasi 80 - 85 % pylvääseen pannusta aktiivisuudesta. Se oli yksi ainoa proteiinin kaista, jonka molekyyli-paino oli 70.000 daltonia.
15 Esimerkki 2:
Sen jälkeen kun oli stabiloitu 0,02 %:lla "Tween 80":ä (tavaramerkki) 2 1 viljelylientä, joka koostui ihmissikiön esinahkasoluista (Flow 7000) ja joka sisälsi 10 % termoinak-tivoitua (56 °C, 30 min.) sikiövasikanseerumia ja 20 KIU/ml 20 aprotiniiniä, aine laitettiin yhteen yllä valmistetuista af- f initeettipylväistä.
Pylvään effluentti kerättiin ja plasminogeenistä riippuvainen fibrinolyyttinen aktiivisuus mitattiin. Havaittiin n. 45 % pylvääseen pannusta aktiivisuudesta.
25 Tämä fraktio analysoitiin tsymografiällä SDS-polyakryy- liamidigeelielektroforeesin jälkeen. Plasminogeeniaktivaat-toreina havaittiin 2-3 kaistaa 100.000 daltonin lähellä, 2-3 kaistaa n. 50.000 - 70.000 daltonissa ja yksi kaista 35.000 daltonin lähellä.
i :30 Koko viljelyväliaine johdettiin pylvään läpi, pylväs pestiin 20 tilavuusmäärällä (pylvään kapasiteetin suhteen) 0,1 M NH4HC03-puskuria (pH 7,5), joka sisälsi 1,0 M NaCl:a ja 0,2 % "Tween 80":ä. Tällä menetelmällä havaittiin n. 5 % - pylvääseen pannusta aktiivisuudesta. Samat kaistat kuin yllä .35 havaittiin tsymografia11a.
Näin adsorboitu proteiini eluoitiin 0,1 M qlysiinihydro-kloridipuskurilla, joka sisälsi 0,1 M NaCl:a. Tällä tavalla eluoitiin jäljellä oleva plasminogeenista riippuvainen fibrinolyyttinen aktivaattori. Se havaittiin terävänä piik- 8 87793 kinä. Tämä piikki oli yhtäpitävä proteiinin piikin kanssa. Tällä fraktiolla oli 40 - 50 % pylvääseen pannusta aktiivisuudesta. Se oli yksi ainut proteiinin kaista, jonka molekyylipai-no oli 70.000 daltonia.
5 Esimerkki 3:
Tutkittiin tPA:n adsorptio- ja eluointikäyttäytyrnistä, joka oli valmistettu käyttämällä Chinese-hamsterin munasar-jasoluja (CHO) isäntäsoluina rekombinaatiota varten.
Sen jälkeen kun oli stabiloitu 0,02 %:lla "Tween 80":ä 10 (tavaramerkki) 2 1 viljelyväliainetta, joka oli peräisin ei- rekombinantti-CHO-soluista (CHO-K1, ATCC CCL 61) ja joka sisälsi 10 % termoinaktivoitua (56 °C, 30 min.) sikiövasikansee-rumia, aine laitetettiin yhteen esimerkissä 1 valmistetuista affiniteettipylväistä. Viljelyliemessä olevan tPA:n aktiivi-15 suus oli n. 0,2 U/ml.
Pylvään effluentti kerättiin ja plasminogeenistä riippuvainen fibrinolyyttinen aktiivisuus mitattiin. Mitään tPA:ta ei kuitenkaan havaittu.
Koko viljelyliemi johdettiin pylvään läpi, pylväs pes-20 tiin 20 tilavuusmäärällä (pylvään kapasiteetin suhteen) 0,1 M NH4HC03-puskuria (pH 7,5), joka sisälsi 1,5 M NaCl:a ja 0,2 % "Tween 80":ä. Tällä menetelmällä mitattiin plasminogeenistä riippuvainen fibrinolyyttinen aktiivisuus. Mitään tPA:ta ei havaittu.
25 Pylväs pestiin tämän jälkeen 10 tilavuusmäärällä (suh teessa pylvään kapasiteettiin) 0.1 M glysiinihydrokloridi-puskuria (pH 3,5), joka sisälsi 0.1 M NaCl:a ja joka oli ihmisen tPA:n eluentti.
Mitään tPA:ta ei tässä fraktiossa havaittu.
30 Tämän jälkeen tPA:n desorptiota yritettiin 10 tilavuus- määrällä (suhteessa pylvään kapasiteettiin) 0,1 M Tris-HCl-puskuria (pH 9,0), joka sisälsi 3 M ammoniumtiosyanaattia ja 0,2 % "Tween 80":ä. Tällä menetelmällä havaittiin lähes 100 % pylvääseen pannusta aktiivisuudesta. Sen elektroforeesin 35 jälkeen SDS-polyakryyliamidigeelissä tsymografiällä havaittiin tPA, jonka molekyylipaino oli 70.000 daltonia.
Kuten yllä on osoitettu, CHO-soluista johdetulla tPA:lla ja ihmisen tPA:lla oli erilainen adsorptio- ja desorptio-käyttäytyminen affiniteettireagenssin suhteen.
9 87793 Tämän seikan vahvistamiseksi Chinese-hamsterin yllä esitetyllä tavalla valmistettu tPA leimattiin I125:llä, minkä jälkeen se lisättiin 0,5 litraan CHO-solujen viljely-väliainetta, joihin CHO-soluihin oli yhdistetty ihmisen tPA-5 cDNA-geeni seuraavalla menetelmällä. tPA:n ekspressoituminen oli saatu aikaan CHO-soluissa kotransfektiolla ja siitä seuraavalla transfektoitujen sekvenssien lisäyksellä. Ekspressiovek-torit, jotka sisälsivät ihmisen tPA-cDNA-geenin ja dihydrofo-laattireduktaasi-(DHFR)-cDNA-geenin, kotransfektoitiin yhdessä 10 DHFR:ä vailla oleviin CHO-soluihin. DHFR:n osoittavat transfor- mantit valittiin kasvattamalla väliaineissa, joista puuttuivat nukleosidit ja jotka sisälsivät pienen määrän tPA-geenejä ja DHFR-geenejä. DHFR+-transformanttien asteittainen valinta meto-treksaatin kasvavissa konsentraatioissa tuotti soluja, jotka 15 olivat lisänneet sekä DHFR-geenejä että tPA-geenejä yli 100- kertaisesti. Nämä solulinjat osoittivat entsymaattisesti aktiivisen tPA:n kohonneita tasoja.
