CN112280770B

CN112280770B - 热稳定性提高的胰蛋白酶突变体

Info

Publication number: CN112280770B
Application number: CN202011184570.2A
Authority: CN
Inventors: 刘松; 彭文坚; 陈坚; 周景文
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2020-10-30
Filing date: 2020-10-30
Publication date: 2022-09-06
Anticipated expiration: 2040-10-30
Also published as: CN112280770A

Abstract

本发明公开了热稳定性提高的胰蛋白酶突变体，属于基因工程技术领域。本发明在高酶活灰色链霉菌胰蛋白酶基础上，通过定点突变生物技术改造胰蛋白酶分子结构，分析了SGT所有精氨酸与赖氨酸位点对酶热稳定性的影响，并通过半理性设计最终获得三株热稳定性调高的突变菌株K68T，R146L，R225L。三株突变体在热稳定显著提高同时酶的活性不受影响并提高了酶活。这些突变体能够在较高温度下进行工业生产，利于生产工艺的灵活性，具有良好的工业应用前景。

Description

热稳定性提高的胰蛋白酶突变体

技术领域

本发明涉及热稳定性提高的胰蛋白酶突变体，属于基因工程技术领域。

背景技术

胰蛋白酶作为一种多肽水解酶能够专一性地切割肽链中精氨酸或赖氨酸的羧基端。其在许多领域有广泛的应用。可以应用在皮革加工中局部皮革处理及脱灰软化：清除裸皮中的皮垢清除，纤维基质，从而增强皮革的丰满柔软度、弹性、粒面光滑度；在医药可以应用在创面净化、促进肉芽组织新生、抗炎症等；在食品工业中应用于特异性水解胶原蛋白等天然蛋白，制备功能性多肽；此外胰蛋白酶还是多肽质谱、蛋白组学分析的重要工具酶。

动物来源的胰蛋白酶对人体有潜在的免疫原性，因此，因此异源表达与牛胰蛋白酶同源性高的微生物来源灰色链霉菌胰蛋白酶(SGT)具有重要的应用价值。与常用的商品化猪源胰蛋白酶和牛源胰蛋白酶相比，SGT具有更显著的切割效率，产生大量胰酶特异性切割的多肽序列。但是，由于SGT高效的水解活性，其在异源分泌表达过程中产生自降解问题。

但目前对于SGT异源分泌表达过程中稳定性差从而产生自降解问题，还没有很好的解决方案。如果能够提升SGT在异源表达中的稳定性，将能显著提高该酶的生产应用价值，更有助于工业化生产。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了热稳定性提高的胰蛋白酶突变体，以及能够表达所述胰蛋白酶突变体的毕赤酵母工程菌。

前期研究工作中，发明人已获得一种高酶活的胰蛋白酶重组毕赤酵母工程菌，该酵母菌表达氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的胰蛋白酶，SEQ ID NO.1所示的胰蛋白酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明在亲本氨基酸的基础上对其进行了适当的突变，从而获得了稳定性、酶活提高的突变体，为胰蛋白酶在产业上的应用提供了广阔的前景。

本发明提供了胰蛋白酶突变体，所述突变体以氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的胰蛋白酶为亲本，分别将其第68位、146位或225位的氨基酸进行突变。

在本发明的一种实施方式中，所述胰蛋白酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，分别将亲本第68位氨基酸突变为苏氨酸、第146位氨基酸突变为亮氨酸、或225位的氨基酸突变为亮氨酸。

在本发明的一种实施方式中，将亲本第68位的赖氨酸突变位丙氨酸(K68T)；或将亲本第146位的精氨酸突变为亮氨酸(R146L)；或将225位的精氨酸突变为丙氨酸(R225L)。

本发明提供了编码所述突变体的基因。

本发明提供了携带权利要求3所述基因的载体。

在本发明的一种实施方式中，所述载体为pPIc9k、pHIL-S1、pPIcza、pYAM75P6中的任意一种。

本发明提供了表达所述突变体，或含有所述基因的宿主细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为毕赤酵母GS115、KM71、KM71H和/或X33。

