JP3040189B2 - タンパクの抽出方法 - Google Patents
タンパクの抽出方法Info
- Publication number
- JP3040189B2 JP3040189B2 JP8536391A JP8536391A JP3040189B2 JP 3040189 B2 JP3040189 B2 JP 3040189B2 JP 8536391 A JP8536391 A JP 8536391A JP 8536391 A JP8536391 A JP 8536391A JP 3040189 B2 JP3040189 B2 JP 3040189B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- protein
- buffer
- escherichia coli
- extraction
- corex
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、大腸菌によって産生さ
れたヒトＣ型肝炎ウィルスコア抗原タンパクまたはその
コア抗原領域を含むタンパクの抽出方法に関する。さら
に詳しくは、タンパクの抽出に用いる変性剤を含んだ緩
衝液に関する。
れたヒトＣ型肝炎ウィルスコア抗原タンパクまたはその
コア抗原領域を含むタンパクの抽出方法に関する。さら
に詳しくは、タンパクの抽出に用いる変性剤を含んだ緩
衝液に関する。
【０００２】
【従来の技術】ヒトＣ型肝炎は、ヒトＣ型肝炎ウィルス
によって引き起こされる肝炎であり、輸血後の非Ａ非Ｂ
型肝炎のほとんどは、この肝炎であると言われている。
によって引き起こされる肝炎であり、輸血後の非Ａ非Ｂ
型肝炎のほとんどは、この肝炎であると言われている。
【０００３】そして、その多くは更に肝ガンへと病状が
進行する。ヒトＣ型肝炎ウィルスは、遺伝子の長さ約１
０Ｋｂ（約１万ヌクレオチド）のＲＮＡウィルスとさ
れ、フラビウィルスとの類似性から５′末端から約１．
５Ｋｂの部分が構造タンパク遺伝子部分に相当し、残り
が非構造タンパク遺伝子部分に相当すると考えられてい
る。
進行する。ヒトＣ型肝炎ウィルスは、遺伝子の長さ約１
０Ｋｂ（約１万ヌクレオチド）のＲＮＡウィルスとさ
れ、フラビウィルスとの類似性から５′末端から約１．
５Ｋｂの部分が構造タンパク遺伝子部分に相当し、残り
が非構造タンパク遺伝子部分に相当すると考えられてい
る。
【０００４】又、約１．５Ｋｂの構造タンパク遺伝子部
分は、コア抗原遺伝子部分、膜タンパク遺伝子部分、外
皮タンパク遺伝子部分に機能的に分かれているものと考
えられている。
分は、コア抗原遺伝子部分、膜タンパク遺伝子部分、外
皮タンパク遺伝子部分に機能的に分かれているものと考
えられている。
【０００５】Ｃ型肝炎ウィルスの遺伝子の非構造タンパ
ク遺伝子領域および構造タンパク遺伝子領域について、
前者はカイロン社によるヨーロッパ特許（ＥＰＯ３１８
２１６）での報告があり、後者はカイロン社によるヨー
ロッパ特許（ＥＰＯ３８８２３２）での報告および下遠
野らの平成２年７月３日日本ガン学会における口頭発表
による報告等がある。
ク遺伝子領域および構造タンパク遺伝子領域について、
前者はカイロン社によるヨーロッパ特許（ＥＰＯ３１８
２１６）での報告があり、後者はカイロン社によるヨー
ロッパ特許（ＥＰＯ３８８２３２）での報告および下遠
野らの平成２年７月３日日本ガン学会における口頭発表
による報告等がある。
【０００６】その後の国内外の研究により、ヒトＣ型肝
炎ウィルス遺伝子の構造タンパク遺伝子領域のうちのコ
ア抗原遺伝子部分でコードされるタンパク（コア抗原）
は、その他の抗原性を有する領域（Ｃ−１００抗原等）
よりも抗原性が強く、特異性も高く、且つヒトＣ型肝炎
ウィルス感染の初期診断が可能であるタンパクであるこ
とが明らかにされた。（Muraiso.K, Hijikata.M, Shimo
tono.K et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 17
2,(2), 511-16(1990)）
炎ウィルス遺伝子の構造タンパク遺伝子領域のうちのコ
ア抗原遺伝子部分でコードされるタンパク（コア抗原）
は、その他の抗原性を有する領域（Ｃ−１００抗原等）
よりも抗原性が強く、特異性も高く、且つヒトＣ型肝炎
ウィルス感染の初期診断が可能であるタンパクであるこ
とが明らかにされた。（Muraiso.K, Hijikata.M, Shimo
