JP2022513628A - クモ糸タンパク質のアルカリ精製法 - Google Patents

Abstract

本開示は、合成ブロック共重合体タンパク質、それらの分泌のための発現構築体、それらの産生のための組換え微生物、及び天然絹の多くの性質を再現するそれらのタンパク質を含む合成繊維の産生及び精製方法に関する。【選択図】図１

Description

関連出願
本出願は、その全体が参照により援用される２０１８年１１月２８日に出願された米国仮出願第６２／７７２，５８８号の利益及び優先権を主張する。

配列表
本出願には、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出され、その全体が参照により本明細書に援用される配列表が含まれる。２０ＸＸ年のＸＸ月に作成された上記ＡＳＣＩＩの写しは、ＸＸＸＸＸＵＳ＿ｓｅｑｕｅｎｃｅｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔという名前であり、サイズはＸ，ＸＸＸ，ＸＸＸバイトである。

発明の背景
クモの絹ポリペプチドは、３つのドメイン：Ｎ末端の非反復ドメイン（ＮＴＤ）、反復ドメイン（ＲＥＰ）、及びＣ末端非反復ドメイン（ＣＴＤ）に分解可能な大型（１５０ｋＤａ超、１０００アミノ酸超の）ポリペプチドである。ＮＴＤ及びＣＴＤは比較的小さく（それぞれ約１５０、約１００アミノ酸）、十分に研究されており、ポリペプチドに水安定性、ｐＨ感度、及び凝集時の分子アラインメントを付与すると考えられている。ＮＴＤはまた、強力に予測された分泌タグを有し、これは多くの場合、異種発現の間に取り除かれる。反復領域は、約９０％の天然ポリペプチドを含み、それぞれ、絹繊維に強度及び柔軟性を付与する、結晶性及び非晶質領域に折りたたむ。

絹ポリペプチドは、ハチ、ガ、クモ、ダニ、及び他の節足動物を含む、様々な源に由来する。生物の中には、独自の配列、構造成分、及び機械的特性を備える複数の絹繊維を作製するものがある。例えば、オーブウィービングクモは、環境またはライフサイクルの生態学的地位に適合するようにあつらえられた繊維に重合する、異なる絹ポリペプチド配列を産生する、独自の６種類の腺を有する。繊維は、その繊維が由来する腺に対して名付けられ、ポリペプチドは、腺の略称（例えば「Ｍａ」）、及び（クモのフィブロインに対して短い）スピドロインに対する「Ｓｐ」により標識される。オーブウィーバーにおいて、これらの種類としては、大瓶状（ＭａＳｐ、しおり糸とも呼ばれる）、小瓶状（ＭｉＳｐ）、鞭毛状（Ｆｌａｇ）、ぶどう状（ＡｃＳｐ）、管状（ＴｕＳｐ）、及び洋ナシ状（ＰｙＳｐ）が挙げられる。生物の異なる属及び種間の、繊維の種類、ドメイン、及びバリエーションにまたがるポリペプチド配列のこの組合わせにより、組換え繊維の商業的産生により利用可能な、広大なアレイの潜在的な性質がもたらされる。現在まで、組換え絹による圧倒的多数の研究は、大瓶状（ＭａＳｐ）に焦点が当てられてきた。

現在、組換え絹繊維は市販されておらず、わずかな例外があるものの、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、及び他のグラム陰性原核生物を外れる微生物においては産生されていない。現在まで産生された組換え絹は、大部分が、場合によっては、ＮＴＤ及び／またはＣＴＤと組み合わせた、内在性反復ドメインの、重合した短い絹配列モチーフまたは断片のいずれかで構成されている。これにより、クロマトグラフィーまたはバルク沈殿による細胞内発現及び精製を用いて産生した、小スケールの組換え絹ポリペプチド（実験室スケールにおいてはミリグラム、バイオプロセススケールにおいてはキログラム）の産生がもたらされている。これらの方法は、既存の技術繊維及び織物繊維の価格と競合可能な、実現可能な商業的スケーラビリティをもたらしはしない。絹ポリペプチドを作製するために利用されてきたさらなる産生宿主としては、トランスジェニックヤギ、トランスジェニックカイコ、及び植物が挙げられる。これらの宿主は、おそらく遅い改変サイクル、及び不十分なスケーラビリティが原因で、絹の商業スケールでの産生を未だ実現できてない。

さらに、組換え絹ポリペプチドは、産生及び精製中に、望ましくない不溶性アグリゲートを形成する。精製中にペプチドを再度可溶化する方法では、多くの場合タンパク質を分解し、不十分な収率、ならびに、低い引張強さ及び不十分な手触りを有する繊維がもたらされる。さらに、標準的なタンパク質の可溶化法には、尿素、グアニジン塩酸塩、またはグアニジンチオシアン酸塩などのカオトロープの使用が必要であり、これらは、タンパク質の単離後に適切に収集及び配置されなければならない。したがって、これらのポリペプチドを持続可能に、かつ環境に優しいプロセスで精製する方法が、必要とされている。

一態様では、宿主細胞培養液から、組換えクモ糸タンパク質を単離する方法であって、当該方法が、以下：細胞培養液を入手する工程であって、上記細胞培養液が、宿主細胞及び増殖培地を含み、上記宿主細胞が、組換えクモ糸タンパク質を発現する、工程と；上記組換えクモ糸タンパク質を含む上記細胞培養液の一部を収集する工程と；アルカリ性条件下で、水溶液中で上記細胞培養液の上記一部をインキュベートする工程であって、それにより、上記水溶液中で上記組換えクモ糸タンパク質を可溶化させる、工程と；上記水溶液から当該組換えクモ糸タンパク質を単離する工程であって、それにより、単離された組換えクモ糸タンパク質サンプルを産生する、工程と、を含む方法を、本明細書で提供する。

いくつかの実施形態では、アルカリ性条件は、９～１４のアルカリ性ｐＨを含む。一実施形態では、アルカリ性ｐＨは１１～１２である。

いくつかの実施形態では、単離された組換えクモ糸タンパク質は、完全長組換えクモ糸タンパク質である。一実施形態では、単離された組換えクモ糸タンパク質サンプルは、単離された全組換えクモ糸タンパク質と比較して、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の、完全長組換えクモ糸タンパク質を含む。一実施形態では、完全長組換えクモ糸タンパク質の割合はウェスタンブロットを用いて測定される。別の実施形態では、完全長組換えクモ糸タンパク質の割合はサイズ排除クロマトグラフィーを用いて測定される。

いくつかの実施形態では、単離された組換えクモ糸タンパク質の純度は、５～１０％、１０～１５％、１５～２０％、２０～２５％、２５～３０％、３０～３５％、３５～４０％、４５～５０％、５０～５５％、５５～６０％、６０～６５％、６５～７０％、７０～７５％、７５～８０％、８０～８５％、８５～９０％、０９～９５％、または９５～１００％である。いくつかの実施形態では、単離された組換えクモ糸タンパク質の収率は、尿素またはグアニジンチオシアン酸塩法により単離した組換えクモ糸と比較して、少なくとも５０～５５％、５５～６０％、６０～６５％、６５～７０％、７０～７５％、７５～８０％、８０～８５％、８５～９０％、０９～９５％、または９５～１００％である。

いくつかの実施形態では、組換えクモ糸タンパク質を単離する工程は、上記水溶液の上記アルカリ性条件を変更することにより、組換えクモ糸タンパク質を沈殿させることを含む。一実施形態では、上記アルカリ性条件を変更することは、細胞培養液の一部のアルカリ性ｐＨを、４～１０の、低くされたｐＨへと調節することを含む。一実施形態では、低くされたｐＨは、ｐＨ４、５、６、７、８、９、または１０である。一実施形態では、低くされたｐＨは、ｐＨ６～７である。

いくつかの実施形態では、アルカリ性ｐＨを調節することは、酸を水溶液に添加することを含む。一実施形態では、酸はＨ_２ＳＯ_４である。

いくつかの実施形態では、上記細胞培養液の一部は、上清、全細胞ブロス、または細胞ペレットを含む。いくつかの実施形態では、上記細胞培養液の上記一部を収集する工程は、上記増殖培地から上記宿主細胞を取り出すことと、上記水溶液中で上記宿主細胞を再構成することと、を含む。

いくつかの実施形態では、上記細胞培養液の上記一部を収集する工程は、上記宿主細胞を溶解することを含む。各種実施形態では、溶解することは、熱処理、剪断破壊、物理的均質化、超音波処理、または化学的均質化を含む。

いくつかの実施形態では、上記細胞培養液の上記一部は、上記宿主細胞、及び上記細胞培養液由来の上記増殖培地を含む。

各種実施形態では、上記水溶液は、希釈された増殖培地を含む。

いくつかの実施形態では、アルカリ性条件下で上記細胞培養液の上記一部をインキュベートする工程は、１０～１２０分実施される。いくつかの実施形態では、アルカリ性条件下で上記細胞培養液の上記一部をインキュベートする工程は、少なくとも１０分、少なくとも１５分、少なくとも３０分、少なくとも４５分、少なくとも６０分、少なくとも７５分、少なくとも９０分、少なくとも１０５分、または少なくとも１２０分間実施される。いくつかの実施形態では、アルカリ性条件下で上記細胞培養液の上記一部をインキュベートする工程は、１５～３０分実施される。

各種実施形態では、アルカリ性条件下で上記細胞培養液の上記一部をインキュベートする工程は、細胞培養液の一部を撹拌することをさらに含む。

各種実施形態では、方法は、アルカリ性条件下で、上記水溶液から非可溶化バイオマスを取り出すことをさらに含む。いくつかの実施形態では、非可溶化バイオマスを取り出すことは、濾過、遠心分離、重力沈降、吸着、透析、または相分離を含む。いくつかの実施形態では、濾過は限外濾過、精密濾過、またはダイアフィルトレーションである。いくつかの実施形態では、非可溶化バイオマスを取り出すことは、少なくとも１回繰り返される。

各種実施形態では、方法は、組換えクモ糸タンパク質を単離する前、または、組換えクモ糸タンパク質を単離した後に、不純物を取り除くことをさらに含む。いくつかの実施形態では、不純物を取り除くことは、濾過、遠心分離、重力沈降、吸着、透析、または相分離を含む。各種実施形態では、濾過は限外濾過、精密濾過、またはダイアフィルトレーションである。いくつかの実施形態では、遠心分離は超遠心分離またはダイア遠心分離である。一実施形態では、吸着は炭吸着である。いくつかの実施形態では、不純物を取り除くことは、少なくとも１回繰り返される。

各種実施形態では、方法は、単離された組換えクモ糸タンパク質を濃縮して、濃縮されたクモ糸タンパク質を産生することをさらに含む。いくつかの実施形態では、濃縮することは、沈殿、濾過、限外濾過、遠心分離、透析、蒸発、または凍結乾燥を含む。

各種実施形態では、方法は、単離された組換えクモ糸タンパク質を乾燥させることをさらに含む。

各種実施形態では、方法は、単離された組換えクモ糸から、絹繊維を生成することをさらに含む。一実施形態では、上記絹繊維は、少なくとも１９ｃＮ／ｔｅｘの引張強さを含む。

いくつかの実施形態では、上記組換えクモ糸タンパク質は１８ＢまたはＰ０である。

いくつかの実施形態では、細胞培養液は、真菌細胞、細菌細胞、または酵母細胞を含む。

いくつかの実施形態では、酵母細胞は、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞である。

別の態様において、組換えクモ糸タンパク質の単離方法であって、当該方法が、以下：細胞培養液を入手する工程であって、上記細胞培養液が、宿主細胞及び増殖培地を含み、上記宿主細胞が、組換えクモ糸タンパク質を発現する、工程と；上記組換えクモ糸タンパク質を含む上記細胞培養液の一部を収集する工程と；アルカリ性条件下で、水溶液中で上記細胞培養液の上記一部をインキュベートする工程であって、それにより、上記水溶液中で上記組換えクモ糸タンパク質を可溶化させる、工程と；水溶液を非アルカリ性ｐＨへと調節する工程であって、それにより、上記可溶化された組換えクモ糸タンパク質を沈殿させる、工程と；上記細胞培養液の一部から当該組換えクモ糸タンパク質を単離する工程であって、それにより、単離された組換えクモ糸タンパク質を産生する、工程と、を含む方法を、本明細書で提供する。

別の態様では、開示した方法のいずれか１つにより産生した組換えクモ糸タンパク質を含む組成物を本明細書で提供する。

いくつかの実施形態では、組換えクモ糸は、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％の、完全長の組換えクモ糸を含む。

別の態様では、開示した方法のいずれか１つにより産生した組換えクモ糸タンパク質を含む絹繊維を本明細書で提供する。

いくつかの実施形態では、絹繊維は、少なくとも１９ｃＮ／ｔｅｘの引張強さを含む。

別の態様では、アルカリ性緩衝溶液において、増殖培地を含む細胞培養液と、組換えクモ糸タンパク質を含む宿主細胞と、を含む組成物を本明細書で提供する。

一実施形態では、アルカリ性緩衝溶液は、ｐＨ９～１４を有する。別の実施形態では、ｐＨは１１～１２である。

いくつかの実施形態では、クモ糸タンパク質は１８ＢまたはＰ０である。いくつかの実施形態では、細胞培養液は、真菌細胞、細菌細胞、または酵母細胞を含む。一実施形態では、細菌細胞は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞である。一実施形態では、酵母細胞は、ピキア・パストリス細胞である。

細胞の上清から組換えクモ糸タンパク質を単離するための、例示的なプロセスフローを示す。 細胞可溶化物の上清から組換えクモ糸タンパク質を単離するための、例示的なプロセスフローを示す。 カオトロープを用いる、組換えクモ糸タンパク質を単離するための、例示的なプロセスフローを示す。 アルカリ性ｐＨ緩衝液を用いて細胞ペレットから単離した、精製された１８Ｂクモ糸タンパク質のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分析を示す。１８Ｂのモノマーピークは、矢印により示される。 尿素抽出方法またはアルカリ性抽出方法を用いて精製した１８Ｂクモ糸の、量と純度の比較を示す。 ＳＥＣにより測定した、タンジェンシャルフローフィルトレーション（ＴＦＦ）後の、精製された１８Ｂクモ糸モノマー及び純度の面積割合(%)を示す。 ２段階抽出後の、１８Ｂクモ糸タンパク質の全収率を示す。２つの異なる実行による結果を示す。 ２工程抽出後に、ＳＥＣ割合の面積により測定された、１８Ｂの純度を示す。 全細胞ブロスのアルカリ性抽出後の、１８Ｂモノマー、低（ＬＭＷ）、及び中分子量（ＩＭＷ）の面積割合(%)を示す。抽出されたタンパク質を、タンジェンシャルフローフィルトレーションを用いて濃縮した。 回収した１８Ｂクモ糸タンパク質のＳＥＣ分析を示す。各種タンジェンシャルフローフィルトレーション分画の１８Ｂモノマーのピークを、矢印により示す。 全細胞ブロスのアルカリ抽出及びｐＨ沈殿後の、１８Ｂモノマー、高（ＨＭＷ）、低（ＬＭＷ）、及び中分子量（ＩＭＷ）の面積割合(%)を示す。抽出されたタンパク質を、ダイア遠心分離を用いて濃縮した。 全細胞ブロスのアルカリ抽出及びｐＨ沈殿後の、１８Ｂモノマーの収率割合(%)を示す。抽出されたタンパク質を、ダイア遠心分離を用いて濃縮した。 ｐＨ６における酸沈殿後の、精製された１８Ｂクモ糸タンパク質のＳＥＣ分析を示す。１８Ｂのモノマーピークは、矢印により示される。抽出されたタンパク質を、ダイア遠心分離を用いて濃縮した。 各種ｐＨ緩衝液または尿素を用いた、大腸菌溶解物からの抽出後の、可溶性Ｐ０タンパク質のイムノブロットを示す。

定義
本明細書において別途定義されない限り、本発明に関連して使用される科学用語及び技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈上別途要求されない限り、単数形の用語は、複数形の用語を含むものとし、複数形の用語は単数形の用語を含むものとする。一般的に、本明細書に記載される生化学、酵素学、分子生物学及び細胞生物学、微生物学、遺伝子学、ならびにポリペプチド及び核酸化学、そしてハイブリダイゼーションに関して使用される命名法、及びそれらの技術は、当該技術分野において周知であり、一般的に使用されるものである。

本発明の方法及び技術は、別途指示されない限り、当該技術分野において周知の従来の方法に従って、また本明細書の全体を通して引用され、論じられる種々の一般的な、及びより具体的な参考文献に記載されるように、一般的に行われる。例えば、以下を参照のこと：Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８９）、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，（１９９２，ａｎｄ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ ｔｏ ２００２）、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９９０）、Ｔａｙｌｏｒ ａｎｄ Ｄｒｉｃｋａｍｅｒ，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，（２００３）、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍａｎｕａｌ，Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．，Ｆｒｅｅｈｏｌｄ，Ｎ．Ｊ．、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｅｃｔｉｏｎ Ａ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ Ｉ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，（１９７６）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｅｃｔｉｏｎ Ａ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ ＩＩ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，（１９７６）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ ｏｆ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，（１９９９）。

本明細書において言及される全ての刊行物、特許出願、及び他の参考文献は参照により、それらの全体が本明細書に組み込まれる。

以下の用語は、他に別段の指示がない限り、以下の意味を有するものと理解すべきである。

本明細書で使用する場合、用語「発酵すること」及び「発酵」とは、宿主細胞が増殖する条件を含むがこれに限定されない、所望の生成物を生成するための条件下にて、宿主細胞を培養することを描写する。

本明細書で使用する場合、用語「発酵ブロス」とは、発酵の間に宿主細胞を培養するために使用される水性媒体を意味する。

本明細書で使用する場合、用語「接種材料」とは、発酵を開始するために発酵ブロスに添加される、ある量の宿主細胞を意味する。

本明細書で使用する場合、用語「清澄化すること」とは、宿主細胞バイオマス、例えば、全細胞、溶解細胞、膜、脂質、オルガネラ、細胞核、非クモ糸タンパク質、または、任意の他の望ましくない細胞部分もしくは生成物、または、任意の他の、細胞培養液の望ましくない部分を取り除く方法を意味する。清澄化することは、部分的に精製された、または単離された、クモ糸組成物から、不純物を取り除くこともまた意味することができる。不純物としては、非クモ糸タンパク質、分解されたクモ糸タンパク質、タンパク質の大きなアグリゲート、精製及び単離プロセスの間に使用した化学物質、または任意の他の望ましくない物質を挙げることができるが、これらに限定されない。

本明細書で使用する場合、用語「純度」とは、あらゆる単離された構成成分、例えば、部分的な、または分解された、単離された組換えクモ糸タンパク質、脂質、タンパク質、膜、または、サンプル、例えば抽出されたサンプル中の他の分子の一部としての、単離された完全長組換えクモ糸タンパク質の量を意味する。

本明細書で使用する場合、用語「収率」とは、対照サンプル中での完全長絹タンパク質または全絹タンパク質の量と比較しての、細胞培養液から単離された完全長組換えクモ糸タンパク質の量を意味する。割合は、本明細書に記載する、細胞可溶化物、粗アルカリ性抽出溶液、部分的に精製されたまたは濾過されたアルカリ性抽出溶液、アルカリ性抽出法に供した、精製された溶液、または、尿素もしくはＧｄＳＣＮなどの対照抽出法に供した、精製された溶液中の、完全長クモ糸タンパク質の総量、を参照することができる。

