KR100226978B1 - 봉입체로 발현되는 케이에이치씨브이의 항원결정부위 융합단백질인 유전자 재조합 유비코아518 단백질의 개선된 정제방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 유전자 재조합 대장균에서 봉입체(inclusion body)로 생성되는 한국형 C 형 간염 바이러스(KHCV)의 항원 결정기 융합 단백질인 UBCORE518 단백질의 정제시 발생하는 대장균 유래 분해효소(protease)의 활성을 제거하고, 봉입체 용해조건을 최적화함으로써 UBCORE518 단백질의 정제수율을 증대시키는 효과적인 정제 방법에 관한 것이다.

Description

봉입체로 발현되는 KHCV의 항원 결정 부위 융합 단백질인 유전자 재조합 UBCORE518 단백질의 개선된 정제방법

제1도는 재조합 대장균으로 부터 UBCORE518 단백질을 정제하는 정제과정의 개요를 도시한 것이며,

제2도는 본 발명에 따른 정제 과정 중 얻은 조생성물, 최종 정제된 UBCORE51 8 단백질 및 t-UBCORE518 단백질을 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동(SDS-PAGE)한 결과이며,

제3도는 본 발명에 따른 정제 과정 중 얻은 조생성물, 최종 정제된 UBCORE51 8 단백질 및 t-UBCORE518 단백질을 웨스턴 블롯팅(Western Blotting)한 결과이며,

제4도는 기존의 세척조건에서의 용해조건을 비교한 SDS-PAGE 결과이며,

제5도는 트리톤 X-100 과 수크로즈를 함께 사용한 개선된 봉입체 세척조건에서의 용해조건을 비교한 SDS-PAGE 결과이며,

제6도는 구아니딘 염 용액을 사용한 개선된 봉입체 세척조건에서의 용해조건을 비교한 SDS-PAGE 결과이며,

제7도는 분해효소에 의해 절단된 UBCORE518 단백질을 정제하는 과정 중 젤 여과 크로마토그라피로부터 얻은 분획들을 SDS-PAGE 한 결과이며,

제8도는 UBCORE518 단백질의 전체 아미노산 서열과 분해효소에 의해 절단된 부분을 나타낸 그림이다.

본 발명은 유전자 재조합 대장균에서 봉입체(inclusion body)로 생성되는 한국형 C 형 간염 바이러스(KHCV)의 항원 결정기 융합 단백질인 UBCORE518 단백질의 대량생산을 위한 개선된 정제방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 유전자 재조합 대장균에서 봉입체의 형태로 발현되는 UBCORE518 단백질의 정제시 발생하는 대장균 유래 분해효소(protease)의 활성을 제거하고, 봉입체 용해조건을 최적화함으로써UBCORE518 단백질의 정제수율을 증대시키는 효과적인 정제 방법에 관한 것이다.

C 형 간염은 수혈로 인해 발생되는 간염의 90%를 차지하는 것으로 알려져 있으며(Alter, H. J. et al., Lancet 2, 838-841 (1975)), 더 나아가 감연환자의 40-50%가 만성간염으로 발전하고, 또 그중 20% 정도가 간경병 및 간암으로 까지 진전된다는 것이 알려져 있다(Dienstag, J. L. and Alter, H. J., Semin. Liver. Dis 6, 67-81 (1986)). 이러한 C 형 간염에 대한 진단 및 치료 방법은 세계 각국의 여러 발명자들에 의해 개발되어 왔으며, 본 출원인은 한국형 C 형 간염환자의 혈청으로부터 HCV 입자를 분리하고 그 유전자 구조를 규명하여 기존의 미국형 및 일본형 HCV 와는 상이한 한국형 HCV 가 존재함을 규명한 바 있다(본 출원인의 선행 특허출원 제92-10039 호 참조). 더 나아가 HCV 의 제 3 비구조 유전자(NS3)의 항원 결정기의 유전자 절편을 CORE 14 유전자에 융합시킨 다음 이를 유전공학적인 방법으로 대장균에서 유비퀴틴과 융합단백질인 UBCORE518 로 발현시키고(본 출원의 선행 특허출원 제93-6493호 참조), 그의 정제방법을 보고한 바 있으며(본 출원의 선행 특허출원 제93-6579호 참조), 이를 이용하여 보다 경제적인 진단키트의 제조가 가능함을 보였다(본 출원의 선행 특허출원 제93-7440호 참조). 그러나, C 형 간염 바이러스 진단 키트를 대량으로 생산하기 위해서는 대장균내에서 봉입체로 생산된 UBCORE518 단백질 효과적으로 대량 정제하는 방법이 필수적이다.

