CN1259333C - 制备性基因重组蜘蛛拖丝蛋白的分离纯化方法 - Google Patents
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本发明涉及制备性基因重组蜘蛛拖丝蛋白(简称蛛丝蛋白)工程菌表达目的蛋白质的分离纯化，得到高纯度可利用的蛛丝蛋白的方法。其特征是工程菌细胞首先用1/15M磷酸盐缓冲液(pH7.0)洗涤菌体，离心后，以1∶5比例加入50mMTris-HCl(pH8.0)/1mMPMSF/1mMEDTA，反复冻融3次；4℃，50Hz超声震荡26～40sec，间隔30sec，反复10～15次破碎细胞；目的蛋白用10%醋酸调至pH5.0～6.5，4℃静置过夜，离心除去杂蛋白；上清液加热到45～64℃，离心，上清液用1M NaOH调至pH 8.5～9.2，20%硫酸铵沉淀目的蛋白，4℃保存，备用。本发明分离纯化步骤简单，SDS-PAGE鉴定基因重组蛛丝蛋白质纯度＞85%。该方法不需要昂贵的蛋白质分离纯化介质，成本低，对于规模化制备特别适合。
Description
本发明涉及制备性基因重组蜘蛛拖丝蛋白(简称蛛丝蛋白)工程菌表达目的蛋白质的分离纯化，得到高纯度可利用的蛛丝蛋白的方法。
蜘蛛丝纤维是自然界力学性能最优良的天然纤维蛋白，所具有的强固性和柔韧性是其他人造纤维材料无法同时比拟的。因其独特的机械特性和生物相容性，以及其本质是蛋白质的结构特点，蛛丝蛋白在医学上表现出极大的应用潜力，近年来成为组织工程研究感兴趣的特殊的生物材料。蜘蛛不同的丝腺产生丝的功能不尽相同，最主要的是以编织球形网的园蛛类大壶腹线产生的拖丝所表现出来的显著的柔韧性、抗疲劳和与钢材相似的张力强度，以及在200℃高温的热稳定性，其综合性质明显优于其它天然纤维和合成纤维。
蜘蛛丝获得应用的前提首先要求能够大批量生产出蛛丝蛋白。与蚕丝相反，要获取大量的蜘蛛丝并非易事，只能用生物技术生产蛛丝蛋白，蜘蛛丝蛋白基因工程是实现这个目标的关键。人工合成蛛丝蛋白的构想通常是在原核或真核细胞表达蛛丝蛋白基因，从而得到表达产物，这方面的工作最早见于国外报道。二十世纪九十年代初，Lewis实验室首先报道了来源于棒络新妇蛛拖丝蛋白部分cDNA序列(Xu M，Lewis RV.Structure of a protein superfiber：spiderdragline silk.Proc Natl Acad Sci，1990，87：7120～7124)，由此揭开了蛛丝蛋白基因与结构研究的序幕。1995年，在解决了蛛丝蛋白基因重复序列片段的构建困难之后(Prince JT，Mcgrath KP，Kaplan DL.Construction，cloning andexpression of genes encoding spider dragline silk.Biochem，1995，34：10879～10885)，利用蛛丝蛋白部分cDNA片段以及人工合成丝蛋白部分基因分别在大肠杆菌(Arcidacono S，Mello C，Kaplan et al.Purification andcharacterization of recombinant spider silk expressed in Escherichiacoli.Appl Microbiol Biotechnol，1998，49：31α38)、毕赤酵母(FahnestockSR，Bedzyk LA.Production of synthetic spid er dragline silk protein inPichia pastoris.Appl Microbiol Biotechnol，1997，47：33α39)、烟草(Scheller J，Guhrs KH，Grosse F et al.Production of spider silk proteinsin tobacco and potato.Nat Biotechnol，2001，19：573α577)等体系表达的研究才有进一步的深入。福建师范大学李敏等在国内率先利用原核生物表达体系，构建了不同于他人报道的蛛丝蛋白基因(李敏，章文贤，黄智华等。蜘蛛拖丝蛋白基因的构建及在大肠杆菌中的表达，生物工程学报，2002，18(3)：331α334)，得到基因重组蛛丝蛋白工程菌(命名为pNS2)，奠定了利用蛛丝蛋白发展生物材料的研究工作基础。