用語「ポリヌクレオチド」または「核酸分子」とは、少なくとも１０塩基長ある、ヌクレオチドの重合体形態を指す。かかる用語には、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡもしくは合成ＤＮＡ）及びＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡまたは合成ＲＮＡ）、ならびに非天然型ヌクレオチド類似体、非天然ヌクレオシド間結合、またはその両方を含有するＤＮＡもしくはＲＮＡの類似体が含まれる。核酸は、どのような形態学的コンホメーションにあってもよい。例えば、核酸は、一本鎖、二本鎖、三本鎖、四重鎖、部分的二本鎖、分岐鎖、ヘアピン状、環状、またはパドロックドコンホメーションであってもよい。

別段の指示がない限り、「配列番号」という一般形式で本明細書に記載のあらゆる配列についての一例として、「配列番号１を含む核酸」とは、少なくとも一部に、（ｉ）配列番号１に記載の配列を有するか、または（ｉｉ）配列番号１に相補的な配列を有する核酸を指す。二者択一は文脈により決定される。例えば、核酸がプローブとして使用されている場合は、プローブは所望の標的に相補的でなければならないという要件により二者択一が決定される。

「単離された」ＲＮＡ、ＤＮＡ、または混合ポリマーとは、その天然宿主細胞内で、内在性ポリヌクレオチドに自然に付随する、他の細胞成分から実質的に分離されたもの、例えば、自然に会合しているリボソーム、ポリメラーゼ、及びゲノム配列である。

用語「組換え型」とは、生体分子、例えば、遺伝子またはポリペプチドであって、（１）その天然に生じる環境から除かれているもの、（２）自然界ではその遺伝子が見られるポリヌクレオチドの全部または一部に会合していないもの、（３）自然界では連結していないポリヌクレオチドに作動可能に連結されているもの、または（４）自然界では生じないものを指す。「組換え型」という用語は、クローン化ＤＮＡ分離物、化学合成ポリヌクレオチド類似体、または、異種系により生物学的に合成されたポリヌクレオチド類似体、ならびにかかる核酸によりコードされるポリペプチド及び／またはｍＲＮＡに関して用いてもよい。

本明細書で使用する場合、生物ゲノムの内在性核酸配列（またはその配列によりコードされるポリペプチド産物）の発現が変化するよう、この内在性核酸配列に隣接して異種配列が置かれている場合、その内在性核酸配列は本明細書では「組換え型」とみなされる。この場合、異種配列は、その異種配列がそれ自体内在性（同一宿主細胞もしくはその子孫由来）または外因性（異なる宿主細胞もしくはその子孫由来）であるか否かにかかわらず、天然では内在性核酸配列に隣接していない配列である。例として、プロモーター配列は、宿主細胞のゲノムに存在する遺伝子の天然プロモーターを（例えば、相同組換えにより）置換して、この遺伝子の発現パターンが変化するようにすることができる。ここで、この遺伝子は、天然ではそれに隣接している配列の少なくともいくつかの配列から分離されているため「組換え型」と考えられるであろう。一実施形態では、異種核酸分子は、生物に対して内在性ではない。更なる実施形態では、異種核酸分子は、相同または無作為組込みにより宿主染色体に組み込まれた、プラスミドまたは分子である。

核酸もまた、それが、ゲノム中の対応する核酸に対する、天然では生じない何らかの改変を含有する場合に「組換え型」とみなされる。例えば、内在性コード配列は、それが人為的に、例えば、人の介入などによって導入された挿入、欠失または点変異を含有する場合は「組換え型」とみなされる。「組換え核酸」には、宿主細胞染色体内の非相同部位に組み込まれた核酸、及びエピソームとして存在する核酸構築体も含まれる。

核酸配列において「配列同一性（％）」という用語は、一致度が最大となるよう整列させた場合における、２つの配列中の残基のアラインメントの定量値を意味する。配列同一性を比較する長さは、少なくとも約９ヌクレオチド、通常は少なくとも約２０ヌクレオチド、より一般には少なくとも約２４ヌクレオチド、一般的には少なくとも約２８ヌクレオチド、より一般的には少なくとも約３２ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約３６以上のヌクレオチドの領域にわたる場合がある。ヌクレオチド配列同一性を測定するために使用できる当該技術分野で公知の異なるアルゴリズムが多数ある。例えば、ポリヌクレオチド配列は、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ バージョン１０．０（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ）に同梱のプログラムであるＦＡＳＴＡ、ＧａｐまたはＢｅｓｔｆｉｔを使用して比較することができる。ＦＡＳＴＡは、問い合わせ配列と検索配列の間で最も重複している領域のアラインメント及び配列同一性（％）を提供する。Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６３－９８（１９９０）（参照によりその全体が本明細書に援用される）。例えば、核酸配列間の配列同一性（％）は、参照により本明細書に援用されるＧＣＧ バージョン６．１で提供されるとおり、ＦＡＳＴＡをそのデフォルトのパラメーター（文字列サイズは６、またスコア行列のファクターはＮＯＰＡＭ）で使用するか、またはＧａｐをそのデフォルトのパラメーターを使用して決定することができる。別法として、配列はコンピュータプログラムのＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０）、Ｇｉｓｈ ａｎｄ Ｓｔａｔｅｓ，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３：２６６－２７２（１９９３）、Ｍａｄｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１－１４１（１９９６）、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２（１９９７）、Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｍａｄｄｅｎ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７：６４９－６５６（１９９７））、特にｂｌａｓｔｐまたはｔｂｌａｓｔｎ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２（１９９７））を使用して比較することができる。

核酸またはその断片に言及した際の「実質的な相同性」または「実質的な類似性」という用語は、ヌクレオチドの適切な挿入または欠失を用いて別の核酸（またはその相補鎖）と至適に整列させた場合に、上述のようなＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴまたはＧａｐなどの周知の配列同一性アルゴリズムのいずれかで測定したヌクレオチド配列同一性が、ヌクレオチド塩基の少なくとも約７６％、８０％、８５％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％または９９％においてあることを示す。

核酸（ポリヌクレオチドとも呼ばれる）には、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方、ならびに上記の合成形態及び混合ポリマーが含まれる場合がある。それらは、当業者に容易に理解されるように、化学的もしくは生化学的に改変されてもよく、または非天然もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含有してもよい。かかる改変としては、例えば、標識、メチル化、類似体を用いた１つ以上の天然に生じるヌクレオチドの置換、ヌクレオチド間改変、例えば、非荷電結合（例えば、メチルホスホナート、ホスホトリエステル、ホスホルアミダート、カルバメート等）、荷電結合（例えば、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート等）、ペンダント部分（例えば、ポリペプチド）、インターカレーター（例えば、アクリジン、プソラレン等）、キレート剤、アルキル化剤、及び結合の改変（例えば、アルファアノマー型核酸等）などが挙げられる。また、水素結合及び他の化学的相互作用を介して指定配列に結合する能力においてポリヌクレオチドを模倣する合成分子も挙げられる。かかる分子は当該技術分野で公知であり、例えば、分子骨格にあるリン酸結合がペプチド結合で置換されるものなどが含まれる。他の改変としては、例えば、リボース環が架橋部分または他の構造、例えば、「ロックド」核酸に見られる改変などを含有している類似体を挙げることができる。

「変異した」という用語は、核酸配列に適用する場合、ある核酸配列内のヌクレオチドが参照核酸配列と比較した場合に挿入、欠失または変更されていることを意味する。ある遺伝子座において単一の変更（点変異）を行ってよく、または複数のヌクレオチドについて単一遺伝子座においける挿入、欠失もしくは変更を行ってもよい。さらに、ある核酸配列内で任意の数の遺伝子座において１つ以上の変更を行ってよい。核酸配列は、当該技術分野で公知の任意の方法で変異させてよく、これには、「エラープローンＰＣＲ」（ＰＣＲ産物の全長にわたり高率の点変異が得られるようＤＮＡポリメラーゼの複製忠実度が低い条件下でＰＣＲを実施する方法であり、例えば、Ｌｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，１：１１－１５（１９８９）及びＣａｌｄｗｅｌｌ ａｎｄ Ｊｏｙｃｅ，ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ．２：２８－３３（１９９２）を参照のこと）、及び「オリゴヌクレオチド指定突然変異」（対象の任意のクローン化ＤＮＡセグメントにおいて部位特異的変異の発生を可能にする方法であり、例えば、Ｒｅｉｄｈａａｒ－Ｏｌｓｏｎ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：５３－５７（１９８８）を参照のこと）など変異誘発技術が挙げられるが、これに限定されるものではない。

本明細書で使用する場合、用語「ベクター」とは、それに連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を指すことが意図される。ベクターの一種は「プラスミド」であり、これは一般に、環状二本鎖のＤＮＡループで、その中にさらなるＤＮＡセグメントを連結することができるものを指すが、直鎖状二本鎖分子、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅から生じるもの、または環状プラスミドの制限酵素での処理から生じるものなども含まれる。他のベクターとしては、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）及び酵母人工染色体（ＹＡＣ）が挙げられる。ベクターのもう一種はウイルスベクターであり、ウイルスベクターにおいては、さらなるＤＮＡセグメントがウイルスゲノム内に連結されていてもよい（下記で詳述）。特定のベクターは、それが導入されている宿主細胞での自己複製能がある（例えば、宿主細胞で機能する複製起点を有するベクター）。他のベクターは、宿主細胞内に導入される際にその宿主細胞のゲノムに組み込まれる場合があるため、宿主ゲノムと共に複製される。さらに、特定の好ましいベクターは、それらが作動可能に連結されている遺伝子の発現を導くことができる。かかるベクターを本明細書では「組換えで発現されるベクター」（または単に「発現ベクター」）と呼ぶ。

本明細書で使用する場合、用語「発現系」には、宿主細胞内で遺伝子を発現するためのビヒクルまたはベクター、ならびに、遺伝子の宿主染色体への安定した組込みをもたらす、ビヒクルまたはベクターが含まれる。

「作動可能に連結された（Ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」または「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」発現制御配列とは、その発現制御配列が対象遺伝子に隣接して、かかる対象遺伝子を制御する連結、ならびにトランスに作用するかまたは離れて作用して対象遺伝子を制御する発現制御配列を指す。

本明細書で使用する場合、用語「発現制御配列」とは、それが作動可能に連結されたコード配列の発現に影響を与えるために必要なポリヌクレオチド配列を指す。発現制御配列は、核酸配列の転写、転写後事象及び翻訳を制御する配列である。発現制御配列には、転写開始、転写終結、プロモーター及びエンハンサーの適切な配列；効率的なＲＮＡプロセシングシグナル、例えば、スプライシング及びポリアデニル化のシグナルなど；細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列；翻訳効率を高める配列（例えば、リボソーム結合部位）；ポリペプチド安定性を高める配列；及び必要に応じ、ポリペプチドの分泌を高める配列が含まれる。かかる制御配列の性質は宿主生物に応じて異なり、原核生物では、かかる制御配列には一般にプロモーター、リボソーム結合部位、及び転写終結配列が含まれる。用語「制御配列」には、最低でも、発現にその存在が不可欠とされる全構成成分が含まれることが意図され、存在していると都合がよい追加の構成成分、例えば、リーダー配列及び融合パートナー配列などが含まれていてもよい。

本明細書で使用する場合、用語「プロモーター」とは、ＲＮＡポリメラーゼが結合して遺伝子転写を開始するＤＮＡ領域、及びｍＲＮＡ転写の開始位置の５’方向における位置を意味する。

本明細書で使用する場合、用語「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）とは、組換えベクターが導入されている細胞を指すことが意図される。かかる用語により、特定の対象細胞だけではなく、かかる細胞の子孫も指すことが意図されることを理解されるべきである。変異または環境の影響により継代とともに特定の改変が起こり得るため、かかる子孫は事実、親細胞と同一ではない場合があるが、それでも本明細書で使用する用語「宿主細胞」の範囲内に含まれる。組換え宿主細胞は単離された細胞であっても培養で増殖させた細胞株であってもよく、または生きている組織もしくは生物中に存在している細胞であってもよい。

用語「ポリペプチド」は、天然に生じるタンパク質と天然に生じないタンパク質の両方、ならびにその断片、変異体、誘導体及び類似体を包含する。ポリペプチドはモノマーでもポリマーでもよい。さらに、ポリペプチドは、各々が１つ以上の別個の活性を有する多数の異なるドメインを含んでよい。

本明細書で使用する場合、用語「分子」とは、低分子、ペプチド、ポリペプチド、糖、ヌクレオチド、核酸、ポリヌクレオチド、脂質等を含むがこれらに限定されない、任意の化合物を意味し、かかる化合物は、天然または合成であることができる。

本明細書で使用する場合、用語「ブロック」または「繰返し単位」とは、場合により、中程度のバリエーションと共に、上記天然絹ポリペプチド中で見いだされ、上記絹ポリペプチド配列中で基本繰返し単位として機能する、天然絹ポリペプチドの約１２アミノ酸よりも大きい部分配列を意味する。ブロックは、非常に短い「モチーフ」を含んでよいが、必ずしも含まなくてよい。本明細書で使用する場合、「モチーフ」とは、複数のブロックで現れる、およそ２～１０個のアミノ酸配列を意味する。例えば、モチーフは、アミノ酸配列ＧＧＡ、ＧＰＧ、またはＡＡＡＡＡから構成されていてよい。複数のブロックの配列は「ブロック共重合体」である。

本明細書で使用する場合、用語「反復ドメイン」とは、絹ポリペプチド内の、連続した（公知の絹スペーサー要素を除く、本質的な非反復ドメインにより破壊されていない）反復性セグメントの集合から選択される配列を意味する。天然絹配列は一般に、１つの反復ドメインを含有する。本発明のいくつかの実施形態では、絹分子１個当たり１つの反復ドメインが存在する。本明細書で使用する場合、「マクロリピート」とは、２つ以上のブロックを含む、天然に存在する反復性アミノ酸配列である。一実施形態では、マクロリピートは、反復ドメイン内で少なくとも２回反復される。更なる実施形態では、２回の繰り返しは不十分である。本明細書で使用する場合、「準反復」とは、２つ以上のブロックを、当該ブロックがアミノ酸配列内で、同一ではないが類似となるように含む、アミノ酸配列である。

本明細書で使用する場合、「反復配列」または「Ｒ］とは、反復性アミノ酸配列を意味する。一実施形態では、反復配列は、マクロリピート、またはマクロリピートの断片を含む。別の実施形態では、反復配列はブロックを含む。更なる実施形態では、単一のブロックが、２つの反復配列にまたがり分断されている。

本明細書及び付属の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈上、別途明確に指示されない限り、複数形の指示対象を含むことに留意されなければならない。

本明細書で開示する任意の範囲は、当該範囲の両端を含む。例えば、２～５％の範囲は、２％及び５％、及びその間の任意の数、または数の分数、例えば、２．２５％、２．５％、２．７５％、３％、３．２５％、３．５％、３．７５％、４％、４．２５％、４．５％、及び４．７５％を含む。

組換えクモ糸組成物
数種の天然クモ糸がこれまでに同定されている。自然に出糸されたクモ糸の各種の機械的特性は、そのクモ糸の分子組成と密接な関係があると考えられている。例えば、Ｇａｒｂ，Ｊ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｕｎｔａｎｇｌｉｎｇ ｓｐｉｄｅｒ ｓｉｌｋ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｓｐｉｄｒｏｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｏｍａｉｎｓ，ＢＭＣ Ｅｖｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１０：２４３（２０１０）；Ｂｉｔｔｅｎｃｏｕｒｔ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｍｉｌｉｅｓ，ｎａｔｕｒａｌ ｈｉｓｔｏｒｙ ａｎｄ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｓｐｉｄｅｒ ｓｉｌｋ，Ｇｅｎｅｔ．Ｍｏｌ．Ｒｅｓ．，１１：３（２０１２）；Ｒｉｓｉｎｇ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｐｉｄｅｒ ｓｉｌｋ ｐｒｏｔｅｉｎｓ： ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ａｎｄ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．，６８：２，ｐｇ．１６９－１８４（２０１１）；及びＨｕｍｅｎｉｋ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｐｉｄｅｒ ｓｉｌｋ：ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｏｆ ａ ｎａｔｕｒａｌ ｆｉｂｅｒ，Ｐｒｏｇ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｓｃｉ．，１０３，ｐｇ．１３１－８５（２０１１）を参照のこと。例えば：
ブドウ状（ＡｃＳｐ）絹糸は、適度に高い強度と適度に高い伸縮性とが組み合わされた結果、靭性が高い傾向がある。ＡｃＳｐ絹糸は、しばしばポリセリンとＧＰＸのモチーフが組み込まれている大きいブロック（「集合体の反復」）サイズを特徴とする。管状（ＴｕＳｐまたは円筒状）絹糸は、直径が大きく、中程度の強度と高い伸縮性を有する傾向がある。ＴｕＳｐ絹糸は、そのポリセリンとポリスレオニンの含量、及び短いポリアラニン配列を特徴とする。大瓶状（ＭａＳｐ）絹糸は、高い強度と中程度の伸縮性を有する傾向がある。ＭａＳｐ絹糸は、２つのサブタイプであるＭａＳｐ１及びＭａＳｐ２のいずれかである。ＭａＳｐ１絹糸は一般にＭａＳｐ２絹糸より低伸縮性であり、ポリアラニン、ＧＸ、及びＧＧＸのモチーフを特徴とする。ＭａＳｐ２絹糸は、ポリアラニン、ＧＧＸ、及びＧＰＸのモチーフを特徴とする。小瓶状（ＭｉＳｐ）絹糸は、中程度の強度と中程度の伸縮性を有する傾向がある。ＭｉＳｐ絹糸は、ＧＧＸ、ＧＡ、及びポリＡのモチーフを特徴とし、しばしば約１００のアミノ酸からなるスペーサーエレメントを含有する。鞭毛状（Ｆｌａｇ）絹糸は、非常に高い伸縮性と中程度の強度を有する傾向がある。Ｆｌａｇ絹糸は通常、ＧＰＧ、ＧＧＸ、及び短いスペーサーのモチーフを特徴とする。

それぞれの絹糸種の性質は種ごとに異なる場合があり、ライフスタイルが異なるクモ（例えば、動き回らずに巣を張る造網性のクモと、徘徊して捕食するクモ）または進化的に古い方のクモは、上記説明とは異なる絹を産生する場合がある（クモの多様性及び分類についての記載に関しては、Ｈｏｒｍｉｇａ， Ｇ．，ａｎｄ Ｇｒｉｓｗｏｌｄ， Ｃ．Ｅ．， Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｓ， ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ， ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｏｒｂ－ｗｅａｖｉｎｇ ｓｐｉｄｅｒｓ， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｅｎｔｏｍｏｌ． ５９， ｐｇ．４８７－５１２（２０１４）、及びＢｌａｃｋｅｄｇｅ， Ｔ．Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ ｗｅｂ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｐｉｄｅｒ ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｒａ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， １０６：１３， ｐｇ． ５２２９－５２３４（２００９）を参照のこと）。しかしながら、天然絹タンパク質の反復ドメインに対する配列類似性及び／またはアミノ酸組成類似性を有する合成ブロック共重合体ポリペプチドを使用して、天然絹繊維に対応する性質を再現する一貫した絹様繊維を商業規模で製造することが可能である。