tono.K et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 17
2,(2), 511-16(1990)）
【０００７】近年、輸血後非Ａ非Ｂ型肝炎患者の血液中
に存在する抗体を検出する診断薬に使用できるタンパク
試料として、又、ヒトＣ型肝炎ウィルスに関する分子生
物学的、免疫学的研究に使用できるタンパク試料とし
て、高度に純化したタンパク試料の供給が強く望まれて
いる。
に存在する抗体を検出する診断薬に使用できるタンパク
試料として、又、ヒトＣ型肝炎ウィルスに関する分子生
物学的、免疫学的研究に使用できるタンパク試料とし
て、高度に純化したタンパク試料の供給が強く望まれて
いる。
【０００８】そのためには、ヒトＣ型肝炎ウィルスコア
抗原およびその領域を含むタンパクを大腸菌および酵母
等で大量産生させる製造方法と産生された該タンパクを
産生細胞から抽出する方法、および得られた抽出物から
該タンパクを純化する精製方法とを確立することが必要
である。
抗原およびその領域を含むタンパクを大腸菌および酵母
等で大量産生させる製造方法と産生された該タンパクを
産生細胞から抽出する方法、および得られた抽出物から
該タンパクを純化する精製方法とを確立することが必要
である。
【０００９】大腸菌で産生されたヒトＣ型肝炎ウィルス
のコア抗原タンパクまたはそのコア抗原領域を含むタン
パクを大腸菌から抽出する方法および抽出物から該タン
パクを純化する精製方法については現在まで報告がない
が、大腸菌で産生されたタンパクを抽出し、精製した他
のタンパクの例は数多くなされている。
のコア抗原タンパクまたはそのコア抗原領域を含むタン
パクを大腸菌から抽出する方法および抽出物から該タン
パクを純化する精製方法については現在まで報告がない
が、大腸菌で産生されたタンパクを抽出し、精製した他
のタンパクの例は数多くなされている。
【００１０】大腸菌で産生された可溶性タンパクは、一
般に菌を集菌後、変性剤および界面活性剤を含んでいな
い通常の緩衝液でタンパクを抽出し、続いて、イオン交
換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、
アフィニティークロマトグラフィー、硫酸アンモニウム
沈殿（分画）等の精製手段を用いて精製される。
般に菌を集菌後、変性剤および界面活性剤を含んでいな
い通常の緩衝液でタンパクを抽出し、続いて、イオン交
換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、
アフィニティークロマトグラフィー、硫酸アンモニウム
沈殿（分画）等の精製手段を用いて精製される。
【００１１】又、大腸菌で産生された不溶性又は難溶性
タンパクの精製法としては、菌を集菌後内容物を変性剤
又は界面活性剤を含んだ緩衝液で抽出した後、該抽出物
に対して、ポリアクリルアミド電気泳動を行ない、目的
のタンパク部分のゲルを切り出し、ゲルから電気泳動的
にタンパクを抽出する方法、および菌を集菌後、変性剤
又は界面活性剤を含んだ緩衝液で、内容物を抽出し同緩
衝液存在下で、ゲル濾過、イオン変換クロマトグラフィ
ーを行なった例が報告されている。
タンパクの精製法としては、菌を集菌後内容物を変性剤
又は界面活性剤を含んだ緩衝液で抽出した後、該抽出物
に対して、ポリアクリルアミド電気泳動を行ない、目的
のタンパク部分のゲルを切り出し、ゲルから電気泳動的
にタンパクを抽出する方法、および菌を集菌後、変性剤
又は界面活性剤を含んだ緩衝液で、内容物を抽出し同緩
衝液存在下で、ゲル濾過、イオン変換クロマトグラフィ
ーを行なった例が報告されている。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは大腸菌で
産生されるヒトＣ型肝炎ウィルスのコア抗原タンパクま
たはそのコア抗原領域を含むタンパク（以下、Ｃ−タン
パクともいう）の抽出方法について検討した結果、Ｃ−
タンパクは該タンパクのコア抗原領域の性質から水に難
溶性であり、変性剤非存在下あるいは界面活性剤非存在
下での抽出では効率よく抽出できないことを見い出し、
又、界面活性剤存在下での抽出法は、抽出はできるもの
の、該抽出物を使用すると、後に続く精製工程を進める
ことが容易でないことがわかった。
産生されるヒトＣ型肝炎ウィルスのコア抗原タンパクま
たはそのコア抗原領域を含むタンパク（以下、Ｃ−タン