在本发明的一种实施方式中，所述微生物细胞为原核细胞或真核细胞。

本发明提供了一种制备权利要求1所述突变体的方法，其特征在于，步骤如下：

(1)根据确定的突变位点，设计定点突变的突变引物，以携带胰蛋白酶编码基因的载体为模板进行定点突变；构建含编码突变体的基因的载体；

(2)将含编码突变体的基因的载体转化进微生物细胞；

(3)挑选阳性克隆进行发酵培养，离心收集细胞，细胞破壁上清即为胰蛋白酶突变体的粗酶液。

在本发明的一种实施方式中，所述表达载体包括pPIc9k、pHIL-S1、pPIcza、pYAM75P6中的任意一种。

在本发明的一种实施方式中，所述微生物细胞为细菌或真菌细胞。

本发明提供了一种提高胰蛋白酶热稳定性的方法，所述方法为将胰蛋白酶的第68位氨基酸突变为苏氨酸、第146位氨基酸突变为亮氨酸、或225位的氨基酸突变为亮氨酸。

本发明提供了一种提高胰蛋白酶酶活的方法，所述方法为将氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的胰蛋白酶的第68位氨基酸突变为苏氨酸、第146位氨基酸突变为亮氨酸、或225位的氨基酸突变为亮氨酸。

本发明提供了一种提高胰蛋白酶比活力的方法，所述方法为将氨基酸序列如SEQID NO.1所示的胰蛋白酶的第68位氨基酸突变为苏氨酸、第146位氨基酸突变为亮氨酸、或225位的氨基酸突变为亮氨酸。

本发明还保护所述突变体，或所述基因，或所述载体，或所述宿主细胞在切割肽链中精氨酸或赖氨酸的羧基端中的应用。

本发明还保护所述突变体，或所述基因，或所述载体，或所述宿主细胞在工业、医药、生化、食品领域中的应用。

本发明的有益效果：

本发明在一种高酶活灰色链霉菌(Streptomyces griseus)胰蛋白酶基础上，通过定点突变生物技术改造胰蛋白酶分子结构，分析了SGT所有精氨酸与赖氨酸位点对酶热稳定性的影响，并通过半理性设计最终获得三株热稳定性调高的突变菌株K68T，R146L，R225L。三株突变体在热稳定显著提高同时酶的活性不受影响甚至提高了酶活。突变体R146L和R225L在酶催化活性基本不变的情况下热稳定性提升最大，在45℃热处理30min后，突变体R146L和R225L分别保留35.85％与29.94％的相对酶活，对照组则仅仅保留6.76％的相对酶活。突变体K82T在45℃热处理30min后保留了17.51％的相对酶活，但催化活性明显提升，摇瓶发酵粗酶活达到了90.48±7.83U·mL^-1，相比对照组的60.85U·mL^-1提高了49.68％。这些突变体能够在较高温度下进行工业生产，利于生产工艺的灵活性，具有良好的工业应用前景。

附图说明

图1为定点突变改造的胰蛋白酶表达载体构建图；

图2为45℃水浴保温不同时间后，胰蛋白酶突变体R10A、R21A、K68A、R70A、K73A、K91A、K102A、R130A、K134A、R146A、K183A、R203A、R225A与对照组热稳定性比较图；

图3为胰蛋白酶突变体R10A、R21A、K68A、R70A、K73A、K91A、K102A、R130A、K134A、R146A、K183A、R203A、R225A的摇瓶酶活与45℃水浴保温30min后的酶活回收率图；

图4为45℃水浴保温不同时间后，胰蛋白酶突变体K68T，R146L，R225L与对照组热稳定性比较图。

具体实施方式

1、胰蛋白酶的纯化

1)离心样品后收集上清，用1M NaOH调节pH至7.4，以9000×g离心15min，弃掉菌体沉淀；12000×g离心20min，去除杂质，收集上清；过0.22μm滤膜，将样品放置冰上备用。

2)准备上样缓冲液(A液)50mM Tris-HCl(pH 7.4含0.5MNaCl)，洗脱缓冲液(B液)50mM甘氨酸-HCl缓冲液(pH 3.0)。

3)纯化流程：用超纯水清洗管道及纯化柱，然后用超纯水洗脱系统，2个柱体积；分别用上样缓冲液、洗脱缓冲液清洗A、B泵，上样缓冲液清洗上样泵，然后用上样缓冲液柱洗系统，2个柱体积；切换至上样泵自动上样，上样结束后用上样缓冲液柱洗，直到UV吸收值降低至初始值后再柱洗一个柱体积，使得胰蛋白酶充分与填料中的Benzamidine结合；20％洗脱缓冲液柱洗1个柱体积，40％洗脱缓冲液柱洗1.5个柱体积；60％洗脱缓冲液柱洗1.5个柱体积；80％洗脱缓冲液柱洗1.5个柱体积；100％洗脱缓冲液柱洗2个柱体积。

