NO176797B - Fremgangsmåte for utvinning av renset, renaturert rekombinant interleukin-2 fra mikroorganismer - Google Patents
Fremgangsmåte for utvinning av renset, renaturert rekombinant interleukin-2 fra mikroorganismer Download PDFInfo
- Publication number
- NO176797B NO176797B NO885678A NO885678A NO176797B NO 176797 B NO176797 B NO 176797B NO 885678 A NO885678 A NO 885678A NO 885678 A NO885678 A NO 885678A NO 176797 B NO176797 B NO 176797B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- concentration
- oxidation
- guanidine hydrochloride
- des
- solution
- Prior art date
Links
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 title claims abstract description 202
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 57
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims abstract description 20
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims abstract description 16
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 title claims description 195
- 238000011084 recovery Methods 0.000 title description 9
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 claims abstract description 41
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 claims abstract description 38
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 27
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 claims abstract description 26
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims abstract description 21
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 claims abstract description 18
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims abstract description 10
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 51
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 40
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 37
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 23
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 22
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- 229960004198 guanidine Drugs 0.000 claims description 20
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 16
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 15
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 14
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical group SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 claims description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 10
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 claims description 8
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 8
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 claims description 8
- 125000002057 carboxymethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[*] 0.000 claims description 7
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 6
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 6
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 6
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 claims description 6
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 6
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 claims description 5
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 claims description 4
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 claims description 4
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 claims description 4
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 claims description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 4
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 claims description 4
- 239000002510 pyrogen Substances 0.000 claims description 4
- CJNZAXGUTKBIHP-UHFFFAOYSA-N 2-iodobenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1I CJNZAXGUTKBIHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 claims description 3
- 150000002357 guanidines Chemical class 0.000 claims description 3
- 238000011046 pyrogen test Methods 0.000 claims description 3
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 claims description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 2
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 claims description 2
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 claims 4
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 23
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 23
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 22
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 18
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 17
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 17
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 15
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 12
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 12
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 11
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 10
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 10
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 10
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 10
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 10
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 9
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 8
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 8
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 8
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 8
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 8
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 7
- KBPLFHHGFOOTCA-UHFFFAOYSA-N 1-Octanol Chemical compound CCCCCCCCO KBPLFHHGFOOTCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 6
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 6
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 5
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 5
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 5
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 5
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 5
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 5
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 4
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 4
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 4
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 3
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- -1 alkali metal thiocyanate Chemical class 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 3
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 238000000703 high-speed centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 3
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 3
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 3
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 229910021591 Copper(I) chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910021592 Copper(II) chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 239000002585 base Substances 0.000 description 2
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 2
- OXBLHERUFWYNTN-UHFFFAOYSA-M copper(I) chloride Chemical compound [Cu]Cl OXBLHERUFWYNTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- ORTQZVOHEJQUHG-UHFFFAOYSA-L copper(II) chloride Chemical compound Cl[Cu]Cl ORTQZVOHEJQUHG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000007822 coupling agent Substances 0.000 description 2
- 238000009295 crossflow filtration Methods 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 239000008062 guanidine hydrochloride buffer Substances 0.000 description 2
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- IFPHDUVGLXEIOQ-UHFFFAOYSA-N ortho-iodosylbenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1I=O IFPHDUVGLXEIOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 2
- 229960004799 tryptophan Drugs 0.000 description 2
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WFIYPADYPQQLNN-UHFFFAOYSA-N 2-[2-(4-bromopyrazol-1-yl)ethyl]isoindole-1,3-dione Chemical compound C1=C(Br)C=NN1CCN1C(=O)C2=CC=CC=C2C1=O WFIYPADYPQQLNN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DBTMGCOVALSLOR-UHFFFAOYSA-N 32-alpha-galactosyl-3-alpha-galactosyl-galactose Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(OC2C(C(CO)OC(O)C2O)O)OC(CO)C1O DBTMGCOVALSLOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- BHELIUBJHYAEDK-OAIUPTLZSA-N Aspoxicillin Chemical compound C1([C@H](C(=O)N[C@@H]2C(N3[C@H](C(C)(C)S[C@@H]32)C(O)=O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC(=O)NC)=CC=C(O)C=C1 BHELIUBJHYAEDK-OAIUPTLZSA-N 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 101001002617 Bos taurus Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- RXVWSYJTUUKTEA-UHFFFAOYSA-N D-maltotriose Natural products OC1C(O)C(OC(C(O)CO)C(O)C(O)C=O)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 RXVWSYJTUUKTEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- 206010017533 Fungal infection Diseases 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 101100232904 Homo sapiens IL2 gene Proteins 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003231 Lowry assay Methods 0.000 description 1
- 238000009013 Lowry's assay Methods 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 1
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 241000609499 Palicourea Species 0.000 description 1
- 208000030852 Parasitic disease Diseases 0.000 description 1
- 108010089814 Plant Lectins Proteins 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000010362 Protozoan Infections Diseases 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000008043 acidic salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001447 alkali salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000000961 alloantigen Effects 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 1
- 238000006701 autoxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000004067 bulking agent Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- MGNCLNQXLYJVJD-UHFFFAOYSA-N cyanuric chloride Chemical compound ClC1=NC(Cl)=NC(Cl)=N1 MGNCLNQXLYJVJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N cystine group Chemical group C([C@@H](C(=O)O)N)SSC[C@@H](C(=O)O)N LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 239000008355 dextrose injection Substances 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 239000003349 gelling agent Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 150000002314 glycerols Polymers 0.000 description 1
- 108700003606 glycosylated interleukin 2 Proteins 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000013542 high molecular weight contaminant Substances 0.000 description 1
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 1
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 1
- 210000005104 human peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N hydrogen thiocyanate Natural products SC#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 210000003810 lymphokine-activated killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- FYGDTMLNYKFZSV-UHFFFAOYSA-N mannotriose Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(CO)OC(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)C(O)C1O FYGDTMLNYKFZSV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 229940016286 microcrystalline cellulose Drugs 0.000 description 1
- 235000019813 microcrystalline cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008108 microcrystalline cellulose Substances 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000037368 penetrate the skin Effects 0.000 description 1
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 1
- 239000007981 phosphate-citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000003726 plant lectin Substances 0.000 description 1
- 108010058237 plasma protein fraction Proteins 0.000 description 1
- 229940081857 plasma protein fraction Drugs 0.000 description 1
- 229920001583 poly(oxyethylated polyols) Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920005638 polyethylene monopolymer Polymers 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910001414 potassium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000009696 proliferative response Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 235000017550 sodium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229910001415 sodium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- VGTPCRGMBIAPIM-UHFFFAOYSA-M sodium thiocyanate Chemical compound [Na+].[S-]C#N VGTPCRGMBIAPIM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 235000010356 sorbitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000009987 spinning Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 208000011117 substance-related disease Diseases 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 125000000185 sucrose group Chemical group 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- 239000007916 tablet composition Substances 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 210000003171 tumor-infiltrating lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- FYGDTMLNYKFZSV-BYLHFPJWSA-N β-1,4-galactotrioside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@H](CO)O[C@@H](O[C@@H]2[C@@H](O[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O FYGDTMLNYKFZSV-BYLHFPJWSA-N 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
- C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
- C07K1/1133—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure by redox-reactions involving cystein/cystin side chains
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/55—IL-2
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte for utvinning av renset, renaturert rekombinant interleukin-2 (IL-2) fra transformerte mikroorganismer hvori de blir produsert. IL-2, et lymfokin som blir produsert av normale perifere blodlymfocytter og som induserer proliferasjon av antigen eller mitogen stimulerte T-celler etter eksponering til plantelektiner, antigener, eller andre stimuli, ble først beskrevet av Morgan, D.A., et al, Science (1976) 193:1007-1008. Deretter ble det betegnet T-celle vekstfaktor på grunn av dets evne til å indusere proliferasjon av stimulerte T-lymfocytter og det er nå blitt oppdaget at i tillegg til vekstfaktoregenskapene så modulerer det en mengde funksjoner til immunsystemceller in vitro og in vivo og navnet er blitt skiftet til IL-2. IL-2 er en av flere lymfocytt-produserte messenger (beskjed) -regulatoriske molekyler som tilveiebringer immunocyttinteraksjoner og funksjoner. IL-2 ble opprinnelig fremstilt ved kultivering av humane perifere blodlymfocytter (PBL) eller andre IL-2-produserende cellelinjer. Se, blant annet, US-PS 4,401,756. Rekombinant DNA-teknologi har tilveiebragt et alternativ til PBLer og cellelinjer for produsering av IL-2. Taniguchi, T., et al, Nature (1983) 302:305-310 og Devos, R., Nucleic Acids Research (1983) 11:4307-4323 har rapportert kloning av det humane IL-2-genet og uttrykking av dette i mikroorganismer.
Nativt humant IL-2 er en antigen-uspesifikk, genetisk ubeskyttet oppløselig faktor produsert av erytrocytt rosett-positive T-celler stimulert med antigener, mitogener eller alloantigener. Det er et protein med en rapportert molekylvekt i et omtrentelig område på 13.000 til 17.000 daltons (S. Gillis og J. Watson, J. Exp. Med (1980) 159:1709) og et isoelektrisk punkt i et omtrentelig område på pH 6-8,5. Humant IL-2 har et antall in vitro og in vivo effekter innbefattende forsterking av de proliferative responsene til humane perifere blodmononukleære celler eller murine tymo-cytter, forsterking av immunresponsen i mennesker og i dyr mot bakteriell, parasittisk, sopp, protozo og virale infek-sjoner, og understøtting av veksten av kontinuerlige T-cellelinjer.
Humant IL-2 er blitt tilveiebragt fra genetisk omkonstruert E. coli som et uglykosylert protein med biologiske aktivi-teter som var ekvivalente til nativt, glykosylert IL-2.
(Taniguchi et al, Nature (1983) 11:4307-4323, Rosenberg et al, Science (1984) 223:1412-1415, Wang et al, Science (1984) 224:1431-1433; og Doyle et al, J Biol Resp Modifiers (1985) 4:96-109). Rosenberg og hans medarbeidere har vist at systemisk administrasjon av rekombinant IL-2 i høye doser forårsaker regresjon av etablerte metastatiske svulster i mus (Rosenberg et al, J. Exp. Med (1985) 161:1169-1188); og, sammen med lymfokin-aktiverte drepende (killer) celler (Rosenberg et al, New Eng J Med (1985 ) 313:1485-1492) og lymfocytter med svulst-infiltrasjon (Rosenberg et al, Science
(1986) 233:1318-1321), i mennesker.