パクともいう）の抽出方法について検討した結果、Ｃ−
タンパクは該タンパクのコア抗原領域の性質から水に難
溶性であり、変性剤非存在下あるいは界面活性剤非存在
下での抽出では効率よく抽出できないことを見い出し、
又、界面活性剤存在下での抽出法は、抽出はできるもの
の、該抽出物を使用すると、後に続く精製工程を進める
ことが容易でないことがわかった。
【００１３】さらに、Ｃ−タンパクの変性剤存在下での
抽出を検討した結果、変性剤存在下での抽出において
も、抽出時に使用する緩衝液中に添加する変性剤の種類
および濃度で、抽出中にＣ−タンパクが大腸菌内のプロ
テアーゼにより分解される場合があることが判明した。
抽出を検討した結果、変性剤存在下での抽出において
も、抽出時に使用する緩衝液中に添加する変性剤の種類
および濃度で、抽出中にＣ−タンパクが大腸菌内のプロ
テアーゼにより分解される場合があることが判明した。
【００１４】そこで、本発明者らは、大腸菌で産生され
たＣ−タンパクをいかなる変性剤を含んだ緩衝液で大腸
菌から抽出すれば、効率よく、且つＣ−タンパクが大腸
菌内のプロテアーゼに分解されずに済むか等について、
鋭意研究した結果、大腸菌によって産生されたＣ−タン
パクを２−メルカプトエタノール及びグアニジン塩酸を
含有する緩衝液存在下で大腸菌から抽出することで、上
記問題点を解決できることを見い出し、本発明を完成す
るに至った。
たＣ−タンパクをいかなる変性剤を含んだ緩衝液で大腸
菌から抽出すれば、効率よく、且つＣ−タンパクが大腸
菌内のプロテアーゼに分解されずに済むか等について、
鋭意研究した結果、大腸菌によって産生されたＣ−タン
パクを２−メルカプトエタノール及びグアニジン塩酸を
含有する緩衝液存在下で大腸菌から抽出することで、上
記問題点を解決できることを見い出し、本発明を完成す
るに至った。
【００１５】
【課題を解決するための手段】本発明は、大腸菌によっ
て産生されたヒトＣ型肝炎ウィルスコア抗原タンパクま
たはそのコア抗原領域を含むタンパクを２−メルカプト
エタノール及びグアニジン塩酸を含有する緩衝液で抽出
することを特徴とする抽出方法である。
て産生されたヒトＣ型肝炎ウィルスコア抗原タンパクま
たはそのコア抗原領域を含むタンパクを２−メルカプト
エタノール及びグアニジン塩酸を含有する緩衝液で抽出
することを特徴とする抽出方法である。
【００１６】本発明においてヒトＣ型肝炎ウィルスコア
抗原タンパクとは、ヒトＣ型肝炎ウィルス遺伝子の構造
タンパク遺伝子領域のうちコア抗原遺伝子部分でコード
されるタンパクであり、少なくともヒトＣ型肝炎ウィル
ス遺伝子の開始コドンの最初の塩基（アデニン）から始
まる３６０個の塩基がコードするタンパクを指す。例え
ば開始コドンから始まる４８２塩基のＤＮＡ塩基配列が
コードする１６１個のアミノ酸をヒトＣ型肝炎ウィルス
由来タンパクとして含むタンパクが例示される。
抗原タンパクとは、ヒトＣ型肝炎ウィルス遺伝子の構造
タンパク遺伝子領域のうちコア抗原遺伝子部分でコード
されるタンパクであり、少なくともヒトＣ型肝炎ウィル
ス遺伝子の開始コドンの最初の塩基（アデニン）から始
まる３６０個の塩基がコードするタンパクを指す。例え
ば開始コドンから始まる４８２塩基のＤＮＡ塩基配列が
コードする１６１個のアミノ酸をヒトＣ型肝炎ウィルス
由来タンパクとして含むタンパクが例示される。
【００１７】本発明のタンパクは、上記コア抗原遺伝子
部分でコードされるタンパクの端部が不可避的に切断さ
れている場合、或いは付加的に例えばベクター由来のペ
プチドが連結されている場合も含む。
部分でコードされるタンパクの端部が不可避的に切断さ
れている場合、或いは付加的に例えばベクター由来のペ
プチドが連結されている場合も含む。
【００１８】本発明において使用されるＣ−タンパクを
産生するための大腸菌は、特に制限されるものではな
い。
産生するための大腸菌は、特に制限されるものではな
い。
【００１９】大腸菌でのＣ−タンパクの産生方法は、ヒ
トＣ型肝炎ウィルスコア抗原をコードする遺伝子を大腸
菌で遺伝子発現が可能なベクターに組込んで、組換えベ
クターを得、該組換えベクターで大腸菌を形質転換され
た大腸菌を使用して、Ｃ−タンパクを産生する方法であ
る。
トＣ型肝炎ウィルスコア抗原をコードする遺伝子を大腸
菌で遺伝子発現が可能なベクターに組込んで、組換えベ
クターを得、該組換えベクターで大腸菌を形質転換され
た大腸菌を使用して、Ｃ−タンパクを産生する方法であ
