CN114854713B - PET水解酶IsPETase-cSP突变酶及编码基因及工程菌 - Google Patents

PET水解酶IsPETase-cSP突变酶及编码基因及工程菌 Download PDF

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Abstract

本发明公开了PET水解酶IsPETase‑cSP突变酶及编码基因及工程菌，其PET水解酶IsPETase‑cSP突变酶命名为IsPETaseKEA‑cSP，所述IsPETaseKEA‑cSP的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。本发明对PET水解酶IsPETase‑cSP进行分子改造，经过表达纯化获得具有增强的PET降解活性和MHET降解活性的PET水解酶IsPETase‑cSP突变酶，命名为IsPETaseKEA‑cSP，使用突变酶进行降解PET反应，可以使降解PET反应的产量提升，并得到单一的TPA产物。

Description

PET水解酶IsPETase-cSP突变酶及编码基因及工程菌
技术领域
本发明属于酶工程和生物工程技术领域，具体涉及一种PET水解酶IsPETase-cSP突变酶及编码基因及含有编码基因的质粒及工程菌。
背景技术
PET是最丰富的聚酯塑料，由取自原油的对苯二甲酸(TPA)和乙二醇(EG)通过酯键相连构成。PET具有合成简单、价格低廉、坚固耐用等特性，PET产品包括纤维级PET和非纤维级PET(如瓶类、薄膜和工程塑料等)，包装是PET最大的非纤维级应用市场，也是增速最快的领域。目前大部分瓶装水、软饮料都使用PET进行灌装；PET在食品、药品、化妆品和日用化学品包装等领域也得到更广泛的应用。
随之而来的是大量的PET通过生产或废物处理的方式被引入到环境中，在全球生态系统中累积从而导致严重的环境破坏。PET具有高比例的芳香族对苯二甲酸酯单元，会降低链迁移率，因此是一种极难水解的聚酯，在自然界中可存在16-48年。目前，PET塑料主要处理方法是填埋、焚烧、热解和化学降解，均存在对环境二次污染，而且超4000万吨/年PET塑料被遗弃/填埋至自然界中，造成全球污染极其严重。
近年，生物处理技术由于具有高效降解、低经济成本、绿色环保等特点被逐步应用到废弃塑料的处理当中。目前，在PET塑料的酶法降解领域已取得了较好的研究进展，为其进一步实现工业水平的循环利用提供了可能。此外，Avantika Singh等人预测酶法回收的TPA(rTPA)可能具有成本竞争力。除了有利的长期社会经济效益外，rTPA还可将每公斤TPA的总供应链能源使用量减少69％-83％，温室气体排放量减少17％-43％。一项针对美国的整体经济评估估计，与原始TPA生产相比，TPA回收过程可以减少高达95％的环境影响，同时产生高达45％的社会经济效益。
迄今为止，已经鉴定出许多PET水解酶，酯酶、脂肪酶或角质酶形式的PET水解酶是研究最广泛的塑料降解酶。但这些PET水解酶大多需要在50℃以上的温度条件下对PET进行降解，在常温下表现出极低的活性，因此利用这些酶无法对遗弃在自然界中的PET塑料实现就地降解。
2016年，日本团队发现一种将PET作为主要能量和碳源的细菌Ideonellasakaiensis 201-F6，随后从中鉴定出PET水解酶IsPETase和MHETase，IsPETase首先将PET聚合物水解成MHET，然后类阿魏酸酯酶MHETase将MHET进一步水解成TPA和EG。与其他脂肪酶或角质酶对对硝基苯酯的高活性相比，IsPETase更偏好PET底物。与低结晶度角质酶LCC、枯萎镰刀菌角质酶和Thermififida fusca水解酶相比，在30℃下IsPETase对PET膜的水解活性分别高5.5、88、120倍。
但IsPETase仅在温和的条件下生长，其相对较低的热稳定性限制了其实际应用。此外，为了降低酶的制备和使用成本，应避免多种酶的使用。使用一种PET水解酶水解PET得到单一的TPA产物，将有利于TPA的回收及进一步的升级循环。因此，可通过对IsPETase进行改造使其同时具有增强的水解PET活性和增强的MHETase酶活性，从而达到使用一种PET水解酶IsPETase突变体进行PET水解反应，反应得到的水解产物为单一的TPA，而没有中间产物MHET的累积。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供同时具有增强的PET降解活性和增强的MHET降解活性，使得降解PET反应得到单一TPA产物的PET水解酶IsPETase-cSP突变酶。
本发明的第二个目的是提供编码PET水解酶IsPETase-cSP突变酶IsPETaseKEA-cSP的基因。
本发明的第三个目的是提供含有上述基因的重组质粒。