U.S. patentnummer 4,518,584 beskriver muteiner (analoger) av IL-2 hvori cysteinet som vanligvis oppstår i posisjon 125 i vill-type eller det native molekylet er blitt erstattet med en nøytral aminosyre, såsom serin eller alanin. Europa patent (EP) publikasjon 200,280 beskriver muteiner av IL-2 hvori metionin i posisjon 104 er blitt erstattet med en konservativ aminosyre.
Mikrobielt produsert IL-2 blir ikke glykosylert og blir hovedsakelig produsert i en denaturert tilstand. Den er stort sett uoppløselig og, når uttrykt i høye nivåer, presipiteres den intracellulært i form av "refraktile" eller "innleirende" legemer som fremkommer som lyse flekker som er synlige innenfor celleområdet under et fase kontrastmikroskop ved forstørrelser ned til 1000 ganger. Problemet som er fremsatt ifølge foreliggende oppfinnelse innbefatter hvordan man effektivt kan utvinne IL-2 fra cellen i en renset, cystein-brodannet, renaturert form som er akseptabel for klinisk anvendelse.
De fra før tilgjengelige metodene for utvinning av mikrobielt produsert IL-2 er beskrevet nedenfor.
US-PS 4,569,790 beskriver en fremgangsmåte for utvinning av rekombinant IL-2 fra en IL-2-produserende mikroorganisme hvori cellen blir ødelagt, og disruptatet blir ekstrahert med en vannholdig oppløsning av et kaotropisk middel, såsom urea, IL-2 blir oppløst med et overflateaktivt middel, f.eks. natriumdodecylsulfat (SDS), og IL-2 blir separert i nærvær av et reduserende middel.
US-PS 4,530,787 og 4,572,978 beskriver fremgangsmåter for rensing av rekombinant IL-2 fra mikroorganismer hvori delvis renset IL-2 blir selektivt oksydert under kontrollerte betingelser til dets oksyderte (cystin) form. Det første patentet anvender o-jodosobenzosyre som et oksyderingsmiddel og det siste anvender Cu<+>^ kationet som en fremmer for oksydasjon.
Europa patentpuplikasjon 206,828 publisert 30. desember 1986, og med tittelen "Process for Recovering Refractile Bodies Containing Eeterologous Proteins from Microbial Hosts" beskriver fremgangsmåter for utvinning og rensing av refraktile legemer av IL-2 fra E. coli. For å isolere det refraktile stoffet, innbefatter fremgangsmåten først ødelegging av celleveggen og membranen til vertscellen, fjerning av mere enn 99 vekt-# av saltene fra disruptatet, deretter påny ødelegge det avsaltede disruptatet, tilsetting av et stoff til disruptatet for å danne en tetthetsgradient eller viskositetsgradient i væsken som er i disruptatet, og separering av det refraktile stoffet fra celledebriet ved sentrifugering ved høy hastighet. IL-2 blir deretter oppløst med et oppløsningsmiddel såsom SDS, kromatografert for å fjerne forurensninger med høy molekylvekt, oksydert, og renset ved en kombinasjon av HPLC, ultrafiltrering og gelf iltrering.
Et sammendrag med tittel "Purification and Renaturation of Recombinant Interleukin-2" presentert ved 6th International Symposium on HPLC of Proteins, Peptides and Polynucleotides i Baden-Baden, Vest-Tyskland i oktober 1986 beskriver en fremgangsmåte hvori rekombinant IL-2 blir løst opp fra innleirings-legemer med 6 M guanidinhydroklorid/10 mM ditiotreitol (DTT) og renset i en redusert, denaturert form ved FPLC gelgjennomtrengning. Oppløsningen fra FPLC gel-gjennomtrengningen blir fortynnet for å tilveiebringe renaturering og autooksydasjon. I dette henseendet beskriver US patentene numrene 4,511,502; 4,511,503; 4,512,922 og 4,518,526; og EP publikasjon 114,506 en lignende fremgangsmåte for rensing av heterologe proteiner generelt fra refraktile legemer. I slike fremgangsmåter, blir oksyderingen og renatureringen av IL-2 utført i et enkelt trinn. Men fordi karakterene for oppløselighet er forskjellig mellom den reduserte og oksyderte formen av IL-2, er det vanskelig å oppnå høyt utbytte av renaturert oksydert IL-2 i en slik f remgangsmåte.
EP publikasjon 145,390 beskriver en fremgangsmåte for utvinning av rIL-2 fra E. coli hvori cellene blir suspendert i 7 M guanadinhydroklorid, de faste stoffene blir fjernet ved sentrifugering, rIL-2 inneholdende supernatanten blir dialysert for å fjerne guanidinhydroklorid og dialyzatet blir renset ved anion-byttekromatografi, gelfiltrering og RP-HPLC.
Foreliggende oppfinnelse er rettet mot en forbedret rekombinant IL-2 rensingsprosess hvori oksydering og renaturering blir utført i distinkte trinn.
Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte med høyt utbytte hvori IL-2 blir separert fra et cellulært disruptat i form av et refraktilt legeme, løst opp med et kaotropisk middel og oksydert og renaturert i separate trinn etterfulgt av rensing til et klinisk akseptabelt nivå.
Mere spesifikt vedrører oppfinnelsen en fremgangsmåte for utvinning av renset oppløselig rekombinant IL-2 fra en transformert mikroorganisme inneholdende IL-2 innbefattende: (a) ødelegging av cellemembranen og celleveggen til mikroorganismen ; (b) separering av det vannuoppløselige IL-2-inneholdende materialet fra disruptatet; (c) blanding av det uoppløselige IL-2-inneholdende materiale fra trinn (b) ved en pE på omtrent 7 til omtrent 9 med en vannholdig oppløsning av et guanidinsalt på minst 6M og et reduksjonsmiddel hvorved IL-2 i det uoppløselige materialet blir løst opp og denaturert; (d) presipitat av IL-2 fra den IL-2-inneholdende oppløsningen og utvinning av presipitatet; (e) oppløsning av IL-2-presipitatet; (f) oksydering av IL-2 i oppløsningen, mens konsentrasjonen av det kaotrofiske middelet blir opprettholdt ved en sterk denaturerende konsentrasjon hvorved den naturlige disulfid-broen i IL-2 dannes; (g) etter at oksydasjonen i trinn (f) er fullført, reduseres guanidinkonsentrasjonen i oppløsningen slik at oksydert IL-2 blir renaturert og et presipitat blir dannet; (h) separering av presipitatet fra trinn (g) fra oppløsningen for å tilveiebringe en supernatant; (i) renser oksydert IL-2 i supernatanten ved (1) revers-fase høy prestasjon-væskekromatografi etterfulgt av at man oppløser de sammenblandede fraksjonene 1 en oppløsning av kaotropisk middel og fjerner det kaotropiske middelet fra oppløsningen, eller (2) hydrofob interaksjonskromatografi kombinert med ionebytte-kromatografi, eller (3) ionebytte-kromatografi; og (j ) utvinner et renset oksydert, oppløselig heterolog human IL-2-sammensetning med et IL-2-innhold på minst omtrent 95% som bestemmes ifølge redusert natriumdodecylsulfatpolyakryl-amidgelelektroforese-analyse, en oppløselighet i fosfatbufret saltvann på minst 3 mg IL-2 per ml, en spesifikk aktivitet på minst omtrent 1 x IO<7> enheter/mg som bestemmes ifølge HT-2 celleproliferasjonsanalyse, og et endotoksininnhold på mindre enn omtrent 0,1 nanogram pr. mg IL-2. Figur 1 er et arbeidsdiagram av den foretrukne fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. Figur 2 er en grafisk fremstilling av resultatene av immuno-analysen beskrevet i eksempel 1, nedenfor. De lukkede sirklene representerer SDS-prosess IL-2 og de lukkede firkantene representerer guanidin-prosess IL-2, begge er beskrevet i eksempelet.
Fremgangsmåter for utføring av oppfinnelsen
A. Definis. joner
Betegnelsen "IL-2" refererer til rekombinant interleukin-2 eller interleukin-2-lignende polypeptider produsert av en transformert mikroorganisme og hvori aminosyresekvensen er den samme som eller lignende eller vesentlig homolog med uglykosylert og/eller glykosylert nativt interleukin-2. Eksempler på slike rekombinante IL-2er er de som er beskrevet i Europa publisert patentsøknader 91,539, 88,195, og 109,748, og likeledes de som er beskrevet i U.S. patentnr. 4,518,584, patentanmeldt, tilegnet U.S. serienr. 893,186, inngitt 5. august 1986, EP publikasjon 200,280, og bovint IL-2 som "beskrevet av Cerretti et al, Proe Nati Acad Sei USA (1986) 83:3223-3227. Beskrivelsene av alle disse referansene er inkorporert heri ved referanse.
Rekombinante IL-2er som er spesielt foretrukket er de biologisk aktive muteinene (analoger) av humant IL-2 hvori aminosyreresidiene som ikke er essensielle for biologisk aktivitet med hensikt er blitt deletert i noen tilfeller eller erstattet med en konservativ aminosyre, som angitt nedenfor. Foretrukne rekombinante IL-2er innbefatter de hvori cysteinresidiet i posisjon 125 er erstattet med en annen aminosyre, fortrinnsvis nøytral eller konservativ, for å eliminere seter for intermolekylær kryssbinding eller uriktig intramolekylær disulfid og, eventuelt, er det N-terminale alaninresidiet til den native motparten fjernet. Som anvendt heri, innbefatter slike nøytrale eller konservative aminosyrer glycin, serin, valin, alanin, leucin, isoleucin, tyrosin og metionin. Foretrukne rekombinante IL-2-muteiner i formuleringen ifølge foreliggende oppfinnelse er de hvori (1) cysteinresidiet i aminosyreposisjon 125 til den native motparten er erstattet med et serinresidie (betegnet IL-<2>seri25) eller alaninresidiet (betegnet IL-2aiai25); eller (2) det opprinnelige alaninresidiet er eliminert og cystein i posisjon 125 er erstattet med serin (betegnet des-alanyl-IL-2serl25 ) •
Andre IL-2er som er spesielt foretrukket heri er de biologisk aktive muteinene beskrevet i Europa patentpublikasjon 200,280 hvori oksydasjons-mottagelige metioninresidier er erstattet med en nøytral eller konservativ aminosyre; et foretrukket mutein innbefatter erstatning av metionin i posisjon 104 med en konservativ aminosyre såsom alanin.