る。
【００２０】ヒトＣ型肝炎ウィルスのコア抗原領域を含
むタンパクを大腸菌で産生させる方法の具体例として
は、ヒトＣ型肝炎ウィルスコア抗原をコードする遺伝子
断片をベクターｐＥＴ−３ｄに挿入して得た組換えベク
ターｐＫＭＲ３を用いて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を
形質変換させ、該形質転換体をラクトースを含まない栄
養培地で培養後、ＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクト
シド）を添加して、引き続き培養することで産生させる
方法（Muraiso.K, Hijikata.M, Shimotono.K etal., Bi
ochem. Biophys. Res. Commun., 172,(2), 511-16(199
0)）が挙げられる。
むタンパクを大腸菌で産生させる方法の具体例として
は、ヒトＣ型肝炎ウィルスコア抗原をコードする遺伝子
断片をベクターｐＥＴ−３ｄに挿入して得た組換えベク
ターｐＫＭＲ３を用いて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を
形質変換させ、該形質転換体をラクトースを含まない栄
養培地で培養後、ＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクト
シド）を添加して、引き続き培養することで産生させる
方法（Muraiso.K, Hijikata.M, Shimotono.K etal., Bi
ochem. Biophys. Res. Commun., 172,(2), 511-16(199
0)）が挙げられる。
【００２１】上記の方法で得られたＣ−タンパクを産生
させた大腸菌を遠心分離することで、大腸菌ペレットを
得る。そして、該大腸菌ペレットを２−メルカプトエタ
ノール及びグアニジン塩酸を含有する緩衝液に懸濁す
る。
させた大腸菌を遠心分離することで、大腸菌ペレットを
得る。そして、該大腸菌ペレットを２−メルカプトエタ
ノール及びグアニジン塩酸を含有する緩衝液に懸濁す
る。
【００２２】本発明においては２−メルカプトエタノー
ル及びグアニジン塩酸を含有する緩衝液を用いて抽出す
ることが必須である。他の成分からなる緩衝液を用いた
場合は抽出効率が悪かったり、大腸菌内のプロテアーゼ
による分解を受けて得られるＣ−タンパクの量が低下す
る。
ル及びグアニジン塩酸を含有する緩衝液を用いて抽出す
ることが必須である。他の成分からなる緩衝液を用いた
場合は抽出効率が悪かったり、大腸菌内のプロテアーゼ
による分解を受けて得られるＣ−タンパクの量が低下す
る。
【００２３】該緩衝液中に含有される２−メルカプトエ
タノールの濃度は、１ｍＭ〜１００ｍＭの範囲であれば
いかなる濃度でも良いが、４０ｍＭ〜６０ｍＭが好適で
ある。
タノールの濃度は、１ｍＭ〜１００ｍＭの範囲であれば
いかなる濃度でも良いが、４０ｍＭ〜６０ｍＭが好適で
ある。
【００２４】又、グアニジン塩酸の濃度は、１Ｍ〜８Ｍ
の範囲であればいかなる濃度でも適用できるが、５Ｍ〜
６Ｍが好適である。
の範囲であればいかなる濃度でも適用できるが、５Ｍ〜
６Ｍが好適である。
【００２５】該緩衝液のｐＨは、５〜９の範囲であれば
いかなるｐＨでも適用できるが、６〜８が好適である。
いかなるｐＨでも適用できるが、６〜８が好適である。
【００２６】該緩衝液は、上記のｐＨで緩衝作用を示す
ものなら何んら制限されず、例示すれば、リン酸緩衝
液、トリス−塩酸緩衝液等が好適に使用される。
ものなら何んら制限されず、例示すれば、リン酸緩衝
液、トリス−塩酸緩衝液等が好適に使用される。
【００２７】又、該緩衝液の濃度は５ｍＭ〜１００ｍＭ
の範囲で適用できるが、１０ｍＭ〜５０ｍＭが好適であ
る。
の範囲で適用できるが、１０ｍＭ〜５０ｍＭが好適であ
る。
【００２８】次に、細胞懸濁液に対して、ダイノミル細
胞破砕機、超音波破砕装置等を使用し、細胞の破砕を行
ない、該破砕物を遠心分離し、その上清を得ることで、
Ｃ−タンパクを抽出する。
胞破砕機、超音波破砕装置等を使用し、細胞の破砕を行
ない、該破砕物を遠心分離し、その上清を得ることで、
Ｃ−タンパクを抽出する。
【００２９】
【発明の効果】本抽出方法は、大腸菌で産生されたヒト
Ｃ型肝炎ウィルスコア抗原タンパクまたはそのコア抗原
領域を含むタンパクを大腸菌から高収率で且つ、大腸菌