本发明的第四个目的是提供一种含有上述重组质粒的工程菌。
本发明的第五个目的是提供上述工程菌表达得到的IsPETaseKEA-cSP在水解BHET中的应用。
本发明的第六个目的是提供上述工程菌表达得到的IsPETaseKEA-cSP在水解PET中的应用。
本发明的技术方案概述如下：
PET水解酶IsPETase-cSP突变酶，命名为IsPETaseKEA-cSP，所述IsPETaseKEA-cSP的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
编码PET水解酶IsPETase-cSP突变酶的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
含有上述基因的重组质粒pET-22b-IsPETaseKEA-cSP。
含有上述重组质粒的工程菌BL21(DE3)/pET-22b-IsPETaseKEA-cSP。
上述工程菌BL21(DE3)/pET-22b-IsPETaseKEA-cSP表达得到的IsPETaseKEA-cSP在水解BHET中的应用，BHET为对苯二甲酸双(2-羟乙基)酯的简写。
上述应用，包括如下步骤：
向pH值为6.0～8.0的80mM磷酸氢二钠-HCl缓冲液中加入BHET使终浓度为800～1000μmol/L；加入IsPETaseKEA-cSP使终浓度为50～200nM；在30～40℃，50～220rpm条件下孵育1～3天。
上述工程菌BL21(DE3)/pET-22b-IsPETaseKEA-cSP表达得到的IsPETaseKEA-cSP在水解PET中的应用；PET为聚对苯二甲酸乙二醇酯的简写。
上述应用，包括如下步骤：
向pH值为8.5～9.5的50mM甘氨酸-NaOH缓冲液中加入PET使终浓度为60～100mg/mL；加入IsPETaseKEA-cSP使终浓度为500～1000nM；在30～40℃，50～220rpm条件下孵育1～3天。
本发明的优点：
本发明对PET水解酶IsPETase-cSP进行分子改造，经过表达纯化获得具有增强的PET降解活性和MHET降解活性的PET水解酶IsPETase-cSP突变酶，命名为IsPETaseKEA-cSP，使用突变酶进行降解PET反应，可以使降解PET反应的产量提升，并得到单一的TPA产物。
附图说明
图1为PET水解酶IsPETase和MHETase水解PET过程。
图2为PET水解酶突变酶水解PET过程。
图3为重组质粒pET-22b-IsPETase-cSP结构示意图。
图4为重组质粒pET-22b-IsPETaseKEA-cSP结构示意图。
图5为PET水解酶IsPETase-cSP与IsPETaseKEA-cSP催化降解对苯二甲酸双(2-羟乙基)酯的TPA和MHET产量。
图6为PET水解酶IsPETase-cSP与IsPETaseKEA-cSP催化降解聚对苯二甲酸乙二醇酯的TPA和MHET产量。
具体实施方式
下面通过附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步详述，以下实施例只是描述性的，本发明所保护范围不限于此。
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
BHET为对苯二甲酸双(2-羟乙基)酯的简写；
PET为聚对苯二甲酸乙二醇酯的简写；
MHET为对苯二甲酸单(2-羟乙基)酯的简写；
TPA为对苯二甲酸的简写。
实施例1
含有编码PET水解酶IsPETase-cSP突变酶(IsPETaseKEA-cSP)的基因的重组质粒pET-22b-IsPETaseKEA-cSP的制备，具体步骤如下：
按照北京全式金生物生物技术有限公司无缝重组试剂盒的要求，以改造后的PET水解酶IsPETase-cSP基因(其中的PET水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，基因如SEQID NO.4所示)作为模板，设计引物如下：
S92K-F:5’-CGACCAGCCGAAAAGCCGCTCGTCGCAGCAGATGG-3’(引入92位点的突变)(SEQ ID NO.5)
S92K-R:5’-CGAGCGGCTTTTCGGCTGGTCGAGCGTGGAGTTGGTG-3’(引入92位点的突变)(SEQ ID NO.6)
D157E-F:5’-CCGCAGGCCCCGTGGGAGAGCTCGACCAAC-3’(引入157位点的突变)(SEQID NO.7)
D157E-R:5’-CTCCCACGGGGCCTGCGGCGCCGCGGCTTTC-3’(引入157位点的突变)(SEQID NO.8)
R251A-F:5’-GAACCCGAACAGCACCGCCGTGTCGGACTTC-3’(引入251位点的突变)(SEQID NO.9)