EP 200,280 beskriver også amino-terminale delesjoner av IL-2 hvori en eller flere av de første seks aminosyrene er deletert. Foretrukne oksydasjons-resistente muteiner innbefatter alaiø4seri25lL-2, ala^04lL-2, ala104ala125-IL-2 ' valio4lL-2, val104ala125IL_2 » val104ala125<I>L_2» des-ala^ala^Q4<s>eri25IL-2» des-ala^al<a>^04IL~2» des-ala^alaio4<a>lai25I^-2, des-alaival^04se<r>125IL_2» des-ala^val 104^-2 , des-alaivalig4alai25lL-2» des-ala^des-pro2ala^Q4ser^25lL-2 , des-ala^-des-pro2ala^Q4lL-2, des-ala^des-pro2ala^Q4ala^25lL-2, des-ala^des-pro2val^Q4<s>er^25<l>L-2, des-alaides-prc>2-valio4lL-2 , des-ala^des-pro2val^Q4ala125-'--L-2» des-ala^des-prc^des-thr3ala^04ser125-^L-2 , des-alaides-pro2des-
thr3ala^Q4lL-2 , des-alaides-pro2-des-thr3alaio4ala125IL~2 > des-ala^des-pro2des-thr3-val^Q4<s>er125-I<->Ij"2» des_ ala^des-pro2des-thr3va<l>-LQ4lL-2, des-ala^des-pro2des-thr3val204alai25^^-2 » des-ala^des-prc^des-thr3des-ser4alaio4seri25-'-L-2 , des-ala^des-pro2des-thr3des-ser4alaiø4iL_2, des-ala^des-pr02des-thr3des-ser4ala^Q4al<a>^25^L-2, des-alaides-prc^des-th^des-ser4val^Q4ser^25lL-2, des-alaides-prc^des-th^des-ser4valiQ4lL-2, des-ala^des-prc^des-th^des-ser4val204al<a>i251^-2» des-ala^des-pro2des-thr3des-ser4des-ser5ala^04ser125IIj_2» des-ala^des-prc^des-thr3des-ser4des-ser5ala104IL"2» des-ala^des-prc^des-thr3des-ser4des-ser5ala1Q4ala^25~lL'-2, des-ala^des-pro2des-thr3des-ser4des-ser5va<l>^04_seri25IL-2» des_ ala^des-pro2des-thr3des-ser4des-ser5-val104IL-2, des-ala^des-pro2des-thr3des-ser4des-ser5-val^04_ala125^L-2 » des-ala^des-prc^des-th^des-se^-des-se^des-ser5alaio4al<a>125^L_2» des-ala^des-prc^-des-th^des-ser4des-ser5des-ser^,ala104IL~2» des-ala^des-prc^des-thr3des-ser4des-ser5des-ser5ala104ser^25lL-2, des-al a-^des-pr 02de s-thr 3de s-sendes-ser 5-des-ser^va<l>^Q4ser^25IL-2, des-alaides-prc^des-th^-des-ser4des-ser5des-ser£,val104IL~2» eller des-ala^des-prc^es-thr3des-ser4des-ser5des-ser5val^Q4-ala^25IL-2.
Andre aminoterminale delesjoner i IL-2 er beskrevet i Chemical Abstracts (1987) 106:(21):170236f, et sammendrag fra japansk patentpublikasjon nr. 61/225199, publisert 6. oktober 1986, hvori et hvilket som helst av de første 15 aminosyrene i IL-2 er deletert. PCT 87/04714, publisert 13. august 1987 beskriver delesjoner eller erstatninger av en eller flere av aminosyreresidiene i posisjonene 2 til 11 og/eller 128 til 133 fra den amino-terminale alanin i IL-2.
Den nøyaktige kjemiske strukturen til IL-2-proteinet avhenger av et antall faktorer. Da ioniserbare amino- og karboksyl-grupper er tilstede i molekylet, kan et bestemt rekombinant IL-2-protein bli tilveiebragt som et surt eller basisk salt, eller i nøytral form. Alle slike preparater som har beholdt aktiviteten når de blir plassert i egnede omgivende betingelser er innbefattet i definisjonen av IL-2-proteinene heri. Den primære aminosyresekvensen til proteinet kan bli for-lenget ved derivatisering ved anvendelse av sukkerbestand-deler (glykosylering) eller ved anvendelse av andre tilleggs-molekyler, såsom lipider, fosfat, acetylgrupper og lignende, vanligvis ved konjugasjon med sakkarider. Visse aspekter av slik forlenging blir tilveiebragt gjennom post-translasjons-prosesseringssystemer i den produserende verten; andre slike modifikasjoner kan bli innført in vitro. Slike modifikasjoner er uansett innbefattet i definisjonen av IL-2-proteinet heri forutsatt at aktiviteten til proteinet, som definert ovenfor, ikke er ødelagt. Det er selvfølgelig ventet at slike modifikasjoner kan kvantitativt eller kvalitativt påvirke den biologiske aktiviteten, enten ved forsterking eller redusering av aktiviteten til proteinet i de forskjellige analysene.
Betegnelsen "transformert" til beskrivelse av vertsmikro-organismecellekulturer betegner en mikroorganisme som er blitt genetisk omkonstruert til å produsere et IL-2 polypep-tid som har evnen til å ha aktiviteten til nativt IL-2. Bakterier er foretrukne mikroorganismer for produsering av IL-2-protein. E. coli er spesielt foretrukket.
Betegnelsen "kaotrofisk" middel betegner en forbindelse eller forbindelser som, i vannholdig oppløsning og i en egnet konsentrasjon, har evnen til denaturering av rekombinant IL-2. Korrelativt refererer betegnelsen "sterkt denaturerende konsentrasjon" til en oppløsning av et kaotrofisk middel som effektivt "folder-opp" eller denaturerer rekombinant IL-2. Guanidinsalter (f.eks. hydroklorid) og alkalimetalltiocyanat (f.eks. natriumtiocyanat) ved konsentrasjoner i området på omtrent 4 til 9 M, fortrinnsvis 6-9 M, er eksempler på kaotrofisk middeloppløsninger som vil løse opp og denaturere rekombinant IL-2.
Cellevekst
IL-2-produserende transformerte mikroorganismer blir dyrket i et egnet vekstmedium, vanligvis til en optisk tetthet (OD) på minst omtrent 30 til 680 nm, og fortrinnsvis mellom omtrent 20 og 40 ved 680 nm. Sammensetningen av vekstmediumet avhenger av den bestemte mikroorganismen som er involvert. Mediumet er et vannholdig medium inneholdende forbindelser som oppfyller ernæringskravene til mikroorganismer. Vekstmediumet inneholder vanligvis fordøyelige kilder av karbon og nitrogen, energikilder, magnesium, kalium og natriumioner, og eventuelt aminosyrer og purin og pyrimidinbaser. (Se Review of Medical Biology, Lange Medical Publications, 14th Ed. s. 80-85 (1980)). I ekspresjonsvektorer som innbefatter trp-promoteren, er tryptofankonsentrasjonen i mediumet nøyaktig kontrollert for å bli begrensende på det tidspunktet hvor proteinekspresjon er ønskelig. Vekstmedia for E. coli er velkjent innenfor fagområdet.
Etter at cellene er høstet fra kulturen, kan de bli konsentrert, hvis nødvendig, til omtrent 20 til 150 mg/ml, fortrinnsvis 80 til 100 mg/ml (OD 40 til 300, fortrinnsvis 160 til 200 ved 680 nm) ved kryss-strømningsfiltrering, sentrifugering, eller andre konvensjonelle metoder.
Celleoppbryting
Etter konsentrering av høstet kultur blir cellemembraner og cellevegger til mikroorganismene brutt opp. En forbindelse som ikke er giftig for mennesker, såsom 1-oktanol, i en mengde på omtrent 1 vekt-# av totale komponenter, blir satt til de oppbrutte cellene for å forsikre at det ikke er noen levedyktige rekombinante organismer igjen. Konvensjonelle celleoppbrytingsteknikker, såsom homogenisering, sonikering, eller trykkbelastning kan bli anvendt i dette trinnet av prosessen. Sluttpunktet for oppbrytningstrinnet kan bli bestemt ved registrering av den optiske tettheten med absorbans ved 260 nm av suspensjonen som vanligvis øker ved cellelysis og ved mikroskopisk observasjon. I et hvert tilfelle bør oppbrytingen foregå slik at det i vesentlig grad ikke er noen intakte celler som blir tatt med i de påfølgende trinnene.
Behandling av disruptatet for å isolere uoppløselige IL- 2-legemer
Etter at cellene er blitt oppbrutt blir deionisert vann fortrinnsvis tilsatt til disruptatet og mere enn 99 vekt-# av saltene blir fjernet derfra. Saltene er vann-oppløselige stoffer sammensatt av motsatt ladete ioner med liten molekylvekt. Fjerning av disse saltene for å redusere ionestyrken til disruptatet kan bli tilveiebragt ved diafiltrering ved anvendelse av deionisert vann for å vaske ut ionene eller ved sentrifugering for å pelletere det cellulære debriset og refraktile legemer etterfulgt av resuspensjon i deionisert vann. Hvis diafiltrering blir anvendt, blir fortrinnsvis deionisert vann kontinuerlig tilsatt slik at tilsetnings-hastigheten av vann er lik filtreringshastigheten.
Etter at saltene hovedsakelig er blitt fjernet, kan eventuelt en forbindelse såsom 1-oktanol bli tilsatt for å avsalte disruptatet, hvis det ikke er tilsatt tidligere, for å forsikre at ingen levedyktige rekombinante organismer er tilstede før innholdet blir ødelagt. Det avsaltede disruptatet blir igjen behandlet som beskrevet ovenfor.
Etter den siste oppbrytingen, økes tettheten eller viskositeten og/eller blir en gradient dannet i løpet av sentrifugeringen i væsken innenfor disruptatet ved tilsetting av et stoff til disruptatet. Det er forskjellige måter å tilveiebringe denne hensikten, alle er basert på sedimentasjons-karakterene til partiklene ved variering av tettheten og/eller viskositeten til væskefasen. En måte å oppnå dette målet på er å tilsette et stoff som øker tettheten av væsken til en p på omtrent 1,1 til 1,3 g/ml, fortrinnsvis 1,13 til 1,17 g/ml.
Stoffer som blir anvendt for å oppnå denne økningen av tettheten innbefatter et sukker eller en blanding av sukker, såsom, f.eks. sukrose, dekstrose, fruktose, maltose, malto-triose, og andre mono-, diorpolysakkarider. Sukkeret er fortrinnsvis sukrose. Alternativt kan et to-fase system av stoffer såsom, f.eks. en glyserol/sukroseblanding bli anvendt hvori de ødelagte partiklene fordeler seg mot grensen mellom den tunge og lette fasen og kan bli eluert ved en væske/- væskeseparasj on.
I tillegg, kan viskositeten til væskefasen bli øket i fra 5 til 10 eps ved en hvilken som helst egnet måte såsom tilsetting av en viskøs forbindelse, såsom f.eks. sukrose eller glyserol. En gradient blir også dannet hvis, f.eks. partiklene er i en 60 % vannholdig glyserolsuspensjon mens sentri-fugerøret inneholder 80$ vannholdig glyserol.
IL-2-inneholdende refraktile legemer blir separert fra det cellulære debriset ved sentrifugering i høy hastighet. "Sentrifugering ved høy hastighet" innbefatter spinning av suspensjonen i en sentrifuge ved omtrent 8.000 til 40.000 ganger tyngdekraften (g), fortrinnsvis omtrent 10.000-20.000 x g, i en egnet tidsperiode avhengig av volumet, generelt omtrent 10 minutter til 72 timer.
Partikkelpelleten eller massen som resulterer fra sentrifugeringen inneholder omtrent 15-70 vekt-& IL-2 bestemt ved SDS-polyakrylamidgelelektroforese og ved Lowryanalyse (Lowry et al, J. Biol. Chem (1951) 193:265-275). IL-2 i partikkelmassen eller pelleten blir deretter løst opp og denaturert ved blanding av massen/pelleten med en oppløs-ning av en sterk denaturerende konsentrasjon kaotrofisk middel og et reduksjonsmiddel. Det kaotrofiske middelet og reduksjonsmiddelet er i en vannholdig buffer ved pE 7 til 9, fortrinnsvis fosfatbufret saltvann eller Tris-buffer. pE-justering kan bli tilveiebragt ved tilsetting av base såsom NaOE. W/v-forholdet mellom pellet og oppløsning er vanligvis i området 0,01:1 til 0,25:1 fortrinnsvis 0,05:1 til 0,12:1. Reduksjonsmidler som kan bli anvendt i løpet av oppløsnings/- denatureringstrinnet innbefatter: B-merkaptoetanol, gluta-tion, cystein og ditiotreitol (DTT). DTT er det foretrukne reduksjonsmiddelet. Konsentrasjonen av reduksjonsmiddelet i mediumet er vanligvis varierende mellom 10 til 100 mM mens omtrent 50 mM er den foretrukne konsentrasjonen. Gelaterende midler såsom etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) i konsentrasjoner på 1 til 50 mM, fortrinnsvis omtrent 25 mM, og buffere såsom Tris'ECl ved konsentrasjoner på 25 til 250 mM, fortrinnsvis 50 mM, kan bli inkludert i oppløsningen. Forhøyede temperaturer i området på 35<6>C til 50°C, fortrinnsvis omtrent 40°C, og et nitrogenteppe kan bli anvendt i dette trinnet. Oppløsningen/denatureringen vil vanligvis være fullført etter omtrent 5 til 15 minutter blanding. Etter dette blir blandingen sentrifugert, fortrinnsvis ved 2000 x g til 4000 x g i omtrent 10 til 30 min for å fjerne eventuelt ikke-oppløste stoffer.
Denatruert IL-2 blir deretter utsatt for kontrollert oksydasjon. Reduksjonsmiddelet, sammen med andre forurensende stoffer, blir først fjernet ved anvendelse av gelfiltrering, diafiltrering, eller presipitering. Geler som har evnen til å fjerne reduksjonsmiddel fra proteinoppløsningen er kommer-sielt tilgjengelig. Blant annet når DTT blir anvendt som et reduksjonsmiddel kan Sephadex G-10, G-25 og G-50 geler bli anvendt. Gelfiltreringen kjøres da i en oppløsning av et kaotrofisk middel som inneholder proteinet i oppløsning. Når guanidinhydroklorid blir anvendt, er konsentrasjoner over omtrent 6 M nødvendig for å holde IL-2 i oppløsning og unngå presipitering. Etter fjerning av reduksjonsmiddelet, blir proteinoppløsningen fortynnet, hvis nødvendig, med oppløs-ningen bestående av kaotrofisk middel til en proteinkonsen-trasjon på omtrent 0,1 til 2 mg/ml, fortrinnsvis omtrent 0,25 til 1,0 mg/ml.
En foretrukket fremgangsmåte for å fjerne reduksjonsmiddel sammen med forurensende stoff anvender presipiteringstek-nikker. Redusert IL-2 blir fortynnet til omtrent 2 - 30 mg IL-2 pr. ml, fortrinnsvis 5-10 mg IL-2 pr. ml med 7,0 M guanidin. Dette blir deretter fortynnet til omtrent 1-5 M guanidin, fortrinnsvis 3,5 M guanidin, og det får stå helt til presipiteringen er fullstendig, vanligvis to timer. Når presipiteringen har satt seg, kan IL-2 bli pelletert ved sentrifugering. Gjenværende DTT kan bli fjernet ved vasking av pelleten med en buffer, fortrinnsvis ved anvendelse av en 2-4 M guanidin-inneholdende buffer eller en 1- 2% polysorbat 80-inneholdende buffer.
Foretrukne selektive oksydasjonsfremgangsmåter er beskrevet i US-PS 4,572,798 (anvender en oksydasjonsfremmer inneholdende et Cu<+2> kation såsom fra CuCl2, Cu(N03)2, osv.) og 4,530,787 (som anvender o-jodosobenzosyre), beskrivelsen er inkorporert heri ved referanse. Cu<+2> innbefatter omsetting av den vannholdige oppløsningen av denaturert IL-2 ved en pH mellom omtrent 5,5 og 9, fortrinnsvis 6 til 8, og mest foretrukket omtrent 7,5, i nærvær av luft med minst en effektiv mengde av en oksydasjonsfremmer inneholdende et Cu<+2> kation. Kontrollert oksydasjon forårsaket dannelsen av disulfidbroer i IL-2 som samsvarer med broene i nativt IL-2 uten eller med minimal overoksydasjon og dannelsen av ikke-samsvarende broer eller oligomerer. Slik oksydasjon muliggjør produksjon av rekombinant IL-2 med riktig disulfidbrodannelse i høyt utbytte.
Mengde oksydasjonsmiddel eller oksydasjonsfremmer som blir anvendt innbefatter minst en effektiv mengde for oksydasjon, dvs. en mengde som ved minimum vil være nødvendig for å utføre oksydasjonsreaksjonen effektivt innenfor en hensiktsmessig tidsperiode. En effektiv mengde er mengden som omtrent er ekvivalent til konsentrasjonen av frie sulfhydrylgrupper i IL-2 som er beregnet å være involvert i dannelsen av de ønskede disulfidbindingene. Mengden CuClg vil fortrinnsvis variere fra omtrent 5 til 275 mikromolar. Når det gjelder o-jodsobenzosyre vil molforholdet mellom oksydasjonsmiddel og IL-2 fortrinnsvis være i området på omtrent 0,05:1 til omtrent 5:1, mest foretrukket er omtrent 0,8:1 til omtrent 1:2. Konsentrasjonen av IL-2 i reaksjonsblandingen blir holdt lav, dvs. vanligvis mindre enn omtrent 5 mg/ml, fortrinnsvis omtrent 0,05 til omtrent 2 mg/ml, og mest foretrukket er omtrent 0,1 til omtrent 1 mg/ml, for å redusere sannsynlig-heten for oligomerdannelse. pE blir opprettholdt mellom 5,5 og 9, fortrinnsvis mellom 7 og 8 i o-jodsobenzosyreoksyder-ingen.
Redusert IL-2 må forbli i oppløsning for at effektiv oksydasjon oppstår. Reaksjonsblandingen må derfor inneholde en tilstrekkelig konsentrasjon av kaotrofisk middel for å holde redusert IL-2 i oppløsning. Som indikert ovenfor, når guanidinhydroklorid blir anvendt, må dets konsentrasjon være over 6 M. Ved slike konsentrasjoner vil en vesentlig mengde av IL-2 være i en denaturert form. På grunn av dette er det når det gjelder IL-2 vanskelig å utføre oksydering og renatureringen samtidig og oppnå høye utbytter av renaturert IL-2.
Temperaturen anvendt i oksydasjonen vil normalt være mellom omtrent 20° C og 40°C, romtemperatur er hensiktsmessig. For Cu<+2> oksydasjon, medfører en økning i reaksjonstemperatur til en økning i reaksjonshastighet. Oksydasjonsreaksjonen kan bli effektivt avsluttet ved, f.eks., redusering av pH til et nivå hvorpå reaksjonen opphører, frysing av oppløsningen, eller tilsetting av geldannere såsom EDTA til reaksjonsblandingen. Oksyderingstiden vil vanligvis være i området på 4 timer til omtrent 1 dag.
Når oksyderingen er fullført, reduseres konsentrasjonen av det kaotrofiske middelet (guanidinhydroklorid) ved anvendelse av fortynning, dialyse eller difiltrering, til et nivå som muliggjør at oksydert IL-2 blir renaturert og påny foldes til den native IL-2-konfigurasjonen. Fosfatbuffer eller Citrat-buffer, 10 til 100 mM, fortrinnsvis omtrent 10 mM; NaCl, 10-150 mM, fortrinnsvis 40 mM; og sukrose, 1-5$, fortrinnsvis 2,5$, er foretrukne fortynningsmidler. IL-2 blir fortrinnsvis konsentrert ved anvendelse av en ultrafiltreringsmembran for å unngå håndtering av store volumer av oppløsningen. Konsentrasjonen av guanidinhydrokloridmiddelet blir vanligvis fortynnet eller diafiltrert til under omtrent 2 M, fortrinnsvis under omtrent 0,5 M. Fortynningen vil vanligvis bli utført ved omtrent 4°C til 25°C. Ved slike temperaturer og redusert guanidinhydrokloridkonsentrasjon presipiteres fremmede vertsproteiner. Dette presipitatet blir fjernet ved filtrering eller sentrifugering for å tilveiebringe en supernatant som inneholder oksydert, renaturert IL-2.
Renaturert, oksydert IL-2 blir deretter renset for å fjerne endotoksiner til et nivå som oppfyller kliniske spesifika-sjoner (dvs., mindre enn omtrent 0,1 ng endotoksin pr. ml IL-2). IL-2 blir også fortrinnsvis renset for å fjerne pyrogen, for å være vesentlig fri for pyrogener ifølge målingen i U.S.P. kanin pyrogen-testen ved en dosering på 1,0 x IO<3 >enheter/kg, fortrinnsvis 3,3 x IO<5> enheter/kg). Rensing kan bli tilveiebragt ved ione-byttekromatografi eller en kombinasjon av hydrofobe interaksjoner og ione-byttekromatografi, eller ved RP-HPLC.
Oppløsningen blir deretter sendt gjennom en ione-byttekolonne, såsom en DEAE agarose-kolonne (f.eks., Pharmacia Fast-Flow Sepharose DEAE). IL-2 blir utvunnet fra kolonnen med 10 mM citrat, pH 6,5. Eluerte IL-2 fraksjoner kan deretter bli applisert på en annen ione-byttekolonne, såsom en karboksymetylagarosekolonne (f.eks., Pharmacia Fast-Flow Sepharose CM) som binder IL-2 ved en pH på 6 til 7,4. Bundet IL-2 kan bli eluert med en økende saltgradient. Ønsket IL-2 elueres ved omtrent 150 mM salt mens former av proteinet med lavere isoelektrisk punkt blir eluert ved lavere saltkonsen-trasj oner.
I den hydrofobe interaksjonsteknikken/ione-byttekromatografi-teknikken, blir (^4)2804 tilsatt til IL-2-oppløsningen til en konsentrasjon på minst omtrent 1,0 M, fortrinnsvis omtrent 1,25 M. Oppløsningen blir deretter applisert på en hydrofob interaksjonskolonne, såsom en fenylagarosekolonne (f.eks., Pharmacia Phenyl Fast-Flow Sepharose kolonne). Bundet IL-2 blir utvunnet fra kolonnen med en avtagende (^4)2804 gradient, i det at IL-2 blir samlet i fraksjonene som eluerer ved omtrent 0,95 til 0,75 (NH4)2S04. IL-2-former og andre urenheter (bakterielle vertsproteiner) som lavere isoelek-triske punkter enn nativt IL-2 blir deretter utvunnet ved kation-byttekromatografi ved anvendelse av en bytter som binder IL-2 ved en pH på 6 til 7,5. En karboksymetylagarosekolonne (f.eks. Pharmacia Fast-Flow Sepharose CM) er en foretrukket preparativ kation-bytter. Oppløsningen blir brakt i kontakt med ionebytteren ved det angitte pH-området og IL-2 blir eluert fra ionebytteren ved anvendelse av en ionisk gradient. Ønsket IL-2 elueres ved omtrent 0,15 M salt mens former av proteinet som har lavere isoelektrisk punkt blir eluert ved lavere saltkonsentrasjoner.
HPLC-rensing av renaturert IL-2 kan bli utført essensielt som beskrevet i U.S. 4,569,790 etterfulgt av oppløsning i et kaotrofisk middel og dialyse. Forklart i korte trekk, blir IL-2-oppløsningen kromatografert, utfelt, og den resulterende presipiteringen blir tatt opp i den kaotrofiske middel-oppløsningen. Det kaotrofiske middelet blir deretter fjernet ved dialyse eller diafiltrering. IL-2 kan bli renset videre ved kation-byttekromatografi.
Renheten av renaturert, oksydert IL-2 etter kromatografi-trinnene er minst omtrent 95$ og vanligvis minst omtrent 98%, bestemt ved redusert natriumdodecylsulfatpolyakrylamidgel-elektroforese (SDS-PAGE) analyse. Dette rene IL-2 har en oppløselighet i PBS på minst omtrent 5 mg/ml, en spesifikk aktivitet på minst 1 x IO<7> enheter/mg, vanligvis 5 x IO<6> til 2 x IO<7> enheter/mg bestemt ved HT-2 celle-proliferasjonsana-lyse, og endotoksin-innhold på mindre enn omtrent 0,1 ng/mg IL-2. IL-2 er også fortrinnsvis vesentlig fri for pyrogener, bestemt ved U.S.P. kanin-pyrogentesten ved en dosering på 1,0 x 10<3> enheter/kg, mest foretrukket 3,3 x 10^ enheter/kg.
Formulering
Renset IL-2 blir gjort vannholdig, dets konsentrasjon blir justert, hvis nødvendig, til 0,01 til 2 mg/ml, og en vann-oppløselig bærer blir tilsatt til det ønskede nivået. Bæreren vil vanligvis bli tilsatt slik at den er tilstede i oppløs-ningen ved omtrent 1-10 vekt-#, fortrinnsvis omtrent 5 vekt-#. Den nøyaktige mengden av bærer som blir tilsatt er ikke kritisk. Konvensjonelle faste svellemidler som blir anvendt i farmasøytiske tablettformuleringer kan bli anvendt som bærer. Disse stoffene er vannoppløselige, reagerer ikke med IL-2, og er i seg selv stabile. De er også fortrinnsvis ikke-følsomme overfor vann (dvs. ikke-hygroskopiske). Spesifikke eksempler på bærere som kan bli tilsatt innbefatter dekstrose, laktose, mannitol, sukrose og andre reduserte sukkere såsom sorbitol, stivelse og stivelse-hydrolysater avledet fra hvete, korn, ris og potet, mikro-krystallinsk cellulose, og albumin såsom humant serumalbumin. mannitol, sukrose og dekstrose er foretrukket.
Bæreren utgjør en stor mengde av formuleringen, slik som når enhetsdoseringsmengder av oppløsningen blir frysetørret i beholdere, såsom sterile beholdere, er den fryse-tørkede resten klart synlig. I dette henseendet tilveiebringer den foretrukne bæreren, mannitol, en estetisk akseptabel (hvit, krystallinsk) rest som ikke er følsom overfor vann. Det at mannitol ikke er følsom overfor vann kan forsterke stabili-teten til formuleringen.
EP publikasjon 215,658, publisert 25. mars 1987, med tittel "An Improved Formulation for Lipophilic Proteins" (Hanisch et al) skisserer en forbedret fremgangsmåte for utvinning og rensing av lipofile rekombinante proteiner såsom IL-2 fra mikroorganismer, som tilveiebringer et proteinpreparat som kan bli formulert til en stabil farmasøytisk sammensetning. En slik sammensetning som inneholder en terapeutisk effektiv mengde av det biologisk aktive rekombinante lipofile proteinet løst opp i et ikke-toksisk, innsatt, terapeutisk kompatibel vannholdig-basert bærermedium med en pH på 6,8 til 7,8 inneholder også en stabilisator for proteinet, såsom humant serumalbumin, normalt serumalbumin og humant plasma-proteinfraksjon. Formuleringsaspektene til nevnte EP publikasjon 215,658 er inkorporert heri ved referanse som ved en alternativ formuleringsvei for renset IL-2. EP publikasjon 215,658 skisserer en f ormuleringsprosess med lav pH. U.S. patentnr. 4,462,940 til Hanisch et al, skisserer en formuler-ingsprosess med høy pH, og formuleringsaspektene derav er også inkorporert heri ved referanse.
Etter tilsetting av bærer blir enhetsdoseringsmengdene (dvs. for IL-2 volumer som tilveiebringer 0,01 til 2 mg, fortrinnsvis 0,2 til 1,0 mg, IL-2 pr. dose) av oppløsningen fordelt i beholdere, beholderene blir forseglet med et lokk med spor, og innholdene blir frysetørret ved anvendelse av konvensjonelle frysetørringsbetingelser og apparatur.
Det frysetørrede, sterile produktet består av en blanding av (1) IL-2, (2) bærer (dekstrose, sukrose eller mannitol), (3) eventuelt andre tilsetningsstoffer såsom humant serumalbumin, Tween 80 og lignende og (4) en liten mengde buffer som vil tilveiebringe en fysiologisk pH når blandingen er rekonstituert. Produktet kan også inneholde en mindre mengde av et preserveringsmiddel for å forsterke kjemisk stabilitet. Rekombinant IL-2 utgjør vanligvis omtrent 0,015 tørrvekt-# til 10 tørrvekt-# av blandingen, fortrinnsvis omtrent 2$ til 55é av blandingen.
Den frysetørrede blandingen kan bli rekonstituert ved injisering av en konvensjonell, parenteral vannholdig injeksjon, såsom destillert vann for injeksjon, Ringers oppløsningsinjeksjon, Hanks oppløsningsinjeksjon, dekstrose-injeksjon, dekstrose og saltinjeksjon, fysiologisk saltvann-injeksjon, eller lignende, inn i beholderen. Injeksjonen bør bli tilsatt langs siden av beholderen for å unngå omfattende skumming. Mengden injeksjon som blir tilsatt til beholderen vil vanligvis være i området på 1 til 5 ml, fortrinnsvis 1 til 2 ml.
I en alternativ formulering, beskrevet i PCT W087/00056, publisert 15. januar 1987, med tittel "Solubilization of Recombinant Proteins for Pharmaceutical Compositions Using Homopolymer Conjugation" til M. Knauf et al, hvori beskrivelsen er inkorporert heri ved referanse, blir IL-2 reagert med aktivert polymer valgt fra poletylenglykol, homopolymerer og polyoksyetylerte polyoler, såsom polyoksyetylert glyserol. Polymeren har fortrinnsvis en molekylvekt på fra 300 til 100.000 daltons, mest fortrukket 350 til 40.000 daltons. Polymeren blir aktivert ved konjugasjon med et koblingsmiddel med terminale grupper som er reaktive med både de frie amin eller tiolgruppene på proteinet og hydroksylgruppen til polymeren. Eksempler på slike koblingsmidler innbefatter hydroksynitrobenzensulfonester, cyanursyre-klorid, og N-hydroksysuccinimid. IL-2 blir deretter formulert direkte med den vannoppløselige bærereren og buffer som beskrevet ovenfor, formuleringen blir frysetørret og den frysetørrede blandingen kan bli rekonstituert som beskrevet ovenfor.
Den rekonstituerte formuleringen fremstilt som beskrevet ovenfor er egnet for parenteral og oral administrasjon til mennesker eller andre pattedyr i terapeutisk effektive mengder (dvs. mengder som eliminerer eller reduserer pasien-tens patologiske tilstand) for å tilveiebringe terapi. IL-2 terapi er hensiktsmessig for forskjellige immunmodulatoriske indikasjoner, såsom T-celle-mutagenese, induksjon av cyto-toksiske T-celler, økning av naturlig killercelleaktivitet, induksjon av IFN-7, restituering og styrking av cellulær immunitet) f.eks. behandling av immundefekte tilstander), og økning av cellemediert anti-svulstaktivitet.
Formuleringene ifølge foreliggende oppfinnelse er nyttige for parenteral administrasjon, for eksempel, intravenøs, subkutan, intramuskulær, intraorbital, oftalmisk, intrakapsulær, intraspinal, intrasternal, topisk, intranasal aerosol, skarifikasjon, og også, for oral administrasjon. Foretrukne administrasjonsmåter er ved intramuskulær, subkutan og intravenøs injeksjon, og ved topisk administrasjon. Anvendelse av ikke-ioniske overflateaktive midler er spesielt foretrukket for topisk administrerte formuleringer, på grunn av deres evne til å penetrere hudoverflaten.
Følgende eksempler illustrerer fremgangsmåten og sammensetningen ifølge oppfinnelsen. Disse eksemplene er ikke ment å begrense oppfinnelsen på noen måte. I disse eksemplene er alle temperaturene i grader Celsius hvis ikke annet er angitt. Figur 1 indikerer den foretrukne fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, representert ved eksempler.
Eksempel 1
Dette eksempelet illustrerer en foretrukket fremgangsmåte for utvinning, rensing og formulering av rekombinant IL-2.
Des-alanyl-IL-2ser^25 °le utvunnet fra E. coli. Des-alanyl-IL-2se<r>^25~Pr°duserende E. coli (K12/MM294-1 ) -stammen som bærer plasmid pLW45 og som ble anvendt i dette eksempelet ble deponert til American Type Culture Collection 4. mars, 1984 under aksesjonsnummer 39,626. Nevnte analog og en fremgangsmåte for fremstilling er beskrevet i U.S. patentnr. 4 ,518,584.
E. coli som er transformert med plasmid pLW45 ble dyrket i en 1000-liter fermentor ved 37°C. Oppløst oksygen ble opprettholdt ved omtrent 40$ ved, om nødvendig (1) økende rysting;
(2) tilsetting av luft; og (3) tilsetting av oksygen.
Når fermentoren var fylt med vann til driftsvolumet, ble følgende sporelementer tilsatt:
Fermentormateren og karene for tilsetning ble deretter sterilisert i henhold til standard driftsprosedyre. Deretter ble de følgende sterile tilsetningsstoffer fremstilt: Fermentoren ble avkjølt og inokulert med frossen eller kim E. coli-kultur ved 2 mg/L tørrvektceller. I løpet av fermenter-ingen, ble pH opprettholdt ved 6,8 ved anvendelse av KOH. Målinger av optisk tetthet og målinger av gjenværende glukose i prøvene ble utført ved 14 - 16 timer og deretter med intervaler på omtrent 1 time.
Induksjon av des-alanyl-IL-2ser^25 produksjon ved utelukking av L-tryptofan fra kulturmediumet oppsto ved omtrent 0D6gg=10 etterfulgt av tilsetting av casaminosyrer til en endelig konsentrasjon på 2$ ved 0Dfc3Q=15. Kulturer ble høstet omtrent 3-5 timer senere.
De refraktile legemene inneholdende desalanyl-IL-2ser^25 Dle deretter isolert. Det høstede stoffet ble konstrert omtrent 5-10 ganger ved sirkulering av det høstede stoffet under trykk gjennom UF-kryss-strømningsfiltreringsinnsatser med en 100 K molekylvekt-utelukking. Cellene ble ødelagt ved å bli sendt 3 ganger gjennom en disrupter (anordning for oppbryting av celler) ved omtrent 44817,5 kPa (195 atm). EDTA ble deretter tilsatt til en final konsentrasjon på 5 mM. Suspensjonen ble diafiltrert mot 5 volumer deionisert vann. Oktanol ble tilsatt til 1$ (v/w) for å drepe eventuelle gjenværende levende bakterier i det diafiltrerte produktet. 2 mM EDTA ble tilsatt og etter flere timer, ble det diafiltrerte disruptatet på ny ødelagt ved å bli sendt igjennom en disrupter.
Sukrose ble satt til redisruptatet for å tilveiebringe en finaltetthet på mellom 1,1 og 1,25 g/ml. Blandingen ble sentrifugert 8.000 til 20.000 x g ved 1-2 lpm, og partikkelpelleten eller pastaen ble samlet. En temperatur på minst 20°C ble opprettholdt før og i løpet av sentrifugeringen.
Partikkelpastaen ble deretter blandet med 17 ml pr. gram pasta av en vannholdig oppløsning av mettet guanidinhydroklorid, DTT, 50 mM, Tris, 50 mM, og 25 mM EDTA, og pH ble justert til 8,0 med NaOH og oppvarmet til 40°C i omtrent 10 min. Uoppløste stoffer ble fjernet fra blandingen ved sentrifugering ved 3.000 x g i 15 min.
Det neste trinnet i rensingen var å fjerne DTT og EDTA fra IL-2-oppløsningen (supernatanten) ved gelfiltrering ved anvendelse av en Sephadex G-25 kolonne. Kolonnen ble kjørt i 7 M guanidinhydrokloridbuffer ved pH 7,5. Ved anvendelse av et prosesskromatogram, ble IL-2 toppen samlet og toppen ble fortynnet med guanidinhydrokloridbuffer til en protein-konsentrasjon på 0,5 mg/ml.
Oksydering av IL-2 ble initiert ved tilsetting av CuCl2 i et molart forhold på 3:1 (CuCl2 til IL-2). Oksyderingen ble utført ved omtrent 25 °C i 7 M guanidinhydroklorid, 10 mM fosfat. pHen ble kontrollert til 7,5 ± 0,2 i løpet av oksyderingen og 4 mM EDTA ble tilsatt når oksydasjonen var fullført. På grunn av at oksydert IL-2 er mere hydrofil enn redusert IL-2, ble fremdriften av oksydasjonsreaksjonen registrert ved RP-HPLC.
Den resulterende oppløsningen av oksydert IL-2 ble deretter fortynnet med 10 mM fosfatbuffer for å redusere guanidin-hydrokloridkonsentrasjonen til 2 M. IL-2-konsentrasjonen ble deretter øket til 2,5 mg/ml ved anvendelse av en hul fiber-membran-ultrafiltreringsenhet med en utelukking på 10.000 dalton. Oppløsningen ble deretter videre fortynnet med 10 mM fosfatbuffer til 0,2 M guanidinhydroklorid og latt stå over natt ved 4°C for å tilveiebringe et presipitat.
Presipitatet bestående av fremmede E. coli-proteiner og noe IL-2 ble deretter fjernet ved filtrering med et cellulose-acetat-filter for å tilveiebringe omtrent 85% utbytte av påny foldet IL-2. (NH4)2S04 ble deretter satt til supernatanten til en konsentrasjon på 1,25 M. Denne oppløsningen ble applisert på en Pharmacia Phenyl Fast-Flow Sepharose hydrofob interaksjonskolonne. IL-2 ble utvunnet fra kolonnen med en avtagende (NH4)2S04 gradient, idet IL-2 ble samlet i fraksjonene ved omtrent 0,95 til 0,75 M (NE^^SC^. De sammenslåtte fraksjonene ble diafiltrert og deretter applisert på en Pharmacia karboksymetyl (CM) Fast-Flow Sepharose ione-byttekolonne ved pH 7 ekvilibrert med 10 mM fosfatbuffer. IL-2-fraksjonene ble utvunnet ved 0,15 M NaCl.
Det resulterende IL-2 hadde en renhet på 98$ ifølge SDS-PAGE-analyse og var homogen ifølge HPLC-analyse. Dets spesifikke aktivitet var 8 x IO<6> enheter/mg ifølge måling ved HT-2-celleproliferasjonsanalyse. Enzym-bundet immunosorbentanalyse (ELISA) ble utført for å bestemme om dette renaturerte, rekombinante IL-2 (guanidin-prosess IL-2) ble bundet til polyklonale antistoffer som blir bundet til rekombinant IL-2 fremstilt ved fremgangsmåten beskrevet i US Patentnr. 4,569,790, og denne fremgangsmåten er inkorporert heri ved referanse, hvori IL-2 blir løst opp med SDS (SDS-prosess IL-2). Serum fra en pasient behandlet med SDS-prosess IL-2 ble fortynnet 1:1000 i analysebuf f er (PBS med 0, 5% BSA og 0,05$ Tween 20) og blandet med SDS eller guanidin-prosess IL-2 i finale konsentrasjoner på 0 til 5 ug/ml. Etter inkubasjon i to timer ved romtemperatur, ble blandingen applisert i volumer på 100 ul til 96 brønn mikroelisa-plater (Immulon I, Dynatech) tidligere belagt med SDS-prosess IL-2 (5 ug/ml i 0,05 M Na2C03, pH 9,6, 100 ul/brønn). Blandingen ble stående i de IL-2-belagte brønnene i 30 minutter, og deretter ble platene grundig vasket i PBS med 0,05$ Tween 20, og peroksy-dase-konjugert geit anti-humant IgG (Cappel, 1:1000 fortynning) ble tilsatt. Etter inkubasjon i to timer til, ble det andre antistoffet fjernet og substrat ble tilsatt (OPD, Sigma, 100 ul/brønn). Den enzymatiske reaksjonen ble avsluttet 20 minutter senere ved tilsetting av 50 ul 2N HC1 til hver brønn. Absorbansen ved 490 nm ble målt ved anvendelse av en Dynatech MR580 plateavleser (referansebølgelengde 405 nm). Grafiske fremstillinger av absorbans i mot mengden av konkurrerende antigen er vist i figur 2. Som vist, konkur-rerte guanidin-prosess IL-2 ikke i tilstrekkelig grad.
Eksempel 2
Eksempel 1 ble gjentatt gjennom IL-2-refoldingstrinnet (utvinning av supernatant etter reduksjon av guanidinhydroklorid til 0,2 M). IL-2-oppløsningen (8,8 mg protein) ble surgjort med trifluoreddiksyre til en pH på 2,1 og deretter sentrifugert for å fjerne eventuelt presipitat. Denne ble applisert på en 1,25 cm ganger 30 cm kolonne av Vydac C-4 silisiumoksyd ekvilibrert med 0,1$ trifluoreddiksyre i vann. Kolonnen ble eluert med en gradient bestående av acetonitril inneholdende 0,1$ trifluoreddiksyre. Fraksjonene med rent IL-2 ble slått sammen og deretter dialysert inn i 7 M guanidin pH 7,5 buffer. Denne ble deretter dialysert mot 10 mM fosfatbuffer pH 7,0. Et presipitat ble fjernet ved mikrosentrifugering og 68% av IL-2 i supernatanten ble utvunnet.
Eksempel 3
Eksempel 1 ble gjentatt gjennom utvinning av den refraktile legemepartikkelpasta.
Omtrent 113,7 g fast guanidin (7 M sluttkonsentrasjon) ble satt til ~14 g partikkelpasta etterfulgt av tilsetting av 10 mM Tris/2 mM EDTA-buffer til omtrent 190 ml. Etter homogenisering, ble ~1,5 g fast DTT (50 mM final konsentrasjon) tilsatt og pHen ble justert til 8-8,5 med NaOH. Oppløsningen ble varmet opp til 50° C i 15 min. for å fremme reduksjonen. Oppløsningen ble deretter fortynnet med 10 mM Tris/2 mM EDTA til et finalt volum på 200 ml.
Det neste trinnet i rensingen innbefattet å fjerne reduksjonsmiddelet og andre forurensninger fra IL-2-stoffet. Omtrent 25 ml redusert IL-2 ble fortynnet til omtrent 5-10 mg IL-2/ml med 75 ml 7,0 M guanidin. Denne oppløsningen ble fortynnet til 4,8 M guanidin med Tris/EDTA-buffer og fikk stå i to timer. Veldig lite presipitat ble dannet, og presipitatet ble fjernet ved sentrifugering ved 10.000 x g i 15 minutter. Supernatanten ble fortynnet til 4,0 M guanidin med Tris/EDTA-buffer og latt stå i 2 timer ved romtemperatur. Det tunge presipitaet ble samlet ved sentrifugering (10.000 g x 15 min.).
Pelleten ble vasket en gang med 50 ml 2% Tween 80 og to ganger med 50 ml E2O. 16,7 g fast guanidin ble tilsatt og oppløsningen ble bragt til 25 ml med vann. Oppløst IL-2 ble fortynnet til 1 mg/ml med 7,0 M guanidin i 10 mM Citrat, pH 6,5. CuCl2 (til 0,1 mM) ble tilsatt og pH ble justert til 8-8,5. Denne oppløsningen ble omrørt over natt.
Ved anvendelse av YM-spiral-tvunnet innsats, ble guanidin diafiltrert ut og IL-2 ble konsentrert til omtrent 2 mg/ml. Luften ble fjernet fra systemet på grunn av at oppløselig IL-2 er følsom overfor risting, spesielt med luftbobler. Den ble diafiltrert mot 10 volumer 2, 5% sukrose og 140 mM NaCl i 10 mM NaCitrat pE 6,5 oppløsning. Etter sentrifugering ved 3000 g x 15 min., ble 600 ml supernatant inneholdende 0,63 mg/ml IL-2 samlet. Ione-styrken ble redusert ved dialyse i 10 mM NaCitrat, pE 6,5 før fortsettelsen.
Kromatografien besto av to kolonner, hver ekvilibrert med 10 mM NaCitrat pH 6,5 buffer. Den første kolonnen var pakket med DEAE Sepharose Fast Flow (Pharmacia). 25 ml 0,63 mg IL-2/ml i 10 mM NaCitrat pH 6,5 ble kjørt gjennom en 1 x 10 cm kolonne ved 0,5 ml/minutt. NaCl-konsentrasjonen til de sammenblandede fraksjonene ble justert til 40 mM NaCl. Den andre kolonnen ble pakket med CM Sepharose Fast Flow (Pharmacia). 28,5 ml 0,38 mg IL-2/ml ble applisert ved 0,5 ml/min. IL-2 ble bundet til gelen og ble eluert med en økende NaCl-gradient (40-400 mM NaCl i 10 mM NaCitrat pH 6,5, 0,3 ml/min) i løpet av 6 timer. Omtrent 12,6 ml 0,71 mg IL-2 pr. ml ble slått sammen. CM-blandingen ble avsaltet inn i 10 mM natriumcitrat pE 6,5 over G25 Sephadex for å fjerne NaCl og for å tilveiebringe en godt karakterisert buffer for formulering.
Det resulterende IL-2 hadde en renhet på over 99$ ifølge analytisk RP-HPLC.
Eksempel 4
Omtrent 5 ml IL-2-inneholdende refraktile legemer, blandet med et likt volum vann ble løst opp i guanidin-buf f er. Oppløsningen hadde en guanidinkonsentrasjon på 7 M og et volum på 35 ml. pH til oppløsningen ble justert til omtrent 8,0 med 3 M Tris base. Deretter ble 0,3 g DTT tilsatt og oppløsningen ble oppvarmet til omtrent 45°C i 15 min. Oppløsningen ble deretter fortynnet med et likt volum 0,1 M citrat pH 5,0 buffer og latt stå i 1,5 timer. Det dannede presipitatet ble separert ved sentrifugering (10.000 x g i 10-20 min.). Presipitatet ble vasket fire ganger med 70 1 3,5 M guanidin og to ganger med 70 ml vann. Presipitatet ble løst opp i 7 M guanidin og ble analysert ved revers fase HPLC. Omtrent 265 mg IL-2 ble utvunnetmed en renhet på omtrent 90$.
Det som er beskrevet ovenfor viser at foreliggende fremgangsmåte tilveiebringer følgende fordeler: (1) enkel rensnings-prosess, (2) fravær av oppløsningsmiddel i det endelige produktet og (3) rekombinant IL-2-produkt som fremkommer mindre immunogent enn det som er tidligere blitt fremstilt.
I tillegg til vektorsystemet som er beskrevet tidligere og som anvender trp-promoter for IL-2-ekspresjon, innbefatter alternative vektorsystemer anvendelse av lambda pL-promoteren og/eller et positivt retroregulatorisk element. Disse vektorsystemene er beskrevet i US patentnummeret 4,711,845, publisert 8. desember 1987 og 4,666,848 publisert 19. mai 1987, beskrivelsene av begge er inkorporert heri ved referanse .
Vektorsystemer beskrevet i de førnevnte patentene, samt flere vektorer tilveiebragt som nedenfor, er blitt deponert til American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland med hensyn på "the Budapest Treaty on the Internation Recognition of the Deposit of Microorga-nisms for the Purpose of Patent Procedure and Regulations thereunder" og er dermed opprettholdt og gjort tilgjengelig i henhold til betingelsene i "the Budapest Treaty".
De deponerte plasmidene er blitt tildelt følgende ATCC deponeringsnummer:
Modifikasjoner av de ovenfor beskrevne metoder for utføring av oppfinnelsen som er innlysende for fagmannen innenfor biokjemi og relaterte områder er antatt å være innenfor rammen av følgende krav.
Claims (13)
- Fremgangsmåte for utvinning av renset renaturert rekombinant interleukin-2 (IL-2) fra en transformert mikroorganisme som inneholder IL-2, karakterisert ved at man: (a) ødelegger cellemembranen og celleveggen til mikroorganismen; (b) separerer vannuoppløselig IL-2-inneholdende materialet fra disruptatet; (c) blander det uoppløselige IL-2-inneholdende materialet fra trinn (b) ved en pE på omtrent 7 til omtrent 9 med en vannholdig oppløsning av et guanidinsalt på minst 6M og et reduksjonsmiddel hvorved IL-2 i det uoppløselige materialet blir løst opp og denaturert; (d) presipiterer IL-2 ut av den IL-2-inneholdende oppløs-ningen og utvinner presipitatet; (e) oppløser av IL-2-presipitatet; (f) oksyderer IL-2 i oppløsningen, mens konsentrasjonen av det kaotrofiske middelet blir opprettholdt ved en sterk denaturerende konsentrasjon hvorved den naturlige disulfid-broen i IL-2 dannes; (g) etter at oksyderingen i trinn (f) er fullført, reduseres guanidinkonsentrasjonen i oppløsningen slik at oksydert IL-2 blir renaturert og et presipitat dannes; (h) separerer presipitatet fra trinn (g) fra oppløsningen for å tilveiebringe en supernatant; (i) renser oksydert IL-2 i supernatanten ved (1) revers-fase høy prestasjon-væskekromatografi etterfulgt av at man oppløser de sammenblandede fraksjonene i en oppløsning av kaotropisk middel og fjerner det kaotropiske middelet fra oppløsningen, eller (2) hydrofob interaksjonskromatografi kombinert med ionebytte-kromatografi, eller (3) ionebytte-kromatografi; og (j) utvinner et renset oksydert, oppløselig heterolog human IL-2-sammensetning med et IL-2-innhold på minst omtrent 95% som bestemmes ifølge redusert natriumdodecylsulfatpolyakryl-amidgelelektroforese-analyse, en oppløselighet i fosfatbufret saltvann på minst 3 mg IL-2 per ml, en spesifikk aktivitet på minst omtrent 1 x IO<7> enheter/mg som bestemmes ifølge HT-2 celleproliferasjonsanalyse, og et endotoksininnhold på mindre enn omtrent 0,1 nanogram pr. mg IL-2.
- 2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det kaotrofiske middelet som anvendes er guanidinhydroklorid og den sterkt denaturerende konsentrasjonen er minst omtrent 6 M.
- 3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at IL-2-presipitatet i trinn (e) dannes ved redusering av guanidinhydroklorid-konsentrasjonen til under omtrent 5 M.
- 4 . Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at guanidinhydroklorid-konsentrasjonen som anvendes er omtrent 3 til 4 M.
- 5 . Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at IL-2-presipitatet samles ved sentrifugering og vaskes med en buffer før trinn (e).
- 6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at bufferen som anvendes innbefatter omtrent 2-4 M guanidinhydroklorid.
- 7. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at oksyderingen er en kontrollert oksydering som anvender Cu<+2> ionet som er en oksydasjonsaktivator eller o-jodsobenzosyre som et oksydasjonsmiddel.
- 8. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved man i trinn (g) reduserer konsentrasjonen av guanidinhydroklorid til under omtrent 2 M.
- 9. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at reduksjonsmiddelet er ditiotreitol; i trinn (d) presipiteres IL-2 ved å redusere konsentrasjonen av guanidinhydroklorid til under omtrent 5 M; oksydasjonen er en kontrollert oksydasjon som anvender Cu<+2> ioneer som en oksydasjonsaktivator; i trinn (g) reduseres konsentrasjonen av guanidinhydroklorid til under omtrent 0,5 M; og i trinn (i) renses oksydert IL-2 i supernatanten ved ione-bytte-kromatograf i ved å anvende en DEAE Sepharose-kolonne og karboksylmetyl Sepharose-kolonne.
- 10. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at reduksjonsmiddelet er ditiotreitol; i trinn (d) presipiteres IL-2 ved å redusere konsentrasjonen av guanidinhydroklorid til under omtrent 5 M; oksydasjonen er en kontrollert oksydasjon som anvender Cu<+2> ionet som en oksydasjonsaktivator; i trinn (g) reduseres konsentrasjonen av guanidinhydroklorid til under omtrent 0,5 M; og i trinn (i) renses oksydert IL-2 i supernatanten ved revers-fase høy utførelse væske-kromatografi.
- 11. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at reduksjonsmiddelet er ditiotreitol; i trinn (d) presipiteres IL-2 ved å redusere konsentrasjonen av guanidinhydroklorid til under omtrent 5M; oksydasjonen er en kontrollert oksydasjon som anvender Cu<+2> ionet som en oksyderings-aktivator; i trinn (g) reduseres konsentrasjonen av guanidinhydroklorid til under omtrent 0,5 M; og i trinn (i) renses oksydert IL-2 i supernatanten ved hydrofob interaksjonskromatografi ved anvendelse av en fenylagarosekolonne og ione-byttekromatograf i ved anvendelse av en karboksymetylagarosekolonne.
- 12. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1-11,karakterisert ved at IL-2 er des-ala-IL-2ser125.
- 13. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at IL-2-sammensetningen er vesentlig fri for pyrogener som bestemmes ved U.S.P. kanin pyrogentesten ved en dosering på 1,0 x IO<3> enheter pr. kg.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US4840887A | 1987-05-11 | 1987-05-11 | |
| US16714488A | 1988-03-25 | 1988-03-25 | |
| PCT/US1988/001043 WO1988008849A1 (en) | 1987-05-11 | 1988-03-31 | Process for recovering purified, oxidized, renatured recombinant interleukin-2 from microorganisms |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO885678D0 NO885678D0 (no) | 1988-12-21 |
| NO885678L NO885678L (no) | 1988-12-21 |
| NO176797B true NO176797B (no) | 1995-02-20 |
| NO176797C NO176797C (no) | 1995-05-31 |
Family
ID=26726091
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO885678A NO176797C (no) | 1987-05-11 | 1988-12-21 | Fremgangsmåte for utvinning av renset, renaturert, rekobminant interleukin-2 fra transformerte mikroorganismer |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0368857B1 (no) |
| JP (1) | JP2955294B2 (no) |
| AT (1) | ATE156491T1 (no) |
| AU (1) | AU622860B2 (no) |
| DE (1) | DE3855986T2 (no) |
| DK (1) | DK10189A (no) |
| IL (1) | IL86326A (no) |
| NO (1) | NO176797C (no) |
| WO (1) | WO1988008849A1 (no) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1339757C (en) | 1987-04-16 | 1998-03-17 | Robert F. Halenbeck | Production of purified biologically active, bacterially produced recombinant human csf-1 |
| US4929700A (en) * | 1987-04-16 | 1990-05-29 | Cetus Corporation | Production of purified, biologically active, bacterially produced recombinant human CSF-1 |
| US4931543A (en) * | 1987-05-11 | 1990-06-05 | Cetus Corporation | Process for recovering microbially produced interleukin-2 |
| EP0337243A1 (en) * | 1988-04-14 | 1989-10-18 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Process for purifying recombinant human interleukin-2 |
| DK580789D0 (da) * | 1989-11-20 | 1989-11-20 | Novo Nordisk As | Fremgangsmaade til oprensning af polypeptider |
| GB8927546D0 (en) * | 1989-12-06 | 1990-02-07 | Ciba Geigy | Process for the production of biologically active tgf-beta |
| US5258496A (en) * | 1990-07-10 | 1993-11-02 | Scios Nova Inc. | Isolation and purification of lung surfactant protein |
| US5403716A (en) * | 1991-01-10 | 1995-04-04 | Teijin Limited | Method for measurement of tissue factor in high sensitivity and measurement kit therefor |
| US5288931A (en) * | 1991-12-06 | 1994-02-22 | Genentech, Inc. | Method for refolding insoluble, misfolded insulin-like growth factor-I into an active conformation |
| NZ271088A (en) * | 1993-08-04 | 1996-10-28 | Ciba Geigy Ag | Desulphatohirudin muteins, their production, conjugates thereof and pharmaceutical compositions |
| US5663304A (en) * | 1993-08-20 | 1997-09-02 | Genentech, Inc. | Refolding of misfolded insulin-like growth factor-I |
| TW517059B (en) | 1994-07-25 | 2003-01-11 | Ciba Geigy Ag | New process for the production of biologically active protein |
| WO1997004003A2 (en) * | 1995-07-21 | 1997-02-06 | Amgen Inc. | Process for protein refolding by means of buffer exchange using a continuous stationary phase capable of separating proteins from salts |
| AU2003223936A1 (en) * | 2002-05-17 | 2003-12-02 | Kobenhavns Universitet | Method for purifying denatured proteins having a desired disulfide bond configuration |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GR79124B (no) * | 1982-12-22 | 1984-10-02 | Genentech Inc | |
| US4569790A (en) * | 1984-03-28 | 1986-02-11 | Cetus Corporation | Process for recovering microbially produced interleukin-2 and purified recombinant interleukin-2 compositions |
| US4530787A (en) * | 1984-03-28 | 1985-07-23 | Cetus Corporation | Controlled oxidation of microbially produced cysteine-containing proteins |
| US4572798A (en) * | 1984-12-06 | 1986-02-25 | Cetus Corporation | Method for promoting disulfide bond formation in recombinant proteins |
| JPH0640832B2 (ja) * | 1985-05-10 | 1994-06-01 | 味の素株式会社 | インタ−ロイキン２ポリペプチドの回収方法 |
| US4748234A (en) * | 1985-06-26 | 1988-05-31 | Cetus Corporation | Process for recovering refractile bodies containing heterologous proteins from microbial hosts |
| US4656255A (en) * | 1985-09-09 | 1987-04-07 | International Minerals & Chemical Corp. | Protein recovery |
| US4801686A (en) * | 1986-09-04 | 1989-01-31 | Immunex Corporation | Purification of recombinant interleukin-1 |
| US4931543A (en) * | 1987-05-11 | 1990-06-05 | Cetus Corporation | Process for recovering microbially produced interleukin-2 |
-
1988
- 1988-03-31 DE DE3855986T patent/DE3855986T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-03-31 AU AU16279/88A patent/AU622860B2/en not_active Expired
- 1988-03-31 EP EP88903676A patent/EP0368857B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-03-31 JP JP63503562A patent/JP2955294B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1988-03-31 AT AT88903676T patent/ATE156491T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-03-31 WO PCT/US1988/001043 patent/WO1988008849A1/en active IP Right Grant
- 1988-05-10 IL IL8632688A patent/IL86326A/xx not_active IP Right Cessation
- 1988-12-21 NO NO885678A patent/NO176797C/no not_active IP Right Cessation
-
1989
- 1989-01-11 DK DK010189A patent/DK10189A/da not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NO176797C (no) | 1995-05-31 |
| EP0368857B1 (en) | 1997-08-06 |
| WO1988008849A1 (en) | 1988-11-17 |
| NO885678D0 (no) | 1988-12-21 |
| DE3855986T2 (de) | 1998-02-05 |
| JPH02503384A (ja) | 1990-10-18 |
| JP2955294B2 (ja) | 1999-10-04 |
| DK10189D0 (da) | 1989-01-11 |
| NO885678L (no) | 1988-12-21 |
| DE3855986D1 (de) | 1997-09-11 |
| DK10189A (da) | 1989-01-11 |
| ATE156491T1 (de) | 1997-08-15 |
| IL86326A (en) | 1997-02-18 |
| AU622860B2 (en) | 1992-04-30 |
| AU1627988A (en) | 1988-12-06 |
| IL86326A0 (en) | 1988-11-15 |
| EP0368857A1 (en) | 1990-05-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0206828B1 (en) | Process for recovering refractile bodies containing heterologous proteins from microbial hosts and the use thereof | |
| US4931543A (en) | Process for recovering microbially produced interleukin-2 | |
| US4604377A (en) | Pharmaceutical compositions of microbially produced interleukin-2 | |
| CA1292686C (en) | Pharmaceutical compositions of recombinant interleukin-2 and formulation process | |
| US5037644A (en) | Pharmaceutical compositions of recombinant interleukin-2 and formulation processes | |
| US5162507A (en) | Process for recovering purified, oxidized, renatured recombinant interleukin-2 from microorganisms | |
| NO175704B (no) | Fremgangsmåte for fremstilling av et stabilt, farmasöytisk preparat av rekombinant interferon | |
| US4894330A (en) | Purification of recombinant beta-interferon incorporating RP-HPLC | |
| NO176797B (no) | Fremgangsmåte for utvinning av renset, renaturert rekombinant interleukin-2 fra mikroorganismer | |
| EP0211835B1 (en) | Pharmaceutical compositions of microbially produced interleukin-2 | |
| EP0818466B1 (en) | Purified, biologically active bacterially produced recombinant human CSF-1 | |
| US5643566A (en) | Formulation processes for lipophilic proteins | |
| US4961969A (en) | Process for recovering microbially produced interferon-β | |
| Ouellette et al. | Production and purification of refolded recombinant human IL-7 from inclusion bodies | |
| AU631356B2 (en) | Improved process for recovering microbially produced interferon-beta | |
| US5651963A (en) | Heterodimers forms of CSF-1 and pharmaceutical compositions thereof | |
| CA1337671C (en) | Process for recovering purified, oxidized, renatured recombinant interleukin-2 from microorganisms | |
| CA1283356C (en) | Pharmaceutical compositions of microbially produced interleukin-2 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MK1K | Patent expired |