内のプロテアーゼによる分解を受けずに抽出できる方法
である。該タンパクは、抽出液中に安定に保持される。
Ｃ型肝炎ウィルスコア抗原タンパクまたはそのコア抗原
領域を含むタンパクを大腸菌から高収率で且つ、大腸菌
内のプロテアーゼによる分解を受けずに抽出できる方法
である。該タンパクは、抽出液中に安定に保持される。
【００３０】
【実施例】以下、実施例をあげて説明するが、本発明は
これに限定されるものではない。
これに限定されるものではない。
【００３１】実施例１ ヒトＣ型肝炎ウィルスコア抗原領域を含む組換えタンパ
ク（分子量２３Ｋｄ；以下、COREX タンパクと略す）を
産生する大腸菌ＨＣＶＫＭＲ３からのCOREX タンパクの
抽出。
ク（分子量２３Ｋｄ；以下、COREX タンパクと略す）を
産生する大腸菌ＨＣＶＫＭＲ３からのCOREX タンパクの
抽出。
【００３２】プラスミドｐＫＭＲ３で形質転換されたＢ
Ｌ２１（ＤＥ３）大腸菌ＨＣＶＫＭＲ３（微工研菌寄
第１１５６９号；ＦＥＲＭ Ｐ−１１５６９）を２０リ
ットルのＭ９ＺＢ培地（ＮＨ4 Ｃｌ ０．３％，ＫＨ2
ＰＯ4 ０．３％，Ｎａ2 ＨＰＯ4 ０．６％，ＮａＣ
ｌ ０．５％，ＭｇＳＯ4 １ｍＭ，バクトトリプトン
１％，グルコース ０．１％，アンピシリン ５０μｇ
／ｍｌ）で培養し、ＯＤ600が０．４となった時点で、
ＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトシド）を最終濃度
が０．４ｍＭになるように添加し、引続き、３７℃で２
時間培養することで、COREX タンパクを生産させた。
Ｌ２１（ＤＥ３）大腸菌ＨＣＶＫＭＲ３（微工研菌寄
第１１５６９号；ＦＥＲＭ Ｐ−１１５６９）を２０リ
ットルのＭ９ＺＢ培地（ＮＨ4 Ｃｌ ０．３％，ＫＨ2
ＰＯ4 ０．３％，Ｎａ2 ＨＰＯ4 ０．６％，ＮａＣ
ｌ ０．５％，ＭｇＳＯ4 １ｍＭ，バクトトリプトン
１％，グルコース ０．１％，アンピシリン ５０μｇ
／ｍｌ）で培養し、ＯＤ600が０．４となった時点で、
ＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトシド）を最終濃度
が０．４ｍＭになるように添加し、引続き、３７℃で２
時間培養することで、COREX タンパクを生産させた。
【００３３】その後、細胞を８０００ｒｐｍ，４℃で連
続遠心し、ペレットを凍結することにより保存用に回収
した。湿潤重量は、２０ｇであった。次に湿潤重量５ｇ
の凍結ＨＣＶＫＭＲ３ペレットを解凍し、ペレット１ｇ
につき、抽出用緩衝液４ｍｌの比率で懸濁した。
続遠心し、ペレットを凍結することにより保存用に回収
した。湿潤重量は、２０ｇであった。次に湿潤重量５ｇ
の凍結ＨＣＶＫＭＲ３ペレットを解凍し、ペレット１ｇ
につき、抽出用緩衝液４ｍｌの比率で懸濁した。
【００３４】抽出用緩衝液の組成は、３Ｍグアニジン塩
酸、４０ｍＭ ２−メルカプトエタノール，ｐＨ７．０
の１０ｍＭリン酸緩衝液とした。
酸、４０ｍＭ ２−メルカプトエタノール，ｐＨ７．０
の１０ｍＭリン酸緩衝液とした。
【００３５】該懸濁物を超音波処理によりCOREX タンパ
クを抽出し、遠心分離（１５０００ｒｐｍ，３０ｍｉ
ｎ，４℃）し、上清（１９ｍｌ）を得た。
クを抽出し、遠心分離（１５０００ｒｐｍ，３０ｍｉ
ｎ，４℃）し、上清（１９ｍｌ）を得た。
【００３６】上清の全タンパク量は、１８６０ｍｇであ
った。図１にCOREX タンパクの抽出効率をＳＤＳポリア
クリルアミドゲル電気泳動で調べた結果を示す。
った。図１にCOREX タンパクの抽出効率をＳＤＳポリア
クリルアミドゲル電気泳動で調べた結果を示す。
【００３７】Ｌａｎｅ１は、COREX タンパクを産生して
いる大腸菌ペレットをグアニジン塩酸を含有した緩衝液
に懸濁、続いて超音波処理した処理液を遠心分離し、得
た上清。 Ｌａｎｅ２は、上記処理液を遠心分離し、得た沈殿。 Ｌａｎｅ３は、COREX タンパク精製標品。 上記の結果より、COREX タンパクがほぼ１００％の効率
で抽出されることがわかった。
いる大腸菌ペレットをグアニジン塩酸を含有した緩衝液
に懸濁、続いて超音波処理した処理液を遠心分離し、得
た上清。 Ｌａｎｅ２は、上記処理液を遠心分離し、得た沈殿。 Ｌａｎｅ３は、COREX タンパク精製標品。 上記の結果より、COREX タンパクがほぼ１００％の効率
で抽出されることがわかった。
【００３８】実施例２ 実施例１で得られた凍結ＨＣＶＫＭＲ３ペレットを解凍