R251A-R:5’-GCGGTGCTGTTCGGGTTCTCGCAGGCGAAG-3’(引入251位点的突变)(SEQID NO.10)
按照无缝重组试剂盒的要求采用无缝连接和反向PCR技术构建含突变基因的重组质粒，主要分为三步：
(1)以重组质粒pET-22b-IsPETase-cSP(见图3，构建方法见已申请专利(申请号：202110900376.8)，发明名称为：PET水解酶IsPETase突变酶及编码基因及工程菌)为模板，S92K-F(SEQ ID NO.5)和S92K-R(SEQ ID NO.6)作为引物进行第一轮PCR扩增(95℃2min；95℃30s，58℃30s，72℃3.5min，30个循环；72℃10min)，对其PCR产物进行DMT酶消化、核酸电泳和切胶回收后得到纯化的基因片段，在无缝重组连接酶作用下连接片段后，将其转化入DH5α感受态细胞，通过氨苄青霉素平板培养基筛选、质粒提取和测序验证，获得编码IsPETaseK-cSP突变酶的重组质粒pET-22b-IsPETaseK-cSP；
(2)以重组质粒pET-22b-IsPETaseK-cSP作为模板，D157E-F(SEQ ID NO.7)和D157E-R(SEQ ID NO.8)作为引物进行第二轮PCR扩增(95℃2min；95℃30s，58℃30s，72℃3.5min，30个循环；72℃10min)，将获得的PCR产物按照同步骤(1)同样的步骤进行纯化，在无缝重组连接酶作用下连接片段后，转化入DH5α感受态细胞，通过氨苄青霉素平板培养基筛选、质粒提取和测序验证获得编码IsPETaseKE-cSP突变酶的重组质粒pET-22b-IsPETaseKE-cSP；
(3)以重组质粒pET-22b-IsPETaseKE-cSP作为模板，R251A-F(SEQ ID NO.9)和R251A-R(SEQ ID NO.10)作为引物进行第三轮PCR扩增(95℃2min；95℃30s，55℃30s，72℃3.5min，30个循环；72℃10min)，将获得的PCR产物按照同步骤(1)同样的步骤进行纯化，在无缝重组连接酶作用下连接片段后，转化入DH5α感受态细胞，通过氨苄青霉素平板培养基筛选、质粒提取和测序验证获得编码IsPETaseKEA-cSP突变酶的重组质粒pET-22b-IsPETaseKEA-cSP，其结构如图4所示；
IsPETaseKEA-cSP的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
编码PET水解酶IsPETase-cSP突变酶的基因，其特征是所述基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
所述氨苄青霉素平板培养基的配方为：酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉15g/L，氨苄青霉素霉素50mg/L。
所述PCR反应体系以及PCR程序参照北京全式金生物技术有限公司
Figure BDA0003621788630000041
FastPfuDNA Polymerase试剂盒的要求进行，如下表所示：
Figure BDA0003621788630000042
实施例2
BL21(DE3)/pET-22b-IsPETaseKEA-cSP工程菌的构建，包括如下步骤：
将重组质粒pET-22b-IsPETaseKEA-cSP转化入BL21(DE3)感受态细胞，涂布于氨苄青霉素平板培养基，得到阳性重组子BL21(DE3)/pET-22b-IsPETaseKEA-cSP，即成功构建了含重组质粒pET-22b-IsPETaseKEA-cSP的表达工程菌；
按照上述方法构建对照菌BL21(DE3)/pET-22b-IsPETase-cSP。
实施例3
工程菌BL21(DE3)/pET-22b-IsPETaseKEA-cSP的诱导表达和目的蛋白纯化
将上述两种工程菌分别接种于LB液体培养基，37℃，220r/min培养过夜；将过夜培养菌液分别按1％的接种量接入新鲜的LB液体培养基中，37℃，220r/min培养至OD600约为0.8时，添加0.1％(v/v)的IPTG，降温至16℃诱导表达20h。4000rpm离心15min收集工程菌湿细胞。
将工程菌湿细胞重悬于破菌缓冲液中，利用高压细胞破碎仪对重悬的湿细胞进行破菌处理。破菌后菌液经10000rpm离心60min除去细胞碎片，上清液经Ni-NTA填充柱吸附目的蛋白，利用洗杂缓冲液对非特异性吸附的杂蛋白进行清洗。利用洗脱缓冲液将目的蛋白洗脱，洗脱液经蛋白浓缩管浓缩。
其中，所述LB液体培养基的配方为：酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L；
所述破菌缓冲液的配方为：50mM Tris-HCl，150mM NaCl，10mM Imidazole，pH＝7.5；
