CN117535269A - 一种聚酯塑料水解酶及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种聚酯塑料水解酶及其应用。我们对本课题组前期分离到一株细菌Pse udomonas sp.JM16B3基因组中编码的一个酶基因jmPE14进行克隆、表达、纯化及酶学表征，发现该酶可以水解BHET[对苯二甲酸双(羟乙)酯]、PBAT(聚己二酸对苯二甲酸丁二醇酯)、PET(聚对苯二甲酸乙二醇酯)塑料瓶等，表明该酶在聚酯塑料的生物降解方面具有很好的应用潜力和研究价值。

Description

一种聚酯塑料水解酶及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种新型聚酯塑料水解酶jmPE14、其基因工程菌、以及其在聚酯塑料生物降解中的应用。

背景技术

塑料在工业、农业及日常生活各个方面发挥了重要作用。然而，废塑料是资源的极大浪费，同时也严重影响了全球生态系统和自然环境，对人类健康造成潜在威胁。建立废塑料绿色资源化利用路线，对具有重要意义。

微生物/酶催化塑料解聚是极具应用前景的废塑料绿色低碳回收策略，虽然目前的研究已取得了较大突破，但塑料降解微生物资源依然严重不足，降解效率仍相对较低，塑料解聚酶元件仍存在催化效率低、稳定性差、表达量低等问题，无法满足大规模塑料废弃物处理的需求。因此，挖掘更多塑料降解微生物和酶资源仍是目前的研究热点。

发明内容

本发明旨在提供一种聚酯塑料水解酶jmPE14及其应用。

本发明所述的聚酯塑料水解酶jmPE14，其特征在于：该聚酯塑料水解酶jmPE14的氨基酸序列如SEQ ID NO.1的第26-296位所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2的第76-888位所示。

具体的，所述聚酯塑料水解酶jmPE14来自于细菌Pseudomonas sp.JM16B3。包括296个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示(具体为MVFRVSVAKTFLLAASLVVSSYAVSAPS APCSNCTRGPAPTVASLKASSGPFSTAKFSVSGYLRGFGSSTVYYPTNTTGKMGAIAVIPGYLSYESSIEWWGPRLASHGFVVMTMNTNTIYDQPDSRADQLSSALDYLISQSNSRTSPLYNKIDSTRLGAIGWSMGGGGSLKLSTQRSINAIIPQAPWYSGYNTFNQITTPALILACESDVVAPVASHASPFYNRIPNSTPKAFLEINNGSHFCANSGYPDEALLGLYGISWMKRFIDFDTRYSQFLCGPNHTADYSISEYRQNCPY)，N端25个氨基酸为信号肽，成熟的jmPE14的理论分子量为29kD a。

进一步的，本发明所述的聚酯塑料水解酶jmPE14还涵盖在：所使用的蛋白为表现出聚酯水解酶活性的jmPE14的突变体，包括对该蛋白少量氨基酸的修改、插入或删除。

本发明还公开了一种包含上述聚酯塑料水解酶基因的重组载体pET32a-jmpe14。

本发明还公开了一种包含上述重组载体pET32a-jmpe14的重组大肠杆菌工程菌株BL21(DE3)/jmpe14。

本发明所述的聚酯塑料水解酶jmPE14是由重组大肠杆菌工程菌株BL21(DE3)/jmpe14发酵培养诱导表达、纯化回收获得。

本发明还提供聚酯塑料水解酶jmPE14在BHET、PBAT、PET塑料瓶等聚酯降解中的应用。

我们对本课题组前期分离到一株细菌Pseudomonas sp.JM16B3基因组中编码的一个酶基因jmPE14进行克隆、表达、纯化及酶学表征，发现该酶可以水解BHET[对苯二甲酸双(羟乙)酯]、PBAT(聚己二酸对苯二甲酸丁二醇酯)、PET(聚对苯二甲酸乙二醇酯)塑料瓶等，表明该酶在聚酯塑料的生物降解方面具有很好的应用潜力和研究价值。

附图说明

图1：SDS-PAGE分析纯化的jmPE14酶蛋白，其中，M为蛋白质分子量marker，1为纯化的带有S tag的jmPE14酶蛋白，分子量为50kD；

图2：HPLC分析jmPE14对BHET的水解活力，反应产物MHET和未反应完的BHET的峰已在图谱中标出；

图3：SEM观察jmPE14对PET塑料瓶的降解活力，其中，CK为反应体系不含jmPE14的对照组；

图4：HPLC分析jmPE14对PBAT的水解活力，反应产物BT的峰已在图谱中标出。

具体实施方式

下面是本发明具体的实施示例。需要指出的是，这些实施例仅仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。在本发明的思路和范围下对实施方案的细节和形式进行的修改和替换均落入本发明的保护范围内。