し、ペレット１ｇにつき、表１に示す組成の各々の緩衝
液４ｍｌの割合でそれぞれ懸濁し、該懸濁物を超音波処
理後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ，４℃，３０ｍｉ
ｎ）し、上清４ｍｌと沈殿物を得た。
し、ペレット１ｇにつき、表１に示す組成の各々の緩衝
液４ｍｌの割合でそれぞれ懸濁し、該懸濁物を超音波処
理後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ，４℃，３０ｍｉ
ｎ）し、上清４ｍｌと沈殿物を得た。
【００３９】
【表１】
【００４０】得られた沈殿物および上清をそれぞれ別々
にＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動し、ゲルをク
ーマシー染色した後、脱色した。脱色したゲルをデンシ
ドメトリーで分析することで、電気泳動したゲル上のCO
REX タンパクのバンドの濃さを上清と沈殿とで比較し、
上清に抽出された割合を抽出効率として求め、それぞれ
表２に示した。
にＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動し、ゲルをク
ーマシー染色した後、脱色した。脱色したゲルをデンシ
ドメトリーで分析することで、電気泳動したゲル上のCO
REX タンパクのバンドの濃さを上清と沈殿とで比較し、
上清に抽出された割合を抽出効率として求め、それぞれ
表２に示した。
【００４１】又、上清を電気泳動したゲル上のCOREX タ
ンパクのバンドの濃さを表１の１〜５の緩衝液間で比較
した。表１の緩衝液５を使用して得られた上清のCOREX
タンパクのバンドの濃さを１００％とし、表１の緩衝液
１〜４を用いて、抽出して得られた上清のCOREX タンパ
クのバンドの濃さをCOREX タンパク相対量として表わし
た。（表２）
ンパクのバンドの濃さを表１の１〜５の緩衝液間で比較
した。表１の緩衝液５を使用して得られた上清のCOREX
タンパクのバンドの濃さを１００％とし、表１の緩衝液
１〜４を用いて、抽出して得られた上清のCOREX タンパ
クのバンドの濃さをCOREX タンパク相対量として表わし
た。（表２）
【００４２】
【表２】
【００４３】表１の１，２で示されている変性剤を含有
しない緩衝液を使用した場合、表２に示す通り、抽出効
率が低い。
しない緩衝液を使用した場合、表２に示す通り、抽出効
率が低い。
【００４４】又、表１の緩衝液３、緩衝液４を使用した
場合、抽出効率は１００％であるが、緩衝液５で抽出し
た時のCOREX タンパク量を１００％とした場合、COREX
タンパク相対量はそれぞれ３０％，６０％と少ない。
場合、抽出効率は１００％であるが、緩衝液５で抽出し
た時のCOREX タンパク量を１００％とした場合、COREX
タンパク相対量はそれぞれ３０％，６０％と少ない。
【００４５】これは、抽出操作時に大腸菌内のプロテア
ーゼによりCOREXタンパクが分解されていることが原因
と考えられる。
ーゼによりCOREXタンパクが分解されていることが原因
と考えられる。
【００４６】次に、表１の１〜５の緩衝液を用いて抽出
して得られた上清をそれぞれ３７℃で、２時間保温処理
した。
して得られた上清をそれぞれ３７℃で、２時間保温処理
した。
【００４７】３７℃処理前と処理後の上清をそれぞれ別
々にＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、ゲル
をクーマシー染色した後、脱色した。脱色したゲルをデ
ンシドメトリーで分析することで、電気泳動したゲル上
のCOREX タンパクのバンドの濃さが３７℃処理前と処理
後で変化するか否か即ち、上清中のCOREX タンパク量が
変化するか否かを調べた。
々にＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、ゲル
をクーマシー染色した後、脱色した。脱色したゲルをデ
ンシドメトリーで分析することで、電気泳動したゲル上
のCOREX タンパクのバンドの濃さが３７℃処理前と処理
後で変化するか否か即ち、上清中のCOREX タンパク量が
変化するか否かを調べた。
【００４８】緩衝液５で抽出して得られた上清の３７℃
処理前のCOREX タンパク量を１００％として、各緩衝液
で抽出して得られた上清の３７℃処理後のCOREX タンパ
ク相対量を表３に示した。