所述洗杂缓冲液的配方为：50mM Tris-HCl，150mM NaCl，20mM Imidazole，pH＝7.5；
所述洗脱缓冲液的配方为：50mM Tris-HCl，300mM NaCl，300mM Imidazole，pH＝7.5；
按照上述方法对对照菌BL21(DE3)/pET-22b-IsPETase-cSP进行诱导表达后，在同样的条件下纯化和浓缩蛋白。
实施例4
利用PET水解酶IsPETase-cSP催化降解对苯二甲酸双(2-羟乙基)酯(BHET)
向pH值为7.0的80mM磷酸氢二钠-HCl缓冲液中加入对苯二甲酸双(2-羟乙基)酯使终浓度为800μmol/L；加入IsPETase-cSP使终浓度为50nM；在35℃，50rpm条件下孵育3天。经HPLC检测所得反应液中TPA产量为118.6μmol/L，MHET产量为680.4μmol/L,见图5中的A。
实施例5
利用PET水解酶IsPETase-cSP突变酶IsPETaseKEA-cSP催化降解对苯二甲酸双(2-羟乙基)酯(BHET)
向pH值为6.0的80mM磷酸氢二钠-HCl缓冲液中加入对苯二甲酸双(2-羟乙基)酯使终浓度为900μmol/L；加入IsPETaseKEA-cSP使终浓度为200nM；在30℃，220rpm条件下孵育1天。经HPLC检测所得反应液中TPA产量为202.7μmol/L，MHET产量为697.3μmol/L。
实施例6
利用PET水解酶IsPETase-cSP突变酶IsPETaseKEA-cSP催化降解对苯二甲酸双(2-羟乙基)酯(BHET)
向pH值为7.0的80mM磷酸氢二钠-HCl缓冲液中加入对苯二甲酸双(2-羟乙基)酯使终浓度为800μmol/L；加入IsPETaseKEA-cSP使终浓度为50nM；在35℃，50rpm条件下孵育3天。经HPLC检测所得反应液中TPA产量为360.0μmol/L，MHET产量为439.5μmol/L，见图5中的B。
实施例7
利用PET水解酶IsPETase-cSP突变酶IsPETaseKEA-cSP催化降解对苯二甲酸双(2-羟乙基)酯(BHET)
向pH值为8.0的80mM磷酸氢二钠-HCl缓冲液中加入对苯二甲酸双(2-羟乙基)酯使终浓度为1000μmol/L；加入IsPETaseKEA-cSP使终浓度为100nM；在40℃，150rpm条件下孵育2天。经HPLC检测所得反应液中TPA产量为303.8μmol/L，MHET产量为693.8μmol/L。
实施例8
利用PET水解酶IsPETase-cSP催化降解聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)
向pH值为9.0的50mM甘氨酸-NaOH缓冲液中加入聚对苯二甲酸乙二醇酯使终浓度为60mg/mL；加入IsPETase-cSP使终浓度为1000nM；在30℃，50rpm条件下孵育3天。经HPLC检测所得反应液中TPA产量为0.83mg/L，MHET产量为1.61mg/L，见图6中的A。
实施例9
利用PET水解酶IsPETase-cSP突变酶IsPETaseKEA-cSP催化降解聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)
向pH值为9.0的50mM甘氨酸-NaOH缓冲液中加入聚对苯二甲酸乙二醇酯使终浓度为60mg/mL；加入IsPETaseKEA-cSP使终浓度为1000nM；在30℃，50rpm条件下孵育3天。经HPLC检测所得反应液中TPA产量为3.03mg/L，见图6中的B。
实施例10
利用PET水解酶IsPETase-cSP突变酶IsPETaseKEA-cSP催化降解聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)
向pH值为8.5的50mM甘氨酸-NaOH缓冲液中加入聚对苯二甲酸乙二醇酯使终浓度为80mg/mL；加入IsPETaseKEA-cSP使终浓度为800nM；在40℃，100rpm条件下孵育2天。经HPLC检测所得反应液中TPA产量为2.79mg/L。
实施例11
利用PET水解酶IsPETase-cSP突变酶IsPETaseKEA-cSP催化降解聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)
向pH值为9.5的50mM甘氨酸-NaOH缓冲液中加入聚对苯二甲酸乙二醇酯使终浓度为100mg/mL；加入IsPETaseKEA-cSP使终浓度为500nM；在35℃，220rpm条件下孵育1天。经HPLC检测所得反应液中TPA产量为2.61mg/L。