以上研究工作所得到的基因重组蛛丝蛋白表达产物，均是实验室摇瓶培养的结果，所获得的表达产物量是有限的，采用的纯化方法是His.Bind金属螯合柱层析。亲和层析方法虽然特异性高，但该方法所针对的是小量物质的纯化，仅适用于分析性实验。一旦涉及到需要规模化、高纯度蛋白质的制品，就不能用此方法。这主要因为①亲和层析介质的吸附结合能力有限；②再生后的介质结合能力下降；③亲和层析介质价格昂贵。
福建师范大学李敏等构建的pNS2所表达的蛛丝蛋白，经测定分子量为32kD，等电点pI8.5，蛋白质氨基酸组分以甘氨酸和丙氨酸为主，具有特殊的高度重复序列，疏水性强。对这种类型的蛋白质来说，当浓度超过一定范围，很容易形成不溶于水的沉淀颗粒。虽然加入变性剂能增加蛋白质的溶解性，但同时也降低了层析介质的吸附能力。根据重组蛛丝蛋白质的这些特性，对于要制备一定规模量的蛋白质，采用普通离子交换层析、凝胶层析等方法难以达到吸附、洗脱、分离的效果。
本发明的目的是为从pNS2中大量制备所获得的基因重组蛛丝蛋白提供简单、有效、经济实用的分离纯化方法，采用该方法可得到高纯度的蛛丝蛋白。
为实现本发明的目的所采用的技术方案是：pNS2在发酵罐规模化培养后，细菌细胞经冻融，超声，离心，弃菌体残渣。取上清液用HAC调至pH5.0-6.5，4℃放置过夜，离心。将上清液加热到45-64℃，保温3-15分钟，离心。上清液用NaOH调至pH 8.5-9.2，加饱和硫酸铵至20％饱和度，再用NaOH调至pH8.5-9.2，4℃放置2小时以上，离心。沉淀用20％硫酸铵混悬，4℃保存，备用。
本发明具体内容包括：
1.细菌裂解：经高密度发酵制备的规模化细菌培养物，离心收集菌体，条件：5000rpm，15min，4℃。加入1/15M磷酸盐缓冲液(pH7.0)洗涤菌体，离心。以1∶5比例加入50mM Tris-HCl(pH8.0)/1mMPMSF/1mMEDTA，反复冻融3次后，超声破碎细胞，条件：4℃，50HZ，26-40sec，间隔30sec，反复超声震荡10-15次。4℃离心，12000rpm，30min，弃沉淀，留上清液。
2.除去酸性蛋白：上清液用10％HAC调至pH5.0-6.5，4℃放置过夜。4℃离心，12000rpm，30min，弃沉淀物，留上清液。
3.除去热变性蛋白：将酸化处理的上清液加热到45-64℃，保温3-15min，4℃离心，12000rpm，30min，弃沉淀，留上清液。
4.硫酸铵沉淀目的蛋白：用1MNaOH调节已去除热变性蛋白的上清液的pH至8.5-9.2，缓慢加入饱和硫酸铵溶液，边加边搅拌，至终浓度为20％硫酸铵饱和度。由于加入硫酸铵后，溶液的pH有下降，需用1MNaOH再调至pH 8.5-9.2，4℃至少放置2小时以上。4℃离心，10000rpm，15min。沉淀物(目的蛋白)混悬于20％硫酸铵中，4℃保存，备用。12％SDS-PAGE鉴定，目的蛋白质纯度＞85％。
本发明的优点和明显的效果如下：
1.本发明所述的分离纯化步骤简单，酸化、加热、硫酸铵沉淀等是蛋白质分离纯化中常用的方法，易于掌握。根据基因重组蛛丝蛋白等电点pI8.5，属于碱性蛋白，调节裂解液的pH可以除去大量酸性蛋白，加热有利于除去大分子杂蛋白，硫酸铵分级沉淀目的蛋白，效果显著。
2.不需要昂贵的蛋白质分离纯化介质，成本低，对于规模化制备特别适合。
下面结合实施例对本发明做进一步的说明。
实施例1
1.细菌裂解：取1L经高密度发酵制备的规模化细菌培养物，4℃离心5000rpm，15min，收集菌体。加入1/15M磷酸盐缓冲液(pH7.0)洗涤菌体，离心。以1∶5比例加入50mMTris-HCl(pH8.0)/1mMPMSF/1mMEDTA，混悬，反复冻融3次，4℃超声破碎细胞，条件：50HZ，26sec，间隔30sec，反复超声震荡15次。4℃离心12000rpm，30min，弃沉淀，留上清液。
2.除去酸性蛋白：上清液用10％HAC调至pH5.0，4℃放置过夜。4℃离心12000rpm，30min，弃沉淀物，留上清液。