処理前のCOREX タンパク量を１００％として、各緩衝液
で抽出して得られた上清の３７℃処理後のCOREX タンパ
ク相対量を表３に示した。
【００４９】
【表３】
【００５０】上記の結果より、緩衝液５を用いた場合の
み、COREX タンパクを大腸菌から高収率で且つ、大腸菌
内のプロテアーゼによる分解を受けずに抽出できること
がわかる。又、本抽出方法によりCOREX タンパクは抽出
液中に安定に保持されることも判明した。
み、COREX タンパクを大腸菌から高収率で且つ、大腸菌
内のプロテアーゼによる分解を受けずに抽出できること
がわかる。又、本抽出方法によりCOREX タンパクは抽出
液中に安定に保持されることも判明した。
【図１】ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で調べ
たCOREX タンパクの抽出効率を示す図である。
たCOREX タンパクの抽出効率を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ，Ｒ ｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（1990）Ｖｏｌ. 172，Ｎｏ．２，ｐ．511−516 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12P 21/00 - 21/02 C12N 15/51 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (1)
- 【請求項１】 大腸菌によって産生されたヒトＣ型肝炎
ウィルスコア抗原タンパクまたはそのコア抗原領域を含
むタンパクを、２−メルカプトエタノール及びグアニジ
ン塩酸を含有する緩衝液で抽出することを特徴とするタ
ンパクの抽出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8536391A JP3040189B2 (ja) | 1991-04-17 | 1991-04-17 | タンパクの抽出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8536391A JP3040189B2 (ja) | 1991-04-17 | 1991-04-17 | タンパクの抽出方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04316494A JPH04316494A (ja) | 1992-11-06 |
| JP3040189B2 true JP3040189B2 (ja) | 2000-05-08 |
Family
ID=13856633
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8536391A Expired - Fee Related JP3040189B2 (ja) | 1991-04-17 | 1991-04-17 | タンパクの抽出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3040189B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101682853B1 (ko) * | 2016-04-06 | 2016-12-05 | 김정훈 | 수영 보조 기구 |
-
1991
- 1991-04-17 JP JP8536391A patent/JP3040189B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ，Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９９０）Ｖｏｌ．１７２，Ｎｏ．２，ｐ．５１１−５１６ |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101682853B1 (ko) * | 2016-04-06 | 2016-12-05 | 김정훈 | 수영 보조 기구 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH04316494A (ja) | 1992-11-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4355104A (en) | Bacteriolytic proteins | |