대장균(Escherichia coli)에서 재조합 단백질을 발현시킬 때, 단백질이 봉입체(inclusion body)의 형태로 발현되는 현상은 비록 그 형성 메카니즘에 대한 정보는 제한적이지만 많이 알려진 현상이다(Williams, D. C. et al, Science 215, 687-689 (198 2)). 이러한 현상은 대장균에서 이성 단백질(heterogeneous protein)의 발현을 유도할 때 뿐만 아니라, 대장균의 원형질 단백질(cytoplasmic protein)인 베타-갈락토시다제(β-galactosidase)나 변원형질 단백질(periplasmic protein)인 티이엠-베타-락타마제(TEM-β-lactamase)의 경우도 배양조건에 따라 봉입체의 형태로 발현됨이 보고되었다(Cheng, Y.S., Biochem. Biophys. Res. Commun. 111, 104-111 (1983): Bowden, G. A., J. Biol. Chem. 265, 16760-16766 (1990)). 나아가, 성장 호르몬의 경우는 대장균에서 봉입체의 형태로 발현시켜 상업화가 이루어지기도 하였다(Schoner, R. G. et al. Bio/Technology 3, 151-154 (1985)).

미생물에서 유전공학의 기법을 이용하여 목적 단백질을 상업적으로 대량생산하고자 하는 연구에서는, 목적 단백질을 미생물 내에서 봉입체로 발현시켜 정제하는 방법이 가용성(soluble) 형태로 발현시켜 정제하는 방법보다 상대적으로 목적 단백질의 안전성을 유지하는데 용이하고 정제방법의 대형화가 용이하다는 점에서 꾸준히 발전되어 왔다.

미생물에서 봉입체로 발현되는 목적 단백질을 정제하기 위하여는 일반적으로 세포를 파괴하여 봉입체를 회수한 뒤 우레아(urea), 구아니딘 염, 또는 SDS(sodium dodesyl sulfate)와 같은 계면활성제를 이용하여 이를 용해시킨 후 일련의 정제과정을 거쳐 단백질 고유의 활성을 갖게 하기 위한 원상화 과정을 수행하여야 한다.

1983년 폴(Paul)등은 대장균에서 발현되는 사람의 프로인슐린 펩타이드(proinsulin peptides) 봉입체가 대장균에 클로닝된 단백질외에 여러 가지의 단백질로 이루어져 있음을 면역화학적 방법을 이용하여 밝혔다(Paul et al, E. J. Cell Bio. 31, 171-174 (1983)). 이어서, 하틀리(Hartley)와 케인(Kane)은 봉입체에 존재하는 대부분의 오염 단백질들이 주로 대장균의 외막 단백질(outer membrane protein)임을 보고하였다(Hartley, D. L. and Kane, J. F., Biochem. Soc. Trans. 16, 101-102 (1988)). 그후, 이러한 봉입체 오염의 발생과정에 대한 연구들이 이루어져 1990년에 하트(Hart)등은 봉입체를 구성하는 오염 단백질들은 정제를 위하여 세포를 파괴한 후 봉입체를 회수하는 과정에서 봉입체와 세포조각(cell debris)이 같이 침전(coprecipitation)되어 발생하는 것이라고 보고하였다. (J. Biol. Chem. 265, 12728-12733 (1990)). 또한, 봉입체와 같이 침전되는 세포조각에 목적 단백질을 분해(degradation)시키는 분해효소가 존재하며, 이 대장균의 분해효소에 의해 봉입체를 용해하는 과정에서 목적 단백질이 분해되는 현상이 관측되었다(Patricia, C. B. et al, Bio/Technology 8, 945-949 (1990)). 유용 단백질이 정제과정에서 분해되면 정제 수율을 떨어지게 되며, 일반적인 정제방법을 이용하여서는 분해된 단백질과 원래의 목적 단백질을 분리하기가 어렵게 된다. 따라서, 이러한 분해효소의 활성을 제거하기 위한 방법들이 연구되어져 왔다. 그중 한 방법으로 트리톤 엑스-100(Triton X-100)과 수크로즈(sucrose)를 적당히 사용하여 세포를 파쇄한 후 회수된 봉입체를 세척함으로써 봉입체 용해시 발생하는 목적 단백질의 분해 현상이 현저히 방지된다는 실험적 결과가 보고되었다.(Patricia, C. B. et al, Bio/Technology 8, 945-949 (1990)).