除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的实验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1：重组载体pET32a-jmpe14的构建

首先根据原始核苷酸序列(SEQ ID No.2的第76-888位，具体为GCTCCGTCCGCTCCCTGCTCGAATTGCACCCGCGGTCCGGCGCCGACCGTGGCTTCGCTGAAAGCGTCCAGCGGCCCCTTCAGCACGGCCAAGTTCAGTGTCTCCGGTTACCTGCGTGGGTTCGGTAGCAGCACCGTGTATTACCCGACCAACACCACCGGCAAGATGGGCGCCATTGCCGTCATTCCGGGCTATCTGTCCTACGAAAGCAGTATCGAGTGGTGGGGGCCGCGCCTGGCCTCCCACGGTTTCGTGGTCATGACCATGAACACCAACACCATCTACGACCAGCCGGACAGCCGGGCCGACCAGCTCAGCAGCGCGCTGGATTACCTGATCAGCCAGAGCAACTCACGCACCAGCCCGCTGTACAACAAGATCGACAGCACCCGTCTGGGGGCCATTGGCTGGTCGATGGGCGGCGGCGGATCGCTGAAGCTGTCCACCCAGCGTTCGATCAACGCCATCATCCCGCAGGCCCCCTGGTATTCCGGTTACAACACCTTCAACCAGATCACTACCCCGGCACTGATCCTCGCCTGTGAGTCCGACGTGGTTGCACCGGTGGCGTCCCACGCCTCGCCGTTCTACAACCGCATTCCCAACTCCACGCCCAAGGCCTTCCTGGAGATCAACAACGGTTCGCACTTCTGCGCCAACTCCGGTTACCCGGATGAAGCGCTGTTGGGGCTGTACGGTATTTCCTGGATGAAGCGCTTCATCGACTTCGATACCCGTTACAGCCAGTTCCTTTGCGGTCCCAATCACACTGCCGACTACAGCATCTCCGAATATCGGCAGAACTGCCCGTAT)以大肠杆菌表达宿主进行密码子优化，由金唯智公司合成经优化后的聚酯塑料水解酶编码基因(核苷酸序列如SEQ ID No.3，具体为GCCCCAAGTGCGCCGTGTAGTAATTGCACCCGCGGTCCGGCGCCGACCGTGGCGAGCCTGAAAGCGAGCAGCGGCCCGTTTAGCACCGCGAAATTTAGCGTGAGCGGCTATCTGCGCGGCTTTGGCAGCAGCACCGTGTATTATCCGACCAACACCACCGGCAAAATGGGTGCGATTGCGGTTATTCCGGGCTATCTGAGCTATGAAAGCAGCATTGAATGGTGGGGCCCGCGCCTGGCGAGTCATGGCTTTGTGGTGATGACCATGAACACCAACACCATTTATGATCAGCCGGATAGCCGCGCGGATCAGCTGAGCAGCGCGCTGGATTATCTGATTAGTCAGAGCAACAGCCGCACGAGCCCGCTGTATAACAAAATTGATAGCACCCGCCTGGGCGCGATTGGCTGGAGCATGGGCGGTGGCGGCAGCCTGAAACTGAGCACGCAGCGCAGCATTAACGCGATTATTCCGCAAGCGCCGTGGTATAGCGGCTATAACACCTTTAATCAGATTACCACCCCGGCGCTGATTCTGGCGTGCGAAAGCGATGTGGTGGCGCCGGTGGCGAGTCATGCGAGCCCGTTTTATAACCGCATTCCGAACAGCACCCCGAAAGCGTTTCTGGAAATTAACAACGGCAGCCATTTTTGCGCGAACAGCGGCTATCCGGATGAAGCGCTGCTGGGCCTGTATGGCATTAGCTGGATGAAACGCTTTATTGATTTTGATACCCGCTATAGTCAGTTTCTGTGCGGCCCGAACCATACCGCGGATTATAGCATTAGCGAATATCGTCAGAACTGCCCGTAT)，并克隆至pET32a载体，得到重组载体pET32a-jmpe14，将重组载体pET32a-jmpe14转化至克隆宿主E.coli DH5α，对得到的转化子测序验证是否为正确的基因克隆(与核苷酸序列SEQ ID No.3相同)，挑选测序正确的菌株，并提取重组质粒pET32a-jmpe14。