所述HPLC的检测条件为：紫外检测器，240nm的特征吸收峰，ZORBAX Eclipse PlusC18反相色谱柱(5μl，250mm×4.6mm)，流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为乙腈，在20min内流动相由5％乙腈升至70％乙腈，柱温30℃，进样量10μL，流速0.8ml/min。
序列表
<110> 天津大学
<120> PET水解酶IsPETase-cSP突变酶及编码基因及工程菌
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 263
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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1 5 10 15
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<210> 2
<211> 789
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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Gln Thr Asn Pro Tyr Ala Arg Gly Pro Asn Pro Thr Ala Ala Ser Leu
1 5 10 15
Glu Ala Ser Ala Gly Pro Phe Thr Val Arg Ser Phe Thr Val Ser Arg
20 25 30
Pro Ser Gly Tyr Gly Ala Gly Thr Val Tyr Tyr Pro Thr Asn Ala Gly
35 40 45
Gly Thr Val Gly Ala Ile Ala Ile Val Pro Gly Tyr Thr Ala Arg Gln
50 55 60
Ser Ser Ile Lys Trp Trp Gly Pro Arg Leu Ala Ser His Gly Phe Val
65 70 75 80
Val Ile Thr Ile Asp Thr Asn Ser Thr Leu Asp Gln Pro Ser Ser Arg
85 90 95
Ser Ser Gln Gln Met Ala Ala Leu Arg Gln Val Ala Ser Leu Asn Gly
100 105 110
Thr Ser Ser Ser Pro Ile Tyr Gly Lys Val Asp Thr Ala Arg Met Gly
115 120 125
Val Met Gly Trp Ser Met Gly Gly Gly Gly Ser Leu Ile Ser Ala Ala
130 135 140
Asn Asn Pro Ser Leu Lys Ala Ala Ala Pro Gln Ala Pro Trp Asp Ser
145 150 155 160
Ser Thr Asn Phe Ser Ser Val Thr Val Pro Thr Leu Ile Phe Ala Cys
165 170 175
Glu Asn Asp Ser Ile Ala Pro Val Asn Ser Ser Ala Leu Pro Ile Tyr
180 185 190
Asp Ser Met Ser Arg Asn Ala Lys Gln Phe Leu Glu Ile Asn Gly Gly
195 200 205
Ser His Ser Cys Ala Asn Ser Gly Asn Ser Asn Gln Ala Leu Ile Gly
210 215 220
Lys Lys Gly Val Ala Trp Met Lys Arg Phe Met Asp Asn Asp Thr Arg
225 230 235 240
Tyr Ser Thr Phe Ala Cys Glu Asn Pro Asn Ser Thr Arg Val Ser Asp
245 250 255
Phe Arg Thr Ala Asn Cys Ser
260
<210> 4
<211> 789
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cagaccaacc cctacgcccg cggcccgaac ccgacagccg cctcactcga agccagcgcc 60
ggcccgttca ccgtgcgctc gttcaccgtg agccgcccga gcggctacgg cgccggcacc 120
gtgtactacc ccaccaacgc cggcggcacc gtgggcgcca tcgccatcgt gccgggctac 180
accgcgcgcc agtcgagcat caaatggtgg ggcccgcgcc tggcctcgca cggcttcgtg 240