한편, 본 발명자들은 KHCV 진단 키트의 대량생산을 위해 본 발명자들이 선행 특허출원 제93-6579 호의 정제방법에 준하여 UBCORE518 항원 단백질의 대량정제를 수행하던 중, UBCORE518 단백질의 봉입체를 회수, 세척, 용해하는 과정에서 목적 단백질인 UBCORE518 항원 단백질의 분해 현상이 발생함을 관측하였다. 이러한 UBCORE518 항원 단백질의 분해는 정제 수율을 현저히 감소 시켰으며, 분해현상의 원인을 조사 분석한 결과, 상기에 기술한 봉입체의 분해현상과 일치하는 것임을 확인하였다. 또한, 본 발명자들은 분해된 단백질을 선택적으로 정제하여 N-말단 아미노산 서열 분석(N-terminal amino acid sequence analysis)을 수행한 결과, UBCORE518 단백질의 서열중, 핵(CORE) 부분의 N 말단으로부터 50개 까지의 아미노산이 특정하게 절단되었음을 발견하였다. 이렇게 절단된 부분에는 핵 항원기의 중요 부분이 포함되어 있으므로(Marc, S. N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 5462-5466 (1991)), 이 부분이 절단된 항원은 NS3 항원 결정기의 기능밖에는 수행할 수 없게 된다. 따라서, 본 발명자들은 봉입체로 발현된 재조합 단백질을 정제하는 과정에서 목적 단백질의 분해현상을 최소화하여 재조합 단백질을 효과적으로 대량 정제하는 방법을 개발하고자 예의 연구한 결과, 상기의 실험적 사실에 착안하여 UBCORE518 봉입체의 세척방법과 용해 조건 및 기타의 과정을 개선함으로써 정제 수율을 증가시키는 방법을 개발하였다.

본 발명의 목적은 한국형 C 형 간염 바이러스의 항원 결정기 융합 단백질인 KHCV UBCORE518 단백질의 고순도로 대량 정제할 수 있는 제어방법을 제공하는 것이다.

즉, 본 발명은 유전자 재조합 대장균으로부터 UBCORE518 단백질을 정제하는데 있어서, 세포파쇄 및 가용성 단백질의 제거, 봉입체의 회수, 세척 및 용해, 양이온 교환 크로마토그라피, 단백직의 침전 및 세척, 음이온 교환 크로마토그라피, 단백질의 침전 및 세척, 젤 여과 크로마토그라피 및 원상화를 위한 투석을 포함하는, UBCORE518 단백질의 정제방법에 관한 것이다.

본 발명을 보다 상세히 설명하면 다음과 같다.

KHCV UBCORE518 단백질이 발현된 세포 침전물을 초음파로 처리하여 분쇄한 후 원심분리하여 상측액인 가용성 단백질을 제거하고 불용성 침전물인 봉입체를 얻는다. 상기 단계에서 봉입체와 함께 회수된 오염 단백질을 제거하기 위해 트리톤 X-100 과 같은 비이온성 계면활성제를 사용하여 봉입체를 세척한다. 본 발명에서는 봉입체의 오염물질, 특히, 대장균 유래 분해효소의 활성을 없애기 위해 트리톤 X-100과 수크로즈를 혼합하여 사용하거나 구아니딘 염을 사용하며, 바람직하게는 4% 트리톤 X-100과 6% 스쿠로즈의 혼합용액 또는 1M 구아니딘 염 용액을 사용한다.

상기에서 회수 및 세척된 봉입체는 우레아를 사용하여 용해시킬 수 있다. 사용되는 우레아의 양은 봉입체를 충분히 녹여 줄 수 있는 양이어야 하며, 본 발명에서는 6 내지 8M, 바람직하게는 7M의 우레아 용액을 사용한다.

이어서, 봉입체 용액을 원심분리하여 얻은 상충액을 양이온 교환수지에 흡착시킨 후, 염 농도 구배를 이용하여 용출시켜 오염 단백질을 제거한다. 본 발명의 양이온 교환수지로는 CM-세파로스(CM-Sepharose, Pharmacia, Sweden) 또는 S-세파로스(S-Sepharose, Pharmacia, Sweden)를 사용할 수 있으며, CM-세파로스를 사용하는 것이 바람직하다. 양이온 교환 크로마토그라피 수행시 완충액의 pH는 6.9 내지 7.0 의 범위내일 수 있고, pH 6.5가 바람직하다. 완충액은 완충제로서 비스-트리스(Bis-Tris)를 포함하는 것이 바람직하고, 6내지 8M, 바람직하게는 6M 의 우레아를 포함한다. 용출시에는 0.0 내지 0.4M의 염화나트륨 선형농도 구배가 바람직하게 사용된다.

상기 양이온 교환 크로마토그라피에서 취득한 단백질 용액을 다음 단계의 음이온 교환 수지에 흡착시켜 주기 위해서는 단백질 용액의 이온 전도도를 낮추어 주어야 하는데 이를 위하여 본 발명에서는 황산 암모늄을 이용한 단백질 용액의 침전 방법을 사용한다. 사용할 수 있는 황산 암모늄의 양은 단백질 용액의 부피당 45% 이상이며, 바람직하게는 45%가 사용된다. 침전된 단백질을 원심분리에 의해 회수한 후 증류수로 세척한다.

부분정제된 UBCORE518 단백질의 순도를 높이기 위하여 음이온 교환 크로마토그라피 단계를 수행한다. 음이온 교환 수지로는 큐-세파로스(Q-Sepharose, Pharm acia, Sweden) 또는 디이에이이-세파로스(DEAE-Sepharose, Pharmacia, Sweden)를 사용할 수 있고, 바람직하게는 DEAE-세파로스를 사용된다.

완충액의 pH는 8.0 내지 9.0 이며, 바람직하게는 pH 8.3이 사용된다. 완충액은 완충제로서 트리스를 포함하며, 완충액내의 우레아 농도는 6내지 8M, 바람직하게는 6M 이다. 용출시에는 0.0 내지 0.3M의 염화나트륨 선형농도 구배가 바람직하게 사용된다.

음이온 교환 크로마토그라피에서 용출된 단백질 용액을 젤 여과 크로마토그라피 단계에 적용하려면 단백질 용액의 부피를 줄여야 한다. 일반적으로 단백질 용액을 농축하기 위해서는 환외여과 농축 방법을 사용하나 UBCORE518 단백질은 그와 같이 농축하면 기계적인 충겨에 의해 분해되는 성질이 있으므로, 본 발명에서는 단백질을 안정하게 침전시킨 후에 다시 적당 부피로 용해하는 침전방법을 사용한다. 이 침전방법으로는 상기의 침전방법이 동일하게 적용된다.

최종 순도 95%이상의 UBCORE518 단백질을 얻기 위하여 젤 여과 크로마토그라피 단계를 수행한다. 수지로서는 분획가능 단백질 범위(fractionation range)가 10kDa 이상인 세파크릴-100,200,300(Sephacryl-100,200,300, Pharmacia, Sweden)이 사용될수 있으며, 바람직하게는 세파크릴-200이 사용된다. 사용되는 완충용액의 pH는 7.0 내지 8.5 이며, 바람직하게는 pH 8.0이다. 완충액중에 우레아 농도는 6내지 8M, 바람직하게는 6M 이다.

마지막으로, 변성된 단백질을 원상화하기 위하여 투석(dialysis)에 의해 단백질 용액내의 우레아 제거하여 준다.

투석에 사용되는 완충액의 pH 범위는 7.0 내지 7.5, 바람직하게는 pH 7.3이다. 완충제로는 HEPES(Hydroxyethyl piperazine ethanesulfonic acid, Sigma)가 바람직하게 사용되며, 0.5 내지 1.5M, 바람직하게는 0.5M의 염화나트륨이 완충용액에 첨가된다.

본 발명을 하기 실시예에 의거하여 보다 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 예시한 것으로서 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

하기 실시예에서 사용된 완충용액의 조성은 특별한 언급이 없는 한 다음과 같다.

· 완충용액 1 : 20mM 트리스, 5mM 에틸렌 디아민 테트라아세트산(ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA), 150mMNaCl, 1mM 페닐 메틸 설포닐 플루오라이드(phenyl methyl sulfonyl fluoride, PMSF), 10mM 2-머캅토에탄올(2-mercaptoethanol), pH 8.0

·완충용액 2 : 20mM 트리스, 1mM EDTA, 10mM 2-머캅토에탄올, 1mM PMSF, 1% 트리톤(Triton) X-100, pH 8.0

·완충용액 3 : 20mM 트리스, 5mM EDTA, 1mM PMSF, 10mM 2-머캅토 에탄올, 4% 트리톤 X-100, 6% 스쿠로즈, pH 8.0

·완충용액 4 : 1M 구아니딘 HCL, 20mM 트리스(pH 8.0), 1mM EDTA, 1mM PMSF

·완충용액 5 : 8M 우레아, 1mM EDTA, 1mM PMSF, 10mM 2-머캅토 에탄올

·완충용액 6 : 6M 우레아, 20mM 비스-트리스 1mM PMSF, 1mM EDTA, 10 mM 2-머캅토 에탄올, pH 6.5

·완충용액 7 : 6M 우레아, 20mM 트리스, 1mM EDTA, 1mM PMSF, 10mM 2-머캅토 에탄올, pH 8.3

·완충용액 8 : 6M 우레아, 20mM 트리스, 1mM EDTA, 1mM PMSF, 150mM NaCl, 10mM 2-머캅토 에탄올, pH 7.5

·완충용액 9 : 50mM HEPES, 500mM NaCl, pH 7.3

[실시예 1]

단계1 : 세포파쇄 및 가용성 단백질의 제거

UBCORE518 단백질이 발현된 세포 침전물 20g(젖은 무게)에 200㎖의 완충용액 1을 가하여 현탁시킨 후, 얼음 중탕안에서 초음파 분쇄기(ultrasonic homogenizer 4710: Cole-Parmer, USA)로 50% 의 출력과 50%의 효율 사이클(duty cycle)에서 4분간 초음파 처리하여 세포를 파쇄하였다. 이렇게 하여 얻은 세포 균질액을 고속 원심 분리기(Beckman J2-21M, Rotor JA14)로 10000 rpm에서 30분간 원심분리하여 상층액인 가용성 단백질을 제거하고 불용성 침전물인 봉입체를 얻었다.

단계2 : 봉입체의 세척

상기의 단계1에서 회수한 봉입체에 200㎖의 완충용액 4를 넣어 균질화기(Heavy-duty homogenizer: Cole-Parmer, USA)를 이용하여 현탁시킨 후, 고속 원심분리기로 10000 rpm에서 30분가 원심분리하여 침전물인 세척된 봉입체를 회수하였다.

단계3 : 봉입체의 용해

단계2에서 얻은 봉입체에 100㎖의 완충용액 5를 넣어 1시간동안 상온에서 용해시켰다. 용해 후 고속 원심분리(10000 rpm/ 40분)하여 용해되지 않은 침전물은 제거하고 상충액만큼을 취했다.

단계 4 : 양이온 교환 크로마토그라피

단계3의 상충액 100㎖에 200㎖의 완충용액 6을 넣어 희석한 후, 동일 완충액으로 평평한 CM-세파로스 칼럼(Pharmacia, XK 50/20)에 분당 2㎖의 속도로 통과시켰다. 이어서 300㎖의 완충용액 6을 칼럼에 흘려 이온 교환수지에 흡착되지 않은 단백질들을 제거하였다. 그 다음, 0.0 내지 0.4M 선형 농도 구배의 염화 나트륨을 포함하는 1000㎖의 완충용액 6을 가하여 수지에 흡착되어 있던 단백질들을 분당 2㎖의 속도로 용출시켜 각 10㎖의 분획들을 수집하였다. 수집된 분획들을 15% SDS-폴리아크릴아미드젤 전기영동(SDS-PAGE)하여 UBCORE518 단백질을 포함하는 특징 분획들만을 별도로 수집하였다.