絹ヌクレオチド及びペプチド配列
推定絹配列の一覧は、例えば、「スピドロイン」、「フィブロイン」、「ＭａＳｐ」などの関連用語をＧｅｎＢａｎｋで検索して収集することができ、それらの配列を、別個に取り組んだ配列決定により得たさらなる配列と一緒にプールすることができる。その後、配列をアミノ酸に翻訳して重複エントリーをフィルタリングし、手作業で各ドメイン（ＮＴＤ、ＲＥＰ、ＣＴＤ）に分割する。いくつかの実施形態では、候補アミノ酸配列を、例えば、ピキア（コマガタエラ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ））パストリス、または大腸菌での微生物発現用に最適化されたＤＮＡ配列に逆翻訳する。ＤＮＡ配列をそれぞれ発現ベクターにクローニングし、ピキア（コマガタエラ）・パストリス、または大腸菌などの微生物に形質転換する。いくつかの実施形態では、発現及び分泌の成功を示した各種の絹ドメインはその後、組み合わせ様式でアセンブルされ、繊維形成能のある絹分子が構築される。

絹ポリペプチドは特徴的に、反復ドメイン（ＲＥＰ）に非反復領域（例えば、Ｃ末端ドメイン及びＮ末端ドメイン）が隣接して構成される。上記反復ドメインは階層構造を示す。上記反復ドメインは一連のブロック（反復単位とも呼ばれる）を含む。上記ブロックは、絹の反復ドメイン全体にわたり、ときに完全に、ときに不完全に（準反復ドメインを構成）繰り返される。ブロックの長さ及び組成は、異なる絹の種類間、また異なる種間で変化する。表１は、選択した種及び絹種のブロック配列例の一覧であり、さらなる例が、Ｒｉｓｉｎｇ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｐｉｄｅｒ ｓｉｌｋ ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ａｎｄ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．，６８：２，ｐｇ １６９－１８４（２０１１）、及びＧａｔｅｓｙ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｔｒｅｍｅ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ，ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｃｅ ｏｆ ｓｐｉｄｅｒ ｓｉｌｋ ｆｉｂｒｏｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９１：５５１３，ｐｇ．２６０３－２６０５（２００１）に記載されている。場合によっては、ブロックを通常パターンで並べ、絹配列の反復ドメインに複数回（通常２～８回）出現する、より大きなマクロリピートを形成してよい。反復ドメインまたはマクロリピートの内側で繰り返されるブロックと、反復ドメイン内で繰り返されるマクロリピートとを間隔エレメントで分離してよい。ブロック配列はグリシンに富む領域と、それに続くポリＡ領域とを含んでよい。短い（約１～１０）アミノ酸モチーフはブロック内に複数回出現してよい。一般的に観察されるモチーフのサブセットを図１に示す。本発明の目的上、円順列とは関係なく、異なる天然絹ポリペプチドに由来するブロックを選択することができる（すなわち、同定されたブロックが他の点において絹ポリペプチド間で類似する場合に円順列のため整列しないことがある）。したがって、例えば、ＳＧＡＧＧという「ブロック」は本発明の目的上、ＧＳＧＡＧと同一であり、またＧＧＳＧＡと同一であり、それらはいずれも互いに円順列にすぎない。所与の絹配列について選択された特定順列は、他の何よりも利便性によって決定されてもよい（通常、Ｇで開始）。ＮＣＢＩデータベースから得た絹配列は、ブロック及び非反復領域に分割することができる。

（表１）ブロック配列の試料

本発明の特定の実施形態による、ブロック及び／またはマクロリピートドメイン由来の繊維形成ブロック共重合体ポリペプチドは、参照により援用される国際公開公報第ＷＯ／２０１５／０４２１６４号に記載されている。ＧｅｎＢａｎｋなどのタンパク質データベースから得た天然絹配列、または新規に行った配列決定により得た天然絹配列はドメイン（Ｎ末端ドメイン、反復ドメイン、及びＣ末端ドメイン）により破壊される。合成後に集合させて繊維を構築するために選択されるＮ末端ドメイン及びＣ末端ドメインの配列としては、天然アミノ酸配列情報及び本明細書に記載の他の改変が挙げられる。反復ドメインを反復配列に分解するが、この反復配列は、重要なアミノ酸情報を獲得する代表的ブロック（通常は１～８で、絹の種類による）を含有する一方で、アミノ酸をコードするＤＮＡの大きさを、容易に合成可能な断片まで縮小する。いくつかの実施形態では、適切に形成されたブロック共重合体ポリペプチドは、少なくとも１つの反復配列を含む少なくとも１つの反復ドメインを含み、任意選択で、Ｎ末端ドメイン及び／またはＣ末端ドメインを隣接させる。

いくつかの実施形態では、反復ドメインは少なくとも１つの反復配列を含む。いくつかの実施形態では、反復配列は１５０～３００アミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、反復配列は複数のブロックを含む。いくつかの実施形態では、反復配列は複数のマクロリピートを含む。いくつかの実施形態では、ブロックまたはマクロリピートは複数の反復配列全体において分割される。

いくつかの実施形態では、反復配列は、ＤＮＡアセンブリ要件を満たすため、グリシンで開始され、かつ、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、システイン（Ｃ）、ヒスチジン（Ｈ）、アスパラギン（Ｎ）、メチオニン（Ｍ）、またはアスパラギン酸（Ｄ）で終わることはできない。いくつかの実施形態では、いくつかの反復配列は、天然配列と比べて変化させることができる。いくつかの実施形態では、反復配列は、ポリペプチドのＣ末端へのセリン付加などにより変化させることができる（Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｍ、またはＤでの終止を回避するため）。いくつかの実施形態では、反復配列は、不完全ブロックに別のブロック由来の相同配列を充てんして改変することができる。いくつかの実施形態では、反復配列は、ブロックまたはマクロリピートの順序を再構成して改変することができる。

いくつかの実施形態では、非反復のＮ末端及びＣ末端のドメインを合成用に選択することができる。いくつかの実施形態では、Ｎ末端ドメインは、リーディングシグナル配列、例えば、ＳｉｇｎａｌＰにより同定されたものなどの除去によるものであり得る（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｔ．Ｎ．，ｅｔ．Ａｌ．，ＳｉｇｎａｌＰ ４．０：ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｎｇ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｒｏｍ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｒｅｇｉｏｎｓ，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，８：１０，ｐｇ．７８５－７８６（２０１１）。

いくつかの実施形態では、Ｎ末端ドメイン配列、反復配列、またはＣ末端ドメイン配列は、アゲレノプシス・アペルタ（Ａｇｅｌｅｎｏｐｓｉｓ ａｐｅｒｔａ）、アリアチプス・グロサス（Ａｌｉａｔｙｐｕｓ ｇｕｌｏｓｕｓ）、アフォノペルマ・シーマニー（Ａｐｈｏｎｏｐｅｌｍａ ｓｅｅｍａｎｎｉ）、アプトスチチュス種（Ａｐｔｏｓｔｉｃｈｕｓ ｓｐ．）ＡＳ２１７、アプトスチチュス種 ＡＳ２２０、アラネウス・ディアデマツス（Ａｒａｎｅｕｓ ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ）、アラネウス・ゲムモイデス（Ａｒａｎｅｕｓ ｇｅｍｍｏｉｄｅｓ）、アラネウス・ヴェントリコサス（Ａｒａｎｅｕｓ ｖｅｎｔｒｉｃｏｓｕｓ）、アルギオペ・アモエナ（Ａｒｇｉｏｐｅ ａｍｏｅｎａ）、アルギオペ・アルゲンタタ（Ａｒｇｉｏｐｅ ａｒｇｅｎｔａｔａ）、ナガコガネグモ（Ａｒｇｉｏｐｅ ｂｒｕｅｎｎｉｃｈｉ）、アルギオペ・トリファスシアタ（Ａｒｇｉｏｐｅ ｔｒｉｆａｓｃｉａｔａ）、アチポイデス・リヴェルシ（Ａｔｙｐｏｉｄｅｓ ｒｉｖｅｒｓｉ）、アヴィキュラリア・ジュルエンシス（Ａｖｉｃｕｌａｒｉａ ｊｕｒｕｅｎｓｉｓ）、ボスリオシルツム・カリフォルニカム（Ｂｏｔｈｒｉｏｃｙｒｔｕｍ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃｕｍ）、デイノピス・スピノサ（Ｄｅｉｎｏｐｉｓ Ｓｐｉｎｏｓａ）、ディグエチア・カニチエス（Ｄｉｇｕｅｔｉａ ｃａｎｉｔｉｅｓ）、ドロメデス・テネブロサス（Ｄｏｌｏｍｅｄｅｓ ｔｅｎｅｂｒｏｓｕｓ）、エウアグルス・キソセウス（Ｅｕａｇｒｕｓ ｃｈｉｓｏｓｅｕｓ）、エウプロスセノプス・オーストラリス（Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ ａｕｓｔｒａｌｉｓ）、ガステラキャンタ・マンモサ（Ｇａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａ ｍａｍｍｏｓａ）、ヒポキルス・トレルリ（Ｈｙｐｏｃｈｉｌｕｓ ｔｈｏｒｅｌｌｉ）、ククルカニア・ヒベルナリス（Ｋｕｋｕｌｃａｎｉａ ｈｉｂｅｒｎａｌｉｓ）、ラトロデクツス・ヘスペルス（Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ ｈｅｓｐｅｒｕｓ）、メガヘクスラ・フルヴァ（Ｍｅｇａｈｅｘｕｒａ ｆｕｌｖａ）、メテペイラ・グランディオサ（Ｍｅｔｅｐｅｉｒａ ｇｒａｎｄｉｏｓａ）、ネフィラ・アンチポディアナ（Ｎｅｐｈｉｌａ ａｎｔｉｐｏｄｉａｎａ）、ネフィラ・クラヴァタ（Ｎｅｐｈｉｌａ ｃｌａｖａｔａ）、ネフィラ・クラヴィペス（Ｎｅｐｈｉｌａ ｃｌａｖｉｐｅｓ）、ネフィラ・マダガスカリエンシス（Ｎｅｐｈｉｌａ ｍａｄａｇａｓｃａｒｉｅｎｓｉｓ）、ネフィラ・ピリペス（Ｎｅｐｈｉｌａ ｐｉｌｉｐｅｓ）、ネフィレンギス・クルエンタタ（Ｎｅｐｈｉｌｅｎｇｙｓ ｃｒｕｅｎｔａｔａ）、パラウィキシア・ビストリアタ（Ｐａｒａｗｉｘｉａ ｂｉｓｔｒｉａｔａ）、ペウセチア・ヴィリダンス（Ｐｅｕｃｅｔｉａ ｖｉｒｉｄａｎｓ）、プレクトレウリス・トリスチス（Ｐｌｅｃｔｒｅｕｒｙｓ ｔｒｉｓｔｉｓ）、ポエシロセリア・レガリス（Ｐｏｅｃｉｌｏｔｈｅｒｉａ ｒｅｇａｌｉｓ）、テトラグナタ・カウアイエンシス（Ｔｅｔｒａｇｎａｔｈａ ｋａｕａｉｅｎｓｉｓ）、またはウロボルス・ディヴェルサス（Ｕｌｏｂｏｒｕｓ ｄｉｖｅｒｓｕｓ）に由来し得る。

いくつかの実施形態では、絹ポリペプチドヌクレオチドコード配列は、アルファ接合因子ヌクレオチドコード配列に作動可能に連結され得る。いくつかの実施形態では、絹ポリペプチドヌクレオチドコード配列は、別の内在性または異種の分泌シグナルコード配列に作動可能に連結され得る。いくつかの実施形態では、絹ポリペプチドヌクレオチドコード配列は、３Ｘ ＦＬＡＧヌクレオチドコード配列に作動可能に連結され得る。いくつかの実施形態では、絹ポリペプチドヌクレオチドコード配列は、６～８のＨｉｓ残基などの他のアフィニティータグに作動可能に連結される。

分泌シグナル
細胞より分泌されるタンパク質の量は、タンパク質ごとに大幅に異なり、その初期状態において、タンパク質に作動可能に連結された分泌シグナルに、部分的に左右される。分泌シグナルの数は当技術分野において公知であり、中には、ピキア・パストリス及びサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の微生物分泌シグナルを含む、分泌された組換えタンパク質の産生に一般的に用いられるものもある。これらの中でも、Ｎ末端の１９アミノ酸シグナルペプチド（本明細書において、プレαＭＦ（ｓｃ）とも呼ばれる）、続いて、７０アミノ酸リーダーペプチド（プロαＭＦ（ｓｃ）とも呼ばれる）からなる、サッカロマイセス・セレビシエのα接合因子（αＭＦ）の分泌シグナルが顕著である。サッカロマイセス・セレビシエのαＭＦの分泌シグナルにプロαＭＦ（ｓｃ）を含めること（本明細書において、プレαＭＦ（ｓｃ）／プロαＭＦ（ｓｃ）とも呼ばれる）は、タンパク質の高分泌収率を達成するために必須であることが証明されている。プロαＭＦ（ｓｃ）、またはその機能性多様体を、プレαＭＦ（ｓｃ）以外のシグナルペプチドに付加することは、組換えタンパク質の分泌達成手段として発見されているが、様々な程度の有効性が示されており、特定の組換え宿主細胞における特定の組換えタンパク質に対しては分泌が増加するものの、他の組換えタンパク質に対しては効果なし、または分泌が低下する。

複数の異なる分泌シグナルを使用することにより、米国出願第１５／７２４，１９６号に記載されているように、P. パストリス（Ｐ． ｐａｓｔｏｒｉｓ）などの宿主細胞内で産生された組換えタンパク質の分泌収率を改善することができる。１つの分泌シグナルのみ（例えばプレαＭＦ（ｓｃ）／プロαＭＦ（ｓｃ））に作動可能に連結された組換えタンパク質をコードする複数のポリヌクレオチド配列を含む組換え宿主細胞と比較して、少なくとも２つの異なる分泌シグナルに作動可能に連結された組換えタンパク質をコードする同数のポリヌクレオチド配列を含む組換え宿主細胞は、より高い分泌収率の組換えタンパク質を産生する。理論に束縛されるものではないが、少なくとも２つの異なる分泌シグナルを用いることにより、組換え宿主細胞が、異なる細胞分泌経路と関与して、組換えタンパク質の効率的な分泌を達成し、故に、任意の１つの分泌経路の過飽和を防止することが可能となり得る。

異なる分泌シグナルのうち少なくとも１つは、表２もしくは３から選択され得るシグナルペプチドを含む、または、表２もしくは３から選択されるシグナルペプチドに対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する、機能性多様体である。いくつかの実施形態では、機能性多様体は、１つまたは２つの置換されたアミノ酸を含む、表２または３から選択されるシグナルペプチドである。いくつかのかかる実施形態では、機能性多様体は、表２または３から選択されるシグナルペプチドに対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、翻訳後に、初期の組換えタンパク質の、ＥＲへの転座を媒介する（即ち、タンパク質合成は、初期の組換えタンパク質が、ＥＲへの転座前に細胞シトゾルに存在するように、転座を進める）。他の実施形態において、シグナルペプチドは、翻訳と同時に、初期の組換えタンパク質のＥＲへの転座を媒介する（即ち、タンパク質合成と、ＥＲへの転座が同時に生じる）。ＥＲへの同時翻訳転座を媒介するシグナルペプチドを用いる利点は、迅速な折畳みを受けやすい組換えタンパク質の、ＥＲへの転座を妨げる構造の推定、故に分泌が妨げられることである。

（表２）分泌シグナル

（表３）組換え分泌シグナル

発現ベクター
本発明の発現ベクターは、当該技術分野において公知の技術に鑑みて、本明細書の教示に従い作製することができる。配列、例えばベクター配列、または導入遺伝子をコードする配列は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ ｏｒ Ａｔｕｍ，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ．などの企業から商業的に入手することができる。キメラ絹ポリペプチドの高濃度発現を指令する発現ベクターを、本明細書で例示する。

本発明で使用するポリヌクレオチドの、別の標準的な源は、生物（例えば細菌）、細胞、または選択された組織から単離された、ポリヌクレオチドである。選択された源由来の核酸は標準的な手順により単離することができ、標準的な手段としては典型的には、連続フェノール及びフェノール／クロロホルム抽出、それに続くエタノール沈殿が挙げられる。沈殿後、核酸分子を断片に切断する制限エンドヌクレアーゼで、ポリヌクレオチドを処理することができる。選択されたサイズの断片は、アガロースもしくはポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはパルスフィールドゲル電気泳動（Ｃａｒｅ ｅｔ ａｌ．（１９８４） Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１２：５６４７－５６６４；Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．（１９８６） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４：１５８２；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５１：４６１）を含む多数の技術により分離し、クローニングのための適切なサイズの出発物質をもたらすことができる。

発現ベクターまたは構築体のヌクレオチド構成成分を得るための別の方法は、ＰＣＲである。ＰＣＲの一般的な手順は、ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＲ： Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ，（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，（１９９１））において教示されている。各増幅反応に対するＰＣＲ条件は、経験的に決定してよい。多数のパラメーターが、反応の成功に影響を及ぼす。とりわけ、これらのパラメーターには、アニーリング温度及び時間、延長時間、Ｍｇ２＋及びＡＴＰ濃度、ｐＨ、ならびに、プライマー、テンプレート、及びデオキシリボヌクレオチドの相対濃度がある。例示的なプライマーを、実施例において以下で記載する。増幅後、得られた断片を、アガロースゲル電気泳動、続いて、エチジウムブロマイド染色及び紫外線照射による可視化により検出することができる。

ポリヌクレオチドを得るための別の方法は、酵素分解によるものである。例えば、ヌクレオチド配列は、好適な認識制限酵素による、適切なベクターの分解により、生成することができる。制限切断断片は、標準的な技術を用いて、4種類のデオキシヌクレオチドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）の存在下において、大腸菌 ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｋｌｅｎｏｗ）の大型断片により処理することにより平滑末端化することができる。

ポリヌクレオチドを、当該技術分野において周知の技術を用いて、好適な骨格、例えばプラスミドに挿入する。例えば、好適な条件下で、制限酵素により、インサート及びベクターＤＮＡを接触させて、互いに対形成可能な各分子上で相補性、または平滑末端を作製し、リガーゼにより結合することができる。あるいは、合成核酸リンカーを、ポリヌクレオチドの末端にライゲーションすることができる。これらの合成リンカーは、ベクターＤＮＡ内の特定の制限酵素切断部位に対応する核酸配列を含有することができる。他の方法が公知であり、当該技術分野において利用可能である。各種源を、構成成分であるポリヌクレオチドに対して使用することができる。

いくつかの実施形態では、Ｒ、Ｎ、またはＣ配列を含有する発現ベクターを、発現及び分泌のために、宿主生物に形質転換する。いくつかの実施形態では、発現ベクターは分泌シグナルを含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは停止シグナルを含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、宿主細胞ゲノムに一体化されるように設計され、標的ゲノムへの相同性領域、プロモーター、分泌シグナル、タグ（例えばＦＬＡＧタグ）、停止／ポリＡシグナル、ピキア用の選択マーカー、大腸菌用の選択マーカー、大腸菌用の複製起点、及び対象の断片を放出するための制限酵素切断部位を含む。

宿主細胞形質転換体
クモ糸ポリペプチドを発現する核酸分子またはベクター、及びこれらの子孫で形質転換した宿主細胞を提供する。これらの細胞は、ベクター上に本発明の核酸配列を担持することもまた可能であり、ベクターは、必ずしも自由複製ベクターである必要はなくてよい。本発明の他の実施形態では、核酸は宿主細胞のゲノムに一体化されている。

いくつかの実施形態では、本発明のブロック共重合体ポリペプチドの大規模スケール産生を可能にする微生物または宿主細胞は、１）大型（＞４０ｋＤａ）ポリペプチドを産生する能力、２）細胞外のポリペプチドを分泌し、下流細胞内精製を高コストで回避する能力、３）大規模スケールでの、汚染物質（ウイルス及び細菌汚染物質など）への耐性、ならびに／または、４）生物の成長及び加工に関する既存のノウハウが大型（１～２０００ｍ３）バイオリアクターであること、の組み合わせを含む。

各種宿主生物を改変／形質転換して、ブロック共重合体ポリペプチド発現系を含むようにすることができる。組換え絹ポリペプチドの発現に好ましい生物には、酵母、真菌、グラム陰性菌、及びグラム陽性菌が含まれる。特定の実施形態では、宿主生物は、アークスラ・アデニニボランス（Ａｒｘｕｌａ ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ）、アスペルギルス・アクレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フィクーム（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｉｃｕｕｍ）、アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・チュービンゲンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｕｂｉｇｅｎｓｉｓ）、バチルス・アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・アントラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・ラウタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｕｔｕｓ）、バチルス・レンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メタノリクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、カンジダ・ボイディニー（Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ）、クリソスポリウム・ラックナウエンセ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、大腸菌、フサリウム・グラミネアラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フサリウム・ヴェネナタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、クルイヴェロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、クルイヴェロミセス・マルキシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、ミセリオプソラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、オガタエア・ポリモルファ（Ｏｇａｔａｅａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ペニシリウム・カメンベルティ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉ）、ペニシリウム・カネセンス（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃａｎｅｓｃｅｎｓ）、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、ペニシリウム・エマソニイ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）、ペニシリウム・フニクロサム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）、ペニシリウム・グリセオロセウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｇｒｉｓｅｏｒｏｓｅｕｍ）、ペニシリウム・プルプロゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、ペニシリウム・ロックフォーティ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ）、白色腐朽菌（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、ピキア・アングスタ（Ｐｉｃｈｉａ ａｎｇｕｓｔａ）、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピキア（コマガタエラ）・パストリス、ピキア・ポリモルファ（Ｐｉｃｈｉａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ピキア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）、リゾムコール・プシルス（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｐｕｓｉｌｌｕｓ）、リゾプス・アリザス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ａｒｒｈｉｚｕｓ）、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）、サッカロマイセス・セレビシエ、シュワニオマイセス・オクシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）、トリコデルマ・ハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、またはヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である。

好ましい態様では、方法は、バイオマスを抽出する必要なく、容易な回収のための直接生成物分泌のために、宿主細胞を培養することを提供する。いくつかの実施形態では、ブロック共重合体ポリペプチドは、収集及び加工のために、培地に直接分泌される。

改変された宿主細胞株
任意の適切な宿主細胞株を使用して、組換えタンパク質を産生することができる。メチロトローフ酵母ピキア・パストリスは組換えタンパク質の産生に広く使用されている。Ｐ．パストリスは高い細胞密度に増殖し、厳密に制御されたメタノール誘導性の導入遺伝子発現を提供し、合成培地中に組換えタンパク質を効率よく分泌する。しかしながら、Ｐ．パストリスの株の培養中に、組換えにより発現したタンパク質が、収集可能となる前に分解され得、組換えにより発現したタンパク質の断片と、収率が低下した完全長組換えタンパク質とを含むタンパク質の混合物が得られる。組換えタンパク質産生のための、別の広範に用いられている細胞株は、細菌の大腸菌である。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の、プロテアーゼ活性が低下した改変株は、絹様ポリペプチド配列を組換えで発現する。いくつかの実施形態では、上記絹様ポリペプチド配列は、１）絹ポリペプチド配列由来の反復ドメインを混合して一致させることにより生成したブロック共重合体ポリペプチド組成物、及び／または２）組換えで発現された、大きさが、工業的に拡張可能な微生物から分泌させることによって有用な繊維を形成するのに十分に大きい（約４０ｋＤａ）ブロック共重合体ポリペプチドである。公開されているクモ糸ポリペプチドのアミノ酸配列のほぼすべてに由来する配列を含め、絹の反復ドメイン断片を遺伝子操作した大きい（約４０ｋＤａ～約１００ｋＤａ）ブロック共重合体ポリペプチドは、本明細書に記載の改変微生物で発現させることができる。いくつかの実施形態では、絹ポリペプチド配列は、繊維形成能のある、高発現かつ高分泌のポリペプチドを産生するよう一致させ、設計される。いくつかの実施形態では、宿主改変株におけるプロテアーゼ遺伝子のノックアウトまたはプロテアーゼ活性の低下により、絹様ポリペプチドの分解が抑制される。

いくつかの実施形態では、ピキア・パストリスにおけるプロテアーゼ活性を減弱させるために、これらの酵素をコードする遺伝子は活性が低下もしくは消失するように不活性化または変異導入されている。これは、その遺伝子自体への変異もしくは挿入を介して、または遺伝子の調節エレメントの改変を介して行うことができる。これは、標準的な酵母の遺伝学的技法によって実現可能である。かかる技法の例としては二重相同組換えによる遺伝子置換が挙げられ、この二重相同組換えにおいては、不活性化すべき遺伝子に隣接する相同領域が、選択マーカー遺伝子（抗生物質耐性遺伝子または酵母株の栄養要求性を相補する遺伝子など）に隣接するベクターにクローニングされる。

別法として、上記相同領域をＰＣＲ増幅し、オーバーラップＰＣＲで選択マーカー遺伝子に連結することができる。その後、当該技術分野で公知の方法、例えば、電気穿孔法によりかかるＤＮＡ断片をピキア・パストリスに形質転換する。その後、選択的条件下で増殖させる形質転換体を、標準的な技法、例えば、ゲノムＤＮＡのＰＣＲまたはサザンブロットにより遺伝子破壊事象について分析する。代替的実験では、単一相同組換えにより遺伝子不活性化を実現することができ、その場合、例えば、遺伝子のＯＲＦの５’末端を、やはり選択マーカー遺伝子を含有するプロモーター不含ベクター上にクローニングする。かかるベクターが、標的遺伝子相同断片でのみベクターを切断する制限酵素を用いた消化によって線状になった時点で、かかるベクターをピキア・パストリスに形質転換する。標的遺伝子部位への組み込みは、ゲノムＤＮＡのＰＣＲまたはサザンブロットにより確認される。この方法では、ベクター上にクローニングされた遺伝子断片の複製がゲノム内で実現し、それにより標的遺伝子座の２コピー、すなわち、ＯＲＦが不完全なために（発現したとしても）短縮された不活性なタンパク質を発現する第１のコピー、及び転写を誘導するプロモーターがない第２のコピーが生じる。

別法として、トランスポゾン変異誘発を使用して標的遺伝子を不活性化する。かかる変異体のライブラリーは、ＰＣＲで標的遺伝子内の挿入事象についてスクリーニングを行うことができる。

遺伝子操作／ノックアウトを行った株の機能的表現型（すなわち、欠損）は、当該技術分野で公知の技法を使用して評価することができる。例えば、遺伝子操作株のプロテアーゼ活性の欠損は、当該技術分野で公知の多種多様な方法のいずれを使用しても確認することができ、特に、発色プロテアーゼ基質の加水分解活性アッセイ、選択プロテアーゼに対する基質タンパク質のバンドシフトなどがある。

本明細書に記載するプロテアーゼ活性の減弱をノックアウト変異以外の機構によって達成することができる。例えば、核酸配列を変化させること、遺伝子をより活性が低いプロモーターの制御下に置くこと、下方制御させること、対象遺伝子を標的とする干渉ＲＮＡ、リボザイムもしくはアンチセンスの配列を発現させることによるアミノ酸配列の変更、または当該技術分野で公知の他の任意の技術などによるアミノ酸配列の変さらによって、所望のプロテアーゼを減弱させることができる。好ましい株では、ＰＡＳ＿ｃｈｒ４＿０５８４（ＹＰＳ１－１）及びＰＡＳ＿ｃｈｒ３＿１１５７（ＹＰＳ１－２）にてコードされるプロテアーゼのプロテアーゼ活性は、上記方法のいずれかで減弱される。いくつかの態様では、本発明は、ＹＰＳ１－１及びＹＰＳ１－２遺伝子が不活性化されたメチロトローフ酵母菌株、特にピキア・パストリス株を対象とする。いくつかの実施形態では、プロテアーゼをコードするさらなる遺伝子を本明細書で提供する方法に従ってノックアウトし、当該の株により発現される所望のタンパク質産物のプロテアーゼ活性をさらに低下させてもよい。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示するＰ．パストリス株は絹様ポリペプチドを発現するよう改変されている。好ましい実施形態の絹様ポリペプチドの製造方法は、参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１５／０４２１６４、特に第１１４段落～第１３４段落に提示されている。ＷＯ２０１５／０４２１６４には、ナガコガネグモ種由来などのＭａＳｐ２由来の組換えクモ糸タンパク質断片配列に基づく合成タンパク質性共重合体が開示されている。２～２０個の反復単位を含む絹様ポリペプチドが記載されており、上記ポリペプチドにおいて、各反復単位の分子量は約２０ｋＤａより大きい。上記共重合体の各反復単位内には、多数の「準反復単位」に組織化されている約６０を超えるアミノ酸残基がある。いくつかの実施形態では、本開示に記載のポリペプチドの反復単位の、ＭａＳｐ２引き綱絹タンパク質の配列に対する配列同一性は、少なくとも９５％である。

組換えタンパク質の産生及び精製方法
本明細書において提供する方法は、所望の累計収率及び／または累計力価及び／または累計生産性の組換えタンパク質を産生するための、好適な発酵条件下において、好適な発酵ブロス及び好適な発酵容器内で、本明細書において提供する組換え宿主細胞の接種材料を発酵することを含む。

いくつかの実施形態では、組換え宿主細胞は組換えタンパク質を分泌する。各種実施形態では、組換え宿主細胞は、組換えタンパク質を分泌しない原核生物であることができる。特定の実施形態では、組換え宿主細胞は大腸菌である。

各種実施形態では、組換え宿主細胞は、組換えタンパク質を分泌する真核生物、または、組換えタンパク質を分泌するグラム陰性もしくはグラム陽性細菌などの原核生物であることができる。いくつかの実施形態では、組換え宿主細胞はピキア・パストリスである。特定の実施形態では、組換え宿主細胞は、（例えば、機能的ノックアウトにより）無効にされた１つ以上のプロテアーゼの活性を有する、ピキア・パストリス株である。さらに、以下で論じる特定の実施形態は、絹タンパク質などの、組換え疎水性または部分疎水性タンパク質の産生に適用可能である。

参照により本明細書に援用される、米国特許第９，９６３，５５４号“Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｓｉｌｋ Ｆｉｂｅｒｓ”は、合成ブロック共重合体用組成物、その産生のための組換え微生物、及びタンパク質を含む合成繊維について開示している。参照により本明細書に援用される、米国特許出願第１５／７２４，１９６号“Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｓｔｒａｉｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｓｉｌｋ”は、酵母細胞により発現される組換えタンパク質の分解を低下させるように選択された、または遺伝子組み換えされた、改変ピキア・パストリス、及び有用な化合物の産生のために酵母細胞を培養する方法について開示している。大腸菌を含む他の好適な微生物株は、有用な化合物の産生において培養及び使用することができる。

発酵
いくつかの実施形態では、組換え宿主細胞の接種材料は、シード株（すなわち、十分な数の組換え宿主細胞を生成する、値が増加する一連の発酵）に由来することができる。実施形態に応じて、シードの数は、２～７、３～７、３～６、または３～５種類のシードの範囲であってよい。

いくつかの実施形態では、組換え宿主細胞の接種材料は、少なくとも０．２ｇ／Ｌ、少なくとも０．５ｇ／Ｌ、少なくとも０．７ｇ／Ｌ、少なくとも０．８ｇ／Ｌ、少なくとも１ｇ／Ｌ、少なくとも２ｇ／Ｌ、少なくとも３ｇ／Ｌ、少なくとも４ｇ／Ｌ、または少なくとも５ｇ／Ｌ；０．２ｇ／Ｌ～３ｇ／Ｌ、０．２ｇ／Ｌ～２ｇ／Ｌ、または０．２／Ｌ～１ｇ／Ｌ；０．５ｇ／Ｌ～３ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ～２ｇ／Ｌ、または０．５／Ｌ～１ｇ／Ｌ；１ｇ／Ｌ～３ｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌ～２ｇ／Ｌ、または０．５／Ｌ～１ｇ／Ｌ；または、３ｇ／Ｌ～１ｇ／Ｌの、培地１リットル当たりの乾燥細胞重量％（ＤＣＷ）を有する。ＤＣＷは、バイオフォトメーター（例えば、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｂｉｏ Ｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ Ｄ３０）を使用して測定することができる。

大部分の実施形態では、接種材料のサイズは、発酵容器のサイズにより左右されるであろう。発酵容器のサイズが１５０Ｌ未満である実施形態において、ＤＣＷは０．１ｇ／Ｌ～０．５ｇ／Ｌの範囲であることができる。発酵容器のサイズが１５０Ｌを超える実施形態において、ＤＣＷは２～４ｇ／Ｌの範囲であることができる。

特定の実施形態に応じて、好適な発酵ブロスは、組換え宿主細胞が生存（すなわち、増殖及び／または生存能を維持）可能な、任意の発酵ブロスである。好適な発酵ブロスの非限定例としては、組換え宿主細胞の増殖及び／または生存能のために必要な栄養素を含む水性媒体が挙げられる。かかる栄養素の非限定例としては、炭素源、窒素源、ホスフェート供給源、塩類、ミネラル、塩基類、酸類、ビタミン類（例えばビオチン）、アミノ酸、及び金属類（例えば鉄、亜鉛、カルシウム、銅、ナトリウム、カリウム、コバルト、マグネシウム、マンガン）が挙げられる。

いくつかの実施形態では、細胞増殖を阻害し、組換えタンパク質の生産性、収率、または力価を改善するために、上記栄養素のいずれかを制限してよい。炭素源は、組換え宿主細胞により発酵可能な、任意の炭素源であることができる。好適な炭素源の非限定例としては、単糖類、二糖類、多糖類、アセテート、エタノール、メタノール、メタン、及びこれらの組み合わせが挙げられる。単糖類の非限定例としては、デキストロース（グルコース）、フルクトース、ガラクトース、キシロース、アラビノース、及びこれらの組み合わせが挙げられる。二糖類の非限定例としては、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、セロビオース、及びこれらの組み合わせが挙げられる。多糖類の非限定例としては、デンプン、グリコーゲン、セルロース、及びこれらの組み合わせが挙げられる。

窒素源は、組換え宿主細胞により同化（すなわち、代謝）可能な任意の窒素源であることができる。好適な窒素源の非限定例としては、無水アンモニア、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸二アンモニウム、リン酸一アンモニウム、ポリリン酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、尿素、ペプトン、タンパク質加水分解物、酵母抽出物、及び空気または酸素により富化された、上記のいずれかが挙げられる。

いくつかの実施形態では、発酵ブロスへの添加前に、微生物汚染物質を減少させる、または除去するために、熱またはオゾン処理を用いて、栄養素のいずれかまたは全てを滅菌することができる。例えば、炭素源は、発酵ブロスへの添加前に、熱を用いてカラメル化、または滅菌することができる。同様に、炭素源は、発酵ブロスへの添加前にオゾン処理することができる。オゾン処理の好適な方法は、Ｄｚｉｕｇａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｏｚｏｎａｔｉｏｎ ａｓ ａｎ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｗａｙ ｔｏ ｓｔａｂｉｌｉｚｅ ｎｅｗ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｍｅｄｉａ ｕｓｅｄ ｉｎ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｑｕｉｄ ｆｕｅｌ ａｄｄｉｔｉｖｅｓ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ Ｂｉｏｆｕｅｌｓ， ９：１５０ （２０１６）において論じられている。

発酵ブロスは、ｐＨを調節、及び／または維持するための、酸または塩基を含むことができる。いくつかのかかる実施形態では、ｐＨは、４．０～８．０、７．５、７．０、６．５、６．０、５．５、５．０、または４．５；４．５～８．０、７．５、７．０、６．５、６．０、５．５、または５．０；５．０～８．０、７．５、７．０、６．５、６．０、または５．５；５．５～８．０、７．５、７．０、６．５、または６．０；６．０～８．０、７．５、７．０、または６．５；６．５～８．０、７．５、または７．０；７．０～８．０、または７．５；または、７．５～８．０である。

好適な酸の非限定例としては、アスパラギン酸、酢酸、塩酸、及び硫酸が挙げられる。好適な塩基の非限定例としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化アンモニウム、炭酸カルシウム、アンモニア、及びリン酸二アンモニウムが挙げられる。いくつかの実施形態では、強酸または強塩基を使用して、発酵ブロスの希釈を制限する。

いくつかの実施形態では、発酵ブロスは、所望の酸素吸収速度（ＯＵＲ）が達成され、かつ／または維持された、かかる栄養素、またはかかる量のかかる栄養素を含む。いくつかのかかる実施形態では、所望のＯＵＲは、少なくとも４０ｍｍｏｌ Ｏ_２／Ｌ／時、少なくとも８０ｍｍｏｌ Ｏ_２／Ｌ／時、少なくとも１００ｍｍｏｌ Ｏ_２／Ｌ／時、少なくとも１０５ｍｍｏｌ Ｏ_２／Ｌ／時、少なくとも１１０ｍｍｏｌ Ｏ_２／Ｌ／時、少なくとも１１５ｍｍｏｌ Ｏ_２／Ｌ／時、少なくとも１２０ｍｍｏｌ Ｏ_２／Ｌ／時、または、少なくとも１４０ｍｍｏｌ Ｏ_２／Ｌ／時、少なくとも１６０ｍｍｏｌ Ｏ_２／Ｌ／時、少なくとも１８０ｍｍｏｌ Ｏ_２／Ｌ／時、少なくとも２００ｍｍｏｌ Ｏ_２／Ｌ／時、または、少なくとも２２０ｍｍｏｌ Ｏ_２／Ｌ／時；４０ｍｍｏｌ Ｏ_２／Ｌ／時～２２０ｍｍｏｌ Ｏ_２／Ｌ／時、６０ｍｍｏｌ Ｏ_２／Ｌ／時～２２０ｍｍｏｌ Ｏ_２／Ｌ／時、８０ｍｍｏｌ Ｏ_２／Ｌ／時～２２０ｍｍｏｌ Ｏ_２／Ｌ／時、または、１００ｍｍｏｌ Ｏ_２／Ｌ／時～２２０ｍｍｏｌ Ｏ_２／Ｌ／時；１００ｍｍｏｌ Ｏ_２／Ｌ／時～１４０ｍｍｏｌ Ｏ_２／Ｌ／時、１００ｍｍｏｌ Ｏ_２／Ｌ／時～１３５ｍｍｏｌ Ｏ_２／Ｌ／時、１００ｍｍｏｌ Ｏ_２／Ｌ／時～１３０ｍｍｏｌ Ｏ_２／Ｌ／時、または、１００ｍｍｏｌ Ｏ_２／Ｌ／時～１２５ｍｍｏｌ Ｏ_２／Ｌ／時；１１０ｍｍｏｌ Ｏ_２／Ｌ／時～１２５ｍｍｏｌ Ｏ_２／Ｌ／時、または、１１０ｍｍｏｌ Ｏ_２／Ｌ／時～１２０ｍｍｏｌ Ｏ_２／Ｌ／時；または、１１５ｍｍｏｌ Ｏ_２／Ｌ／時～１２０ｍｍｏｌ Ｏ_２／Ｌ／時である。ＯＵＲは、Ｂｉｏｒｅａｃｔｉｏｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ２０１１， Ｓｐｒｉｎｇ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＋ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｍｅｄｉａ， ｐ． ４４９に記載されている直接法を使用して、当業者により計算することができる。