4)收集胰蛋白酶样品，用1MTris缓冲液调收集样品的pH至3.0并进行透析。

2、胰蛋白酶酰胺酶酶活测定方法

在37℃下，测定100μL粗酶液同900μL BAPNA(Na-苯甲酰-DL-精氨酸-对硝基酰胺盐酸盐)溶液在光径0.5cm的反应池中，在410nm下10min内的吸光值变化，得到A410nm/min。酶活定义为：在37℃下，ΔA410nm/min升高0.1所需要的酶量为1个酰胺酶水解单位。

3、蛋白质质量采用天根BCA蛋白质定量试剂盒(PA115)测定。

表1实施例中所使用的引物

实施例1：胰蛋白酶热稳定性提高的突变位点筛选

(1)丙氨酸突变体重组质粒的构建

①以将氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的胰蛋白酶第91位突变为丙氨酸(K91A)的质粒构建为例，将连接有SEQ ID NO.2所示的序列的Ppic-9K载体(购自赛默飞世尔科技有限公司)为模板，以K91A-F、K91A-R为引物，进行PCR得到编码氨基酸序列第91位赖氨酸突变为丙氨酸的突变体(K91A)的核苷酸序列；

②将上一步得到的含有重组基因的PCR产物用DpnI酶切去除模板，将酶切产物进行纯化，将纯化后的产物化学法转化至JM109感受态细胞，得到转化液；

③将转化液涂布于含100μg/L卡那霉素的LB培养基，在37℃培养至长出单菌落，挑取单菌落至含100μg/L卡那霉素LB液体培养基中，37℃培养8-10h，提取菌液中的质粒，进行测序验证，验证正确的即为构建的重组质粒，命名为pPIC9K-ExmtK91A。

利用表1中的引物及与步骤(1)相同的方法，构建得到突变体R10A、R21A、K68A、R70A、K73A、K91A、K102A、R130A、K134A、R146A、K183A、R203A、R225A、的重组质粒，分别命名为pPIC9K-ExmtR10A、pPIC9K-ExmtR21A、pPIC9K-ExmtK68A、pPIC9K-ExmtR70A、pPIC9K-ExmtK73A、pPIC9K-ExmtK91A、pPIC9K-ExmtK102A、pPIC9K-ExmtR130A、pPIC9K-ExmtK134A、pPIC9K-ExmtR146A、pPIC9K-ExmtK183A、pPIC9K-ExmtR203A、pPIC9K-ExmtR225A。

(2)产成熟胰蛋白酶丙氨酸突变体的酵母工程菌构建

将步骤1得到的重组质粒pPIC9K-ExmtK91A用Sal I线性化，将线性化片段回收并电击转化Pichiapastoris GS115感受态细胞，具体方法如下：

1)将在YPD平板活化的Pichiapastoris GS115接种至于含YPD培养基的25mL/250mL三角瓶，30℃过夜培养；将过夜培养后的菌液以1mL/100mL的接种量接种至含YPD培养基的50mL/500mL三角瓶，培养菌体浓度OD₆₀₀为1.3～1.5；

2)5000r/min，4℃离心10min收集菌体，分别用50mL、25mL无菌水悬浮细胞；

3)5mL1M山梨醇重悬上述细胞，5000r/min，4℃离心10min收集菌体；

4)500μL1M山梨醇重悬上述细胞，分装80μL/1.5mL EP管用于电转化感受态细胞；

5)20μL线性化质粒与上述80μL感受态细胞混合，冰上静置15min；

6)上述混合物加入预冷的无菌电转化杯(0.2cm)，1500V、25μF、200Ω电击一次，再向其中加入1mL1M山梨醇；

7)取步骤6得到的混合物150μL涂布MD平板，30℃培养3天；

8)挑取上述平板中白色菌落，验证正确的重组菌：分别点种在1、2、3、4mg/mL(遗传霉素)YPD平板中，挑选在4mg/mL遗传霉素平板中的单菌落用于摇瓶发酵，测胰蛋白酶酶活，挑选酶活最高的重组菌，命名为重组菌GS115-K91A。