实施例2：大肠杆菌基因工程菌BL21(DE3)/jmpe14的构建

从E.coli DH5α提取质粒pET32a-jmpe14，并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，涂布于含有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB平板，37℃培养过夜，挑取单菌落进行测序验证，测序验证正确的为含有聚酯塑料水解酶jmPE14的基因工程菌BL21(DE3)/jmpe14。

实施例3：jmPE14酶蛋白的制备

基因工程菌BL21(DE3)/jmpe14接种至含有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB液体培养基中，37℃180rpm震荡培养至OD₆₀₀为0.6-0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG，于16℃震荡培养20h。8000g离心10min收集菌体，用50mM pH8.0的Tris-HCl缓冲液洗涤菌体3次，重悬菌体并超声破碎，于4℃12000g离心去除沉淀，上清即为粗酶液。粗酶液用孔径0.22μm水系膜过滤后，用Ni²⁺亲和层析柱进行蛋白纯化，用咪唑梯度洗脱，收集洗脱液，然后用10kDa的超滤管置换为50mM pH8.0的Tris-HCl缓冲液，并进行浓缩。利用SDS-PAGE检验蛋白的纯度，利用Bradford试剂盒测定蛋白浓度。SDS-PAGE结果如图1所示，由此得到聚酯塑料水解酶jmPE14。

实施例4：jmPE14在BHET降解中的应用

反应体系包含0.01g BHET，50mM Tris-HCl(pH 8.0)，0.2mg/mL聚酯塑料水解酶jmPE14，于30℃1000rpm震荡孵育48h。对照组不含jmPE14。反应结束后，12000g离心10min，取50μL上清，加50μL甲醇(含10％甲酸)，混合后用0.2μm滤膜过滤。

利用HPLC检测反应产物，色谱柱为C18反相色谱柱，柱温箱25℃，流动相A为纯水，流动相B为甲醇，流动相C为1％乙酸，流速为1mL/min，进样量为20μL。液相程序为：0-15min，流动相C为10％，流动相B从60％到55％线性改变；15-16min，流动相C为10％，流动相B为60％。

结果如图2所示，jmPE14可以将BHET水解为MHET(单羟乙基对苯二甲酸乙二醇酯)。

实施例5：jmPE14在PET塑料瓶降解中的应用

废弃的PET塑料瓶用打孔器打出直径6mm圆片，分别用乙醇和水超声清洗30min，晾干。将圆片置于2mL离心管中，加入500μL浓度为0.2mg/mL的jmPE14酶液，对照组为不含jmPE14的50mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液，于30℃金属浴孵育2周。反应结束后，取出塑料圆片，于水中超声清洗后，利用扫描电镜观察表面结构变化。

结果如图3所示，jmPE14对PET塑料瓶具有明显的降解作用。

实施例6：jmPE14在PBAT降解中的应用

反应体系包含0.01g PBAT，50mM Tris-HCl(pH 8.0)，0.2mg/mL聚酯塑料水解酶jmP E14，于30℃、1000rpm震荡孵育48h。对照组不含jmPE14。反应结束后，12000g离心10min，取150μL上清，加150μL甲醇、6.5μL HCl(6N)，混合后用0.2μm滤膜过滤。

利用HPLC检测反应产物，色谱柱为C18反相色谱柱，柱温箱25℃，流动相A为1mMH2SO4，流动相B为甲醇，流速为1mL/min，进样量为20μL。液相程序为：0-15min，甲醇30％；15-45min，甲醇30％-90％线性增加；46-60min，100％甲醇。