| Kook et al. | Isolation and partial chemical characterization of THF, a thymus hormone involved in immune maturation of lymphoid cells | |
| US5512459A (en) | Enzymatic method for modification or recombinant polypeptides | |
| EP0215625B1 (en) | Protein recovery | |
| HU197357B (en) | Process for cleaning and reactivating precipitated heterologous proteins | |
| Stewart et al. | Purification and characterization of human converting enzyme (kininase II) | |
| JPH0439445B2 (ja) | ||
| JPH0797995B2 (ja) | ペプチド類の製造法 | |
| JP3045778B2 (ja) | Ｃ型肝炎ウイルスプロテアーゼの不溶性凝集物をリフォールディングするための方法 | |
| HEW et al. | Biosynthesis of antifreeze polypeptides in the winter flounder: characterization and seasonal occurrence of precursor polypeptides | |
| JPH02503384A (ja) | 微生物から精製され、酸化され、再生された組換えインターロイキン‐２を回収する方法 | |
| JPS6299399A (ja) | ヒトγ−インタ−フエロンの生物活性誘導体 | |
| JP2517100B2 (ja) | ヒト顆粒球コロニ―刺激因子活性を有する蛋白質の精製法 | |
| JP3040189B2 (ja) | タンパクの抽出方法 | |
| JP3550409B2 (ja) | ジクチオステリウムのジペプチジルアミノペプチダーゼ | |
| JP3930051B2 (ja) | 正しく折畳まれた生物学的に活性の組換えタンパク質の製造方法 | |
| KR0161656B1 (ko) | 글루카곤의 생산방법 | |
| WO2019143193A1 (ko) | 재조합 폴리펩타이드 생산용 n-말단 융합 파트너 및 이를 이용하여 재조합 폴리 펩타이드를 생산하는방법 | |
| JP3009458B2 (ja) | ヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターをコードするｄｎａ配列を含むプラスミド | |
| JP3040190B2 (ja) | タンパクの精製方法 | |
| Butkus et al. | Processing and bioactivity of the corpuscles of Stannius protein of the Australian eel | |
| Richmond | The microfibrillar components of porcine lung elastic fiber | |
| Wallace et al. | Isolation of coconut storage proteins by polyacrylamide-gel electrophoresis | |
| Levenbook et al. | Ubiquitin in the blowfly Calliphora vicina: Partial characterization, titers during the life cycle and relation to calliphorin breakdown | |
| JPS62221636A (ja) | Ｂ型肝炎ウイルス抗原蛋白の可溶化方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100303 Year of fee payment: 10 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |