JPH02503384A - 微生物から精製され、酸化され、再生された組換えインターロイキン‐２を回収する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 微生物から精製され、酸化され、再生された組換えインターロイキン−２を回収 する方法仮歪立互 本発明は生化学の分野に属し、そして精製されそして再生された組換えインター ロイキン−２（ＩＬ−２）をそれが生産される微生物から回収する方法に関する 。

■−！ 植物レクチン、抗原又は他の刺激剤への暴露の後に抗原又はマイトジェンにより 刺激されたＴ細胞の増殖を誘導しそして正常末梢血リンパ球により生産されるリ ンホカインの一種であるＩＬ−２は、最初Ｍｏｒｇａｎ、　Ｄ、Ａ、ら、５ｃｉ ｅｎｃｅ（１９７６）１９３　：１００７−１００８により記載された。そして 、刺激されたＴリンパ血の増殖を誘導するその能力の故にＴ細胞増殖因子と称さ れ、今や、その増殖因子特性に加えて、試験管内及び生体内において免疫系細胞 の種々の機能することが認識され、そしてルー２と改称された。ＩＬ−２は、リ ンパ球により生産されそして免疫細胞の相互作用及び機能を調節する幾つかの伝 達−制御（ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ−ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）分子の一種である。

ＩＬ−２は最初、ヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）又は他のＩＬ−２生産性細胞系 を培養することにより製造された０例えば、米国特許患４．４０１．７５６を参 照のこと０組換えＤＮＡ技法はＩＬ−２の製造のためのＰＢＬ及び細胞系に代る 方法を提供した。

丁ａｎｉｇｕｃｈｉ、　Ｔ、　　ら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８３）３０２　：　３ ０５−３１０及びＤｅｖｏｓ　＋Ｒ，，Ｎｕｃｌｅｆｃ　　ｃｉｄｓ　Ｒｅ５ｅ ａｒｃｈ（１９８３）１１　：　４３０７−４３２３は、ヒトＩＬ−２遺伝子の クローニング及び微生物でのその発現を報告した。

生来のヒトＩＬ−２は、抗原、マイトジェン又はアロ抗原により刺激された赤血 球ロゼント陽性Ｔ細胞により生産される抗原非特異的な遺伝的に制限されない可 溶性因子である。このものは、およそ１３．０００〜１７．０００ダルトンの範 囲の分子量（Ｓ、Ｇ１１ｌｉｓ及びＪ、　Ｗａｔｓｏｎ、　ＬＪ」シμ世工（１ ９８０）　１５９　：　１７０９）及びおよそｐＨ６〜８．５の範囲の等電点を 有することが報告されている蛋白質である。ヒ）ＩＬ−２は多数の試験管内効果 及び生体内効果を有し、これにはヒト末梢血単核細胞又はネズミ胸腺細胞の増殖 応答の増強、ヒト及び動物における細菌感染、寄生体感染、真菌感染、原生物質 感染及びライ、ルス感染に対する免疫応答の増強、並びに連続的Ｔ細胞系の増殖 の支持が含まれる。

ヒ）ＩＬ−２は、遺伝的に操作された大腸菌Ｅ、　ｃｏｌｉから、生来のグリコ ジル化されたＩＬ−２と同等の生物学的活性を有する非グリコジル化蛋白質とし て得られている。　　（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８３）１１ 　：　４３０７−４３２３　；　Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、５ｃｉｅｎｃｅ（１９ ８４）２２３　：　１４１２−１４１５　；　Ｗａｎｇら、５ｃｉｅｎｃｅ（１ ９８４）２２４　：　１４３１−１４３３　；及びＤｏｙｌｅら、Ｊ、Ｂｉｏｌ 　Ｒｅｓ　、Ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ（１９８５）土：　９６−１０９）　。

Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ及び彼の共同研究者は、組換えＩＬ−２の大量投与がマウス における樹立された転移点の退化を惹起することを示し［Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら 、ムハムユム（１９８５）　１　ｆ迂：　１１６９−１１８８）、そしてリンホ カイン活性化キラー細胞［Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、ル本−影」工Ｊ、Ｍｅｄ、　 （１９８５）３１３　：　１４８５−１４９２）及び腫瘍浸潤リンパ球（Ｒｏｓ ｅｎｂｅｒｇら、５ｃｉｅｎｃｅ（１９８６）２３３　：　１３１８−１３２１ ）との組合せで、ヒトにおいてそれを示した。

米国特許ｋ　４．５１８，５８４は、野性形の又は生来の分子の１２５位に通常 存在するシスティンがセリン又はアラニンのごとき中性アミノ酸により置き換え られているＩＬ−２のミューティン（類似体）を開示している。ヨーロッパ特許 （ＥＰ）出願公開阻２００．２８０は１０４位のメチオニンが保存的（ｃｏｎｓ ｅｒｖａ　ｔｉｖｅ）アミノ酸により置き換えられているＩＬ−２のミニ−ティ ンを開示している。

微生物的に生産されたＩＬ−２はグリコジル化されておらず、そして主として変 性された形で生産される。このものは非常に不溶性であり、そして高レベルで発 現された場合、１０００倍以上の倍率の位相差顕微鏡のもとて細胞内に見ること ができる輝点として現われる「屈折体Ｊ　（ｒｅｆｒａｃｔｉｌｅ　ｂｏｄｙ） 又は「封入体ｊ（ｆｎｃｌｕｓｉｏｎ　ｂｏｄいの形で細胞内に沈澱する０本発 明により指摘される問題点は、ＩＬ−２を細胞から、臨床用に許容される精製さ れ、システィン架橋が形成され、再生された形で効率的にいかにして回収するか 、にある。

微生物的に生産されたＩＬ−２を回収するために従来利用可能な方法を下に記載 する。

米国特許Ｎｃｔ　４，５６９，７９０はＩＬ−２生産性微生物から組換えＴＬ− ２を回収する方法を記載しており、この方法においては、細胞が破砕され、破砕 物が尿素のごときチャオトロピック（ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ）剤の水溶液により 抽出され、ＩＬ−２が界面活性剤、例えばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＯ５）に より可溶化され、そして還元剤の存在下でＩＬ−２が分離される。

共通に所有される米国特許Ｎｉｌ　４，５３０，７８７及びＮＣＬ　４，５７２ ，９７８は微生物から組換えＩＬ−２を精製する方法を記載しており、この方法 においては、部分精製され還元されたＩＬ−２が制御された条件下でその酸化さ れた（シスチン）形に選択的に酸化される。前者の特許は酸化剤として０−ヨー ドソ安息香酸を使用し、そして後者は酸化促進剤としてＣｕ″２イオンを使用す る。

１９８６年１２月３０日に公開された、「微生物宿主から異種蛋白質含有屈折体 の回収方法」と題するヨーロッパ特許出願Ｎα２０６．８２８は、大腸菌からＩ Ｌ−２の屈折体を回収しそして精製する方法を開示している。屈折性材料を単離 するため、この方法においては、まず宿主細胞の細胞壁及び細胞膜を破砕し、該 破砕物から９９重量％より多（の塩を除去し、脱塩された破砕物を再破砕し、該 破砕物に物質を添加して該破砕物内の液中に密度勾配又は粘度勾配を形成し、そ して高速遠心分離により細胞破片から屈折性材料を分離する０次にＩＬ−２をＳ ＤＳのごとき溶解剤により可溶化し、クロマトグラフィーにより高分子汚染物を 除去し、酸化し、そしてＨＰＬＣ２限外濾過及びゲル濾過の組合せにより精製す る。

１９８６年１０月の西ドイツ、バーデンーバーデンでの蛋白質、ペプチド及びポ リヌクレオチドのＨＰＬＣについての第六回国際シンポジウムにおいて提示され た１組換えインターロイキン−２の精製及び再生」と題する要約は、組換えＩＬ −２が封入体から６Ｍグアニジン塩酸塩／１０＋ｎＭジチオスレイトール（ＤＴ Ｔ　）により可溶化され、そしてＦＰＬＣゲル浸透により還元されそして再生さ れた形で精製される方法を記載している。ＦＰＬＣゲル浸透からの溶液は再生及 び自動酸化を行うために稀釈される。

これに関些て、米国特許Ｎα４，５１１，５０２　、　Ｎα４，５１１，５０３ 　、　Ｎα４．５１２．９２２及びＮａ　４，５１８，５２６、並びにＥＰ公開 Ｎａ　１１４，５０６は、屈折体から一般に異種性蛋白質を精製するための類憤 の方法を記載している。これらの方法においては、ＩＬ−２の酸化及び再生は単 一の段階において行われる。しかしながら、ＩＬ−２の還元形と酸化形との間の 本質的に異る溶解性のために、この様な方法において再生され酸化されたＩＬ− ２の高収量を達成することは困難である。

ＥＰ公開ｋ　１４５．３９０は大腸菌からｒｌＬ　−２を回収する方法を記載し ており、この方法においては、細胞が７Ｍグアニジン塩酸塩に懸濁され、遠心分 離により固形物が除去され、グアニジン塩酸塩を除去するためにｒｌＬ　−２含 有上清が透析され、そして透析物が陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過 及びＲＰ−ＨＰＬＣにより精製される。

本発明は組換えルー２の改良された精製方法に向けられ、この方法においては、 酸化と再生が別個の段階により行われる。

光３廊Ｕ４丞 本発明は高収量方法に関し、この方法においては、ＩＬ−２が細胞破砕物から屈 折体の形で分離され、チャオトロビック剤により溶解され、そして別個の段階に おいて酸化されそして再生され、次に臨床的に許容されるレベルにまで精製され る。

さらに詳しくは、本発明はＩＬ−２を含有する形質転換された微生物から精製さ れた可溶性組換えＩＬ−２を回収する方法に関し、この方法は、 （ａ）微生物の細胞膜及び細胞壁を破砕し；（ｂ）破砕物から水不溶物を分離し ； （ｃ）段階（ｂ）の該不溶性物質を約７〜約９のｐＨにおいて、還元剤及び強度 性濃度のチャオトロビック剤の水性液と混合し、これによって前記不溶物中のＩ Ｌ−２を可溶化し；（ｄ）該ＩＬ−２含有溶液からＩＬ−２を沈澱せしめそして その沈澱を回収し； （ｅ）該ＩＬ−２沈澱物を可溶化し； （ｆ）該溶液中のＩＬ−２を酸化し、これによってＩＬ−２の天然ジスルフィド 橋を形成せしめ； （ｇ）段Ｎ　（ｆ　）の酸化が完了した後、溶液中のチ中オトロビック剤の濃度 を、酸化されたＩＬ−２が再生されそして沈澱が生ずるレベルに低下せしめ； （ｈ）段階（ｇ）の沈澱を溶液から分離して上滑を得；（１）　該上滑中の酸化 されそして再生されたＩＬ−２を、逆相高速液体クロマトグラフィー並びにそれ に続（チャオトロピック剤の溶液中でのプールの可溶化及び該溶液からのチャオ トロピック剤の除去により、又はイオン交換クロマトグラフィーと組み合わされ た疎水性相互作用クロマトグラフィーにより、又はイオン交換クロマトグラフィ ーにより精製し；そして、 （ｊ）還元的ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動分析によ り測定した場合９５％以上のＩＬ−２含量を有し、−当り３■以上のＩＬ−２の 溶解性を有し、ＨＴ−２細胞増殖アツセイにより測定した場合Ｉ　ＸＩＯ’ユニ ット／■以上の比活性を有し、そしてエンドトキシン含量がＩＬ−２■当り約０ ．１ナノグラム未満である、精製されそして酸化された可溶性異種性ヒトＩＬ− ２組成物を回収する；ことを含んで成る。好ましくは、この組成物はさらに、１ ．０ｘｉｏ’ユニット／ｋｇ、好ましくは３．３Ｘ１０’ユニット／ｋｇの投与 １でのｕ、ｓ、ｐ、ラビット・パイロジエン・テストに測定された場合にパイロ ジエンを実質的に含有しない。

型皿Ω亙生星脱所 第１図は、本発明の方法の好ましい具体例の流れ図である。

第２図は、後記の例１において記載するイムノアッセイの結果のグラフである。

閉じた円は５ＤＳ−法のＩＬ−２を示しそして閉じた四角形はグアニジン−法の ＩＬ−２を示し、そしてその両者が前記例に記載されている。

８　　−るための能 Ａ、定−且 本明細書において使用する場合、ｒｌＬ−２Ｊなる語は、形質転換された微生物 により生産される組換えインターロイキン−２又はインターロイキン−２様ポリ ペプチドであってそのアミノ酸配列がグリコジル化されていない及び／又はグリ コジル化されている生来のインターロイキン−２と同一であるか又はそれに類似 しているか又は実質的に相同であるものを意味する。この様な組換えＩＬ−２の 例は、公開されたヨーロッパ特許出＠に９１．５３９、Ｎａ８８．１９５及びＮ ｉｌ　１０９，７４８に記載されているもの、並びに米国特許４．５１８．５８ ４．１９８６年８月５日に出願された米国特許出願Ｎα８９３．１８６、及びＥ Ｐ公開Ｎα２００．２８０に記載されているもの、並びにＣｅｒｒｅｔｔｉら、 Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

匙し工１針（１９８６）影し３２２３−３２２７により記載されているウシＩＬ −２である。これらすべての参照文献の開示を引用によりこの明細書に組み入れ る。

本発明において特に好ましい組換えＩＬ−２は、後で記載するように、生物学的 活性のために必須でないアミノ酸残基が幾つかの例において注意深く除去されて おり、又は保存的アミノ酸により置き換えられている生物学的に活性なミューテ ィン（類似体）である、さらに具体的には、好ましい組換えＩＬ−２には、分子 間架橋又は正しくない分子内ジスルフィドを排除するために１２５位のシスティ ン残基が他のアミノ酸、好ましくは中性又は保存的アミノ酸により置き換えられ ており、そして場合によっては生来の対応物のＮ−末端アラニン残基が除去され ているものが包含される。この明細書において使用される場合、この様な中性又 は保存的アミノ酸はグリシン、セリン、バリン、アラニン、ロイシン、イソロイ シン、チロシン及びメチオニンである。さらに詳しくは、本発明の構成において 好ましい組換えＩＬ−２ミユーテインは、（１）生来の対応物のアミノ酸位置１ ２５におけるシスティン残基がセリン残基により置き換えられているもの（ＩＬ 　　２ｓｅｒ＋２ｓと称する）又はアラニン残基により置き換えられているもの （ＩＬ　　２ａｌａｔｔｓと称する）；あるいは（２）最初のアラニン残基が除 去されており且つ１２５位のシスティンがセリンにより置き換えられているもの （ｄｅｓ−アラニル−ルー２Ｓｅｔ＋　ｚｓと称する）である。

この発明において特に好ましい他のＩＬ−２は、酸化感受性のメチオニン残基が 中性又は保存的アミノ酸により置き換えられているヨーロッパ特許出願公開ｋ　 ２００．２８０に記載されている生物学的に活性なミューティンであり、好まし いミューティンはアラニンのごとき保存的アミノ酸による１０４位のメチオニン の置換を含む。

ＥＰ　２００，２８０はまた、最初の６個のアミノ酸の内に１個又は複数個が除 去されているＩＬ−２のアミノ末端除去を記載している。好ましい酸化耐性ミュ ーティンには、ａｌａ、。ａｓｅｒ＋ｚｓｌＬ−２、ａｌａ＋。４ＩＬ　　２　 ＋ａｌａ＋ｏａａｌａ＋＊ｓｌＬ　　２　＋Ｖａｌ＋ｅａＳｅｒｌｚｓＩＬ−２ ＊　ｖａｌ＋＊＊ＩＬ　−２＊　ｖａｌ＋ｏ４ａｌａｔｚｓｌＬ　−２＊　ｄｅ ｓ−ａｌａ＋ａｌａ＋ｏ４Ｓｅｒ＊ｚｓＩＬ　−２、ｄｅｓ−ａｌａ＋ａｌａ＋ ｏａＩＬ　−２、６ｅｓ−ａｌａＩａｌａｔｏ＊ａｌａ＋ｚｓｌＬ　−２＊　ｄ ｅｓ−ａｌａｌＶａｌｌｏｎＳｅｒ＋ｘｓｌＬ　−２＋ｄｅｓ−ａｌａ＋ｖａｌ ＋ｏ４１Ｌ　−２、ｄｅｓ−ａｌａ＋ＶａｌＩｏ４ａｌａ＋ｚｓＩＬ　−２、ｄ ｅｓ−ａｌａｌｄｅＳ−ｐｒＯ２ａｌａｌｏａＳｅｒ＋ｚｓＩＬ　　２　、　ｄ ｅｓ−ａｌａ＋−ｄｅｓ−ｐｒｏｚａｌａ＋ｏａＩＬ　−２、ｄｅｓ−ａｌａＩ ｄｅｓ−ｐｒｏｚａｌａ＋ｏａａｌａ＋ｚｓＩＬ　−２。

ｄｅＳ−ａｌａＩｄｅｓ−ｐｒｏｚＶａｌｌｏａｓｅｒＩｚＳＩＬ　　２　、　 ｄｅＳ−ａｌａＩｄｅＳ−ｐｒＯｚ−Ｖａｌ＋ｏｎＩＬ　−２、ｄｅｓ−ａｌａ Ｉｄｅｓ−ｐｒｏｚｖａｌ、ｃ＋ａａｌａ、ｚｓＩＬ　−２、ｄｅｓ−ａｌａ、 ｄｅｓ−ｐｒｏｚｄｅｓ−ｔｈｒ２ａｌａ＋ｏａｓｅｒ＋ｚｓｌＬ　−２、ｄｅ ｓ−ａｌａ、ｄｅｓ−ｐｒｏｚｄｅｓ−ｔｈｒ＋ａｌａ＋ｏａｌＬ　−２、ｄｅ ｓ−ａｌａ、ｄｅｓ−ｐｒｏ、−ｄｅｓ−ｔｈｒ３ａｌａ＋ｏ４ａｌａ＋ｚｓｌ Ｌ　−２、ｄｅｓ−ａｌａ、ｄｅｓ−ｐｒｏ、ｄｅｓ−ｔｈｒｓ−ｖａｌ＋ｏａ ｓｅｒ＋ｚｓＴＬ　　２　、　ｄｅｓ−ａｌａＩｄｅｓ−ｐｒｏｚｄｅｓ−ｔｈ ｒ＝ｖａｌ、ｏａＩＬ−２、ｄｅｓ−ａｌａｔｄｅｓ−ｐｒｏｚｄｅｓ−ｔｈｒ ｓｖａｌ＋ｏａａｌａ＋ｚｓｌＬ　−２、ｄｅｓ−ａｌａｌｄｅＳ−ｐｒＯｚｄ ｅｓ−ｔｈｒ２ｄｅＳ−３ｅｒａａｌａ＋ｏａＳｅｒ＋ｚ５ｒＬ　　２　、　ｄ ｅｓ−ａｌａ、ｄｅｓ−ｐｒｏ、ｄｅｓ−ｔｈｒｚｄｅｓ−ｓｅｒ４ａｌａ＋ｏ ａＩＬ　−２、ｄｅｓ−ａｌａ、ｄｅｓ−ｐｒｏｚｄｅｓ−ｔｈｒｚｄｅｓ−ｓ ｅｒａａｌａ、ｏ　４ａｌａ＋ｚｓＩＬ　−２、ｄｅｓ−ａｌａ、ｄｅｓ−ｐｒ ０２ｄｅＳ−ｔｈｒ３ｄｅＳ−５ｅｒａＶａｌ＋ｏａＳｅｒＨｓＩＬ　　２　、 　ｄｅＳ−ａｌａｌｄｅＳ−ｐｒｏｚｄｅｓ−ｔｈｒｚｄｅｓ−ｓｅｒｎｖａｌ 、ｎＩＬ　−２，ｄｅｓ−ａｌａ、ｄｅｓ−ｐｒｏｚｄｅｓ−ｔｈｒｚｄｅｓ− ｓｅｒａｖａｌ＋ｏａａｌａ＋ｚｓＩＬ　−２、ｄｅｓ−ａｌａＩｄｅｓ−ｐｒ ｏｚｄｅｓ−ｔｈｒｓｄｅｓ−ｓｅｒ４ｄｅｓ−ｓｅｒｓａｌａ＋ｏａｓｅｒｓ ｚｓＩＬ　−２、ｄｅｓ−ａｌａ、ｄｅｓ−ｐｒｏｚｄｅｓ−ｔｈｒｚｄｅｓ− ｓｅｒａｄｅｓ−ｓｅｒ５ａｌａ＋ｏ４ＩＬ　−２、ｄｅｓ−ａｌａ、ｄｅｓ− ｐｒｏｚｄｅｓ−ｔｈｒｓｄｅｓ−ｓｅｒ４ｄｅｓ−ｓｅｒｓａｌａ＋ｏａａｌ ａ＋ｚｓ−ＩＬ　−２、ｄｅｓ−ａｌａ　ｒ　ｄｅｓ−ｐｒｏｔｄｅｓ−ｔｈｒ ｚｄｅｓ−ｓｅｒａｄｅｓ−ｓｅｒｓｖａ　１　ｔ　ｏ　４−ｓｅｒ　ｓ　ｔｓ 　ＩＬ−２、ｄｅｓ−ａｌａ、ｄｅｓ−ｐｒｏ、ｄｅｓ−ｔｈｒｚｄｅｓ−ｓｅ ｒｎｄｅｓ−ｓｅｒ、−ｖａｌ＋ｏｎＩＬ　−２、ｄｅｓ−ａｌａ、ｄｅｓ−ｐ ｒｏｚｄｅｓ−ｔｈｒｘｄｅｓ−ｓｅｒａｄｅｓ−ｓｅｒｓ−ｖａｌ＋ｏａａｌ ａ＋ｚｓＩＬ　　　　２　　、ｄｅｓ−ａｌａＩｄｅｓ−ｐｒｏｚｄｅｓ−ｔｈ ｒｓｄｅｓ−ｓｅｒａｄｅｓ−３ｅｒｓｄｅＳ−３ｅｒｉａｌａ＋ｏ４ａｌａ＋ ｚｓＩＬ　　２　、　ｄｅｓ−ａｌａＩｄｅｓ−ｐｒｏｚ−ｄｅｓ−ｔｈｒｚｄ ｅｓ−ｓｅｒ、ｄｅｓ−ｓｅｒｓｄｅｓ−ｓｅｒ、ａｌａ＋ｏａｌＬ　−２、ｄ ｅｓ−ａｌａ、ｄｅｓ−ｐｒｏｚｄｅｓ−ｔｈｒ、ｄｅｓ−ｓｅｒ４ｄｅｓ−ｓ ｅｒ、ｄｅｓ−ｓｅｒｈａｌａ＋ｏ＊ｓｅｒ＋ｚｓｌＬ　　２　　＊ｄｅｓ−ａ ｌａ、ｄｅｓ−ｐｒｏｚｄｅｓ−ｔｈｒ　３ｄｅｓ−ｓｅｒａｄｅｓ−ｓｅｒ５ −ｄｅｓ−ｓｅｒ、ｖａｌ＋ｏａｓｅｒ、ｓｌＬ　−２、ｄｅｓ−ａｌａ、ｄｅ ｓ−ｐｒｏｚｄｅｓ−ｔｈｒ、−ｄｅｓ−ｓｅｒ４ｄｅｓ−ｓｅｒ、ｄｅｓ−ｓ ｅｒ、ｖａｌ＋ｏ４１Ｌ　−２＋又はｄｅｓ−ａｌａ、ｄｅｓ−ｐｒｏｚｄｅｓ −ｔｈｒ、ｄｅｓ−ｓｅｒ４ｄｅｓ−ｓｅｒ５ｄｅｓ−ｓｅｒ、ｖａｌ＋ｏ４− ａｌａ＋ｚｓｌＬ　　２が含まれる。

ＩＬ−２の他のアミノ末端除去は、１９８６年１０月６日に公開された特開昭６ １−２２５１９９の要約であるＣｈｅ＋ｇｉｃａｌ　Ａｂｓｔｒａｃｔｓ（１９ ８７）１０６　：　（２１）　：　１７０２３６　ｆに記載されており、そこで はＩＬ−２の最初の１５アミノ酸のいずれかの１つが除去されている。　１９８ ７年８月１３日に公開されたＰＣＴ　８７１０４７１４は、ＩＬ−２のアミノ末 端アラニンから２〜１１及び／又は１２８〜１３３位のアミノ酸の１個又は複数 個の除去又は置換を記載している。

ＩＬ−２の正確な化学構造は多くの因子に依存する０分子中にイオン化し得るア ミノ基及びカルボキシル基が存在するので、特定の組換えＩＬ−２蛋白質は酸性 塩又は塩基性塩として、あるいは中性の形で得ることができる。適当な環境条件 におかれた場合にその活性を維持しているすべての調製物は本発明におけるＩＬ −２蛋白質の定義に含まれる。さらに、蛋白質の一次アミノ酸配列は、糖性分の 使用による誘導体化（グリコジル化）により、又は他の補完的分子、例えば脂質 、リン酸基、アセチル基等により、より一般的にはサツカライドとの接合により 増大され得る。この様な増大の幾つかの観点は生産宿主の翻訳後プロセシング系 により達成され、他のこのような修飾は生体外で導入される。いずれにしても、 この様な修飾は、上に定義した蛋白質の活性が破壊されない限り、本発明のＩＬ −２蛋白質の定義に含まれる。言うまでもなく、この様な修飾が、種々のアッセ イにおいて蛋白質の活性を増強又は低下せしめることにより生物学的活性に量的 又は質的な影響を与える場合があることは予想されるところである。

本明細書において使用する場合、宿主微生物細胞培養物を記載する際の「形質転 換された」なる語は、生来のＩＬ−２の活性を有し得るＩＬ−２ポリペプチドを 生産するように遺伝子操作された微生物を意味する。細菌が、ＩＬ−２蛋白質を 生産するだめの好ましい微生物である。大腸菌が特に好ましい。

「チャオトロピック剤Ｊ　（ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ　ａｇｅｎｔ）なる用語は、 水性溶液中でそして適当な濃度において組換えＩＬ−２を変性することができる 一種又は複数種の化合物を意味する。相関的に、「強く変性する濃度」なる語は 、組換えルー２を効果的に「はぐすＪ　（ｕｎｆｏｌｄ）又は変性する（ｄｅｎ ａｔｕｒｅ）チャオトロビック剤の溶液に関する。約４〜９Ｍ、好ましくは約６ 〜９Ｍの範囲の濃度のグアニジン塩（例えば塩酸塩）及びアルカリ金属チオシア ネート（例えばチオシアン酸ナトリウム）が、組換えＩＬ−２を溶解しそして変 性するであろうチャオトロビック剤溶液の例である。

亘皿膚瀘 ＩＬ−２生産性の形質転換された微生物は適当な増殖培地中で、典型的には６８ ０ｎｍにおいて約３０以上、そして好ましくは６Ｂ０ｎｍにおいて約２０〜４０ の間の光学濃度（ＯＤ）において、増殖する。増殖培地の組成は関連する特定の 微生物に依存するであろう。増殖培地は典型的には資化性の炭素源及び窒素源、 エネルギー源、マグネシウム、カリウム及びナトリウムイオン、並びに場合によ ってはアミノ酸、及びプリン及びピリミジン塩基を含有するであろう、　　（Ｒ ｅｖｉｅｗ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃａｌ影囮旦■、　Ｌａｎｇｅ　Ｍｅｄｉｃａｌ　 Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、第１４版、８０−８５頁（１９８０）を参照のこと 、）ｔｒｐプロモーターを含む発現ベクターにおいて、培地中のトリプトファン 濃度は、蛋白質発現が望まれる時点において制限的となるように注意深く調節さ れる。大腸菌用の増殖培地は当業界においてよく知られている。