いくつかの実施形態では、発酵ブロスは、組換え宿主細胞による組換えタンパク質の産生が、副産物の産生に関連して増加する、かかる栄養素、またはかかる量のかかる栄養素を含む。かかる副産物の非限定例としては、エタノールが挙げられる。いくつかの実施形態では、７２時間の発酵で、組換え宿主細胞は、０．１ｇ／Ｌ未満、１ｇ／Ｌ未満、５ｇ／Ｌ未満、１０ｇ／Ｌ未満、または１５ｇ／Ｌ未満；０．１ｇ／Ｌ～１５ｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌ～１５ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ～１５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ～１５ｇ／Ｌ、または０．５ｇ／Ｌ～１５ｇ／Ｌ；または、０．１ｇ／Ｌ～１．５ｇ／Ｌ、０．２ｇ／Ｌ～１．５ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ～１．５ｇ／Ｌ、０．７ｇ／Ｌ～１．５ｇ／Ｌ、または１．０ｇ／Ｌ～１．５ｇ／Ｌの累積収率でエタノールを産生する。

いくつかの実施形態では、発酵ブロスは、所望の溶存酸素（ＤＯ）含量が到達され、かつ／または維持された、かかる栄養素、またはかかる量のかかる栄養素を含む。いくつかのかかる実施形態では、所望のＤＯ含量は、少なくとも２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、もしくは１００％；または、２％～４０％、２％～５％、５％～４０％、２％～２０％、５％～２０％、２～１５％、もしくは５％～１５％である。

いくつかの実施形態では、発酵ブロスは、所望の呼吸商（ＲＱ；すなわち、消費された酸素に対する、産生された二酸化炭素の比率）が達成され、かつ／または維持された、かかる栄養素、または、かかる量のかかる栄養素を含む。いくつかのかかる実施形態では、所望のＲＱは、２未満、１．７５未満、１．５未満、もしくは１．２５未満；または、１～１．１、１～１．２、１～１．３、１～１．４、もしくは１～１．５である。

いくつかの実施形態では、発酵ブロスは、組換え宿主細胞の所望の倍加時間が到達され、かつ／または維持された、かかる栄養素、またはかかる量のかかる栄養素を含む。いくつかのかかる実施形態では、所望の倍加時間は、少なくとも４時間、８時間、１２時間、１６時間、１８時間、２２時間、２６時間、３０時間、３４時間、もしくは３６時間；または、４時間～１２時間、４時間～１０時間、４時間～８時間、６時間～１２時間、６時間～１０時間、もしくは６時間～８時間である。

いくつかの実施形態では、発酵ブロスは、１つ以上の追加のタンパク質を含む。かかる追加のタンパク質を付加することは、組換え宿主細胞が組換えタンパク質を分泌する実施形態における組換え宿主細胞により産生された組換えタンパク質からのプロテアーゼ活性を混乱させる役割を果たし得る。追加のタンパク質の非限定例としては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及びカザミノ酸が挙げられる。他の追加のタンパク質が、当該技術分野において周知である。

栄養素を、１回のボーラスで、漸増式に、または連続的に、のいずれかで、発酵ブロスに添加することができる。栄養素が連続的に添加される実施形態において、栄養素は、急速、低速、または指数的速度で添加されることができる。

栄養素が発酵ブロスに連続して添加される実施形態において、栄養素は、当該栄養素を含有する媒体の連続添加により、添加してよい。これらの実施形態において、発酵ブロス中の等体積の水性媒体を発酵から取り出し、発酵ブロスの全体積を同一に保持してよい。いくつかの実施形態では、組換え宿主細胞は発酵ブロスから取り出されることができ、発酵ブロスへの添加前の栄養素を含有する媒体に再添加される。

好適な発酵容器は、組換え宿主細胞が生存（増殖及び／または生存能を維持）可能な、任意の発酵容器である。好適な発酵容器の非限定例としては、培養プレート、バイアル、フラスコ、または発酵槽が挙げられる。好適な発酵槽の非限定例としては、撹拌タンク発酵槽、エアリフト発酵槽、気泡塔反応槽、固定ベッドバイオリアクター、及びこれらの任意の組み合わせが挙げられる。

好適な発酵条件は、組換え宿主細胞が生存（増殖及び／または生存能を維持）可能な、任意の条件である。かかる発酵条件の非限定例としては、好適な体積の発酵ブロス、好適なｐＨの発酵ブロス、発酵ブロス内の好適なＤＯ、好適な温度、好適な酸素添加、組換え宿主細胞の好適な撹拌、及び好適な期間の発酵が挙げられる。

各種実施形態では、好適な温度は、組換え宿主細胞の増殖及び／もしくは生存能、ならびに／または、組換えタンパク質の産生に好適な、任意の温度であることができる。いくつかの実施形態では、温度は、少なくとも１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃；１５℃～３５℃、１５℃～２５℃、１５℃～２０℃、２０℃～３５℃、２０℃～３０℃、２０℃～２５℃、２５℃～３５℃、または２５℃～３０℃である。

好適な酸素添加は、組換え宿主細胞の増殖及び／もしくは生存能、ならびに／または、組換え宿主細胞の産生に好適な、任意の酸素添加であることができる。かかる酸素添加は、発酵容器及び／または発酵ブロスの、好適な通気及び／または好適な撹拌を提供することにより達成することができる。いくつかの実施形態では、好適な通気は、少なくとも１．５ｖｖｍ、少なくとも１．６ｖｖｍ、少なくとも１．７ｖｖｍ、少なくとも１．８ｖｖｍ、少なくとも１．９ｖｖｍ、または少なくとも２ｖｖｍ；１．５ｖｖｍ～２ｖｖｍ、１．５ｖｖｍ～１．９ｖｖｍ、１．５ｖｖｍ～１．８ｖｖｍ、１．５ｖｖｍ～１．７ｖｖｍ、１．５ｖｖｍ～１．６ｖｖｍ、１．６ｖｍ～２ｖｖｍ、１．７ｖｖｍ～２ｖｖｍ、１．８ｖｖｍ～２ｖｖｍ、または１．７ｖｖｍ～１．９ｖｖｍである。

実施形態、及び発酵の種類に応じて、発酵ブロス中での組換え宿主細胞の好適な撹拌は、変化し得る。

実施形態に応じて、気泡塔を通気のために使用してよい。気泡塔は、特定の実施形態に基づいて複雑性が変化し得（例えば、単相または複層であってよい）、様々な気体速度を付与し得る。好適な気体速度の非限定例としては、０．００３～０．０８ｍ／ｓであるが、これに限定されない。気泡反応槽の非限定例は、Ｋａｎｔａｒｃｉ ｅｔ ａｌ．， Ｂｕｂｂｌｅ Ｃｏｌｕｍｎ Ｒｅａｃｔｏｒｓ， Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４０：２２６３－２２８３ （２００５）に含まれている。

いくつかの実施形態では、発酵ブロスは、発酵中の発泡を低減する剤（「消泡剤」）を含む。本明細書に定義するように、泡とは、発酵容器内、またはその上部付近に位置する、連続液相中での気体の分散である。実施形態に応じて、任意の組換えタンパク質産生物との相互作用を低減するために、消泡剤を選択及び最適化してよい。消泡剤の非限定例としては、ケイ素ベースの油、エマルション、及びポリマー；ポリプロピレングリコール；ポリエチレングリコールベースの消泡剤；ポリアルキレングリコールベースの消泡剤；二官能性エチレン／プロピレンオキシド（ＥＯ／ＰＯ）ブロック共重合体；脂肪酸ベースの消泡剤；ポリエステルベースの消泡剤；オイルベースの消泡剤、及び前述の任意の組み合わせが挙げられる。好適な消泡剤は、Ｊｕｎｋｅｒ， Ｆｏａｍ ａｎｄ ｉｔｓ Ｍｉｔｉｇａｔｉｏｎ ｉｎ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．， ２３：７６７－７８４ （２００７）で論じられている。組換えタンパク質が絹タンパク質などの疎水性タンパク質である実施形態において、消泡剤が疎水性タンパク質を可溶化する、または可溶化しないように、消泡剤を選択してよい。

組換えタンパク質の所望の累積収率は、低産生コストに寄与する、任意の累積収率であることができる。本明細書で使用する場合、累積収率は、発酵の過程で、組換え宿主細胞により異化作用された炭素源の質量に対する、産生した組換えタンパク質の質量の割合として計算される（すなわち、提供された炭素源の質量－発酵ブロス中に残った炭素源の質量；例えば、１００グラムのグルコースが組換え宿主細胞に提供され、発酵の終了時に、２５グラムの組換えタンパク質が産生され、１０グラムのグルコースが残っている場合、組換えタンパク質の累積収率は２７．７％である）。他の全ての基準値が等しいと推定すると、累積収率が高いことにより、低累積収率よりも低い産生コストがもたらされる。いくつかの実施形態では、７２時間の発酵後の、炭素源における組換え絹タンパク質の累積収率は、少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも３０％、または少なくとも１００％；１％～５％、５％～１０％、１０％～３５％、３５％～５０％、または５０％～１００％である。

組換えタンパク質の所望の累積力価は、低産生コストに寄与する、任意の累積力価であることができる。本明細書で使用する場合、累積力価は、発酵の過程における、発酵ブロスの力価当たりの、産生された組換えタンパク質のグラム（すなわち、ｇ／Ｌ）として計算される。他の全ての基準値が等しいと推定すると、累積力価が高いことにより、低累積力価よりも低い産生コストがもたらされる。いくつかの実施形態では、７２時間の発酵後の、組換えタンパク質の累積力価は、少なくとも２ｇ／Ｌ、少なくとも５ｇ／Ｌ、少なくとも１５ｇ／Ｌ、もしくは少なくとも３０ｇ／Ｌ；１ｇ／Ｌ～１００ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、もしくは３０ｇ／Ｌ；１０ｇ／Ｌ～１００ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、もしくは７５ｇ／Ｌ；または、５ｇ／Ｌ～３０ｇ／Ｌである。

組換えタンパク質の所望の累積生産性は、低産生コストに寄与する、任意の累積生産性であることができる。本明細書で使用する場合、累積生産性は、発酵の過程における、１時間当たりの発酵ブロスの１リットル当たりの、産生された組換えタンパク質のグラム（すなわち、ｇ／Ｌ／時）として計算される。他の全ての基準値が等しいと推定すると、累積生産性が高いことにより、低累積生産性よりも低い産生コストがもたらされる。いくつかの実施形態では、組換えタンパク質の累積生産性は、少なくとも０．００１ｇ／Ｌ／時、少なくとも０．０２５ｇ／Ｌ／時、少なくとも０．０５ｇ／Ｌ／時、少なくとも０．１ｇ／Ｌ／時、または少なくとも０．２ｇ／Ｌ／時；０．００１ｇ／Ｌ／時～０．５ｇ／Ｌ／時である。

本明細書において提供する方法は、任意の発酵スケールで、かつ／または、当該技術分野において公知の任意の発酵手順に従い、実施することができる。発酵手順は、フェッドバッチ、バッチ、連続、またはこれらの任意の組み合わせであることができる。いくつかの実施形態では、方法は、１つ以上のバッチ発酵により開始して、その後１つ以上の連続発酵が続き、組換え宿主細胞の接種材料、好適な発酵ブロス、好適な発酵容器、及び／または好適な発酵条件は、１つ以上のバッチ発酵、及び／または１つ以上の連続発酵間で異なり得る。いくつかの実施形態では、バッチ発酵の温度は、連続発酵の温度よりも高い。いくつかのかかる実施形態では、バッチ発酵の温度は２７℃より高く、連続発酵の温度は２７℃未満である。

いくつかの実施形態では、発酵は段階的に進行する。かかる段階は、増殖段階、産生段階、及び／または回収段階を含み得る。いくつかの実施形態では、段階では互いに、組換え宿主細胞の接種材料、好適な発酵ブロス、好適な発酵容器、及び／または１つ以上の好適な発酵条件が異なる。

組換えタンパク質の単離方法
実施形態に応じて、各種方法を使用して、対象の組換えタンパク質を単離及び回収することができる。上述のように、これらの方法の全てではないがいくつかが、対象の組換えタンパク質を分泌する組換え宿主細胞に対して特異的である。さらに、これらの方法のいくつかが、疎水性である対象のタンパク質に対して特異的である。

図１は、本発明の一実施形態に従った組換えタンパク質を単離するためのプロセスフローを示す。当業者は、図１に示す工程のいくつかを、別の順序で、及び／または繰り返して実施可能であることを理解するであろう。開示された実施形態は、本明細書において提供する方法の範囲の限定を意図するものではなく、使用される組換え宿主細胞、所望の累積収率、累積力価、及び／もしくは累積生産性、または他の因子に基づいて、方法は変化し得ることを、当業者は認識するであろう。

任意の工程Ａ０２において、バイオマス（すなわち、インタクトな、または破壊された組換え宿主細胞及び細胞片）を、組換え宿主細胞を含む発酵物から取り出す。各種実施形態では、バイオマスを取り出すことは、不溶性発酵不純物（例えば、タンパク質の可溶化の間に沈殿し得る、発酵ブロスの消泡剤及び他の構成成分）を取り除くこともまた含むことができる。

各種実施形態では、バイオマスを取り出すことは、サイズ、重量、密度、またはこれらの組み合わせに応じて達成され得る。サイズに基づきバイオマスを取り出すことは、例えば、濾過プレス、キャンドルスティックフィルタ、または、業界で用いられている、他の、組換え宿主細胞のサイズよりも小さい、分子量カットオフを有する濾過システムを使用する濾過により達成することができる。重量または密度に基づきバイオマスを取り出すことは、例えば、沈降機、低ｇ力デカンター遠心分離器、ディスクスタック分離器、２相ノズル遠心分離器、固体排出遠心分離器、または液体サイクロンを用いる重力沈降または遠心分離により達成することができる。本明細書で開示したとおりにバイオマスを取り出すことにより、タンパク質を含む、遠心分離液（すなわち、軽相または透明細胞ブロス）、及びバイオマスと不溶性発酵不純物とを含む固体（重相）が得られる。バイオマスを取り出すための好適な条件（例えばｇ力、沈降時間、遠心分離時間、遠心分離器入力における固体の割合、遠心分離器の供給速度）は、透明な細胞ブロス中での、バイオマス及び不溶性発酵不純物を最小限に抑えるために連動される、当該技術分野において公知の方法を使用して決定することができる。いくつかの実施形態では、バイオマスを取り出すことにより、５％未満、１％未満、0．５％未満、または０．１％未満の、湿潤充てん固体体積を有する、透明細胞ブロスがもたらされる。いくつかの実施形態では、バイオマスを取り出すことにより、１ｇ／Ｌ～５０ｇ／Ｌの濃度においてタンパク質を含む、透明細胞ブロスがもたらされる。いくつかの実施形態では、透明細胞ブロスを研磨遠心分離に供して、残りの固体を取り出す。いくつかの実施形態では、バイオマスを取り出すことで得られた固体を、少なくとももう１ラウンドの、タンパク質の可溶化及びバイオマスの取り出しに供し、全ての遠心分離液が最終的には、本明細書において提供する方法に従った更なる処理のために合わせられる。

実施形態に応じて、工程Ａ０２は、工程Ａ０４の前、及び／または後に実施してよい。工程Ａ０２は数回実施してよい。例えば、数ラウンドの遠心分離及び／または濾過を実施して、工程Ａ０４の前、及び／または後に、バイオマスを取り出すことができる。

工程Ａ０４の後で、組換えタンパク質が可溶化される。工程Ａ０２を実施しないいくつかの実施形態では、組換え宿主細胞、及び組換え宿主細胞と会合した組換えタンパク質を、バイオマスのペレット（以下「細胞ペレット」）に遠心分離し、上清を廃棄することによる可溶化の前に、組換えタンパク質を、組換え宿主細胞と共に単離してよい。組換えタンパク質が不溶性であり、かつ／または、組換えタンパク質が、自身で及び／または組換え宿主細胞と凝集し、かつ／または、組換え宿主細胞の表面に付着する場合において、本工程は有益であり得る。他の実施形態では、組換えタンパク質は全細胞ブロス中で可溶化される。いくつかの実施形態では、組換えタンパク質は、工程Ａ０２を実施することで生成した透明細胞ブロス中で可溶化される。

いくつかの実施形態では、可溶化剤を全細胞ブロス、透明細胞ブロス、または細胞ペレットに添加することにより、組換えタンパク質の可溶化を達成することができる。好適な可溶化剤の非限定例としては、界面活性剤、ヒドロトロープ、ＳＤＳ、尿素、システイン、グアニジンチオシアン酸塩、多糖類を加水分解する酵素（例えば、グルカナーゼ、リチカーゼ、マンナーゼ、キチナーゼ）、高ｐＨ水（ｐＨが１１～１２のＨ_２Ｏ）、または、他の公知のカオトロープが挙げられる。異なる種類の組換えタンパク質に対しては、異なる可溶化剤を選択してよい。タンパク質を可溶化するための好適な条件（例えば、抽出剤の種類及び量、温度、インキュベーション時間、撹拌、ｐＨ）は、組換えタンパク質の収率を最大化し、組換え宿主細胞の溶解、及び不純物の可溶化を最小限に抑えるために連動される、当該技術分野において公知の方法を使用して決定することができる。上述のように、組換えタンパク質が不溶性であり、かつ／または、組換えタンパク質が、自身と、及び／または組換え宿主細胞内もしくはその付近で凝集する特定の実施形態において、組換え宿主細胞を遠心分離することができ、可溶化剤をペレットに添加する前に上清を廃棄することができる。

いくつかの実施形態では、可溶化及び／または沈殿前に、膜から過剰のタンパク質を取り出すために、各種技術を使用して、組換え宿主細胞の膜を穿孔または透過処理してよい。かかる方法としては化学的破壊、機械的破壊、または超音波処理が挙げられる。細胞膜の機械的破壊としては、均質化、剪断力、凍結／解凍、加熱、圧力、超音波処理、及び濾過が挙げられる。化学的破壊としては、トリトン、ドデシル硫酸ナトリウムなどの洗剤；または、尿素及びグアニジンなどのカオトロープ剤が挙げられる。他の方法が、当該技術分野において周知である。

特定の実施形態では、尿素を可溶化剤として使用し、組換えタンパク質を可溶化して、組換え宿主細胞の破壊を防止する。尿素の濃度を変化させて、組換え宿主細胞の破壊を防止することができる。実施形態に応じて、尿素の濃度の量は、４Ｍ～１０Ｍで変化することができる。各種実施形態では、組換え宿主細胞及び組換えタンパク質は、１～２時間、１～３時間、または１～４時間、尿素でインキュベートすることができる。実施形態に応じて、グアニジンチオシアン酸塩などの、他の公知のカオトロープを使用して、組換えタンパク質を可溶化する。