3.除去热变性蛋白：将酸化处理的上清液加热到45℃，保温15min，4℃离心12000rpm，30min，弃沉淀，留上清液。
4.沉淀目的蛋白：用1MNaOH调节已去除热变性蛋白的上清液的pH至8.5.缓慢加入饱和硫酸铵溶液，边加边搅拌，至终浓度为20％硫酸铵饱和度。月1MNaOH再调至pH 8.5，4℃放置2小时。4℃离心10000rpm，15min。沉淀物混悬于20％硫酸铵中，4℃保存，备用。12％SDS-PAGE鉴定，目的蛋白质纯度＞90％。
实施例2
1.细菌裂解：取2L经高密度发酵制备的规模化细菌培养物，4℃离心5000rpm，15min，收集菌体。加入1/15M磷酸盐缓冲液(pH7.0)洗涤菌体，离心。以1∶5比例加入50mMTris-HCl(pH8.0)/1mMPMSF/1mMEDTA，反复冻融3次，4℃超声破碎细胞，条件：50HZ，35sec，间隔30sec，反复超声震荡12次。4℃离心12000rpm，30min，弃沉淀，留上清液。
2.除去酸性蛋白：上清液用10％HAC调至pH6.0，4℃放置过夜。4℃离心12000rpm，30min，弃沉淀，留上清液。
3.除去热变性蛋白：将酸化处理的上清液加热到50℃，保温8Mmin，4℃离心12000rpm，30min，弃沉淀，留上清液。
4.沉淀目的蛋白：用1MNaOH调节已去除热变性蛋白的上清液的pH至9.0，缓慢加入饱和硫酸铵溶液，边加边搅拌，至终浓度为20％硫酸铵饱和度。用1MNaOH再调至pH 9.0，4℃放置5小时。4℃离心10000rpm，15min。沉淀物混悬于20％硫酸铵中，4℃保存，备用。12％SDS-PAGE鉴定，目的蛋白质纯度＞85％。
实施例3
1.细菌裂解：取500ml经高密度发酵制备的规模化细菌培养物，4℃离心5000rpm，15min，收集菌体。加入1/15M磷酸盐缓冲液(pH7.0)洗涤菌体，离心。以1∶5比例加入50mMTris-Cl(pH8.0)/1mMPMSF/1mMEDTA，反复冻融3次，4℃超声破碎细胞，条件：50HZ，40sec，间隔30sec，反复超声震荡10次，。4℃离心，12000rpm，30min，弃沉淀，留上清液。
2.除去酸性蛋白：上清液用10％HAC调至pH5.5，4℃放置过夜。4℃离心12000rpm，30min，弃沉淀，留上清液。
3.除去热变性蛋白：将酸化处理的上清液加热到60℃，保温3min，4℃离心12000rpm，30min，弃沉淀，留上清液。
4.沉淀目的蛋白：用1MNaOH调节已去除热变性蛋白的上清液的pH至9.2，缓慢加入饱和硫酸铵溶液，边加边搅拌，至终浓度为20％硫酸铵饱和度，用1MNaOH再调至pH9.2，4℃放置4小时。4℃离心10000rpm，15min。沉淀物混悬于20％硫酸铵，4℃保存，备用。12％SDS-PAGE鉴定，目的蛋白质纯度＞88％。
Claims (2)
1.一种制备性基因重组蜘蛛拖丝蛋白的分离纯化方法，其特征是利用pNS2基因重组蛛丝蛋白工程菌在发酵罐规模化培养后，细胞经冻融、超声裂解，目的蛋白通过酸化、加热、硫酸铵沉淀步骤纯化制备；
(1)细菌细胞冻融时以1∶5比例加入50mM Tris-HCl(pH8.0)/1mMPMSF/1mMEDTA，反复冻融3次；
(2)超声裂解细胞的条件是：4℃，50HZ，26～40sec，间隔30sec，反复超声震荡10～15次；
(3)基因工程菌在超声、离心后，其上清液用10％醋酸调至pH5.0～6.5，4℃静置过夜，离心除去杂蛋白；
(4)酸化处理后的上清液，加热到45～64℃，保温3～15min，离心，弃沉淀，留上清液。
2.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征是加热处理后的上清液，用1M NaOH调至pH 8.5～9.2，20％硫酸铵沉淀目的蛋白，再用1M NaOH调至pH8.5～9.2，4℃放置2小时以上，离心后沉淀混悬于20％硫酸铵溶液，4℃保存。
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