Viljelyväliaine, joka sisälsi 10 % termoinaktivoitua (56 °C, 30 min.) sikiövasikanseerumia stabiloitiin 0,02 %:lla 20 "Tween 80":ä. Liuos laitettiin yhteen yllä valmistetuista pylväistä. Pylväs pestiin 0,1 M NH4HC03-puskurilla (pH 7,5), joka sisälsi 1,5 M NaCl:a ja 0,2 % "Tween 80":ä, proteiini eluoitiin 0,1 M glysiinihydrokloridipuskurilla (pH 3,5), joka sisälsi 0,1 M NaCl:a.
25 Tässä vaiheessa eluoitiin n. 90 % pylväässä olevasta plasminogeenistä riippuvaisesta fibrinolyyttisestä aktiivisuudesta. Kuitenkin tässä fraktiossa havaittiin vain alle 5 % pylväässä olevasta radioaktiivisuudesta. tPA, jonka mole-kyylipaino oli 70.000 daltonia, havaittiin tsymografiällä 30 SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesin jälkeen.
Jäljellä oleva proteiini saatettiin desorboitumaan 0,1 M Tris-HCl-puskurilla (pH 9,0), joka sisälsi 3 M ammoniumtio-syanaattia ja 0,2 % "Tween 80":ä.
Mitattiin n. 5 % pylvääseen pannusta plasminogeenistä 35 riippuvaisesta aktiivisuudesta, kuitenkin tässä fraktiossa havaittiin lähes 90 % pylväässä olevasta radioaktiivisuudesta.
Yllä olevista tuloksista tehtiin se johtopäätös, että Chinese-hamsterin tPA ja ihmisen tPA voidaan erottaa 10 87793 käyttämällä ETI-affiniteettipylvästä.
Esimerkki 4:
Hiiren fibroblasteja (C127I, ATCC CRL 1616-soluja) voidaan käyttää isäntäsoluina valmistettassa tPA:ta rekombi-5 nantti-DNA-tekniikan avulla. Sen jälkeen kun oli stabiloitu 0,02 %:lla "Tween 80":ä (tavaramerkki) 3 1 viljelemättömästä kannasta koostuvaa viljelylientä, joka sisälsi 2 % termoinak-tivoitua (56 °C, 30 min.) sikiövasikanseerumia, se laitettiin yhteen yllä valmistetuista affiniteettipylväistä.
10 Pylvään effluentti kerättiin ja plasminogeenistä riippu vainen fibrinolyyttinen aktiivisuus mitattiin. tPA:ta ei havaittu.
Kaikki viljelyliemi johdettiin pylvään läpi, pylväs pestiin 20 tilavuusmäärällä (pylvään kapasiteetin suhteen) 0,1 15 M NH4HC03-puskuria (pH 7,5), joka sisälsi 1,5 M NaClra ja 0,2 % "Tween 80":ä. Tällä menetelmällä havaittiin lähes 100 % pylväässä olevasta aktiivisuudesta. tPA, jonka molekyylipai-no oli 70.000 daltonia, havaittiin tsymografiällä SDS-poly-akryyliamidigeelielektroforeesin jälkeen.
20 Pylväs eluoitiin samoissa olosuhteissa, joita käytetään tavanomaisesti ihmisestä johdetun tPA:n eluoimiseksi, mutta mitään tPA:ta ei havaittu. Pylväs pestiin 10 tilavuusmäärällä (pylvään kapasiteetin suhteen) 4 M NH4SCN-liuoksella, joka sisälsi 0,2 % "Tween 80":ä, mutta tPA:ta ei eluoitunut 25 tällä menetelmällä. Näistä seikoista vahvistettiin se, että C127:stä johdetun tPA:n sitoutumislujuus affiniteettirea-genssiin on erilainen kuin ihmisen tPA:n.
Erillisenä leimattiin yllä esitetyllä tavalla saatu hiiren tPA-fraktio i!25:llä^ minkä jälkeen se lisättiin 0,5 litraan 30 C127I-solujen viljelylientä, joihin soluihin oli lisätty ihmi sen tPA-geeni. Liemi sisälsi 2% termoinaktivoitua (56 °C, 30 min.) sikiövasikanseerumia. Muodostunut seos stabiloitiin 0,02 %:lla "Tween 80":ä, minkä jälkeen se johdettiin yhden yllä esitetyn pylvään läpi.
35 Pylvään effluentti kerättiin ja plasminogeenistä riippu vainen Cibrinolyyttinen aktiivisuus ja radioaktiivisuus mitattiin. Vaikka ei havaittu mitään fibrinolyyttistä aktiivisuutta, n. 10 % pylvääseen pannusta radioaktiivisuudesta havaittiin.
u 87793
Koko viljelyliemi johdettiin pylvään läpi, minkä jälkeen pylväs pestiin 0,1 M NH4HC03-puskurilla (pH 7,5), joka sisälsi 1,5 M NaCl:a ja 0,2 % "Tween 80":ä. Vaikka yllä olevalla menetelmällä havaittiin vain n. 10 % pylväässä olevasta fibrinolyyt-5 tisestä aktiivisuudesta, rekisteröitiin n. 90 % pylvääseen pannusta radioaktiivisuudesta.
Eluaatti analysoitiin tsymografiällä sen SDSissä suoritetun elektroforeesin jälkeen. Havaittiin kaistat, jotka vastasivat 110.000 ± 20.000 daltonia ja vastaavasti 70.000 10 daltonia. Radioaktiivisuutta havaittiin vain 70.000 daltonin proteiinista. Tämän jälkeen proteiini eluoitiin 0.1 M gly-siinihydrokloridi-puskurilla (pH 3,5), joka sisälsi o.l M NaCl:a. Tällä tavalla jäljellä oleva plasminogeenistä riippuvainen fibrinolyyttinen aktivaattori eluoitiin ja havait-15 tiin n. 90 % pylvääseen pannusta fibrinolyyttisestä aktiivi suudesta. Kuitenkaan ei havaittu olennaisesti yhtään radioaktiivisuutta.
Yllä olevista tuloksista tehtiin se päätös, että hiiren tPA ja ihmisen tPA voidaan erottaa käyttämällä affiniteetti-20 pylvästä. Tämä johtopäätös oli yhtäpitävä sen seikan kanssa, että erotettiin ja saatiin ainoastaan yksi ainoa 70.000 daltonin fraktio normaaleista ihmisen soluista johdetusta tPA:sta esimerkin 4 loppuvaiheessa.