特定の実施形態では、高ｐＨ Ｈ_２Ｏまたは水性緩衝液を使用して、組換えタンパク質を可溶化し、組換え宿主細胞の破壊を防止する。高ｐＨ Ｈ_２Ｏまたは水性緩衝液のｐＨを変化させて、組換え宿主細胞の破壊を防止することができる。実施形態に応じて、高ｐＨ Ｈ_２ＯのｐＨは、ｐＨ１０～ｐＨ１２．５、ｐＨ１０．５～ｐＨ１２．５、ｐＨ１１～ｐＨ１２．５、ｐＨ１１．５～ｐＨ１２．５、ｐＨ１２～ｐＨ１２．５、ｐＨ１０～ｐＨ１２、ｐＨ１０．５～ｐＨ１１．０、ｐＨ１０．５～ｐＨ１１．５、ｐＨ１０．５～ｐＨ１２、ｐＨ１０．５～ｐＨ１２．５、ｐＨ１１～ｐＨ１１．５、ｐＨ１１～ｐＨ１２、ｐＨ１１．５～ｐＨ１２．５、またはｐｈ１２～ｐＨ１２．５の範囲であることができる。各種実施形態では、組換え宿主細胞及び組換えタンパク質を、高ｐＨ Ｈ_２Ｏで、少なくとも１０分、少なくとも１５分、少なくとも３０分、少なくとも４５分、少なくとも６０分、少なくとも７５分、少なくとも９０分、少なくとも１１５分、または少なくとも１２０分間、インキュベートしてよい。

特定の実施形態では、均質化を用いて宿主細胞を溶解する。均質化圧力（ｐｓｉ）は、５，０００～１００，０００ｐｓｉ、５，０００～１０，０００ｐｓｉ、１０，０００～２０，０００ｐｓｉ、２０，０００～３０，０００ｐｓｉ、３０，０００～４０，０００ｐｓｉ、４０，０００～５０，０００ｐｓｉ、５０，０００～６０，０００ｐｓｉ、６０，０００～７０，０００ｐｓｉ、７０，０００～８０，０００ｐｓｉ、８０，０００～９０，０００ｐｓｉ、９０，０００～１００，０００ｐｓｉであることができる。均質化は、１回の過程、または複数回の過程であることができる。いくつかの実施形態では、均質化は１回の過程、２回の過程、３回の過程、４回の過程、または５回の過程である。

工程Ａ０６の後、不純物が発酵物から取り除かれる。工程Ａ０６を、工程Ａ０４及び／または工程Ａ０８の前、及び／または後に実施してよい。工程Ａ０６を、任意の回数繰り返してよい。発酵物から不純物を取り除くことは、濾過、吸収（例えば、炭または固体状態吸収）、透析、ならびに、コアセルベーション、または各種化学物質を用いることにより誘発される、相分離により達成することができる。相分離がコアセルベーションにより誘発される実施形態において、コアセルベーションは、発酵物を、相分離を誘発するのに十分な温度まで冷却することにより、誘発することができる。他の実施形態では、相分離は、溶液からタンパク質を沈殿させるために使用される、コスモトロープ及び／または化合物を添加することにより、化学的に誘発することができる。相分離を用いる不純物除去の詳細の実施形態を、図Ｃについて以下で記載する。組換えタンパク質が熱安定性であるいくつかの実施形態では、発酵物を高温に供して、他のタンパク質を変性させ、遠心分離に供して、変性したタンパク質を、溶液中のタンパク質から分離することにより、他のタンパク質を取り出すことができる。

いくつかの実施形態では、不純物は（例えば、脱イオン水に対する）濾過、精密濾過、ダイアフィルトレーション、及び／または限外濾過を使用して取り除かれる。精密濾過に好適な膜は、０．１ｕＭ～１ｕＭを含んでよい。限外濾過に好適な膜の非限定例としては、５０ｋＤａ～８００ｋＤａ、１００ｋＤａ～８００ｋＤａ、２００ｋＤａ～８００ｋＤａ、３００ｋＤａ～８００ｋＤａ、４００ｋＤａ～８００ｋＤａ、５００ｋＤａ～８００ｋＤａ、６００ｋＤａ～８００ｋＤａ、７００ｋＤａ～８００ｋＤａ、１００ｋＤａ～７００ｋＤａ、２００ｋＤａ～７００ｋＤａ、３００ｋＤａ～７００ｋＤａ、４００ｋＤａ～７００ｋＤａ、５００ｋＤａ～７００ｋＤａ、６００ｋＤａ～７００ｋＤａ、または、５００ｋＤａ～６００ｋＤａの分子量カットオフを有する疎水性膜（例えば、ＰＥＳ、ＰＳ、酢酸セルロース）が挙げられる。いくつかの実施形態では、限外濾過により、濃縮水として、水中の組換えタンパク質スラリーが、及び不純物を含む浸透水が得られる。限外濾過に好適な条件（例えば膜、温度、体積交換）は、浸透密度を最大にするために連動される、当該技術分野において公知の方法を使用して決定することができる。いくつかの実施形態では、限外濾過により、１ｇ／ｍＬ～３０ｇ／ｍＬの密度を有する濃縮水がもたらされる。いくつかの実施形態では、限外濾過は、濃縮された濃縮水を得る濃縮工程と、その後の、不純物を取り除き、水中に懸濁したタンパク質スラリーを得る、ダイアフィルトレーション工程と、を含む。いくつかのかかる実施形態では、濃縮された濃縮液は、開始体積に対して２倍～１２倍の体積減少の、濃度因子を有する。いくつかの実施形態では、ダイアフィルトレーションにより、３倍～１０倍の、一定の体積交換がもたらされる。

実施形態、及び取り除かれる不純物の種類に応じて、不純物を取り除く方法は変化し得る。単離された組換えタンパク質から脂質不純物を取り除くことは、当該技術分野において公知の方法により達成することができる。かかる方法の非限定例としては、炭、または、脂質に特異的に結合する他の吸収媒体への吸収が挙げられる。単離された組換えタンパク質から多糖類不純物を取り除くことは、当該技術分野において公知の方法により達成することができる。かかる方法の非限定例としては、多糖類を加水分解する酵素による処理の後に、限外濾過により生成した小さな糖類を除去することが挙げられる。かかる酵素の非限定例としては、グルカナーゼ、リチカーゼ、マンナーゼ、及びキチナーゼが挙げられる。

工程Ａ０８において、可溶化された組換えタンパク質が単離される。可溶化された組換えタンパク質は、抽出緩衝液、サイズ排除クロマトグラフィー、ゲル濾過、超音波タンパク質抽出、及びイオン交換クロマトグラフィーを使うことを含む、多数の異なる方法において単離することができる。バイオマスが任意の工程Ａ０２において取り出されない、いくつかの実施形態では、組換えタンパク質は、組換え宿主細胞と共に単離することができる。

いくつかの実施形態では、組換えタンパク質は、単一の単離工程として、または他の単離工程に加えて、沈殿される。可溶化された組換えタンパク質を沈殿させることは、発酵物に沈殿剤を添加することにより達成することができる。かかる沈殿剤の非限定例としては、硫酸イオン（例えば、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、硫酸）、またはクエン酸イオン（例えば、クエン酸ナトリウム）が挙げられる。いくつかの実施形態では、沈殿剤は酸である。いくつかの実施形態では、沈殿剤は塩である。一実施形態では、沈殿剤はＨ_２ＳＯ_４である。

任意の好適な酸を使用して、可溶化された組換えタンパク質を含む溶液のｐＨを調節する、または変化させることができる。好適な酸としては、塩酸（ＨＣｌ）、硫酸（Ｈ２ＳＯ４）、硝酸（ＨＮｏ３）、ホウ酸（Ｈ３ＢＯ３）、リン酸（Ｈ３ＰＯ４）、フッ化水素酸（ＨＦ）、臭化水素酸（ＨＢｒ）、過塩素酸（ＨＣｌＯ４）、ヨウ化水素酸（ＨＩ）などの鉱酸；クエン酸、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、カプロン酸、シュウ酸、乳酸、リンゴ酸、安息香酸、炭酸、尿酸、タウリン、ｐ－トルエンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、アミノメチルホスホン酸、及び２，２，２－トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）；または、これらの任意の組み合わせ、もしくは、当該技術分野において公知の他の好適な酸が挙げられる。上で開示した酸のいずれかの酸性塩もまた、使用することができる。

いくつかの実施形態では、組換えタンパク質は、ｐＨ４～１０で沈殿する。いくつかの実施形態では、沈殿はｐＨ４、５、６、７、８、９、または１０における。いくつかの実施形態では、沈殿は、少なくともｐＨ４、少なくともｐＨ４．５、少なくともｐＨ５、少なくともｐＨ５．５、少なくともｐＨ６、少なくともｐＨ６．５、少なくともｐＨ７、少なくともｐＨ７．５、少なくともｐＨ８、少なくともｐＨ８．５、少なくともｐＨ９、少なくともｐＨ９．５、少なくともｐＨ１０における。一実施形態では、沈殿はｐＨ７における。いくつかの実施形態では、沈殿はｐＨ４～５、ｐＨ５～６、ｐＨ６～７、ｐＨ７～８、ｐＨ８～９、またはｐＨ９～１０である。

沈殿は１回、２回、または、必要に応じてできるだけ多い回数、繰り返してよい。いくつかの実施形態では、２回以上の沈殿工程を実施し、各沈殿のｐＨは同一である。他の実施形態では、２回以上の沈殿工程を実施し、各沈殿のｐＨは異なる。例えば、最初の沈殿はｐＨ４にて実施してよく、第２の沈殿はｐＨ７にて実施してよい。

沈殿した組換えタンパク質を単離することは、本明細書で開示するとおり、サイズ、重量、密度、またはこれらの組み合わせに基づいて達成することができる。いくつかの実施形態では、かかる単離により、濃縮液として、懸濁した組換えタンパク質スラリーが、及び廃棄物を含む浸透液がもたらされる。組換えタンパク質を沈殿させるのに好適な条件（例えば、二価アニオン添加前の希釈、二価アニオンの種類及び量、インキュベーション温度、インキュベーション時間）、及び沈殿した組換えタンパク質を単離するのに好適な条件は、懸濁した組換えタンパク質スラリー中での組換えタンパク質の収率を最大にするために連動される、当該技術分野において公知の方法を使用して決定することができる。いくつかの実施形態では、懸濁した絹タンパク質スラリー中での、沈殿した組換えタンパク質の収率は、２０％～９９％である。いくつかの実施形態では、懸濁した絹タンパク質スラリーは、３０％～６５％の、湿潤充てん固体含量を有する。いくつかの実施形態では、懸濁した絹タンパク質スラリーは、１０ｇ／Ｌ～５０ｇ／Ｌの濃度で、絹タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、絹タンパク質を沈殿させ、沈殿した絹タンパク質を単離する工程を、少なくとも１回（同一または異なる処理条件を用いて）繰り返し、水性の可溶性不純物をさらに洗い流す。

任意の工程Ａ１０において、単離された組換えタンパク質が濃縮される。単離された組換えタンパク質を濃縮することは、高温及び／または減圧（例えば、不完全真空）での蒸発により達成することができる。単離された組換えタンパク質を濃縮するための好適な条件（例えば温度、圧力、期間）は、乾燥固形分の含量が増加した、単離された組換えタンパク質を得るために連動される、当該技術分野において公知の方法を使用して決定することができる。いくつかの実施形態では、濃縮することにより、元の体積からの、２０％～７０％の体積の減少がもたらされる。いくつかの実施形態では、濃縮することにより、３％～２０％の乾燥固形分を含む、濃縮した、単離された組換えタンパク質がもたらされる。

任意の工程Ａ１２において、単離された組換えタンパク質は乾燥している。懸濁した絹タンパク質スラリーを乾燥させて絹タンパク質粉末を得ることは、スプレードライ、ドラム乾燥機、凍結乾燥、または流動床乾燥により、達成することができる。いくつかの実施形態では、粉末は、１０％未満、９％未満、８％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満の含水量を有する。

図２は、本発明の一実施形態に従った組換えタンパク質を単離するためのプロセスフローを示す。当業者は、図２に示す工程のいくつかを、別の順序で、及び／または繰り返して実施可能であることを理解するであろう。開示された実施形態は、本明細書において提供する方法の範囲の限定を意図するものではなく、使用される組換え宿主細胞、所望の累積収率、累積力価、及び／もしくは累積生産性、または他の因子に基づいて、方法は変化し得ることを、当業者は認識するであろう。

工程Ｂ０５において、組換え宿主細胞は溶解され、かつ／または別の方法で破壊され、組換え宿主細胞の内容物が放出され、発酵物に供される。実施形態に応じて、組換え宿主細胞を、各種異なった方法を用いて破壊することができる。宿主細胞を溶解、及び／または破壊するための好適な方法としては、高温短時間（ＨＴＳＴ）法などの熱を用いること、高剪断細胞破壊、物理的均質化、及び化学的均質化が挙げられる。

任意の工程Ｂ０４において、組換えタンパク質を、工程Ａ０４に関して上述したとおりに可溶化させる。工程Ｂ０４は、工程Ｂ０５の前、または後に実施してよい。いくつかの実施形態では、工程Ｂ０４は、工程Ｂ０５の前、及び後に実施してよい。

任意の工程Ｂ０２において、バイオマスを、工程Ａ０２に関して上述したとおりに取り出す。さらに、溶解した、及び／または破壊されたセルからバイオマスを取り出す他の方法としては、組換えタンパク質が可溶化されている場合における遠心分離及び濾過を含むことができる。

任意の工程Ｂ０６において、不純物を、工程Ａ０６に関して上述したとおりに取り除く。工程Ｂ０２及びＢ０６は、他の工程の前または後に実施することができ、かつ、繰り返して実施することができる。いくつかの実施形態では、工程Ｂ０６は、工程Ｂ０８の前、及び後に実施してよい。

工程Ｂ０８において、組換えタンパク質が単離される。組換えタンパク質を単離するための好適な方法は、工程Ａ０８に関して上述したとおりである。さらに、組換えタンパク質を単離するための方法としては、濾過及び／または脱ガムにおいてさらなる膜を用いて、リン脂質を取り除くこともまた挙げることができる。

任意の工程Ｂ１０において、組換えタンパク質は、工程Ａ１０に関して上述したとおりに濃縮される。任意の工程Ｂ１２において、組換えタンパク質を、工程Ｂ１０に関して上述したとおりに乾燥させる。

図３は、本発明の一実施形態に従った、組換えタンパク質精製のためのプロセスフローを示す。当業者は、図３に示す工程のいくつかを、別の順序で、及び／または繰り返して実施可能であることを理解するであろう。開示された実施形態は、本明細書において提供する方法の範囲の限定を意図するものではなく、方法は、各種因子に基づき変化し得ることを、当業者は認識するであろう。

工程Ｃ０２において、強力なカオトロープを用いて水性の２相溶液を作製し、組換えタンパク質を変性する。好適なカオトロープとしては、グアニジンチオシアン酸塩（ＧＤ－ＳＣＮ）、グアニジン塩酸塩（ＧＤ－ＨＣｌ）、ヨウ化グアニジン、尿素、リチウム過塩素酸塩、酢酸リチウム、塩化マグネシウム、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ヨウ化カリウム（ＫＩ）、またはこれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。実施形態に応じて、カオトロープ及びタンパク質を加熱して、タンパク質の変性を促進してよい。

いくつかの実施形態では、コスモトロープ（本明細書においては「沈殿剤」とも呼ばれる）を溶液に添加し、相分離を促進する。好適なコスモトロープとしては、上で参照した沈殿剤が挙げられる。他の実施形態では、高い開始濃度のカオトロープを使用して組換えタンパク質を変性し、その後、相分離を得るために、カオトロープの濃度をゆっくりと希釈する。

工程Ｃ０４において、相分離の粘性層が得られる。相分離の種類に応じて、各種方法を使用して、非粘性層をデカンター／抽出することなどにより、粘性層を入手することができる、または、ハミルトンシリンジもしくはピペットを使用して、粘性層を抽出することができる。他の方法が当業者に公知である。

工程Ｃ０６として、相分離の粘性層をさらに処理して、不純物を取り除く。好適な透析剤としては、低濃度における二重希釈Ｈ２Ｏ、またはＧＤ－ＳＣＮが挙げられる。実施形態に応じて、実施可能な透析の各種方法としては、カセット透析、または当該技術分野において公知の他の好適な方法が挙げられる。いくつかの実施形態では、タンジェンシャルフローフィルトレーション（ＴＦＦ）を使用して粘性層を透析する。

いくつかの実施形態では、単離された組換えクモ糸タンパク質は、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の、完全長の組換えクモ糸タンパク質である。

いくつかの実施形態では、単離された組換えクモ糸タンパク質の純度は、５～１０％、１０～１５％、１５～２０％、２０～２５％、２５～３０％、３０～３５％、３５～４０％、４５～５０％、５０～５５％、５５～６０％、６０～６５％、６５～７０％、７０～７５％、７５～８０％、８０～８５％、８５～９０％、９０～９５％、または９５～１００％である。いくつかの実施形態では、単離された組換えクモ糸タンパク質の純度は、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％である。

いくつかの実施形態では、完全長組換えクモ糸タンパク質は、測定されるかまたは定量化される。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、イムノブロット（ウェスタンブロット）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）、もしくは高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）、もしくは当該技術分野において公知の任意の他の好適な方法、またはこれらの任意の組み合わせを含むがこれらに限定されない、任意の好適な方法を使用して、完全長組換えタンパク質の量を測定または定量化することができる。一実施形態では、完全長組換えクモ糸タンパク質の量はウェスタンブロットを用いて測定される。別の実施形態では、完全長組換えクモ糸タンパク質の量は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて測定される。

以下は、本発明を実施するための具体的な実施形態の例である。これらの例は、例証することのみを目的として提供されるものであり、本発明の範囲を何ら限定するものではない。使用する数字（例えば、量、温度など）に関して正確さを保証するべく努めたが、実験上の何がしかの誤差及び偏差は当然のことながら許容されるべきものである。

本発明の実施には、別段の指示がない限り、当技術分野の技術の範囲内のタンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技法、及び薬理学の従来方法が使用される。かかる技法は文献において十分に説明されている。例えば、Ｔ．Ｅ． Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ （Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， １９９３）、Ａ．Ｌ． Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｉｎｃ．， ｃｕｒｒｅｎｔ ａｄｄｉｔｉｏｎ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， １９８９）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ （Ｓ． Ｃｏｌｏｗｉｃｋ ａｎｄ Ｎ． Ｋａｐｌａｎ ｅｄｓ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．）、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｅａｓｔｏｎ， Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ： Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， １９９０）；Ｃａｒｅｙ ａｎｄ Ｓｕｎｄｂｅｒｇ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３ｒｄ Ｅｄ． （Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ） Ｖｏｌｓ Ａ ａｎｄ Ｂ（１９９２）を参照されたい。

実施例１：ワンステップアルカリ性条件を用いる１８Ｂの精製
高ｐＨ溶液を使用して、組換えタンパク質を分泌する宿主細胞を破壊することなく、組換えタンパク質を可溶化した。ｐＨ緩衝液溶液濃度及びインキュベーション時間を試験して、Ｐ．パストリスにて発現したＣ末端３×ＦＬＡＧタグ（配列番号４０）を有する、ナガコガネグモ ＭａＳｐ２ブロック（「１８Ｂ」、配列番号３８）からの組換えクモ糸タンパク質の溶解度を測定した。ＦＬＡＧタグは、１８Ｂペプチド配列のＣ末端において、グリシン残基（Ｇ）リンカーと連結している。