gtcatcacca tcgacaccaa ctccacgctc gaccagccgt ccagccgctc gtcgcagcag 300
atggccgcgc tgcgccaggt ggcctcgctc aacggcacca gcagcagccc gatctacggc 360
aaggtcgaca ccgcccgcat gggcgtgatg ggctggtcga tgggcggtgg cggctcgctg 420
atctcggcgg ccaacaaccc gtcgctgaaa gccgcggcgc cgcaggcccc gtgggacagc 480
tcgaccaact tctcgtcggt caccgtgccc acgctgatct tcgcctgcga gaacgacagc 540
atcgccccgg tcaactcgtc cgccctgccg atctacgaca gcatgtcgcg caatgcgaag 600
cagttcctcg aaatcaacgg tggctcgcac tcctgcgcca acagcggcaa cagcaaccag 660
gcgctgatcg gcaagaaggg cgtggcctgg atgaagcgct tcatggacaa cgacacgcgc 720
tactccacct tcgcctgcga gaacccgaac agcacccgcg tgtcggactt ccgcaccgcg 780
aactgcagc 789
<210> 5
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cgaccagccg aaaagccgct cgtcgcagca gatgg 35
<210> 6
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cgagcggctt ttcggctggt cgagcgtgga gttggtg 37
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ccgcaggccc cgtgggagag ctcgaccaac 30
<210> 8
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ctcccacggg gcctgcggcg ccgcggcttt c 31
<210> 9
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gaacccgaac agcaccgccg tgtcggactt c 31
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gcggtgctgt tcgggttctc gcaggcgaag 30

Claims (8)

1.PET水解酶IsPETase-cSP突变酶，命名为IsPETaseKEA-cSP，其特征在于所述IsPETaseKEA-cSP的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.编码PET水解酶IsPETase-cSP突变酶的基因，其特征是所述基因的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。
3.含有权利要求2所述基因的重组质粒pET-22b-IsPETaseKEA-cSP。
4.含有权利要求3所述重组质粒的工程菌BL21(DE3)/pET-22b-IsPETaseKEA-cSP。
5.权利要求4的工程菌BL21(DE3)/pET-22b-IsPETaseKEA-cSP表达得到的IsPETaseKEA-cSP在水解BHET中的应用；所述BHET为对苯二甲酸双(2-羟乙基)酯的简写。
6.根据权利要求5所述应用，其特征是包括如下步骤：
向pH值为6.0～8.0的80mM磷酸氢二钠-HCl缓冲液中加入BHET使终浓度为800～1000μmol/L；加入IsPETaseKEA-cSP使终浓度为50～200nM；在30～40℃，50～220rpm条件下孵育1～3天。
7.权利要求4的工程菌BL21(DE3)/pET-22b-IsPETaseKEA-cSP表达得到的IsPETaseKEA-cSP在水解PET中的应用；PET为聚对苯二甲酸乙二醇酯的简写。
8.根据权利要求7所述应用，其特征是包括如下步骤：
向pH值为8.5～9.5的50mM甘氨酸-NaOH缓冲液中加入PET使终浓度为60～100mg/mL；加入IsPETaseKEA-cSP使终浓度为500～1000nM；在30～40℃，50～220rpm条件下孵育1～3天。
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