将步骤1的中构建得到的其他重组质粒以相同的方法转化至PichiapastorisGS115感受态细胞，构建得到含有胰蛋白酶突变体的重组毕赤酵母菌株GS115-R10A、GS115-R21A、GS115-K68A、GS115-R70A、GS115-K73A、GS115-K91A、GS115-K102A、GS115-R130A、GS115-K134A、GS115-R146A、GS115-K183A、GS115-R203A、GS115-R225A。

(3)胰蛋白酶丙氨酸突变体的酶活及热稳定性

将步骤2构建得到的含有胰蛋白酶突变体的重组毕赤酵母，分别接种至50mL YPD培养基，在30℃下、活化24h，将活化后的菌液在3000g下、离心5min收集菌体，弃去上清液，加入35mL的发酵培养基重悬。

发酵培养基(g/L)：K₂HPO₄·3H2O1.51；KH₂PO₄5.91；生物素0.2；YNB(酵母无氨基酸氮源)13.4；胰蛋白胨10；酵母粉5；生物素4×10^-4；甲醇1mL/100mL。

在30℃，220rpm的条件下，每24h补加一次甲醇，使得甲醇在发酵体系中的浓度为1mL/100mL，培养120h，收集发酵液，并将其进行纯化，得到纯化后的蛋白。分别测定蛋白的酶活，另取一定量的纯酶液于pH8.0 Tris-HCL缓冲液45℃水浴热处理，分别在处理前及处理后的10min、20min、30min，测定剩余酶的酶活，以未经过高温处理的纯酶液的酶活为参比，得到残余酶活百分比，突变体的酶活变化结果如图2所示，摇瓶酶活与热处理30min后的剩余酶活如图3所示。

热稳定性前五的突变体由高到低依次为R225A，K91A，R146A，R130A和K68A。

实施例2：胰蛋白酶突变体的构建

根据实施例1中选出的位点第225位、146位、68位，进行理性突变，分别将第225位的R突变为L、将第68位的K突变为T、将第146位的R突变为L。

采用表1中的引物，具体构建方式同实施例1的步骤1，构建得到重组质粒pPIC9K-ExmtK68T、pPIC9K-ExmtR146L、pPIC9K-ExmtR225L。

高酶活热稳定的突变体K68T，R146L，R225L的酶活变化情况如表3。

实施例3：产成熟胰蛋白酶突变体的酵母工程菌构建

将实施例2构建得到的重组质粒pPIC9K-ExmtK68T、pPIC9K-ExmtR146L、pPIC9K-ExmtR225L，按照实施例1的步骤2转化至Pichiapastoris GS115感受态细胞中，构建得到重组毕赤酵母菌株GS115-K68T、GS115-R146L、GS115-R225L。

实施例4：胰蛋白酶突变体的酶活及热稳定性

将实施例3中构建得到的重组毕赤酵母菌株GS115-K68T、GS115-R146L、GS115-R225L，按照实施例1步骤3发酵生产胰蛋白酶，发酵结束后，将酶在45℃水浴热处理10min、20min、30min，测定剩余酶活(表2)，并计算残余酶活比率(图4)。

表2胰蛋白酶突变体热处理后剩余酶活(U/mL)

	0min	10min	20min	30min
					亲本酶	56.95	21.01	6.97	3.85
K68T	64.74	36.26	19.86	11.36
					R146L	48.66	34.06	23.18	14.57
R225L	50.32	36.22	25.72	18.03

胰蛋白酶突变体K68T、R146L、R225L的摇瓶粗酶活与比酶活如表3所示。

表3胰蛋白酶突变体比酶活

突变体	粗酶活(U/mL)	比酶活(U/mg)
			亲本酶	60.85±2.42	1527.96±62.8
K68T	90.48±7.83	1743.08±30.10
			R146L	70.84±6.45	1643.56±44.96
R225L	65.82±5.77	1468±33.88

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 热稳定性提高的胰蛋白酶突变体

<130> BAA200613A

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 227

<212> PRT

<213> Streptomyces griseus

<400> 1

Phe Val Glu Phe Val Val Gly Gly Thr Arg Ala Ala Gln Gly Glu Phe

1 5 10 15

Pro Phe Met Val Arg Leu Ser Met Gly Cys Gly Gly Ala Leu Tyr Ala

20 25 30

Gln Asp Ile Val Leu Thr Ala Ala His Cys Val Ser Gly Ser Gly Asn

35 40 45

Asn Thr Ser Ile Thr Ala Thr Gly Gly Val Val Asp Leu Gln Ser Ser

50 55 60

Ser Ala Val Lys Val Arg Ser Thr Lys Val Leu Gln Ala Pro Gly Tyr

65 70 75 80

Asn Gly Thr Gly Ala Asp Trp Ala Leu Ile Lys Leu Ala Gln Pro Ile

85 90 95

Asn Gln Pro Thr Leu Lys Ile Ala Thr Thr Thr Ala Tyr Asn Gln Gly

100 105 110

Thr Phe Thr Val Ala Gly Trp Gly Ala Asn Ile Glu Gly Gly Ser Gln

115 120 125

Gln Arg Tyr Leu Leu Lys Ala Asn Val Pro Phe Val Ser Asp Ala Ala

130 135 140

Cys Arg Ser Ala Tyr Gly Asn Glu Leu Val Ala Asn Glu Glu Ile Cys

145 150 155 160

Ala Gly Tyr Pro Asp Thr Gly Gly Val Asp Thr Cys Gln Gly Asp Ser

165 170 175

Gly Gly Pro Met Phe Val Lys Asp Asn Ala Asp Glu Trp Ile Gln Val

180 185 190

Gly Ile Val Ser Trp Gly Tyr Gly Cys Ala Arg Pro Gly Tyr Pro Gly

195 200 205

Val Tyr Thr Glu Val Ser Thr Phe Ala Ser Ala Ile Ala Ser Ala Ala

210 215 220

Arg Thr Leu

225

<210> 2

<211> 684

<212> DNA

<213> Streptomyces griseus

<400> 2

tttgtagaat tcgtcgtcgg cggaacccgc gccgcccagg gcgagttccc cttcatggtc 60

cggctctcca tgggctgcgg cggcgccctc tacgcccagg acatcgtcct caccgccgcc 120

cactgcgtga gcggatcggg caacaacacc tcgatcaccg ccaccggcgg cgtcgttgat 180

ctccagtcgt ccagcgccgt caaggtccgc tccaccaagg tcctccaggc ccccggctac 240

aacggcaccg gcgctgactg ggcgctcatc aagctcgccc agcccatcaa ccagcccacg 300

ctgaagatcg ccaccaccac cgcctacaac cagggcacgt tcaccgtcgc cggctggggc 360

gccaacattg agggcggcag ccagcagcgc tacctgctca aggccaacgt cccattcgtc 420

tccgacgccg cctgccgctc cgcctacggc aacgagcttg tggccaacga ggagatttgc 480

gccggatacc ccgacactgg tggcgttgat acctgccagg gtgactccgg cggcccgatg 540

ttcgttaagg acaacgccga cgagtggatt caggtcggca tcgtcagctg gggctacggc 600

tgcgcccggc ccggctaccc gggtgtctac accgaggtct cgaccttcgc ttccgccatc 660

gcctcggccg cccgcacgct ctga 684

Claims

1.胰蛋白酶突变体，其特征在于，所述突变体以氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的胰蛋白酶为亲本，分别将亲本第68位氨基酸突变为苏氨酸、第146位氨基酸突变为亮氨酸、或225位的氨基酸突变为亮氨酸。

2.编码权利要求1所述突变体的基因。

3.携带权利要求2所述基因的载体。

4.表达权利要求1所述突变体、或含有权利要求2所述基因的微生物细胞。

5.根据权利要求4所述的微生物细胞，其特征在于，所述微生物细胞为原核细胞或真核细胞。

6.一种制备权利要求1所述突变体的方法，其特征在于，步骤如下：

(2)将含编码突变体的基因的载体转化进微生物细胞；

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述表达载体包括pPIc9k、pHIL-S1、pPIcza、pYAM75P6中的任意一种。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述微生物细胞为细菌或真菌细胞。

9.权利要求1所述突变体、或权利要求2所述基因、或权利要求3所述载体、或权利要求4所述微生物细胞在切割肽链中精氨酸或赖氨酸的羧基端中的应用。