具体的には、細胞培養液発酵ブロスに、１８Ｂ組換えタンパク質を発現するピキア・パストリスを播種し、インキュベートして１８Ｂタンパク質を発現させた。培養液を遠心分離にかけて細胞を収集し、細胞ペレットを、１：１（細胞ペレットと水が等量）、または１：３（細胞ペレット１部と水２部）の比率で、蒸留水に再懸濁した。細胞ペレット懸濁液のｐＨを、２～１０ＭのＮａＯＨにより、１１．８～１１．９の最終ｐＨに調節した。細胞ペレット懸濁液を１５～３０分間、撹拌しながら室温でインキュベートした。ＮａＯＨによりｐＨを調節し、インキュベーション中はｐＨ１１．８～１１．９を維持した。細胞ペレット懸濁液を遠心分離にかけ、組換えタンパク質を含有する上清を収集した。上清を凍結乾燥して１８Ｂタンパク質を濃縮し、収集した１８Ｂタンパク質の量を、後述のようにサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）（図４Ａ及び４Ｂ）により評価した。

サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して、高、低、及び中分子量不純物、単量体１８Ｂ、ならびにアグリゲート１８Ｂの相対量を分析した。１８Ｂ粉末を５Ｍのグアニジンチオシアン酸塩（ＧｄＳＣＮ）に溶解させ、Ｙａｒｒａ ＳＥＣ－３０００ ＳＥＣ－ＨＰＬＣカラムに注入し、分子量に基づき成分を分離した。屈折率を検出のモダリティとして使用した。１８Ｂアグリゲート、１８Ｂ単量体、低分子量（１～８ｋＤａ）不純物、中分子量不純物（８～５０ｋＤａ）、及び高分子量不純物（１１０～１５０ｋＤａ）を定量化した。関連する組成物を、質量％及び面積％として報告した。全てのタンパク質の９０％超が互いに約７％以内のｄｎ／ｄｃ値（屈折率の応答係数）を示すという仮定の下で、一般的なタンパク質標準としてＢＳＡを使用した。保持時間の標準としてポリ（エチレンオキシド）を使用し、方法の一貫した性能を保証するチェック標準としてＢＳＡ較正物質を使用した。対照として、尿素を使用して１８Ｂタンパク質を可溶化したサンプルもまた評価した。

ｐＨ１１．９にてＰ．パストリス細胞ペレットからの１８Ｂのアルカリ抽出により、７０～７５％の抽出収率の、５ＭのＧｄＳＣＮを使用して単離した１８Ｂタンパク質の量に正規化した、完全長１８Ｂタンパク質が得られた。抽出した１８Ｂタンパク質のＳＥＣ面積割合(%)を使用して、サンプルの純度を計算した。アルカリ性抽出物における１８Ｂ単量体の純度は、約３５％の単量体面積、３５％の中分子量不純物面積、及び２８％の低分子量不純物面積割合(%)であった（図４Ａ及び４Ｂ）。比較すると、１０Ｍの尿素による１８Ｂタンパク質の可溶化により、約２６％の単量体面積、２７％の中分子量不純物面積、及び４５％の低分子量不純物面積を伴う、低収率の１８Ｂタンパク質が得られた。アルカリ性可溶化及び抽出方法により、単離された１８Ｂタンパク質のより高い１８Ｂ収率及び高い純度が得られたことを、これらのデータは示す。

実施例２：単離された絹ポリペプチドのさらなる精製
１８Ｂクモタンパク質をさらに精製するために、上記アルカリ抽出から単離した１８Ｂサンプルを、７５０ｋ ＭＷのフィルタ、及び８ダイア容量の水を用いる限外濾過及びタンジェンシャルフローフィルトレーションに供した。未濾過のタンパク質、未限外濾過のタンパク質、ならびに、１、３、６、及び８ダイア容量の水の後のタンパク質を含むサンプルを、前述のとおりにＳＥＣにより評価した。各サンプル中の、１８Ｂ単量体、中分子量不純物、低分子量不純物、及び高分子量不純物に対するＳＥＣ面積割合(%)を、図５に示す。未濾過タンパク質のサンプルを、一番左のバー（「未調節供給」）に示し、未限外濾過タンパク質のサンプルを、左から２番目のバー（「未調節ＵＦＲ」）に示し、１、３、６、または８ダイア容量のサンプルをそれぞれ、中側左、中側右、右から２番目、及び一番右のバーに示す（図５）。洗浄のダイア容量が増加することにより、１８Ｂ単量体の面積割合(%)の増加、及び低分子量不純物の面積割合(%)の減少がもたらされた。

実施例３：２段階アルカリ抽出を用いる１８Ｂの精製
細胞からの１８Ｂタンパク質の回収率を増加させるために、２段階抽出プロセスもまた実施した。１８Ｂを発現するＰ．パストリス細胞の全細胞ブロスのｐＨを、第１のアルカリ抽出工程として、２ＭのＮａＯＨによりｐＨ１１．８に調節し、３０～６０分間インキュベートした。１８Ｂを発現するＰ．パストリス細胞の全細胞ブロスの対照サンプルを、５ＭのＧｄＳＣＮで約１５分間インキュベートし、１８Ｂタンパク質を可溶化して抽出した。細胞をペレット処理し、上清を収集した。当該第１のアルカリ抽出工程からの残りのペレットを、第２の抽出工程として、１：１、１：２、または１：３のペレット：水比率にて、ｐＨ１１．８にて水を添加することにより再抽出した。組換え１８Ｂタンパク質を含有する、第１及び第２のアルカリ性抽出物からの上清を収集した。上清を凍結乾燥して１８Ｂタンパク質を濃縮し、実施例１にて前述するとおりに、サンプルをＳＥＣにより評価した。２つの個別の実験実行を、各抽出条件及びＧｄＳＣＮ対象に対して示す（図６Ａ）。アルカリ水の量を増加させること（１：２及び１：３の比率）により、回収した１８Ｂタンパク質の量が増加した。しかし、二重抽出１８Ｂ単量体タンパク質の純度は、１回抽出において最大であった。第２の抽出で用いたペレットと比較してよりアルカリ性の水が増加すると、１８Ｂ単量体の純度もまた増加した（図６Ｂ）。

次に、上述した７５０ｋ ＭＷフィルタ、及び最大８ダイア容量の水を用いる、限外濾過及びタンジェンシャルフローフィルトレーションにより、抽出からのサンプルを精製した。得られた絹ポリペプチド組成物の純度を、ＳＥＣにより評価した（図７Ａ及び７Ｂ）。図７Ａは、１８Ｂ単量体、中ＭＷ不純物、及び低分子量不純物の面積割合(%)を示す。タンジェンシャルフローフィルトレーション中にダイア容量が増加することにより、１８Ｂ単量体ピーク面積の増加がもたらされた。図７Ｂは、各サンプルに対するＳＥＣピーク、出発物質（「ＳＭ」）、未限外濾過濃縮液（「ＵＦ Ｒ」）、ならびに、タンジェンシャルフローフィルトレーションダイア容量サンプル１、２、３、４、６、及び８（ＤＦ １、２、３、４、６、８）を示す。

実施例４：ｐＨを変えることによる、アルカリ性抽出物からの絹ポリペプチドのさらなる単離
抽出物のｐＨを調節することにより、アルカリ性抽出物から、アルカリ性抽出物からの１８Ｂ組換えタンパク質を沈殿させた。本実験において、細胞培養液ブロスからのアルカリ抽出は、ＮａＯＨを添加することにより１１．８～１１．９の最終ｐＨにすることで、全細胞培養液ブロスのｐＨを調節することでまず実施し、これにより、アルカリ性細胞懸濁液を作製した。細胞懸濁液を１５～３０分間、撹拌しながら室温でインキュベートした。インキュベーション後、細胞懸濁液を遠心分離にかけ、可溶化された１８Ｂタンパク質を含有するアルカリ性上清を収集して、１８Ｂアルカリ性抽出物を生成した。

次に、１８Ｂアルカリ性抽出物のサンプルを、異なるｐＨ条件で処理して１８Ｂタンパク質を沈殿させた。Ｈ_２ＳＯ_４をアルカリ性抽出物のサンプルに添加し、４、５、６、７、８、９、または１０の最終ｐＨにした。次に、１８Ｂ組換えタンパク質を含有する沈殿物をアルカリ性抽出物から単離した。沈殿物サンプルを、前述のとおりにＳＥＣによって評価した。図８は、各ｐＨ条件に対する、高分子量（ＨＭＷ）ピーク、１８Ｂ単量体及びアグリゲートピーク、中ＭＷ（ＩＭＷ）、ならびに低ＭＷ（ＬＭＷ）ピークの、ＳＥＣ面積純度の割合(%)を示す。図９は、試験した各沈殿剤のｐＨに対する、１８Ｂタンパク質の収率割合(%)を示す。全条件の中でも、一段階沈殿法、その後の、１８Ｂタンパク質の初期アルカリ抽出に対しては、沈殿工程に対してｐＨ７が最も効果的であることが分かり、約７０％の純度を示す、約７０％の面積割合(%)を有している。図１０は、ｐＨ６における１８Ｂ沈殿物に対する、ＳＥＣプロファイルを示す。

ダイア遠心分離に加えて、ＴＦＦ（タンジェンシャルフローフィルトレーション）もまた実施して、アルカリ性抽出物を単離した。しかし、ダイア遠心分離は、不純物の除去においてＴＦＦよりも効果的であり、一般的に、７０％を超える１８Ｂタンパク質純度を有する、６０～７０％のタンパク質回収がもたらされた。

ｐＨ６において得られた１８Ｂタンパク質沈殿物を凍結乾燥し、潤紡して繊維にし、引張強さ測定に供した。凍結乾燥した１８Ｂタンパク質をギ酸に溶解すると、最終のタンパク質の量は３６重量％であった。溶解したタンパク質を、４０μＬ／分にて１００％エタノール凝固浴槽に押し出し、繊維を作製した。本方法により作製した１８Ｂ繊維は、１９．４ｃＮ／ｔｅｘｔの引張強さを有した。

実施例５：アルカリ性条件ｖｓ塩沈殿を用いるＰ０の回収
ｐＨ緩衝液溶液の濃度、及びインキュベーション時間を試験して、細胞培養液からの抽出のための、大腸菌細胞可溶化物中におけるＰ０（配列番号３９）組換え絹タンパク質の可溶化における、それらの使用を決定した。

細胞培養液発酵ブロスに、Ｃ末端６×Ｈｉｓタグを有するＰ０組換えタンパク質を発現する大腸菌を播種し、インキュベートしてＰ０タンパク質を発現させた。培養液を１５，０００ｒｃｆで遠心分離にかけ、細胞をペレット処理した。上清を取り除き、細胞ペレットを１：４（細胞ペレット：緩衝液）または１：９（細胞ペレット：緩衝液）の比率でＨ_２Ｏに再懸濁し、１５～６０分間インキュベートした。再懸濁した細胞ペレットのｐＨを、ＮａＯＨで調節して、９、１０、１０．５、または１１の最終ｐＨにした。対照として、再懸濁した細胞ペレットサンプルを、５Ｍのグアニジンチオシアン酸塩（ＧｄＳＣＮ）でもインキュベートし、１．５分間超音波処理した。サンプルを、回転式ミキサーを使用してボルテックスして均質化した。溶解物を、１５，０００ｒｃｆで遠心分離により５分間清澄化し、Ｐ０タンパク質を含有する清澄化した上清を保持した。０．２５μｍを用いて上清をフィルタにかけ、ＢＣＡ、ＥＬＩＳＡ、及びイムノブロットにより分析した。

サンプルを、１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度に対して正規化し、各サンプルに可溶化したＰ０の量を、抗Ｈｉｓ抗体を用いるウェスタンブロットにより評価した（図１１）。レーンＨ１は、５ＭのＧｄＳＣＮにおける超音波処理により溶解した対照サンプルである。レーンＢ１～Ｂ４は、１：４の、細胞ペレット：ｐＨ９、ｐＨ１０、ｐＨ１０．５、及びｐＨ１１における緩衝液の比率で混合したサンプルであり、レーンＢ７～Ｂ１０は、１：９の、細胞ペレット：ｐＨ９、ｐＨ１０、ｐＨ１０．５、及びｐＨ１１における緩衝液の比率で混合したサンプルである。レーンＣ２～Ｃ４は、１５、３０、または６０分間、ＧｄＳＣＮと共にインキュベートしたサンプルである。

例示的な方法において、細胞培養液発酵ブロスに、Ｐ０組換えタンパク質を発現する大腸菌を播種し、インキュベートしてＰ０タンパク質を発現した。培養液を１５，０００ｒｃｆで遠心分離にかけ、細胞をペレット処理する。細胞ペレットを、１：１または１：３の細胞ペレット：液体比率でＨ_２Ｏに再懸濁し、細胞懸濁液を、１０，０００～４０，０００ｐｓｉで均質化して大腸菌細胞を溶解する。溶解物を遠心分離により清澄化し、不溶性Ｐ０を含む細胞ペレットを保持する。細胞ペレットをＨ２Ｏに再懸濁し、細胞ペレット懸濁液のｐＨを、２～１０ＭのＮａＯＨにより、最終ｐＨ１１．５に調節する。細胞ペレット懸濁液を１５～６０分間、撹拌しながら室温でインキュベートする。ＮａＯＨによりｐＨを調節し、インキュベーション中はｐＨ１１．５を維持する。インキュベーション後、細胞懸濁液を遠心分離にかけ、組換えＰ０タンパク質を含有する上清を収集した。

さらなる方法として、不溶性Ｐ０を、１０Ｍの尿素を含むアルカリ性緩衝液を用いて、細胞ペレットから抽出することもできる。Ｈ_２Ｏによる細胞ペレットの再懸濁後、細胞ペレット懸濁液のｐＨを、２～１０ＭのＮａＯＨで、最終ｐＨ１１．５に調節し、尿素を添加して、１０Ｍの終濃度の尿素にした。細胞ペレット懸濁液を１５～６０分間、撹拌しながら室温でインキュベートする。

全ての方法において、単離された組換えＰ０タンパク質を、濾過、遠心分離、沈殿、またはクロマトグラフィーなどの追加の清澄化工程により、さらに生成することができる。

等価物
本発明は、好ましい実施形態、及び様々な代替の実施形態を参照して具体的に示され記載されているものの、形態及び詳細の様々な変化が、本発明の精神及び範囲から逸脱することなしにその中で可能であることが当業者により理解されるであろう。

即時的な明細書の本文において引用されている全ての参考文献、発行された特許、及び特許出願は、あらゆる目的のために、それら全体が参照により本明細書により援用されている。