細胞が培養物から収得された後、それらは所望により約２０〜１５０■／ｄ、好 ましくは８０〜１００■／　ｒａｆｔ　（６８０ｎ−におし）て０Ｄ４０〜３０ ０、好ましくは１６０〜２００）に、交流濾過（ｃｒｏｓｓ−ｆｌｏｗｆｉｌｔ ｒａｔｉｏｎ）　、遠心分離、又は他の常用の方法により濃縮される。

週１す良礁 収得した培養物の：ａ縮に続き、微生物の細胞膜及び細胞壁が破砕される。好ま しくは、ヒトに対して非毒性の化合物、例えば１−オクタツールが全成分に対し て約１重量％の量で破砕された細胞に添加され、組換え生物が生き残らないこと を保証する０本発明の方法のこの段階において、常用の細胞破砕技法、例えばホ モシネ−ジョン、音波処理又は圧力循環を用いることができる。破砕段階の終点 は光学濃度をモニターすることにより決定することができ、この場合懸濁液の２ ６０ｎｍにおける吸光度が細胞溶解と共に典型的に増加し、あるいは顕微鏡観察 によって決定することができる。ともか（、次の段階に移行する無傷の細胞が実 質的に存在しないように、破砕段階は実質的にすべての細胞を破壊すべきである 。

沖　ＩＬ−２るための　　　の几 細胞が破砕された後、好ましくは脱イオン水が破砕物に添加され、そしてそこか ら９９重量％より多くの塩が除去される。

塩は反対に荷電した小分子イオンから成る水溶性物質である。

破砕物のイオン強度を低下せしめるためのこれらの塩の除去は、イオンをフラッ シュするために脱イオン水を用いるダイアフィルトレージジン（ｄｉａｆｉｌｔ ｒａｔｉｏｎ）　％又は遠心分離によって細胞破片及び屈折体をベレット化し次 に脱イオン水中に再懸濁することにより達成することができる。ダイアフィルト レージョンを用いる場合、好ましくは脱イオン水を連続的に添加して水の添加速 度が濾過速度と同じになるようにする。

塩が実質的に除去された後、もし前もって添加されていない場合には１−オクタ ツールのごとき化合物を脱塩した破砕物に添加して、密閉が破られる前に組換え 生物が生き残れないことを保証することができる。脱塩された破砕物は最近の破 砕について前記したようにして再度破砕する。

再破砕の後、遠心分離の間に破砕物に物質を添加することにより破砕物内の液の 密度もしくは粘度を上昇せしめ、そして／又はそれに勾配を形成せしめる。この 目的を達成するために幾つかの手段が存在し、そのすべてが液相の密度及び／又 は粘度を変えることによる粒子の沈降特性に顧る。この目的を達成するための１ つの手段は液の密度を約１．１〜１．３ｇ／Ｉｄ、好ましくは１．１３〜１．１ ７ｇ／ｍのρに密度を上昇せしめる物質を添加することである。

この密度の上昇を達成するために使用し得る物質には、糖又は糖の混合物、例え ばシェークロース、デキストロース、フラクトース、マルトース、マルトトリオ ース、及び他のモノ−、ジー又はポリ−サツカライドが含まれる。最も好ましく は糖はシュークロースである。あるいは、物質の二相系、例えばグリセロール／ シュークロース混合物を使用することができ、この場合、重相と軽相との間の界 面に破砕された粒子が分配され、そして液／液分離によって溶出され得る。

さらに、任意の適当な手段により、例えば、シェークロース又はグリセロールを 添加することにより液相の粘度を５〜１０ｃｐｓに増加させることができる。さ らに、例えば、粒子が６０％グリセロール水性懸濁液中にあり他方遠心管が８０ ％水性グリセロールを収容する場合、勾配が形成される。

ＩＬ−２含有屈折体は高速遠心分離により細胞破片から分離される。「高速遠心 分離」とは、懸濁液を遠心管中で約８．０００〜４０．０ＯＯＸＧ、好ましくは 約１０．０００〜２０．０ＯＯＸＧにおいて、容量に依存して適当な時間、−Ｃ 的には約１０分間〜７２時間にわたり回転せしめることを意味する。

遠心分離から生ずる粒子のペレット又はペーストは、５ＤＳ−ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動により及びＬｏｗｒｙアンセイ（Ｗｏｗｒｙら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、　（１９５１）１９３　：　２６５−２７５：ｌにより測定した場合 約１５〜７０重量％のＩＬ−２を含有する。

次に、粒子ペースト又はペレットを、強く変性する濃度のチャオトロピック剤及 び還元剤の溶液と混合することにより、粒子ペースト又はペレット中のＩＬ−２ を溶解しそして変性せしめる。チャオトロビック剤及び還元剤はｐＨ７〜９の水 性緩衝液、好ましくはリン酸緩衝液又はＴｒｉｓ緩衝液中に存在する。

ｐＨの調整はＮａＯＨのごとき塩基の添加により達成することができる。ペレッ トと溶液とのｗ　／　ｖ比は、通常、０．０１：１〜０．２５：１、好ましくは ０．０５：１〜０．１２：１の範囲である。溶解／変性段階で使用することがで きる還元剤には、β−メルカプトエタノール、グルタチオン、システィン及びジ チオスレイトール（ＤＴＴ　）が含まれる。ＤＴＴが好ましい還元剤である。媒 体中の還元剤の濃度は通常約１０〜１００ｍＭの範囲であり、約５０ｍＭが好ま しい濃度である。１〜５０１Ｍ、好ましくは約２５ｍＭの濃度のキレート剤、例 えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ　）及び２５〜２５０ａ＋Ｍ　、好まし くは５０ｗＭの濃度の緩衝剤、例えばＴｒｉｓ−ＩＣｌを溶液中に含めることが できる。この段階において、３５℃〜５０°Ｃ１好ましくは約４０℃の上昇した 温度及び窒素包囲を用いることができる。熔解／変性は典型的には約５〜１５分 間の混合の後に完了する。この時間の後、混合°物を好ましくは２０００ＸＧ〜 ４０００ＸＧにおいて約１０〜３０分間遠心してすべての未溶解物を除去するこ とができる。

次に、変性したＩＬ−２を制御された酸化にかける。まず、ゲル濾過、ダイアフ ィルトレージョン又は沈澱を用いて還元剤を他の汚染物と共に除去する。蛋白質 溶液から還元剤を除去することができるゲルは市販されている０例えば、ＤＴＴ が還元剤として使用される場合、セファテックスＧ−１０，Ｇ−２５及びＧ−５ ０ゲルを使用することができる。ゲル濾過は、蛋白質を溶液として維持するチャ オトロピック剤の溶液中で行われるであろう、塩酸グアニジンが使用される場合 、ＩＬ−２を溶液として維持しそして沈澱の形成を回避するために約６Ｍより高 い濃度が使用される。還元剤を除去した後、所望より、チャオトロピック剤の溶 液により蛋白質溶液を約０．１〜２■／−１好ましくは約０．２５〜１．０■／ −の蛋白質濃度に稀釈される。

還元剤を夾雑物と共に除去するための好ましい方法は沈澱技法を用いる。還元さ れたＩＬ−２を７．０　Ｍグアニジンによりｄ当り約２〜３０■のＩＬ−２、好 ましくは−当り５〜１０■のＩｔ。

−２に稀釈する０次にこれを約１〜５Ｍグアニジン、好ましくは３．５Ｍグアニ ジンに稀釈し、そして沈澱が完了するまで、通常２時間放置する。沈澱の沈降が 始まればＩＬ−２を遠心分離によりペレット化することができる。緩衝液により 、好ましくは２〜４Ｍグアニジンを含有する緩衝液、又は１〜２％のポリソルベ ート８０を含有する緩衝液を用いてペレットを洗浄することにより残留ＤＴＴを 除去することができる。

好ましい選択的酸化方法は米国特許Ｎｃｔ　４，５７２．７９８　（例えばＣｕ Ｃ１ｔ、　Ｃｕ（ＮＯｓ）ｚ等からのＣｕ”陽イオンを含有する酸化促進剤を用 いる）及びＮａ　４．５３０．７８７　（ｏ−ヨードソ安息香酸を用いる）に記 載されており、その開示を引用により本明細書に組み入れる。　Ｃｕ”酸化は、 変性したＩＬ−２の水溶液を約５゜５〜９、好ましくは６〜８、そして最も好ま しくは約７．５のｐＨにおいて、空気の存在下でＣｕ”陽イオンを含有する酸化 促進剤の少なくとも有効量と反応せしめることを含む、制御された酸化が、過剰 酸化及び生来のものと一致しない架橋又はオリゴマーの形成全く又はほとんど伴 わないで生来のＴＬ−２における架橋と一致するＩＬ−２中のジスルフィド橋の 形成を生じさせる。このような酸化が、適切なジスルフィド橋を有する組換えＩ Ｌ−２の高収量での製造を可能にする。

酸化剤又は酸化促進剤の量は酸化のための有効量、すなわち便利な時間内に効果 的に酸化反応を行うために必要な最少量、以上の量である。有効量は、所望のジ スルフィド結合の形成に関与することが予定されているＩＬ−２中の遊離ヒルヒ ドリル基の濃度とおよそ当量となる量である。好ましくは、ＣｕＣｌ！ｔの量は 約５〜２７５−の範囲である。０−ヨードソ安息であろう、オリゴマーの形成の 可能性を少なくするため、反応混合物中のＩＬ−２の濃度は低く保持され、一般 に約５■／ｄ未満、好ましくは約０．０５〜約２■／ｄ、そしてさらに好ましく は約０．１〜約ＩＩＩＩｇ／Ｉ１１である。０−ヨードソ安息香酸による酸化に おいてはｐＨは５．５〜９、好ましくは５〜８の範囲に維持される。