Claims (10)

1. Menetelmä raa'an tPA:n puhdistamiseksi, joka sisältää epäpuhtautena proteiinin, joka reagoi anti-ihmis-tPA-vasta-aineen kanssa ja jonka molekyylipaino on 110.000 ± 20.000 5 daltonia ja jota on läsnä seerumia sisältävässä viljelyväli- aineessa, tunnettu siitä, että: (A) raaka tPA ajetaan affiniteettireagenssipylvään läpi, joka sisältää immobilisoidun Kunitz-inhi-biittorin, jota valmistuu Erythrina latissiman ja 10 muiden Ervthrina-kasvien siemenissä ja joka toi mii trypsiinin, plasmiinin ja tPA:n inhibiittorina, mutta ei urokinaasin, niin että tPA sitoutuu affiniteettireagenssiin ja sitoutumaton aines erottuu; 15 - (B) pylväs pestään suolapuskuriliuoksella, joka si sältää suoloja neutraalissa tai alkalisessa pH:ssa ja sisältää 0,5 - 3,0 M NaCl:a; ja sen jälkeen (C) tPA:n sitonut affiniteettireagenssi eluoidaan 20 puskurilla, jonka pH on hapan.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että raaka tPA tuotetaan transformanttikannasta, joka saadaan käyttämällä eläinsolulinjoja isäntäsoluina ja liittämällä ihmisen tPA-geeni niihin, ja tPA:n sitonut affiniteet- 25 tireagenssi eluoidaan tPA:n saamiseksi puhtaassa muodossa vapaaksi proteiinista, jonka molekyylipaino on 110.000 * 20.000 daltonia, ja eläinsoluista johdetusta tPA:sta.
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että raaka tPA tuotetaan sopivassa viljelyväliainees- 30 sa, joka sisältää sikiönaudanseerumia.
4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että tPA on erittynyt viljelysoluista, jotka on johdettu melanoomasoluista.
5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen menetelmä, 35 tunnettu siitä, että tPA on erittynyt viljelysoluista, jotka on johdettu normaaleista ihmisen kudoksista.
6. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että tPA on erittynyt viljelysoluista, jotka i3 87793 on saatu yhdistämällä ihmisen tPA-geeni rekombinantti-DNA-tekniikalla.
7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ihmisen tPA-geeni on johdettu melanoomasoluista.
8. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ihmisen tPA-geeni on johdettu normaaleista ihmisen kudoksista.
9. Jonkin patenttivaatimuksen 6-8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että tPA tuotetaan transformanttikannalla 10 käyttäen nisäkkään solulinjoja isäntäsoluina ja liittämällä ihmisen tPA-geeni niihin.
10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että nisäkkään solulinjat ovat hiiren fibroblasteja C127I; ATCC CRL 1616. i4 87793
FI863111A 1985-08-01 1986-07-30 Foerfarande foer rengoering av oren tpa FI87793C (fi)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP60168601A JPS6229975A (ja) 1985-08-01 1985-08-01 粗ｔＰＡの精製法
JP16860185 1985-08-01

Publications (4)

Publication Number Publication Date
FI863111A0 FI863111A0 (fi) 1986-07-30
FI863111A FI863111A (fi) 1987-02-02
FI87793B true FI87793B (fi) 1992-11-13
FI87793C FI87793C (fi) 1993-02-25

Family

ID=15871078

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI863111A FI87793C (fi) 1985-08-01 1986-07-30 Foerfarande foer rengoering av oren tpa

Country Status (9)

Country Link
US (1) US5110736A (fi)
EP (1) EP0210870B1 (fi)
JP (1) JPS6229975A (fi)
CA (1) CA1314833C (fi)
DE (1) DE3681528D1 (fi)
DK (1) DK369686A (fi)
FI (1) FI87793C (fi)
NO (1) NO172396C (fi)
ZA (1) ZA865536B (fi)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3689927T3 (de) * 1985-10-04 1998-10-22 South African Inventions Reagens und Verfahren.
JPS6463378A (en) * 1986-08-11 1989-03-09 Mitsui Toatsu Chemicals Separation of single stranded tpa and double standard tpa
WO1988010119A1 (en) * 1987-06-22 1988-12-29 Genetics Institute, Inc. Novel thrombolytic proteins
US5411864A (en) * 1987-11-05 1995-05-02 Genentech, Inc. Method of purifying recombinant proteins from corresponding host cell proteins
DE3832898A1 (de) * 1988-09-28 1990-04-12 Boehringer Mannheim Gmbh Praeparat von in prokaryonten exprimiertem plasminogenaktivator
AU1801101A (en) * 1999-11-22 2001-06-04 American Red Cross Novel detection method for a functionally active form of an enzyme in biologicalsamples and a kit
US7200993B2 (en) * 2005-03-31 2007-04-10 Caterpillar Inc Electro-hydraulic steering control system
CN114426962B (zh) * 2021-12-21 2024-06-18 佛山汉腾生物科技有限公司 t-PA纯化方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3382389D1 (de) * 1982-12-14 1991-10-02 South African Inventions Plasminogenaktivator.
PT79518B (pt) * 1983-11-21 1986-12-12 Ciba Geigy Ag 54). 5 ^ig do plasmídeo pBR 322 /PHO5 Bam Rsa 637 são digeridos com a endonuclease de restrição Xbal. Apos digestão completa o DNA ê extraído com fenol/clorofórmio e precipitado com etanol. 0 DNA ê redissolvido em Tris.HCl 50mM pH8,0 numa concentração de 50 p-g/nd. e ê digerido com 11 unidades de fosfatase alcalina do intestino de vitela (Boehringer), durante 1 hora a 379C. - 97 fORHjf y| A enzima ê inativada a 65 9C durante 1 hora. 0 DNA ê purificado por cromatografia de troca iõnica em DE 52 ( Whatman) e precipitação com etanol como descrito no Exemplo 9Aa. Dois oligodeoxinucleotídeos sintéticos com a formula 5’-CTAGAAGGGGTATCTTTGGATAAGA - 3' 3’- TTCCCCATAGAAACCTATTCTCTAG -5' são fosforilados individualmente nas suas extremidades 5' como descrito no Exemplo 9Ab. Os oligodeoxinacleotídeos fosforilados são misturados em quantidades equimolares . A mistura ê aquecida durante 10 min. a 759C, depois deixada arrefecer lentamente atê à temperatura ambiente e guardada a -209C. Este adaptador ê designado por adaptador C. 1 ^ig (120 pmoles) do adaptador C emparelhado e fosforilado e 5 pg (1,5 pmoles) de pBR322/ /PH05 Bam-Rsa 637 desfosforilado e cortado com Xba I são ligados em 40^1 de Tris.HCl 60mM pH 7,5, MgCl2 lOmM, DTT 5mM, ATP lmM, 1600 unidades da ligase de DNA do T4 a 159C durante 20 horas. A ligase de DNA ê inactivada durante 10 min. a 859C e o excesso de adaptadores ê removido por precipitação com isopropanol. 0 DNA ê redissolvido em H20 numa concentração de 0,25 mg/ml. Os múltiplos de adaptadores são removidos por digestão com a endonuclease de restrição BglII. 0 DNA ê precipitado com etanol, redissolvido e depois digerido com Bam HI. Os fragmentos de restrição são separados num gel de 0,6¾ de agarose de baixo ponto de fusão em Tris-borato-EDTA pH8,3. 0 fragmento Bam HI-BglII de 662 pb (derivado de fragmento Bam HI-Rsa I de 637 pb) ê localizado e removido do gel. c) Isolamento de um fragmento de vector contendo a sequência codificadora do TPA maduro ( fig. 23) 5 yig do plasmídeo p31R/SS-TPA /\ 2, são digeridos com as endonucleases de restrição Bam HI e BglII. Após digestão completo de DNA e precipitado com etanol e ressuspenso em Tris.HCl 50mM pH 8,0 numa concentração de 75 jxg /ml. Os fragmentos de DNA sao desforilados nas suas extremidades 5' por digestão com 1 unidade de fosfatase alcalina de intestino de vitela ( Boehringer) em 60 de Tris.HCl 50mM pH 8,0 durante 1 hora a 379 C. A fosfatase ê inactivada por incubação a 659C durante 1,5 horas. 0 DNA é purificado por cromatografia de troca iónica em DE-52 (Whatman) como descrito no Exemplo 9Aa. 0 DNA ê precipitado com etanol, redissolvido em Tris-HCl lOmM, pH8,0 e aplicada num gel de 0,6 °'o de agarose de ponto de fusão baixo. 0 fragmento maior Bam HI -BglII de 5,2 kb ê removido do gel. d) Ligação dos fragmentos de DNA isolados e transformação de E.coli HB 101 (cf. figs 23 e 24 ). Dois blocos de gel de agarose de ponto de fusão baixo contendo 0,1 pmoles do fragmento Bam HIBglII de 5,2 kb de p31R/SS-TPA/\ 2 e 0,2 pmoles do fragmen to BamHI -BglII de 662 pb de pBR322/PHO5 Bam-Rsa 637, respectivamente, são misturados, liquefeitos a 659C e diluídos para baixar a concentração de agarose para 0,3¾. A ligação ê feita em 150^1 de Tris.HCl 60mM, pH 7,5; MgCl^ lOmM, 99 jr £ DTT 5mM, ATP ImM e 800 unidades de ligase de DNA do T4 (Biolabs) a 159C durante 16 horas. Amostras de 10 ^il e 30 yjl são misturadas com 100 p.1 de células E.coliHB 101 competentes para a transformação como descrito no Exemplo 4a. - R 6 colonias transformadas amp são crescidas individualmente em meio LB contendo 100 ^g/ml de ampicilina. 0 DNA de plasmídeo ê analisado quanto ao tamanho e orientação da invenção por corte com a endonuclease de restrição Bam Hl. Um único clone com a orientação correcta da inserção é designado por p31/PHO5 637-TPA (cf. fig. 23). 0 plasmídeo pBR 322/PHO5 Bam-Rsa 637 pode também ser substituído por pBR 322/PHO5 Bam-Rsa 595, pBR 322/PHO5 Bam-Rsa 811 e pBR 322/PHO5 Bam-Rsa 1312 . Seguindo o processo descrito atras são isolados clones únicos com inserções do tamanho e orientação esperados e designados por p31/PHO5 595C-TPA, p51/PHO5 811C-TPA e p31/PHO5 1312 C-TPA. 0 adaptador C pode também ser substituído pelo adaptador B com a seguinte férmula 5' -CTAGATAAGAGATCTGC -3’ 3’ TATTCTCTAGACG -5' o qual codifica Lis -Arg na construção final (fig. 24). A fosforilação dos oligodeoxinucleotídeos sintéticos e emparelhamento são como descrito para o adaptador C. Para a adição do adaptador 5 de pBR 322/PHO5 Bam-Rsa 637 cortado com Xba I são digeridos com 2 unidades de nuclease (Sigma) em 50 yjl de acetato de sédio 30mM pH 4,6, NaCI 200mM e ZnSO^ ImM durante 40 min. a 379C para criar extremidades cerses (ver fig.23). Apos extração com fenol clorofórmio o DNA ê precipitado com etanol e redissolvido em H^O numa concentração de 0,25 mg/ml. 0,4 ^g (120 pmoles) de adaptador A fosforilado e emparelhado e 5 ^ig (1,5 pmoles) de pBR 322/PHO5 Bam -Rsa 637 cortado com Xba I /S^ são ligados através das extremidades cerses como descrito para o adaptador C exceptuando a utilização de ATP 3,5 mM. As outras construções são como descrito atras. Os clones resultantes são identificado pela letra A e referidos como p31/PHO5 595A-TPA, p31/PHO5 637A-TPA, p31/PHO5 811A-TPA e p31/PHO5 1312 A-TPA. Exemplo 16: Subclonagem de construção genética no vector de levedura de elevado numero de copias pJDB2O7 e transformação de S. cerevisiae GRF18 As construções descritas nos Exemplos 13-19 contêm o promotor de PH05 com ou sem extensões para a região codificadora do gene de PH05 . A região codificadora do TPA com ou sem prepo-sequência e os sinais de terminação da transcrição de PH05 num arranjo tendem, tudo inserido num vector derivado do pBR 322. Os fragmentos Bam HI-HIND III contendo todo o arranjo são ligados ao fragmento Bam Hl -Hind III de 6,4 kb do pJDB 207 como descrito para uma reacção analoga no Exemplo 10. Células E.coli HB101 competentes são transformadas e vãrias colonias amp^ de cada experiência são crescidas individualmente em meio LB com 100 ^ig/ml de ampicilina. 0 DNA de plasmídio é analisado por corte com as endonucleases de restrição Hind III, Bam Hl e Pst I. Partindo dos plasmídeos p31/PHO5-TPA 18, ρ31 /PHO5-TPA 42, p31R/SS-TPA /\ 2, p31R/SS-TPA/\ 3, Ρ31/ΡΗΟ5 595C-TPA, p31/PHO5 637C-TPA,’ p31/PHO5 811C-TPA, P31/PHO5 1312C-TPA, p31/PHO5 595B-TPA, p31/PHO5 637-TPA, P31/PHO5 811 B-TPA, p31/PHO5 1312 B-TPA, p31/PHO5 595 A-TPA P31/PHO5 637-TPA, p31/PHO5 811-A-TPA e p31/PHO5 1312A-TPA obtem-se os clones que se seguem com as inserções correctas PJDB2O7/PHO5-TPA18 PJDB2O7/PHO5-TPA42 PJDB2O7R/PHO5-SS-TPA Λ 2 PJDB2O7R/PHO5-SS-TPA Λ 3 PJDB2O7/PHO5 595C-TPA PJDB2O7/PHO5 637C-TPA PJDB2O7/PHO5 811C-TPA PJDB2O7/PHO5 1312C-TPA PJDB2O7/PHO5 595B-TPA PJDB207/PH05 637B-TPA pJDB2O7/PHO5 811B-TPA PJDB2O7/PHO5 1312B-TPA pJDB2O7/PHO5 595A-TPA PJDB2O7/PHO5 637A-TPA PJDB2O7/PHO5 811A-TPA PJDB2O7/PHO5 1312A-TPA . Estes plasmídeos são introduzidos individualmente em Saccharomyces cerevisiae estirpe GRF 18 como descrito no Exemplo 11. Uma única colónia de levedura de cada uma das transformações de levedura ê picked. Os clones obtidos são designados por . Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2Ò7/PHO5-TPA18 Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5-TPA42 Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7R/PHO5-SS-TPA/\ 2 Sacchãtúiuycea cerevisíae GRFi8/pJD32O7R/?HO5~SS-TPA /\ 3 Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 595C-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 637C-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 811C-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 1312C-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 595B-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 637B-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 811B-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 1312B-TPA As células de levedura são crescidas colhidas e extraídas como descrito nos Exemplos 11 e 12. A actividade de TPA nos extractos celulares é testado como descrito no Exemplo 12. Os resultados estão apresen tados na tabela 3. Tabela 3: Actividade de TPA da estirpe de levedura Saccharomyces cerevisiae GRF18 transformada com diferentes plasmídeos e testada em condições de desrepressão (Pi baixo) : plasmídeo Actividade de TPA(unidades/l de cultura de células de levedura/ OD^qq) PJDB2O7/PHO5-TPA18 750 PJDB2O7/PHO5-TPA42 700 PJDB2O7R/PHO5-SS-TPA_A 2 600 PJDB2O7R/PHO5-SS-TPA 3 650 PJDB2O7/PHO5 595C-TPA 900 Exemplo 17: Substituição cromossómica do gene de PHO5 pelo gene do TPA (ver fig.25) A região codificadora da proteína TPA ê colocada no cromossoma II de levedura na posição da região codificadora da proteína PH05 . Experimentálmente isto ê con seguido por cotransformação. Saccharomyces cerevisiae estirpe GRF 18 ê cotransformada com 25 ^ig do plasmídeo p31/PHO5 -TPA 18, linearizado com BnmHI e Hind III, e 3 ^xg do plasmídeo de levedura Yepl3 (51). De 24 colónias Leu obtidas, uma ê Pho5 e ao mesmo tempo produz aproximadamente 35 unidades de TPA/1 de cultura de células de levedura /0D600. Por crescimento deste transformante num meio contendo leucina (YPD, 10g/l de Bacto Yeast Extract, 20g/l de Bacto Peptone, 20 g/l de glucose) durante 10 gerações, segregantes Leu~são obtidos com uma frequência de 10-20¾ os quais provavelmente perderam o plasmideo Yep31. Por análise ou Southern do DNA total de levedura isolado dos segregantes Leu (52) verifica-se que no nível de DNA que as sequências codificadoras da proteína TPA substituem as sequências codificadores da proteína PH05 deixando inal. teradas as sequências ladeantes do cromossoma II. Seleccionou-se uma estirpe que se designou por Saccharomyces cerevisiae GRF 18 (pho-5-ΤΡΑ)♦ Exemplo 18: Melhoramento de estirpe por mutação A estirpe Saccharomyces cerevisiae GRF18 /pJDB2O7/PHO5-TPA (IA) é ainda desenvolvida para produção de TPA por mutação e selecção de baixa actividade de fosfatase ácida. Saccharomyces cerevisiae H2 4 3/pJDB 20 7/ /PH05 -TPA (IA) um mutante termo-sensível de Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB2O7/PHO5 TPA (IA) ê obtido por irra_2 diação com UV (0,08 yiWcm , 15 segundos, 99,2¾ de morte). As colónias são crescidas em meio YPD osmc ticamente estabilizado contendo sorbitol 1,2M (10 g/l de Bacto Yeast Extract, 20 g/l de Bacto Peptone, 20g/l de glucose, 20 g/l de agar Bacto) e transferidas para meio YPD sem sorbitol. Saccharomyces cerevisiae H243 ê isolada como colónia de crescimento lento. Cerca de 10$ células de Saccharomyces cerevisiae H243/pJDB2O7/PHO5 -TPA (IA) são semeadas em agar YNB (6,8 1 de yeast Nitrogen Base sem aminoãcidos ; 20 g/1 de glucose, 20 g/1 de agar Bacto, suplementado com 20 mg/1 de histidina) e são irradiadas directamente com UV (0,08 -2 uWcm durante 12 segundos). A morte e de 98¾. As colonias obtidas a partir das células sobreviventes são transferidas para meio de Pi baixo e dois dias depois coradas para a actividade de fosfatase acida por um teste de sobrecamada de agar mole (48). Os mutantes negativos para a fosfatase _4 acida são obtidos com uma frequência de mutaçao de 3,2x10 . A estirpe com o título de TPA mais elevado é seleccionado e referido como Saccharomyces cerevisiae H423/pJDB2O7/PHO5-TPA (IA). As actividades de TPA de tres estirpes diferentes de levedura transformadas com pJDB2O7/PHO5-TPA (IA) estão apresentadas na Tabela 4. Tabela 4: Actividade de TPA de diferentes estirpes de Saccharomyces cerevisiae transformadas em condi ções de desrepressão (Pi baixo) Actividade de TPA (unidades/1 de cultura de células de levedura /OD^qq) GRF18/pJDB2O7/PHO5-TPA(lA) 625 H243/pJDB2O7/PHO5 -TPA(IA) 1560 H423/pJDB2O7/PHO5 -TPA(IA) 7200 • 1 Exemplo 19 : Produção de TPA por uma estirpe recombinante da levedura Saccharomyces cerevisiae numa escala de 30 1. Saccharomyces cerevisiae estirpe GRF 18/pJDB2O7/PHO5-TPA(lA) possui um plasmídeo que inclui uma marca para leucina permitindo manutenção selectiva do plasmídeo no organismo hospedeiro, um gene estrutural para o TPA humano e o promotor da fosfatase acida PH05 que permite a expressão do gene do TPA em meios com quantidades limitativas de fosfato inorgânico (condições de desrepressão). A estirpe ê mantida em culturas de agar inclinado preparadas com um meio definido sem o aminoãcido leucina para assegurar a retenção do plasmídeo. Agar recentemente inoculado e incubado durante 24 horas a 30?C. A cultura â superfície de um dos agares inclinados ê ressuspensa em 3ml de meio de pre-cultura o qual ê então transferido para o primeiro balão de pre-cultura com agitação. 0 balão de 500 ml tem uma unica saída e contem 100 ml de meio I de pre-cultura tendo o seguinte composição ( valoreq em g/1). L-asparagina, 2,0; L-histidina, 0,02 glucose, 10 ; Kt^PO^, 1,0 ; MgSO4· 7H2O, 0,5 ; NaCl 0,1 ; CaCl2~2H2O, 0,1 ; solução de vitaminas 5 jil/1 e solução de micronutriantes 5 ml/1. 0 meio e ajustado a pH7,2 usando NaOH antes da esterilização . A glucose, vitaminas e micronutrientes são esterilizados à parte e adicionados ao meio. As soluções "stock” de vitaminas e micronutrientes têm as seguintes composições (em g/1): Vitaminas - biotina, 0,0002; D-pantotenato de cãlcio , 0,04 ; acido fõlico, 0,0002; acido micotínico, 0,04 ; acido p-aminobenzõico, 0,02 ; hidrocloreto de piridoxina, 0,04; riboflãvina, 0,02 ; hidrocloreto de tiamina, 0,04; e inositol 0,2 em 1 1 de agua desionizada ; micronutrientes - acido bórico 0,05 ; CuSO "^H 0, 0,004 ; Kl, 0,01; FeCl^.óH^O, 0,02 ; MnSO^, 0,04 ; NaMoO^. 2^0, 0,02 e ZnSO^.71^0, 0,04 em 1 1 de agua desionizada. 0 meio ê preparado usando agua desionizada. A primeira pré-cultura é incubada durante 24 horas a 309C num agitador orbitol com 5cm de excentricidade a uma velocidade de 250 rev/min. Os balões com a primeira pré-cultura constituem o inoculo para os balões da segunda pré-cultura. Estes balões recebem um inoculo de 1¾ (v/v). Eles contem 100 ml de meio II de pré-cultura tendo a seguinte composição (mg/1): Extracto de levedura (Difco), 10,0 ; L-asparagina, 6,6; Κ^ΡΟ^ 1.0 ; MgSO^.7H2O, 1,0 ; L-histidina, 0,02 e D-glucose (mono-hidrato) , 33,0. 0 meio que ê preparado usando agua desionizada tem um pH de aproximadamente 6,0. A glucose é esterilizada separadamente. As condições de incubação são idênticas âs da primeira pré-cultura. 0 caldo de cultura de 3 balões ê combinado para dar um inoculo a 1¾ v/v para o fermentador principal de produção. 0 fermentador de produção tem um volume total de aproximadamente 45 1, contem 4 saliências e um agitador de turbina de disco de seis lâminas com um diâmetro de 115 mm. A velocidade de agitação é de 600 rev/min, a sobrepressão de 0,3 bar e uma velocidade de arejamento de 0,5 vol/vol/min. * ,· Η Ο fermentador contem 30 1 de um meio com as composições seguintes: (valores em g/1): L-asparagina, 2,0 ; L-histidina, 0,02 ; Kí^PO^, 0,03; MgSO^. 71^0, 0,5; NaCl, 0,1, CaCl2.2H2O, 0,1 ; KC1, ip ; D-glucose (mono -hidrato) , 20,0 ; solução de vitaminas 5 ml/1 e solução micronutrientes, 5ml/l. 0 meio ê ajustado pH 7,2 usando NaOH antes da esterilização. A glucose, vitaminas e micronutrientes são esterilizados separadamente e adicionados ao meio. As soluções "stock" de vitaminas e micronutrientes têm composição idêntica às descritas para o meio I de prê-cultura. A temperatura de fermentação ê de 309C. 0 pH desce para 5,0 onde ê controlado usando NaOH. Apos fermentação durante cerca de 20 horas atinge-se a produção máxima de TPA. A densidade óptica que atinge 2-3 unidades e a actividade de fosfatase ácida dão indicações uteis àcer ca do progresso da fermentação. 0 calor de fermentação ê arrefecido para 109C antes da colheita das células de levedura. Exemplo 20: Recuperação e purificação do TPA e pro-TPA por cromatografia com anticorpos monoclonais anti-TPA a) Preparação de extractos celulares 0 líquido de cultura (pH4) dos 30 1 de fermentação (cf.Exemplo 19) é arrefecido atê 109C e centrifugado usando uma centrífuga Alfa-Laval BRPX-207. As células separadas são ressuspensas em 21 de tampão de lise A ( NaH2P04 20mM, f^HPO^ 80mM, NaCl 150 mM, 0,01¾ de Tween, Benzamidina lOmM e EDTA lOmM). • 1 ί »» A solução é arrefecida atê 59C e passa da através de um moinho Dyno (tipo KDL-Pilot) com uma velocidade de alimentação de 101/h. 0 moinho estã equipado com 500 ml de pérolas de vidro de 0,5 -0,75 m de diâmetro e ê ligado a 3000 rev/min. Antes da adição das pérolas de vidro às células em suspensão aquelas são lavadas com 300 ml de tampão de lise A contendo 30 mg de BSA. A suspensão de células ê centrifugada ( rotor Sorvall 653, 40 min. 9000 rpm) e o sedimento rejeitado. b) Digestão do DNA^e fraccionamento com sulfato de amonio Adiciona-se 5 mg de DNAse a 2 1 da suspensão clarificada e a mistura ê agitada durante 30 min. a 49C. Subsequentemente a solução é levada a 35¾ de saturação com (NH^^SO^ (p/v) e ê agitada durante 1 hora a 49C. A solução ê centrifugada como descrito atrãs e o sedimento contendo toda a actividade de TPA ê ressuspensa em 1 1 de tampão H contendo 1¾ de Tween e 0,1¾ de SDS. A suspensão ê agitada durante pelo menos 1 hora a 49C. c) Cromatografia de imunoafinidade I) Purificação do anticorpo anti-TPA 5 ml de soro de coelho, anti -TPA (oferecido pelo Dr. E. Reich, Friedrich -Miescher-Institut Basel) são passados por uma coluna de sefarose com lisina para renovar o plasminogenio de soro. A coluna ê lavada com 1-2 volumes de PB5 pH 7,4 contendo NaCl 100 mM, KCI 2,7 mM, Na2HP04 8,lmM e KH2PO4 1,5 mM. $ rf* « « Ο líquido da coluna e de lavagens são juntos. 0 anti-soro sem plasminogênio é precipitado pela adição de (NH^)2SO^ sólido para uma concentração final de 50¾ (p/v). A solução ê mantida durante a noite a 4?C e em seguida centrifugada ( rotor Sorvall GSA,1200 rpm, 20 min.) . 0 precipitado e dissolvido num peque no volume de PB5 e dializado contra PBS contendo 0,1 ¾ de NaNj. A IgG desta solução dializada e purificada numa coluna de proteína A -sefarose (55). II) Preparação de uma coluna com anticorpo anti-TPA 13 mg de anticorpo anti-TPA purificado são dializados contra MOPS 0,1 M pH7,0. 0 anticorpo e ligado a 5 ml de Affigel 10 activado ( Biorad ) segundo as instruções do fabricante. A matrix do gel ó equilibrada com PBS contendo 1¾ de Tween 80, 0,1¾ de SDS, NaCl 0,2M, Benzamidin lOmM e 0,1¾ de NaN^. A matrix e aplicada numa coluna de 5 ml. III) Purificação de TPA por cromatografia de imunoafinidade. 0 sedimento redissolvido do fraccionamento com sulfato de amónio ê centrifugado para remover o material insolúvel ( rotor Sorvall GSA, 30 min. 12000rpm) e subsequentemente aplicado â coluna de afinidade a uma ve locidade de fluxo de cerca de lOml/hr a 49C. Depois de todo o volume ter passado através da coluna esta ê lavada com 10 volumes da coluna de PBS contendo 0,05¾. de Tween 80. A coluna ê eluída usando glicina-ΗΟΙΟ,ΙΜ pH2,5 contendo 0,1 ¾ de Tween. São colhidas fracções de 2 ml e testados para a actividade de TPA segundo o método de Rânby (49). Como substracto usa-se D-Val-Leu-Lis -pNA (Kabi -S-2251). As fracções com actividades mais elevadas são reunidas, neutralizadas usando Tris IM e concentradas por ultrafiltração usando uma membrana Amicon YM10. 0 TPA assim obtido apresenta cerca de 90¾ de pureza e estã predominantemente em forma de cadeia unica ( pro-TPA) como evidenciado por SDS-PAGE em condições de redução. 0 peso molecular aparente em condições não redutoras ê de cerca de 60 000 por SDS -PAGE (ver figura A). Figuras A e B : electroforese em gel de poliacrilamida-SDS do produto do gene TPA em levedura (Figura A) e a sua actividade enzimãtica num gel de actividade (placas com caseína) ( figura B). B:gel de actividade A:gel com SDS ad figura A (SDS-PAGE): Faixas 1 e 4 : proteínas padrão (marcadores de peso molecular) Faixas 2 e 5 : TPA de melanoma Faixas 3 e 6 : TPA de levedura Faixas 1 - 3 : em condições de redução Faixas 4 - 6 : em condições de não-redução As amostras correram num gel de 12,5¾ que se corou para proteínas usando azul Coomassie brilhante. ad. figura B (gel de actividade, cf. Exemplo 23): Faixa 1 : TPA de melanoma Faixa 2 : TPA de levedura Sobre-camada para plasminogénio de agar com caseira (referência 56) . Exemplo 21: Recuperação e purificação de TPA e pro-TPA por cromatografia de afinidade com DE-3 a. Preparação de uma coluna de DE-3 Sepharosé 26 mg do inibidor DE-3 purificado a partir de Erythrina latíssima (16) são acoplados a 5 ml de Sepharose 4b ® activada com brometo de cianogênio (Pharmacia) segundo as instruções do fabricante. A matrix ê equilibrada com tampão fosfato salino ("PBS") pH 7,4 contendo NaCl 0,4M, 0,1¾ de Triton X-100R e 0,02¾ de azida de sódio. A matrix ê então acamada numa coluna de 5 ml. b. Purificação de TPA e pro-TPA por cromatografia em DE-3 R Sepharose 4b Os extractos celulares (cf. Exemplo 20a) são tornados 0,4 M relativamente a NaCl e 0,1¾ para Triton X-lOCr^ e filtrados através de uma membrana de 0,45 ^im (Millipore). A solução ê então aplicada à coluna de DE-3 Sepharose (ver atras) a uma velocidade de fluxo de 45ml/hr â temperatura ambiente e o efluente ê rejeitado. Depois do volume total do extracto ter passado através da coluna esta ê lavada com cerca de 50 ml de PB5 contendo NaCl 0,4 M e 0,1 ¾ de Triton X-lOO*' sendo colhidos fracções de 2 ml a 49C. 0 conteúdo protêico de cada fracção ê determinado por medição da absorvância de UV a 280nm. A proteína adsorvida verificou-se ser eluída como um pico bem definido. As fracções contendo os valores mais elevados de absorvância de UV e de activida125 de fibrinolítica determinada pelo teste da I fibrina (47) são reunidas dando 8 ml de solução que se guardou a -209 C. Isto representa aproximadamente 70-80¾ da actividade total aplicada à coluna. As fracções com as actividades »· mais baixas são reunidas separadamente. A recuperação total de actividade em ambos os conjuntos de fracções monta os 90-100¾. c). Purificação de pro-TPA por cromatografia em DE-3 Sepharose 4b® na presença de um inibidor de proteíases. A cromatografia dos extractos de células de levedura ê feita de modo semelhante ao descrito no Exemplo 21b exceptuando a inclusão neste caso do inibidor de tripsina pancreãtica bãsica (BPTI) a 0,1 KlU/ml usando o teste fluorimétrico como Cbz-Gly-Gly-Arg-AMC como substracto (37) determinou-se o conteúdo em TPA e pro-TPA da solução purificada. 90¾ do TPA estã na forma de pro-enzima e 10¾ na forma activa. Assim, a conversão de pro-TPA em TPA durante o processo de purificação é inibido pelo BPTI. Exemplo 22: Separação de pro-TPA do TPA A solução de TPA e pro-TPA obtida como descrito no Exemplo 21c e ajustada a pH8,0 com Tris.HCl O,1M contendo 0,1¾ de Triton X-lOcP e tornado lmM relativamente ao diisopropilfluorofosfato. Apos incubação a 37?C durante 4 horas, a mistura ê passada através de uma coluna de 5 ml de DE-3 Sepharose® (cf. Exemplo 21a). 0 efluente contendo o TPA irreversivelmente inibido é rejeitado. A coluna e lavada com 6 volumes de coluna de PBS contendo NaCl 0,4 M e 0,1¾ de Triton X-IOC^ e subsequentemente eluída com PB5 contendo K SCN 1,6M, NaCl 0,4M e 0,1¾ de Triton X-10C^ como descrito no Exemplo 21b . As fracções apresentando as absorvân. 1 s· P0RWI « ? » ... Ή , - - - , __. «τ'. cias de UV mais elevadas são reunidas. 0 conjunto de fracções contem pro-TPA numa forma substancialmente pura uma vez que não se detecta actividade amidolítica no teste fluorimêtrico usando Cbz-Gli-Gli-Arg-AMC (37) como substrato. A actividade amidolítica assim como a fibrinolítica pode ser restabelecida por tratamento com plasmina a qual converte pro-TPA em enzima activa. Exemplo 23: Propriedades do produto do gene TPA em levedura a. Propriedades enzimãticas 0 produto do gene TPA em levedura obtido segundo o Exemplo 19 e purificado por eromatografia de afinidade em DE-3 (cf. Exemplo 21b) ê enzimãticamente activo como se mostra por clivagem de plasminogênio zimogênio em plasmina na ausência e na presença de fibrina. A actividade enzimãtica pode ser verificada pelos testes colorimêtricos descritos por Ranby (49) (cf. Exemplo 12) e por Verheijen et al. (60) , em placas de caseína e de fibrina (56) e num teste de fase solida com 12 9 I - fibrinogenio ( 47). A actividade enzimãtica em placas de caseína ê mostrada na figura B ( cf. Exemplo 20 c III). A actividade enzimãtica do TPA obtido ê grandemente estimulada pela fibrina. 0 TPA parcialmente purificado por eromatografia de afinidade em DE-3 ê testado num teste de velocidade parabólica (cf. Ranby (49)). Tomando a velocidade reacção Δ E versus Δ t^ entre e 5 minutos como uma medida da actividade enzimãtica a estimulação por concentração óptimas de fibrina ê de 10-20 vezes ( ca. 100 yig /ml) . 0 efeito pode ser observado com fragmentos de fibrina obtidos por digestão com CnBr

Also Published As

Publication number Publication date
NO863095D0 (no) 1986-07-31
NO172396B (no) 1993-04-05
NO172396C (no) 1993-07-14
CA1314833C (en) 1993-03-23
EP0210870B1 (en) 1991-09-18
FI87793C (fi) 1993-02-25
DK369686A (da) 1987-02-02
EP0210870A2 (en) 1987-02-04
NO863095L (no) 1987-02-02
EP0210870A3 (en) 1988-01-07
FI863111A (fi) 1987-02-02
FI863111A0 (fi) 1986-07-30
DE3681528D1 (de) 1991-10-24
JPS6229975A (ja) 1987-02-07
US5110736A (en) 1992-05-05
ZA865536B (en) 1987-03-25
DK369686D0 (da) 1986-08-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI87793B (fi) Foerfarande foer rengoering av oren tpa
EP0256836B1 (en) Purification procedure of tpa from crude preparations
EP0245100B1 (en) Purification of single-chain and double-chain tissue plasminogen activator
AU606582B2 (en) Methods for the recovery of tissue plasminogen activator
WO1999015196A1 (de) Pharmazeutisches präparat enthaltend vitamin k-abhängige einzelfaktoren
EP0139447B1 (en) A process for preparing urokinase zymogen
EP1015568B1 (en) METHOD FOR THE PRODUCTION OF rDSPA Alpha1
EP0124613B1 (en) Novel plasminogen activator derived from human kidneys, process for its preparation, and thrombolytic drug containing the same
EP0276328B1 (en) Process for separating single-strand human tpa and double-strand human tpa from each other
Soeda et al. Rapid and high-yield purification of porcine heart tissue-type plasminogen activator by heparin-sepharose choromatography
JPH0223158B2 (fi)
YOSHIMOTO et al. Prolyl Endopeptidase form Bovine Testis: Purification, Characterization and Comparison with the Enzymes from Other Tissues
Tamura et al. Purification of human plasma kallikrein and urokinase by affinity chromatography
Inagami et al. Renin and general aspartyl proteases: Differences and similarities in structure and function
CA1333163C (en) Methods for the recovery of tissue plasminogen activator
JPS62259585A (ja) 一本鎖ｔ−ＰＡと二本鎖ｔ−ＰＡを分離する方法
US5158882A (en) Method for purifying a crude tissue plasminogen activator preparation
WO1991002798A2 (de) t-PA-MUTANTE GK1L
WO1991010447A1 (en) Tissue plasminogen activator

Legal Events

Date Code Title Description
MM Patent lapsed
MM Patent lapsed

Owner name: MITSUI TOATSU CHEMICALS, INCORPORATED