非公式の配列表

いくつかの実施形態では、クモ糸タンパク質は１８ＢまたはＰ０である。いくつかの実施形態では、細胞培養液は、真菌細胞、細菌細胞、または酵母細胞を含む。一実施形態では、細菌細胞は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞である。一実施形態では、酵母細胞は、ピキア・パストリス細胞である。
[本発明1001]
宿主細胞培養液から組換えクモ糸タンパク質を単離する方法であって、以下の工程を含む、方法：
ａ．細胞培養液を入手する工程であって、前記細胞培養液が、宿主細胞及び増殖培地を含み、前記宿主細胞が、組換えクモ糸タンパク質を発現する、工程と、
ｂ．前記組換えクモ糸タンパク質を含む前記細胞培養液の一部を収集する工程と、
ｃ．アルカリ性条件下で、水溶液中で前記細胞培養液の前記一部をインキュベートする工程であって、それにより、前記水溶液中で前記組換えクモ糸タンパク質を可溶化させる、工程と、
ｄ．前記水溶液から前記組換えクモ糸タンパク質を単離する工程であって、それにより、単離された組換えクモ糸タンパク質サンプルを産生する、工程。
[本発明1002]
前記アルカリ性条件が、９～１４のアルカリ性ｐＨを含む、本発明１００１の方法。
[本発明1003]
前記アルカリ性ｐＨが、１１～１２である、本発明１００２の方法。
[本発明1004]
前記単離された組換えクモ糸タンパク質が、完全長組換えクモ糸タンパク質である、先行本発明のいずれかの方法。
[本発明1005]
前記単離された組換えクモ糸タンパク質サンプルが、単離された全組換えクモ糸タンパク質と比較して、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の、完全長組換えクモ糸タンパク質を含む、本発明１００４の方法。
[本発明1006]
完全長組換えクモ糸タンパク質の割合が、ウェスタンブロットを用いて測定される、本発明１００５の方法。
[本発明1007]
完全長組換えクモ糸タンパク質の割合が、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて測定される、本発明１００５の方法。
[本発明1008]
前記単離された組換えクモ糸タンパク質の純度が、５～１０％、１０～１５％、１５～２０％、２０～２５％、２５～３０％、３０～３５％、３５～４０％、４５～５０％、５０～５５％、５５～６０％、６０～６５％、６５～７０％、７０～７５％、７５～８０％、８０～８５％、８５～９０％、０９～９５％、または９５～１００％である、先行本発明のいずれかの方法。
[本発明1009]
前記単離された組換えクモ糸タンパク質の収率が、尿素またはグアニジンチオシアン酸塩法により単離した組換えクモ糸と比較して、少なくとも５０～５５％、５５～６０％、６０～６５％、６５～７０％、７０～７５％、７５～８０％、８０～８５％、８５～９０％、０９～９５％、または９５～１００％である、先行本発明のいずれかの方法。
[本発明1010]
前記組換えクモ糸タンパク質を単離する工程が、前記水溶液の前記アルカリ性条件を変更することにより、前記組換えクモ糸タンパク質を沈殿させることを含む、先行本発明のいずれかの方法。
[本発明1011]
前記アルカリ性条件を変更することが、前記細胞培養液の前記一部の前記アルカリ性ｐＨを、４～１０の、低くされたｐＨへと調節することを含む、本発明１０１０の方法。
[本発明1012]
前記低くされたｐＨが、ｐＨ４、５、６、７、８、９、または１０である、本発明１０１１の方法。
[本発明1013]
前記低くされたｐＨが、ｐＨ６～７である、本発明１０１１の方法。
[本発明1014]
前記アルカリ性ｐＨを調節することが、酸を前記水溶液に添加することを含む、本発明１０１０～１０１３のいずれかの方法。
[本発明1015]
前記酸が、Ｈ _２ ＳＯ４である、本発明１０１４の方法。
[本発明1016]
前記細胞培養液の前記一部が、上清、全細胞ブロス、または細胞ペレットを含む、先行本発明のいずれかの方法。
[本発明1017]
前記細胞培養液の前記一部を収集する工程が、前記増殖培地から前記宿主細胞を取り出すことと、前記水溶液中で前記宿主細胞を再構成することと、を含む、先行本発明のいずれかの方法。
[本発明1018]
前記細胞培養液の前記一部を収集する工程が、前記宿主細胞を溶解することを含む、先行本発明のいずれかの方法。
[本発明1019]
溶解することが、熱処理、剪断破壊、物理的均質化、超音波処理、または化学的均質化を含む、本発明１０１８の方法。
[本発明1020]
前記細胞培養液の前記一部が、前記宿主細胞、及び前記細胞培養液由来の前記増殖培地を含む、先行本発明のいずれかの方法。
[本発明1021]
前記水溶液が、希釈された増殖培地を含む、先行本発明のいずれかの方法。
[本発明1022]
アルカリ性条件下で前記細胞培養液の前記一部をインキュベートする工程が、１０～１２０分実施される、先行本発明のいずれかの方法。
[本発明1023]
アルカリ性条件下で前記細胞培養液の前記一部をインキュベートする工程が、少なくとも１０分、少なくとも１５分、少なくとも３０分、少なくとも４５分、少なくとも６０分、少なくとも７５分、少なくとも９０分、少なくとも１０５分、または少なくとも１２０分間実施される、本発明１０２２の方法。
[本発明1024]
アルカリ性条件下で前記細胞培養液の前記一部をインキュベートする工程が、１５～３０分実施される、本発明１０２２の方法。
[本発明1025]
アルカリ性条件下で前記細胞培養液の前記一部をインキュベートする工程が、前記細胞培養液の前記一部を撹拌することをさらに含む、先行本発明のいずれかの方法。
[本発明1026]
アルカリ性条件下で、前記水溶液から非可溶化バイオマスを取り出すことをさらに含む、先行本発明のいずれかの方法。
[本発明1027]
前記非可溶化バイオマスを取り出すことが、濾過、遠心分離、重力沈降、吸着、透析、または相分離を含む、本発明１０２６の方法。
[本発明1028]
前記濾過が、限外濾過、精密濾過、またはダイアフィルトレーションである、本発明１０２７の方法。
[本発明1029]
前記非可溶化バイオマスを取り出すことが、少なくとも１回繰り返される、本発明１０２６～１０２８のいずれかの方法。
[本発明1030]
前記組換えクモ糸タンパク質を単離する前、または、前記組換えクモ糸タンパク質を単離した後に、不純物を取り除くことをさらに含む、先行本発明のいずれかの方法。
[本発明1031]
前記不純物を取り除くことが、濾過、遠心分離、重力沈降、吸着、透析、または相分離を含む、本発明１０３０の方法。
[本発明1032]
前記濾過が、限外濾過、精密濾過、またはダイアフィルトレーションである、本発明１０３１の方法。
[本発明1033]
前記遠心分離が、超遠心分離またはダイア遠心分離である、本発明１０３１の方法。
[本発明1034]
前記吸着が、炭吸着である、本発明１０３１の方法。
[本発明1035]
不純物を取り除くことが、少なくとも１回繰り返される、本発明１０３１～１０３４のいずれかの方法。
[本発明1036]
前記単離された組換えクモ糸タンパク質を濃縮して、濃縮されたクモ糸タンパク質を産生することをさらに含む、先行本発明のいずれかの方法。
[本発明1037]
濃縮することが、沈殿、濾過、限外濾過、遠心分離、透析、蒸発、または凍結乾燥を含む、本発明１０３６の方法。
[本発明1038]
前記単離された組換えクモ糸タンパク質を乾燥させることをさらに含む、先行本発明のいずれかの方法。
[本発明1039]
前記単離された組換えクモ糸から、絹繊維を生成することをさらに含む、先行本発明のいずれかの方法。
[本発明1040]
前記絹繊維が、少なくとも１９ｃＮ／ｔｅｘの引張強さを含む、本発明１０３９の方法。
[本発明1041]
前記組換えクモ糸タンパク質が、１８ＢまたはＰ０である、先行本発明のいずれかの方法。
[本発明1042]
前記細胞培養液が、真菌細胞、細菌細胞、または酵母細胞を含む、先行本発明のいずれかの方法。
[本発明1043]
前記酵母細胞が、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞である、先行本発明のいずれかの方法。
[本発明1044]
組換えクモ糸タンパク質の単離方法であって、以下の工程を含む、方法：
ａ．細胞培養液を入手する工程であって、前記細胞培養液が、宿主細胞及び増殖培地を含み、前記宿主細胞が、組換えクモ糸タンパク質を発現する、工程と、
ｂ．前記組換えクモ糸タンパク質を含む前記細胞培養液の一部を収集する工程と、
ｃ．アルカリ性条件下で、水溶液中で前記細胞培養液の前記一部をインキュベートする工程であって、それにより、前記水溶液中で前記組換えクモ糸タンパク質を可溶化させる、工程と、
ｄ．前記水溶液を非アルカリ性ｐＨへと調節する工程であって、それにより、前記可溶化された組換えクモ糸タンパク質を沈殿させる、工程と、
ｅ．細胞培養液の前記一部から前記組換えクモ糸タンパク質を単離する工程であって、それにより、単離された組換えクモ糸タンパク質を産生する、工程。
[本発明1045]
先行本発明のいずれか１項の方法により産生される組換えクモ糸タンパク質を含む、組成物。
[本発明1046]
前記組換えクモ糸が、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％の、完全長の組換えクモ糸を含む、本発明１０４５の組成物。
[本発明1047]
本発明１００１～１０４４のいずれかの方法により産生される組換えクモ糸タンパク質を含む、絹繊維。
[本発明1048]
前記絹繊維が、少なくとも１９ｃＮ／ｔｅｘの引張強さを含む、本発明１０４７の絹繊維。
[本発明1049]
アルカリ性緩衝溶液において、増殖培地を含む細胞培養液と、組換えクモ糸タンパク質を含む宿主細胞と、を含む、組成物。
[本発明1050]
前記アルカリ性緩衝溶液が、ｐＨ９～１４を有する、本発明１０４５～１０４９のいずれかの組成物。
[本発明1051]
前記ｐＨが、１１～１２である、本発明１０５０の組成物。
[本発明1052]
前記クモ糸タンパク質が、１８ＢまたはＰ０である、本発明１０４９～１０５１のいずれかの組成物。
[本発明1053]
前記細胞培養液が、真菌細胞、細菌細胞、または酵母細胞を含む、本発明１０４９～１０５２のいずれかの組成物。
[本発明1054]
前記細菌細胞が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞である、本発明１０５３の組成物。
[本発明1055]
前記酵母細胞が、ピキア・パストリス細胞である、本発明１０５３の組成物。

本明細書で使用する場合、用語「ブロック」または「繰返し単位」とは、場合により、中程度のバリエーションと共に、上記天然絹ポリペプチド中で見いだされ、上記絹ポリペプチド配列中で基本繰返し単位として機能する、天然絹ポリペプチドの約１２アミノ酸よりも大きい部分配列を意味する。ブロックは、非常に短い「モチーフ」を含んでよいが、必ずしも含まなくてよい。本明細書で使用する場合、「モチーフ」とは、複数のブロックで現れる、およそ２～１０個のアミノ酸配列を意味する。例えば、モチーフは、アミノ酸配列ＧＧＡ、ＧＰＧ、またはＡＡＡＡＡ（配列番号４１）から構成されていてよい。複数のブロックの配列は「ブロック共重合体」である。

絹ポリペプチドは特徴的に、反復ドメイン（ＲＥＰ）に非反復領域（例えば、Ｃ末端ドメイン及びＮ末端ドメイン）が隣接して構成される。上記反復ドメインは階層構造を示す。上記反復ドメインは一連のブロック（反復単位とも呼ばれる）を含む。上記ブロックは、絹の反復ドメイン全体にわたり、ときに完全に、ときに不完全に（準反復ドメインを構成）繰り返される。ブロックの長さ及び組成は、異なる絹の種類間、また異なる種間で変化する。表１は、選択した種及び絹種のブロック配列例の一覧であり、さらなる例が、Ｒｉｓｉｎｇ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｐｉｄｅｒ ｓｉｌｋ ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ａｎｄ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．，６８：２，ｐｇ １６９－１８４（２０１１）、及びＧａｔｅｓｙ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｔｒｅｍｅ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ，ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｃｅ ｏｆ ｓｐｉｄｅｒ ｓｉｌｋ ｆｉｂｒｏｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９１：５５１３，ｐｇ．２６０３－２６０５（２００１）に記載されている。場合によっては、ブロックを通常パターンで並べ、絹配列の反復ドメインに複数回（通常２～８回）出現する、より大きなマクロリピートを形成してよい。反復ドメインまたはマクロリピートの内側で繰り返されるブロックと、反復ドメイン内で繰り返されるマクロリピートとを間隔エレメントで分離してよい。ブロック配列はグリシンに富む領域と、それに続くポリＡ領域とを含んでよい。短い（約１～１０）アミノ酸モチーフはブロック内に複数回出現してよい。一般的に観察されるモチーフのサブセットを図１に示す。本発明の目的上、円順列とは関係なく、異なる天然絹ポリペプチドに由来するブロックを選択することができる（すなわち、同定されたブロックが他の点において絹ポリペプチド間で類似する場合に円順列のため整列しないことがある）。したがって、例えば、ＳＧＡＧＧ（配列番号４２）という「ブロック」は本発明の目的上、ＧＳＧＡＧ（配列番号４３）と同一であり、またＧＧＳＧＡ（配列番号４４）と同一であり、それらはいずれも互いに円順列にすぎない。所与の絹配列について選択された特定順列は、他の何よりも利便性によって決定されてもよい（通常、Ｇで開始）。ＮＣＢＩデータベースから得た絹配列は、ブロック及び非反復領域に分割することができる。

いくつかの実施形態では、絹ポリペプチドヌクレオチドコード配列は、アルファ接合因子ヌクレオチドコード配列に作動可能に連結され得る。いくつかの実施形態では、絹ポリペプチドヌクレオチドコード配列は、別の内在性または異種の分泌シグナルコード配列に作動可能に連結され得る。いくつかの実施形態では、絹ポリペプチドヌクレオチドコード配列は、３Ｘ ＦＬＡＧヌクレオチドコード配列に作動可能に連結され得る。いくつかの実施形態では、絹ポリペプチドヌクレオチドコード配列は、６～８のＨｉｓ残基（配列番号４５）などの他のアフィニティータグに作動可能に連結される。

細胞培養液発酵ブロスに、Ｃ末端６×Ｈｉｓタグ（配列番号４６）を有するＰ０組換えタンパク質を発現する大腸菌を播種し、インキュベートしてＰ０タンパク質を発現させた。培養液を１５，０００ｒｃｆで遠心分離にかけ、細胞をペレット処理した。上清を取り除き、細胞ペレットを１：４（細胞ペレット：緩衝液）または１：９（細胞ペレット：緩衝液）の比率でＨ_２Ｏに再懸濁し、１５～６０分間インキュベートした。再懸濁した細胞ペレットのｐＨを、ＮａＯＨで調節して、９、１０、１０．５、または１１の最終ｐＨにした。対照として、再懸濁した細胞ペレットサンプルを、５Ｍのグアニジンチオシアン酸塩（ＧｄＳＣＮ）でもインキュベートし、１．５分間超音波処理した。サンプルを、回転式ミキサーを使用してボルテックスして均質化した。溶解物を、１５，０００ｒｃｆで遠心分離により５分間清澄化し、Ｐ０タンパク質を含有する清澄化した上清を保持した。０．２５μｍを用いて上清をフィルタにかけ、ＢＣＡ、ＥＬＩＳＡ、及びイムノブロットにより分析した。

Claims (55)

1. 宿主細胞培養液から組換えクモ糸タンパク質を単離する方法であって、以下の工程を含む、方法：
   ａ．細胞培養液を入手する工程であって、前記細胞培養液が、宿主細胞及び増殖培地を含み、前記宿主細胞が、組換えクモ糸タンパク質を発現する、工程と、
   ｂ．前記組換えクモ糸タンパク質を含む前記細胞培養液の一部を収集する工程と、
   ｃ．アルカリ性条件下で、水溶液中で前記細胞培養液の前記一部をインキュベートする工程であって、それにより、前記水溶液中で前記組換えクモ糸タンパク質を可溶化させる、工程と、
   ｄ．前記水溶液から前記組換えクモ糸タンパク質を単離する工程であって、それにより、単離された組換えクモ糸タンパク質サンプルを産生する、工程。
2. 前記アルカリ性条件が、９～１４のアルカリ性ｐＨを含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記アルカリ性ｐＨが、１１～１２である、請求項２に記載の方法。
4. 前記単離された組換えクモ糸タンパク質が、完全長組換えクモ糸タンパク質である、先行請求項のいずれかに記載の方法。
5. 前記単離された組換えクモ糸タンパク質サンプルが、単離された全組換えクモ糸タンパク質と比較して、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の、完全長組換えクモ糸タンパク質を含む、請求項４に記載の方法。
6. 完全長組換えクモ糸タンパク質の割合が、ウェスタンブロットを用いて測定される、請求項５に記載の方法。
7. 完全長組換えクモ糸タンパク質の割合が、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて測定される、請求項５に記載の方法。
8. 前記単離された組換えクモ糸タンパク質の純度が、５～１０％、１０～１５％、１５～２０％、２０～２５％、２５～３０％、３０～３５％、３５～４０％、４５～５０％、５０～５５％、５５～６０％、６０～６５％、６５～７０％、７０～７５％、７５～８０％、８０～８５％、８５～９０％、０９～９５％、または９５～１００％である、先行請求項のいずれかに記載の方法。
9. 前記単離された組換えクモ糸タンパク質の収率が、尿素またはグアニジンチオシアン酸塩法により単離した組換えクモ糸と比較して、少なくとも５０～５５％、５５～６０％、６０～６５％、６５～７０％、７０～７５％、７５～８０％、８０～８５％、８５～９０％、０９～９５％、または９５～１００％である、先行請求項のいずれかに記載の方法。
10. 前記組換えクモ糸タンパク質を単離する工程が、前記水溶液の前記アルカリ性条件を変更することにより、前記組換えクモ糸タンパク質を沈殿させることを含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。
11. 前記アルカリ性条件を変更することが、前記細胞培養液の前記一部の前記アルカリ性ｐＨを、４～１０の、低くされたｐＨへと調節することを含む、請求項１０に記載の方法。
12. 前記低くされたｐＨが、ｐＨ４、５、６、７、８、９、または１０である、請求項１１に記載の方法。
13. 前記低くされたｐＨが、ｐＨ６～７である、請求項１１に記載の方法。
14. 前記アルカリ性ｐＨを調節することが、酸を前記水溶液に添加することを含む、請求項１０～１３のいずれか１項に記載の方法。
15. 前記酸が、Ｈ_２ＳＯ４である、請求項１４に記載の方法。
16. 前記細胞培養液の前記一部が、上清、全細胞ブロス、または細胞ペレットを含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。
17. 前記細胞培養液の前記一部を収集する工程が、前記増殖培地から前記宿主細胞を取り出すことと、前記水溶液中で前記宿主細胞を再構成することと、を含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。
18. 前記細胞培養液の前記一部を収集する工程が、前記宿主細胞を溶解することを含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。
19. 溶解することが、熱処理、剪断破壊、物理的均質化、超音波処理、または化学的均質化を含む、請求項１８に記載の方法。
20. 前記細胞培養液の前記一部が、前記宿主細胞、及び前記細胞培養液由来の前記増殖培地を含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。
21. 前記水溶液が、希釈された増殖培地を含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。
22. アルカリ性条件下で前記細胞培養液の前記一部をインキュベートする工程が、１０～１２０分実施される、先行請求項のいずれかに記載の方法。
23. アルカリ性条件下で前記細胞培養液の前記一部をインキュベートする工程が、少なくとも１０分、少なくとも１５分、少なくとも３０分、少なくとも４５分、少なくとも６０分、少なくとも７５分、少なくとも９０分、少なくとも１０５分、または少なくとも１２０分間実施される、請求項２２に記載の方法。
24. アルカリ性条件下で前記細胞培養液の前記一部をインキュベートする工程が、１５～３０分実施される、請求項２２に記載の方法。
25. アルカリ性条件下で前記細胞培養液の前記一部をインキュベートする工程が、前記細胞培養液の前記一部を撹拌することをさらに含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。
26. アルカリ性条件下で、前記水溶液から非可溶化バイオマスを取り出すことをさらに含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。
27. 前記非可溶化バイオマスを取り出すことが、濾過、遠心分離、重力沈降、吸着、透析、または相分離を含む、請求項２６に記載の方法。
28. 前記濾過が、限外濾過、精密濾過、またはダイアフィルトレーションである、請求項２７に記載の方法。
29. 前記非可溶化バイオマスを取り出すことが、少なくとも１回繰り返される、請求項２６～２８のいずれか１項に記載の方法。
30. 前記組換えクモ糸タンパク質を単離する前、または、前記組換えクモ糸タンパク質を単離した後に、不純物を取り除くことをさらに含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。
31. 前記不純物を取り除くことが、濾過、遠心分離、重力沈降、吸着、透析、または相分離を含む、請求項３０に記載の方法。
32. 前記濾過が、限外濾過、精密濾過、またはダイアフィルトレーションである、請求項３１に記載の方法。
33. 前記遠心分離が、超遠心分離またはダイア遠心分離である、請求項３１に記載の方法。
34. 前記吸着が、炭吸着である、請求項３１に記載の方法。
35. 不純物を取り除くことが、少なくとも１回繰り返される、請求項３１～３４のいずれか１項に記載の方法。
36. 前記単離された組換えクモ糸タンパク質を濃縮して、濃縮されたクモ糸タンパク質を産生することをさらに含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。
37. 濃縮することが、沈殿、濾過、限外濾過、遠心分離、透析、蒸発、または凍結乾燥を含む、請求項３６に記載の方法。
38. 前記単離された組換えクモ糸タンパク質を乾燥させることをさらに含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。
39. 前記単離された組換えクモ糸から、絹繊維を生成することをさらに含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。
40. 前記絹繊維が、少なくとも１９ｃＮ／ｔｅｘの引張強さを含む、請求項３９に記載の方法。
41. 前記組換えクモ糸タンパク質が、１８ＢまたはＰ０である、先行請求項のいずれかに記載の方法。
42. 前記細胞培養液が、真菌細胞、細菌細胞、または酵母細胞を含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。
43. 前記酵母細胞が、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞である、先行請求項のいずれかに記載の方法。
44. 組換えクモ糸タンパク質の単離方法であって、以下の工程を含む、方法：
    ａ．細胞培養液を入手する工程であって、前記細胞培養液が、宿主細胞及び増殖培地を含み、前記宿主細胞が、組換えクモ糸タンパク質を発現する、工程と、
    ｂ．前記組換えクモ糸タンパク質を含む前記細胞培養液の一部を収集する工程と、
    ｃ．アルカリ性条件下で、水溶液中で前記細胞培養液の前記一部をインキュベートする工程であって、それにより、前記水溶液中で前記組換えクモ糸タンパク質を可溶化させる、工程と、
    ｄ．前記水溶液を非アルカリ性ｐＨへと調節する工程であって、それにより、前記可溶化された組換えクモ糸タンパク質を沈殿させる、工程と、
    ｅ．細胞培養液の前記一部から前記組換えクモ糸タンパク質を単離する工程であって、それにより、単離された組換えクモ糸タンパク質を産生する、工程。
45. 先行請求項のいずれか１項に記載の方法により産生される組換えクモ糸タンパク質を含む、組成物。
46. 前記組換えクモ糸が、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％の、完全長の組換えクモ糸を含む、請求項４５に記載の組成物。
47. 請求項１～４４のいずれか１項に記載の方法により産生される組換えクモ糸タンパク質を含む、絹繊維。
48. 前記絹繊維が、少なくとも１９ｃＮ／ｔｅｘの引張強さを含む、請求項４７に記載の絹繊維。
49. アルカリ性緩衝溶液において、増殖培地を含む細胞培養液と、組換えクモ糸タンパク質を含む宿主細胞と、を含む、組成物。
50. 前記アルカリ性緩衝溶液が、ｐＨ９～１４を有する、請求項４５～４９のいずれか１項に記載の組成物。
51. 前記ｐＨが、１１～１２である、請求項５０に記載の組成物。
52. 前記クモ糸タンパク質が、１８ＢまたはＰ０である、請求項４９～５１のいずれか１項に記載の組成物。
53. 前記細胞培養液が、真菌細胞、細菌細胞、または酵母細胞を含む、請求項４９～５２のいずれか１項に記載の組成物。
54. 前記細菌細胞が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞である、請求項５３に記載の組成物。
55. 前記酵母細胞が、ピキア・パストリス細胞である、請求項５３に記載の組成物。

Images