効果的な酸化が起こるために、還元されたＩＬ−２は溶液中に維持されなければ ならない、従って、反応混合物は、還元されたＩＬ−２を溶液として維持するた めに十分な濃度のチャオトロピック剤を含有しなければならない、上記のように 、グアニジン塩酸塩が使用される場合、その濃度は６Ｍより高くなければならな い、この様な濃度において、実質的な量のＩＬ−２が変性された形で存在するで あろう、この理由のため、ＩＬ−２の場合には酸化と再生を同時に行いそして再 生されたＩＬ−２を高収量で得ることは困難である。

酸化において使用される温度は約２０℃〜４０℃であり、便利には室温である。

Ｃｕ”酸化については、反応温度の上昇と共に反応速度が上昇する。酸化反応は 、例えば、反応が停止するレベルにｐＨを低下させ、溶液を凍結し、又は反応混 合物にＥＤＴＡのごときキレート剤を添加することにより効果的に停止せしめる ことができる。酸化時間は一般に４時間〜約１日の範囲である。

酸化が完了した時に、稀釈、透析又はダイアフィルトレージョンを用いてチャオ トロピック剤（グアニジン塩酸塩）の濃度を、酸化されたＩＬ−２が生来のルー ２のコンフィグレーションに再生（ｒｅｎａｔｕｒａｔｅ及びｒｅｆｏｌｄ）す ることを可能にするレベルに低下せしめる。１０〜１００ｍＭ　、好ましくは約 １０ｍＭのリン酸緩衝液又はクエン酸緩衝液：工０〜１５０ｍＭ　、好ましくは ４０−ＭのＮａＣｆ；及び１〜５％、好ましくは２．５％のシェークロースが好 ましい稀釈剤である。好ましくは、限外濾過膜を用いてＩＬ−２を濃縮して大量 の溶液を取扱うのを回避する。

グアニジン塩酸塩の濃度を約２Ｍ未満、好ましくは約０．５　Ｍ未満に稀釈又は ダイアフィルトレージョンするのが普通である。稀釈は典型的には約４℃〜２５ °Ｃにおいて行う、この様な温度及び低下したグアニジン塩酸塩濃度において夾 雑する宿主蛋白質の沈澱が生ずる。この沈澱を濾過又は遠心分離により除去して 、酸化されそして再生されたＩＬ−２を含有する上清を得る。

次に、再生され酸化されたＩＬ−２を精製してエンドトキシンを臨床用に合致す るレベル（すなわちＩＬ−２のｄ当り０．１ｎｇ未満のエンドトキシン）まで除 去する。ＩＬ−２をさらに精製してパイロジエンを除去し、１．０Ｘ１０３ユニ ット／ｋｇ、好ましくは３．３Ｘ１０’ユニット／ｋｇの投与量でのＵ、Ｓ、Ｐ 、ラビット・パイロジエン・テストにより測定した場合にパイロジエンを実質的 に含有しないようにするのが好ましい、精製はイオン交換クロマトグラフィー、 疎水性相互作用及びイオン交換クロマトグラフィーの組合わせ、又はＨＰ−）Ｉ ＰＬｃにより達成することができる。

次に、この溶液をイオン交換カラム、例えばＤＥＡＥアガロースカラム（例えば 、ファルマシア・ファスト−フロー・セファロースＤＥＡＥ　）に流す、１０Ｉ ＩＭクエン酸塩（ｐＨ６，５）によりＩＬ−２をカラムから回収する。溶出した ＩＬ−２画分を、引続いて他のイオン交換カラム、例えばＩＬ−２をｐＨ６〜７ ．５において結合するカルボキシメチルアガロース（例えば、ファルマシア・フ ァスト−フロー・セファロースＣＭ）に負荷することができる。結合したＩＬ− ２は増加する塩グラジェントにより溶出することができる。所望のＩＬ−２は約 １５０ｍＭの塩濃度において溶出し、より低い等電点形の蛋白質はより低い塩濃 度において溶出する。

疎水性相互作用／イオン交換クロマトグラフィー技法において、（ＮＨａ）　ｚ ｓＯａがＩｆ、−２溶液に約１．０Ｍ以上、好ましくは約１．２５Ｍの濃度に添 加される。次に、この溶液を疎水性相互作用カラム、例えばフェニルアガロース カラム（例えば、ファルマシア・フェニル・ファスト−フロー・セファロースカ ラム）に負荷する。結合したＴＬ−２はカラムから低下する（ＮＯ４）　、Ｓｏ 、勾配により回収され、ＩＬ−２は約０．９５〜０．７５Ｍ（ＮＨａ）ｚｓＯ４ において溶出する両分に集まる。次に、生来のＩＬ−２より低い等電点を有する ＩＬ−２の種及び他の不純物（細菌宿主蛋白質）が、ｐＨ６〜７．５においてＩ Ｌ−２を結合するイオン交換体を用いる陽イオン交換クロマトグラフィーにより 除却される。カルボキシメチルセルロースアガロースカラム（例えば、ファルマ シア・ファスト−フロー・セファロースＣＭ）が好ましい分取用陽イオン交換体 である。溶液を上に示したｐＨ範囲において交換体と接触せしめ、そしてイオン 勾配を用いてＩＬ−２を交換体から溶出する。目的とするＩＬ−２は約０．１５ Ｍ塩において溶出し、より低い等電点形の蛋白質はより低い塩濃度において溶出 する。

再生されたＩＬ−２のＨＰＬＣ精製は、米国特許ＮｃＬ４，５６９．７９０に記 載されているのと実質的に同じ方法、並びにそれに続くチャオトロピック剤中へ の溶解及び透析により行うことができる。要約すれば、ルー２の溶液をクロマト グラフ処理し、沈澱せしめ、そして生ずる沈澱をチャオトロビンク剤溶液に入れ る０次に、チャオトロピック剤を透析又はダイアフィルトレージョンにより除去 する。ＩＬ−２を陽イオン交換クロマトグラフィーによりさらに精製することが できる。

このクロマトグラフィ一段階の後、再生され酸化されたＩＬ−２の純度は、還元 ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） 分析により測定した場合、約９５％以上、そして通常約９８％以上である。この 純粋なＩＬ−２は、ＰＢＳ中での約５■／ｄ以上の澄解性、ＨＴ−２細胞増殖ア ツセイにより測定した場合約ｌＸｌ０’ユニツト／■、通常５×１０’〜２Ｘ１ ０’ユニ７ト／■の比活性、及び約０．１ｎｇ／ＩＬ−２■未満のエンドトキシ ン含量を有する。さらに、好ましくは、ＩＬ−２は、１．０Ｘ１０”ユニット／ ｋｇ、さらに好ましくは３．３Ｘ１０’ユニット／ｋｇの投与量でのＵ、Ｓ、Ｐ 、ラビット・パイロジエン・テストにより測定した場合にパイロジエンを実質的 に含有しない。

１−五一上 精製されたＩＬ−２は水性にされ、必要であればその濃度は０．０１〜２■／ｉ に調整され、そして水溶性キャリヤーが所望の濃度に添加される。このキャリヤ ーは、典型的には、約１〜１０重量％、好ましくは約５重量％で溶液中に存在す るように添加されるであろう、キャリヤーの正確な添加量は臨界的ではない、こ れらの材料は水溶性であり、ＩＬ−２と反応せず、そしてそれ自体安定である。

これらはまた水に対して非感受性（すなわち非吸湿性）である、添加することが できるキャリヤーの特定の例には、デキストロース、ラクトース、マンニトール 、シュークロース、及び他の還元された糖、例えばソルビトール、小麦、トウモ ロコシ、米及びジャガイモからの澱粉及び澱粉加水分解物、マイクロクリスタリ ンセルロース、及びアルブミン、例えばヒト血清アルブミンが含まれる。

マンニトール、シュークロース、及びデキストロースが好ましい。

キャリヤーは製剤を増量し、単位投与量の溶液が容量、例えば無菌バイアル中で 凍結乾燥された場合に、凍結乾燥残渣が肉眼で明瞭に見えるようにする。これに 関し、好ましいキャリヤーであるマンニトールは、水に非感受性の美的に許容さ れる（白色結晶性）残渣をもたらす、マンニトールの水への非感受性は製剤の安 定性を増強するであろう。

「親脂性蛋白質の改良された配合」と題する、１９８７年３月２５日に公開され たＥＰ公開２１５．６５８（Ｈａｎｉｓｃｈら）は、ＩＬ−２のごとき親脂性組 換え蛋白質を微生物から精製して安定な医薬組成物に製剤化することができる蛋 白質調製物を得るための改良された方法を概説している。療法的に有効な量の生 物学的に活性な組換え親脂性蛋白質を非毒性の不活性な療法的に許容されるｐＨ ６，８〜７．８の水性キャリヤー媒体に溶解した組成物はさらに蛋白質のための 安定剤、例えばヒト血清アルブミン、正常血清アルブミン及びヒト血漿蛋白質画 分を含有する。前記ＥＰ公開２１５，６５８の製剤化の観点を、精製されたＩＬ −２の他の製剤化経路として引用によりこの明細書に組み入れる。ＥＰ公開Ｎα ２１５．６５８は低ｐ）ｌ製剤化法を概説している。

Ｈａｎｉｓｃｈら米国特許ＮＣＬ　４．４６２．９４０は高ｐｉ（製剤化法を概 説しており、そしてその製剤化の観点も引用によりこの明細書に組み入れる。

キャリヤーを添加した後、単位投与量（すなわち、投与当り０．０１〜２■、好 ましくは０．２〜１．０■のＩＬ−２を提供するＩＬ−２容量）の溶液を容器に 分注し、この容器をスロット栓で閉じ、そして常用の凍結乾燥条件及び装置を用 いて内容物を凍結乾燥する。

凍結乾燥された無菌生成物は（１）ＩＬ−２、（２）キャリヤー（デキストロー ス、シュークロース又はマンニトール）、（３）場合によっては他の賦形剤、例 えばヒト血清アルブミン、トウィーン８０等、及び（４）混合物が再溶解された 場合に生理的ｐＨをもたらす少量の緩衝剤を混合物から成る。この生成物はまた 、化学的安定性を増強するための少量の保存剤を含有することができる０組換え ＩＬ−２は典型的には混合物の約０．０１５〜１０重量％、さらに好ましくは約 ２〜５重量％を占めるであろう。

常用の非経口的水性注射剤、例えば注射用蒸留水、リンゲル注射液、バンク注射 液、デキストロース注射液、塩注射液、生理的食塩水等をバイアルに注入するこ とにより、凍結乾燥された混合物を再溶解することができる。注射液はバイアル の側部に対して加えて、過剰の発泡を回避すべきである。バイアルに加えられる 注射液の量は典型的には１〜５Ｉｄ、好ましくは１〜２−の範囲であろう。

Ｍ、Ｋｎａｕｆらの「ホモポリマー接合を用いる医薬組成物のための組換え蛋白 質の可溶化」と題する、１９８７年１月１５日に公開されたＴＣＴ　ＷＯ３７１ ０００５６に記載されている他の製剤化においては（この開示を引用により本明 細書に組み入れる）、ＩＬ−２はポリエチレングリコール、ホモポリマー、及び ポリオキシエチル化ポリオール、例えばポリオキシエチル化グリセロールから選 択された活性化されたポリマーと反応する。このポリマーは好ましくは３００〜 １００．０００ダルトン、さらに好まＬ　＜　ｌ”　３５０〜４０．０００ダル トンの分子量を有する。このポリマーは、蛋白質の遊離アミン又はチオール基と 該ポリマーのヒドロキシル基の両方と反応する末端基を有するカップリング剤と の接合により活性化される。この様なカップリング剤の例にはヒドロキシニトロ ベンゼンスルホン酸エステル、シアヌル酸クロリド及びＮ−ヒドロキシサクシン イミドが含まれる０次に、ＩＬ−２は前記のような水溶性キャリヤー及び緩衝剤 と共に直接配合され、この配合物は凍結乾燥され、そして凍結乾燥された混合物 は前記のようにして再溶解することができる。

前記のようにして調製され、再溶解された製剤は、療法的に有効な量（すなわち 、患者の病的状態を除去又は緩和する量）においてヒト又は他の動物に非経口投 与又は経口投与してそれらの医療を提供するために適当である。ＩＬ−２療法は 、種々の免疫調節状態、例えばＴ細胞変異、細胞毒性Ｔ細胞の誘導、天然キラー 細胞活性の増大、ＪＰＮ−γの誘導、細胞性免疫の回復及び増強（例えば、免疫 不全状態の治療）、並びに細胞性抗腫瘍活性の増大、のために適当である。

本発明の製剤は、非経口投与、例えば静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、眼窩 内投与、眼中投与、色白投与、を稚内投与、でん部投与、局所投与、鼻内エーロ ドル投与、乱刺、そしてさらに経口投与のために有用である。好ましい投与経路 は筋肉内注射、皮下注射及び静脈内注射、並びに局所投与による。非イオン性活 剤は皮膚表面を貫通するため、その使用は局所投与される製剤のために特に好ま しい。

次の例は、本発明の方法及び組成物をさらに説明する。これらの例は本発明を制 限することをなんら意味するものではない。これらの例において、すべての温度 は特にことわらない限り°Ｃで示す、第１図は例により示される本発明の好まし い方法を示す。

肛 この例は組換えＩＬ−２を回収し、精製しそして製剤化するための好ましい方法 を例示する。

大腸菌からｄｅｓ−アラニル−ＩＬ　　２ｓｅｒｒｚｓを回収した。この例にお いて使用されたｄｅｓ−アラニル−ＩＬ−２Ｓｅｒｌ□、を生産する大腸菌の株 （Ｋ１２／ＭＭ２９４−１）はアメリカン・タイプ・カルチュアー・コレクショ ンに１９８４年３月４日に、受託番号３９、６２６に寄託されている。この類似 体及びその製造方法は米国特許ｋ　４．５１８．５８４に開示されている。

プラスミドｐＬＷ４５によりこうして形質転換された大腸菌を１０００　ｆの発 酵槽において３７℃にて増殖せしめた。必要により（１）撹拌を増加し、（２） 空気を添加し、そして（３）酵素を添加することにより溶存酵素を約４０％に維 持した。

発酵槽に有効容積まで水を満した後、次の微量要素を添加した。

Ｚｎ５Ｏ−・７　Ｈｚｏ　　　　　　　　　　　３０７／ＭＭｎＳＯ−・４１’ ｌｔ０　　　　　　　　　　３０ａＭＣｕＳＯａ　・５８ｚ０　　　　　　　　 　　３　ＪＩＭクエン酸Ｎａｘ　・２Ｈ２０１，５５Ｍ１［ＨｚＰＯａ　　　　 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２１ｍＭ（ＮＨ４）　ｚＳＯ ４７２＋Ｍ 次に、発酵槽、フィード容器及び添加容器を標準的操作法に従って殺菌した０次 に、下記の無菌添加を行った。

ＭｇＳＯ４・７１ｈＯ３ｍＭ ＦｅＳＯ４・７１１１０７２ｍ Ｌ−トリプトファン　　　　　　　　７０■／ｌチアミン・ＨＣ１２０■／ｌ グルコース　　　　　　　　　　　　５０ｇ／ｌテトラサイタリン　　　　　　 　　　５■／２発酵槽を冷却し、そして凍結又は種田大腸菌培養物を２■／２の 乾燥細胞重量で接種した０発酵の間、ＫＯＨを用いてｐＨを６．８に維持した。

サンプルの光学濃度の測定及び残留グルコースの測定を１４〜１６時間、及びそ の後約１時間の間隔で行った。

培地からのＬ−）リブトファンの消耗によるｄｅｓ−アラニル−ＩＬ　　２ｓｅ ｒＢｓの生産の誘導が約０Ｄｉｓｏ＝１０において起こり、これに続いてカザミ ノ酸を０Ｄｉｓａ＝１５において２％の最終濃度となるように添加した。培養物 を３〜５時間後に収得した。

次に、ｄｅｓ−アラニル−ＩＬ　　２ｓｅｒ＋ｚｓを含有する屈折体を単離した 。収得した材料を、１００Ｋ分子量カットオフのＵＳ向流濾過カートリッジに圧 力下で循環することにより、該材料を５〜１０倍に濃縮した。約６５００ｐｓ　 ｉ　（１９５気圧）にて破砕機を３回通すことにより細胞を破砕した０次にＥＤ ＴＡを５１の最終濃度まで加えた。懸濁液を５容量の脱イオン水に対してダイア フィルトレージョンした。オクタツールを１％（Ｖ／Ｗ）に加えて、ダイアフィ ルトレートされた生成物中のすべての残留生細菌を殺した。２１１１Ｍ　ＥＤＴ Ａを添加し、そして数時間の後、ダイアフィルトレートされた破砕物を破砕機に 通すことよりそれを再破砕した。

再破砕物にシュークロースを加えて１．１〜１．２５ｇ／ｄの最終密度を形成し た。混合物を８，０００〜２０，０ＯＯＸＧ、　１〜２１ｐ−にて遠心し、そし て粒子ペレット又はペーストを集めた。遠心分離の前及び遠心分離中に２０℃以 上の温度を保持した。

次に、粒子ペーストを、飽和グアニジン塩酸塩、５０＋＋Ｍ　ＤＴＴ　。

５０ａ＋Ｍ　Ｔｒｉｓ及び２５ｄ　ＥＤＴＡの水溶液、ペーストｇ当り１７１１ １と混合、ＮａＯＨによりｐＨを８．０に調整し、そして４０℃に約１０分間加 熱した。　３０００ＸＧにて１５分間遠心分離することにより未溶解物を混合物 から除去した。

精製の次の段階は、セファデックス（ＴＮ）　Ｑ　　２５カラムを用いるゲル濾 過によりＩＬ−２溶液（上清）からＤＴＴ及びＥＤＴＡを除去することであった 。カラムを、７Ｍグアニジン塩酸塩緩衝液ｐＨ７，５中で操作した。プロセスク ロマトグラムを用いてＩＬ−２ピークを集め、そしてこのピークをグアニジン塩 酸塩緩衝液により０．５■／Ｍｌの蛋白質濃度に稀釈した。

ＩＬ−２の酸化を、ＣｕＣｊ！ｚを３：１のモル比ＣＣｕＣ１ｚ　：　ＩＬ　　 ２　）で添加することにより開始した。この酸化は約２５℃にて７Ｍグアニジン 塩酸塩、１０＋ｓＭリン酸塩中で行った。酸化のあいだｐｌｌを７．５±０．２ に調節し、そして酸化が完了した時４ｍＭＥＤＴ＾を加えた。酸化されたＩＬ− ２は還元されたＩＬ−２よりも親水性であるので、酸化反応の進行をＲＰ−ＨＰ ＬＣによりモニターした。

次に、酸化されたＩＬ−２の生ずる溶液を１０ｍＭリン酸緩衝液により稀釈して グアニジン塩酸塩濃度を２Ｍに下げた。次に、１０．０００ダルトンのカットオ フを有する中容繊維膜限外濾過ユニットを用いてＩＬ−２濃度を２．５ｍｇ／ｍ ｅに上昇せしめた０次に、この溶液を１０ａＭリン酸緩衝液によりさらに稀釈し て０．２Ｍグアニジン塩酸塩とし、そしてそれを４°Ｃにて一夜放置して沈澱を 得た。

次に、無関係の大腸菌蛋白質及び幾らかのルー２から成る沈澱を酢酸セルロース フィルターを用いる濾過により除去して約８５％回収の再生されたＩＬ−２を得 た０次に、（ＮＨ４）　ｔｓＯａを上清に加えて１．２５Ｍの濃度とした。この 溶液をファルマシア・フェニル・ファスト−フロー・セファロース疎水性相互作 用カラムに負荷した。低下する（ｐｈｎａ）ｚｓｏｓ勾配によりＩＬ−２をカラ ムから回収し、ＩＬ−２を約０．９５〜０．７５Ｍ　（ＮＨａ）ｚｓＯａでの両 分中に集めた。このプールされた両分をダイアフィルトレージョンし、そして次 に、１０ｓ）’ＩリンＭ緩衝液によりｐ）１７で平衡化されたファルマシア・カ ルボキシメチル（ＣＭ）ファスト−フロー・セファロース・イオン交換カラムに 負荷した。ＩＬ−２画分を約０．１５Ｍ　ＮａＣｊ！において回収した。

得られるＩＬ−２は５ＯＳ−ＰＡＧＥ分析により９８％純度であり、そしてＨＰ ＬＣ分析により均一であった。その比活性は、ＨＴ−２細胞増殖アツセイにより 測定した場合８Ｘ１０’ユニツト／■であった。ＩＬ−２がＳＤＳにより可溶化 される米国特許Ｎα４．５６９，７９０に記載されている方法（この方法を引用 によりこの明細書に組み入れる）により製造された組換えＩＬ−２（Ｓ［ｌＳ− 法ＩＬ−２）に結合するポリクローナル抗体に、前記の再生された組換えｒｔ、 −２（グアニジン−法ＩＬ−２）が結合するか否かを決定するため、エンザイム ・リンクド・イムノソルベント・アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を行った。５ＤＳ−法 ＩＬ−２により治療された患者からの血清をアッセイ緩衝液（０，５％ＢＳＡ及 び０．０５％トウィーン２０を含むＰＢＳ）に１　：　１０００で稀釈し、そし て５ＤＳ−法ＩＬ−２又はグアニジン−法ＩＬ−２とＯ〜５ｎ／ｄの最終濃度と なるように混合した。２時間の室温インキュベーションの後、混合物を、１００ Ｉの容量で、５ＤＳ−法ＩＬ−２（ウェル当り１００Ｉｌｌの０．０５Ｍ　Ｎａ ｚＣＯｓ　、ｐＨ９，６中５ｇ／ｄ）によりあらかじめコートした９６ウエル・ ミクロエリサブレート（イムロン■、ダイナチック）に適用した。混合物をＩＬ −２でコートされたウェル中に３０分間放置し、この時点でプレートを０．０５ ％のトウィーン２０を含むＰＢＳ中で十分に洗浄し、そしてパーオキシダーゼ接 合ヤギ抗−ヒト１ｇＧｃ力ベル、１：１０００稀釈）を加えた。さらに２時間の インキュベーションの後、この第二抗体を除去し、そして基質（ＯＰＤ、シグマ 、１００Ｊ１！／ウエル）を加えた。　２０分間の後、各ウェルに５０Ｊ１！の ２ＮＨ１を加えることにより酵素反応を停止した。　４９０ｎａ＋における吸光 度をグイナテックＭＲ５８０プレートリーダー（参照波長４０５ｎｍ）を用いて 測定した。吸光度対競争抗原の量のプロットを第２図に示す、示されるように、 グアニジン−法ＩＬ−２は実質的に競争しなかった。

■１ １Ｌ−２再生段階（グアニジン塩酸塩の０．２Ｍへの低下の後の上滑の回収）に わたって例１を反復した。

ＩＬ−２溶液（８，８■の蛋白質）をトリフルオロ酢酸によりｐ）ｌλ１に酸性 化し、そして次に遠心分離してすべての沈澱物を除去した。これを、水中０．１ ％トリフルオロ酢酸により平衡化したＶｙｄａｃ　Ｃ−４シリカの３０ｃｍカラ ムの１．２５ｃｍに負荷した。

純粋なＩＬ−２の両分をプールし、そして次に７ＭグアニジンｐＨ７，５緩衝液 に透析した０次にこれを１１０１１Ｉリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に対して透析 した。沈澱をマイクロ遠心分離により除去し、上清中に６８％のＩＬ−２を回収 した。

屈折体粒子ペレットの回収にわたり例１を反復した。

約１１３．７ｇの固体グアニジン（最終濃度７Ｍ）を〜１４ｇの粒子ペーストに 加え、次に１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ／　２ｍＭ　ＥＤＴＡ緩衝液を約１９０ｄに加え た。ホモジナイズした後、〜１．５ｇの固体ＤＴＴ　（最終濃度５０ｍ１ｌ　） を加え、そしてｐＨ＠ＮａＯＨにより８〜ａ５に調整した。溶液を５０℃に１５ 分間加温して還元を促進させた０次に溶液を１０ｍＰＩ　Ｔｒｉｓ／　２＋ｅＭ 　ＥＤＴＡにより稀釈して最終容量２００ｉとした。

精製の次の段階はＩＬ−２材料から還元剤及び他の夾雑物を除去することであっ た。約２５ｄの還元されたＩＬ−２を７５ｄの７．０Ｍグアニジンにより約５〜 １０１！Ｉｇ　ＩＬ−２／Ｉ！１１に稀釈した。

この溶液をＴｒｉｓ／ＥＤＴＡ緩衝液により４，８Ｍグアニジンまで稀釈し、そ して２時間放置した。非常にわずかの沈澱が生じ、そしてこれを１０，０ＯＯＸ Ｇでの１５分間の遠心分離により除去した。

上清をＴｒｉｓ／　ＥＤＴＡ緩衝液により４．０Ｍグアニジンに稀釈し、そして 室温にて２時間放置した０重い沈澱を遠心分離（１０，０００ＸＧ、１５分間） により集めた。

ペレットを５０１ｎｌの２％トウィーン８０で１回洗浄し、そして５０ｄの水で ２回洗浄した。　１６．７ｇの固体グアニジンを添加し、そして溶液を水により ２５−にした、可溶化されたＩＬ−２を、１０ｍＭクエン酸塩（ｐＨ６，５）中 ７．０Ｍグアニジンにより１■／ｉに稀釈した。ＣｕＣｊ２ｚを添加しく　０． １　ｒａ！ｊに）、そしてｐＨを８〜８．５に調節した。この溶液を一夜撹拌し た。

ＹＭらせん巻カートリッジを用いてグアニジンをダイアフィルトレージョン除去 し、そしてＩＬ−２を約２■／ｄにｅＡ縮した。可溶性ＩＬ−２は、特に空気泡 による撹拌に対して感受性であるので、系から空気を除去するように注意した。

これを、１０ａ＋ｌ’ｌクエン酸ナトリウム（ｐＨ６，５）中２．５％シューク ロース及び１４０ｍＭ　ＮａＣ１の溶液１０容量に対してダイアフィルトレージ ョンした。　３０００ＸＧにて１５分間の遠心分離の後、０．６３■／−のＩＬ −２を含有する上滑６００ｉを集めた。さらに処理を進める前に、１０ｍＭクエ ン酸ナトリウム（ｐ）１６．５）〜の透析によりイオン強度を下げた。

クロマトグラフィーは、それぞれが１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６ ，５）により平衡化された２本のカラムから成った。第一カラムにはＤＥＡＥセ ファロース・ファスト−フロー（ファルマシア）を充填した。　１０ｍＭクエン 酸ナトリウム（ｐＨ６，５）中０．６３ｍｇ／ｄのＩＬ−２を２５ｍ　、　０． ５　ｄ／分の速度でＩＸ　１０ｃｍ０カラムを通して流した。プールのＮａＣｊ ’４度は４００１ＭＮａＣ４１！に調整した。第二カラムにはＣＭセファロース ・ファスト−フロー（ファルマシア）を充填した。　２８．５ｄの０．３８■／ ｄＩＬ−２を０．５ｄ／分で負荷した。ＩＬ−２はゲルに結合し、そして増加す るＮａＣ１勾配（１０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ６，５）　、０．３　ｄ１ 分〕により６時間にわたり溶出した。

０．７１■／−のＩＬ−２が約１２．６ｄプールされた。得られるＩＬ−２は分 析用ＲＰ−ＨＰＬＣにより９９％より高い純度を有していた。

肛 約５１１ｉのＩＬ−２含有屈折体を同容量の水と共にスラリー化し、グアニジン 緩衝液により溶解した。この溶液は７Ｍのグアニジン濃度及び３５ｄの容量を有 していた。溶液のｐＨを３ＭＴｒｉｓ塩基により約ａ、Ｏに調整した０次に、０ ．３ｇのＤＴＴを加え、そしてその溶液を約４５°Ｃに１５分間加熱した０次に 、この溶液を同容量の０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ５，０）により稀釈し、そ して１時間放置した。生成した沈澱を遠心分離（１０，０００ＸＧにて１０〜２ ０分間）により分離した。この沈澱を７０ｄの３．５Ｍグアニジンで４回及び７ ０ｇｄｌの水で２回洗浄した。

沈澱を７Ｍグアニジン中に溶解し、そして逆相ＨＰＬＣにより分析した。約２６ ５■のＩＬ−２が約９０％の純度で回収された。

前記のことから、本発明の方法は、（１）精製法が簡単であり、（２）最終製品 中に溶解剤が存在せず、そして（３）組換え！Ｌ−２が従来製造されていたもの に比べて免疫原性が低い、ことに関して利点を提供することが明らかであろう。

ＩＬ−２の発現のためにｔｒｐプロモーターを用いる前記のベクター系に加えて 、他のベクター系はラムダｐＬプロモーター及び／又は正のレトロレギュレーシ ョン要素の使用を含む、これらのベクター系は１９８７年１２月８日発行の米国 特許阻４．７１１．８４５及び１９８７年５月１９日発行の米国特許阻４，６６ ６．８４８に記載されており、両者の開示を引用によりこの明細書に組み入れる 。

上記の特許に記載されているベクター系、及び下記の追加のベクター系はアメリ カン・タイプ・カルチュア・コレクション（ＡＴＣＣ）　、メリーランド、ロッ クビル、パークラウン・ドライブ、１２３０１に、特許手続上の微生物の国際的 承認に関するブダペスト条約及びその規則のもとに寄託されており、そしてブダ ペスト条約に従って維持されそして入手可能にされる。これらの株の入手可能性 はいずれかの政府の権威のもとにその特許法に従って認められた権利を害して本 発明を実施する許諾であると解してはならない。

寄託されたプラスミドには下記のＡＴＣＣ寄託番号が与えられた。

生化学の分野及び関連分野における当業者に自明な、本発明を実施するための前 記のＢ欅の変法は、後記の請求の範囲内にあると意図される。

ＦｊＧ、ＩＣその１） 組換ＩＬ−２を含有￥？Ｄ細胞 １、向流ろ過による濃縮 ペレット （廃棄）　　　　　還元され変性されたＩＬ−２を含有する上清ＦＩＧ、Ｉ（そ の２） ＩＬ−２の精製 ＦＩＧ、２ １Ｌ２　　Ｓ１ｇ／ｍｌ 国際調査報告 国際調査報告

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. １．インターロイキン−２（ＩＬ−２）を含有する形質転換された微生物から精 製され再生された組換えＩＬ−２を回収する方法であって、 （ａ）微生物の細胞膜及び細胞壁を破砕し；（ｂ）破砕物から永不溶性ＩＬ−２ 含有物を分離し；（ｃ）段階（ｂ）の該不溶性ＩＬ−２含有物を約７〜約９のｐ Ｈにおいて、還元剤及び強変性濃度のチャオトロピック（ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ ）剤の水性液と混合し、これによって前記不溶物中のＩＬ−２を可溶化しそして 変性し；（ｄ）該ＩＬ−２含有溶液からＩＬ−２を沈澱せしめそしてその沈澱を 回収し； （ｅ）該ＩＬ−２沈澱物を可溶化し； （ｆ）強変性濃度でのチャオトロピック剤の濃度を維持しながら該溶液中のＩＬ −２を酸化し、これによってＩＬ−２の天然ジスルフィド橋を形成せしめ； （ｇ）段階（ｆ）の酸化が完了した後、溶液中のチャオトロピック剤の濃度を、 酸化されたＩＬ−２が再生されそして沈澱が生ずるレベルに低下せしめ； （ｈ）段階（ｇ）の沈澱を溶液から分離して上清を得；（ｉ）該上清中の酸化さ れそして再生されたＩＬ−２を、（１）逆相高速液体クロマトグラフィー並びに それに続くチャオトロピック剤の溶液中でのプールの可溶化及び該溶液からのチ ャオトロピック剤の除去により、又は（２）イオン交換クロマトグラフィーと組 み合わされた疎水性相互作用クロマトグラフィーにより、又は（３）イオン交換 クロマトグラフィーにより精製し；そして、 （ｊ）還元的ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動分析によ り測定した場合９５％以上のＩＬ−２含量を有し、リン酸緩衝液中でｍｌ当り５ ｍｇ以上のＩＬ−２の溶解性を有し、ＨＴ−２細胞増殖アッセイにより測定した 場合１×１０７ユニット／ｍｇ以上の比活性を有し、そしてエンドトキシン含量 がＩＬ−２ｍｇ当り約０．１ナノグラム未満である、精製されそして酸化された 可溶性異腫性ヒトＩＬ−２組成物を回収する；ことを含んで成る方法。
2. ２．前記チャオトロピック剤がグアニジン塩酸塩であり、そして前記強変性濃度 が約６Ｍ以上である、請求項１に記載の方法。
3. ３．段階（ｅ）において、グアニジン塩酸塩の濃度を約５Ｍ未満に低下せしめる ことによりＩＬ−２沈澱を生成せしめる、請求項１に記載の方法。
4. ４．前記グアニジン垣酸塩の濃度が約３〜４Ｍである、請求項３に記載の方法。
5. ５．段階（ｅ）に先立って、前記ＩＬ−２沈澱を遠心分離により集めそして緩衝 液で洗浄する、請求項３に記載の方法。
6. ６．前記緩衝液が約２〜４Ｍグアニジン塩酸塩を含んで成る、請求項５に記載の 方法。
7. ７．前記酸化を、酸化促進剤としてのＣｕ＋２イオン又は酸化剤としてのｏ−ヨ ードソ安息香酸を用いて制御する、請求項１に記載の方法。
8. ８．段階（ｇ）において、グァニジン塩酸塩の濃度を約２Ｍ未満に低下せしめる 、請求項２に記載の方法。
9. ９．前記還元剤がジチオスレイトールであり；段階（ｄ）において、グアニジン 塩酸塩の濃度を約５Ｍ未満に低下せしめることによりＩＬ−２を沈澱せしめ；前 記酸化が酸化促進剤としてＣｕ＋２イオンを用いる制御された酸化であり；段階 （ｇ）において、グアニジン塩酸塩の濃度を約０．５Ｍ未満に低下せしめ；そし て段階（ｉ）において、上清中の酸化されたＩＬ−２を、ＤＥＡＥセファロース カラム及びカルボキシメチルセファロースカラムを用いるイオン交換クロマトグ ラフィーにより精製する、請求項２に記載の方法。
10. １０．前記還元剤がジチオスレイトールであり；段階（ｄ）において、グアニジ ン塩酸塩の濃度を約５Ｍ未満に低下せしめることによりＩＬ−２を沈澱せしめ； 前記酸化が酸化促進剤としてＣｕ＋２イオンを用いる制御された酸化であり；段 階（ｇ）において、グアニジン塩酸塩の濃度を約０．５Ｍ未満に低下せしめ；そ して段階（ｉ）において、上清中の酸化されたＩＬ−２を逆相高速液体クロマト グラフィーにより精製する、請求項２に記載の方法。
11. １１．前記還元剤がジチオスレイトールであり；段階（ｄ）において、グアニジ ン塩酸塩の濃度を約５Ｍ未満に低下せしめることによりＩＬ−２を沈澱せしめ； 前記酸化が、酸化促進剤としてＣｕ＋２イオンを用いる制御された酸化であり； 段階（ｇ）において、グアニジン塩酸塩の濃度を約０．５Ｍ未満に低下せしめ； そして段階（ｉ）において、上清中の酸化されたＩＬ−２を、フェニルアガロー スカラムを用いる疎水性相互作用クロマトグラフィー及びカルボキシメチルセル ロースカラムを用いるイオン交換クロマトグラフィーにより精製する、請求項２ に記載の方法。
12. １２．ＩＬ−２がｄｅｓ−ａｌａ−ＩＬ−２ｓｅｒ１２５である、請求項１〜１ １のいずれか１項に記載の方法。
13. １３．ＩＬ−２組成物が、１．０×１０３ユニット／ｋｇの投与量でのＵ．Ｓ． Ｐ．ラビット・パイロジエン・テストにより測定した場合にパイロジエンを実質 的に含有しない、請求項１に記載の方法。
14. １４．請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法による生成物。
15. １５．（ａ）リン酸緩衝液（ＰＢＳ）中で約５ｍｇ／ｍｌ以上の溶解性を有し； （ｂ）ＰＢＳ中で凝集せず； （ｃ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した場合９８％以上の純度を有し；（ｄ）エンド トキシンの含有量がＩＬ−２ｍｇ当り約０．１ｎｇ未満であり；そして （ｅ）ＨＴ−２細胞増殖アッセイにより測定した場合に約１×１０７ユニット／ ｍｇ以上の比活性を有する；精製され再生された組換えインターロイキン−２（ ＩＬ−２）。
16. １６．ＩＬ−２がｄｅｓ−ａｌａ−ＩＬ−２ｓｅｒ１２５である、請求項１５に 記載の精製され再生されたＩＬ−２。