结果如图4所示，jmPE14可以将PBAT水解为单体BT[对苯二甲酸单(4-羟基丁基)酯]。

SEQ ID NO.1

MVFRVSVAKTFLLAASLVVSSYAVSAPSAPCSNCTRGPAPTVASLKASSGPFSTAKFSVSGYL

RGFGSSTVYYPTNTTGKMGAIAVIPGYLSYESSIEWWGPRLASHGFVVMTMNTNTIYDQPD

SRADQLSSALDYLISQSNSRTSPLYNKIDSTRLGAIGWSMGGGGSLKLSTQRSINAIIPQAPW

YSGYNTFNQITTPALILACESDVVAPVASHASPFYNRIPNSTPKAFLEINNGSHFCANSGYPD

EALLGLYGISWMKRFIDFDTRYSQFLCGPNHTADYSISEYRQNCPYSEQ ID NO.2

ATGGTTTTCAGAGTCTCAGTTGCCAAGACGTTCCTGTTGGCCGCCTCACTGGTGGTCAG

CTCCTATGCGGTGTCGGCTCCGTCCGCTCCCTGCTCGAATTGCACCCGCGGTCCGGCGCC

GACCGTGGCTTCGCTGAAAGCGTCCAGCGGCCCCTTCAGCACGGCCAAGTTCAGTGTC

TCCGGTTACCTGCGTGGGTTCGGTAGCAGCACCGTGTATTACCCGACCAACACCACCGG

CAAGATGGGCGCCATTGCCGTCATTCCGGGCTATCTGTCCTACGAAAGCAGTATCGAGTG

GTGGGGGCCGCGCCTGGCCTCCCACGGTTTCGTGGTCATGACCATGAACACCAACACCA

TCTACGACCAGCCGGACAGCCGGGCCGACCAGCTCAGCAGCGCGCTGGATTACCTGATC

AGCCAGAGCAACTCACGCACCAGCCCGCTGTACAACAAGATCGACAGCACCCGTCTGG

GGGCCATTGGCTGGTCGATGGGCGGCGGCGGATCGCTGAAGCTGTCCACCCAGCGTTCG

ATCAACGCCATCATCCCGCAGGCCCCCTGGTATTCCGGTTACAACACCTTCAACCAGATC

ACTACCCCGGCACTGATCCTCGCCTGTGAGTCCGACGTGGTTGCACCGGTGGCGTCCCA

CGCCTCGCCGTTCTACAACCGCATTCCCAACTCCACGCCCAAGGCCTTCCTGGAGATCA

ACAACGGTTCGCACTTCTGCGCCAACTCCGGTTACCCGGATGAAGCGCTGTTGGGGCTG

TACGGTATTTCCTGGATGAAGCGCTTCATCGACTTCGATACCCGTTACAGCCAGTTCCTTT

GCGGTCCCAATCACACTGCCGACTACAGCATCTCCGAATATCGGCAGAACTGCCCGTATT

GASEQ ID NO.3

GCCCCAAGTGCGCCGTGTAGTAATTGCACCCGCGGTCCGGCGCCGACCGTGGCGAGCCTGAAAGCGAGCAGCGGCCCGTTTAGCACCGCGAAATTTAGCGTGAGCGGCTATCTGCGCGGCTTTGGCAGCAGCACCGTGTATTATCCGACCAACACCACCGGCAAAATGGGTGCGATTGCGGTTATTCCGGGCTATCTGAGCTATGAAAGCAGCATTGAATGGTGGGGCCCGCGCCTGGCGAGTCATGGCTTTGTGGTGATGACCATGAACACCAACACCATTTATGATCAGCCGGATAGCCGCGCGGATCAGCTGAGCAGCGCGCTGGATTATCTGATTAGTCAGAGCAACAGCCGCACGAGCCCGCTGTATAACAAAATTGATAGCACCCGCCTGGGCGCGATTGGCTGGAGCATGGGCGGTGGCGGCAGCCTGAAACTGAGCACGCAGCGCAGCATTAACGCGATTATTCCGCAAGCGCCGTGGTATAGCGGCTATAACACCTTTAATCAGATT

ACCACCCCGGCGCTGATTCTGGCGTGCGAAAGCGATGTGGTGGCGCCGGTGGCGAGT

CATGCGAGCCCGTTTTATAACCGCATTCCGAACAGCACCCCGAAAGCGTTTCTGGAAA

TTAACAACGGCAGCCATTTTTGCGCGAACAGCGGCTATCCGGATGAAGCGCTGCTGGG

CCTGTATGGCATTAGCTGGATGAAACGCTTTATTGATTTTGATACCCGCTATAGTCAGTT

TCTGTGCGGCCCGAACCATACCGCGGATTATAGCATTAGCGAATATCGTCAGAACTGCC

CGTAT。

Claims (8)

1.聚酯塑料水解酶jmPE14，其特征在于：该聚酯塑料水解酶jmPE14的氨基酸序列如SEQID NO.1的第26-296位所示，或对其进行少量氨基酸的修改、插入或删除。

2.编码权利要求1所述的聚酯塑料水解酶jmPE14的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2的第76-888位所示。

4.一种包含权利要求2或3所述的聚酯塑料水解酶基因的重组载体pET32a-jmpe14。

5.一种包含权利要求4所述的重组载体pET32a-jmpe14的重组工程菌株。

6.根据权利要求5所述的工程菌株，其特征在于，所述的重组工程菌株为大肠杆菌工程菌株BL21(DE3)/jmpe14。

7.权利要求1所述的聚酯塑料水解酶jmPE14在降解聚酯塑料中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的聚酯塑料是BHET、PBAT或PET。