단계5 : 황산 암모늄을 이용한 단백질의 침전화

단계4에서 취입하여 얻은 단백질 용액에 용액 100㎖ 당 45g의 황산 암모늄을 넣은 후, 자기 교반기위에서 녹였다. 황산 암모늄이 다 녹은 후, 고속 원심 분리(10000 rpm/20 분)하여 침전된 단백질을 회수하였다.

단계6 : 우레아를 사용한 침전물의 용해

단계5에서 회수한 침전물에 20㎖의 증류수를 가하고 유리막대를 이용하여 교반하였다. 이 용액을 고속 원심 분리(10000rpm/20분)하고 상층액을 버림으로써 잔류 황산 암모늄을 제거하였다. 이렇게 하여 세척된 단백질 침전물에 100㎖의 완충용액 5를 가하여 녹여 주었다.

단계7 : 음이온 교환 크로마토라그라피

단계6에서 얻은 100㎖의 단백질 요액에 300㎖의 완충용액 7을 넣어 희석한 후 동일 완충액으로 평평한 DEAE-세파로스 칼럼(Pharmacia, Sweden, XK 50/20)에 분당 2㎖의 속도로 통과시켰다. 이어서 400㎖의 완충용액 7을 컬럼에 흘려 이온 교환수지에 흡착되지 않은 단백질들을 제거하였다. 그 다음, 0.0 내지 0.3M 선형 농도 구배의 염화 나트륨을 포함하는 1000㎖의 완충용액 7을 가하여 수지에 흡착되어 있던 단백질들을 분당 2㎖의 속도로 용출시켜 각 10㎖의 분획들을 수집하였다. 수집된 분획들을 15% SDS-PAGE하여 UBCORE518 단백질을 포함하는 특징 분획들만을 별도로 수집하였다. 이렇게 수집한 단백질 용액에 단계 5와 같은 조건으로 황산 암모늄을 처리한 후, 회수된 단백질 침전물에 10㎖의 완충용액 5를 가하여 녹였다. 침전물이 다 녹은 후, 고속 원심분리(15000g/30분)하여 상층액을 취했다.

단계8 : 젤 여과 크로마토그라피

단계7의 상충액 15㎖를 완충용액 8로 평형화한 세파크릴(Sephacryl) 200 수지 칼럼(Pharmacia, Sweden, XK 50/100)에 분당 1㎖의 속도로 통과시키면서 젤 여과 크로마토그라피를 수행하였다. 용출되는 단밸질을 각 10㎖의 분획들로 수입하였다. 수집된 분획들을 15% SDS-PAGE하여 UBCORE518 단백질을 포함하는 특징 분획들만을 별도로 수집하였다.

단계9 : 투석

단계8 에서 수집한 UBCORE518 단백질용액을 투석막(Spectrum,USA,molecular cut 10000-12000)에 넣은 후 4L의 완충용액 9가 들어 있는 용기에서 6시간 동안 투석함으로써 실시예 1에서의 세포침전물 20g(젖은 무게)으로 부터 총 350mg의 순수한 UBCORE518 단백질을 얻었다. 최종적으로 수득한 UBCORE518 단백질의 순도는 15% SDS-PAGE로 분리한 후 쿠마시 블루(Coomassie Brilliant Blue R)로 염색하여 확인한 결과 95%이상인 것으로 밝혀졌다.

상기 정제과정 중 각 단계에서 얻은 조생성물 및 최종정제된 UBCORE518 단백질을 분해효소에 의해 절단된 UBCORE518 단백질(t-UBCORE518)과 함께 15% SDS-PAGE 하여 그 결과를 제2도에 나타내었다. 제2도에서, 제1열은 표준 분자량의 단백질을, 제2열은 세포 파쇄후에 회수된 봉입체를, 제3열은 구아니딘 염 용액으로 세척한 후의 봉입체를, 제4열은 최종 정제된 UBCORE518 단백질을, 제5열은 정제된 t-UBCORE518 단백질을 각각 나타낸다.

[실시예 2] : 웨스턴-블롯팅

실시예 1 의 각 단계에서 얻은 시료를 SDS-PAGE 하여 젤 상에서 분리하여 니트로 셀룰로스 막(nitrocellulose membrane, BIO-RAD,USA)에 블롯팅(blotting)하였다. 이 막율 0.5% 트윈 20이 함유된 PBS(10mM 인산, pH 7.0, 0.15M NaCl)에 넣고 상온에서 2시간 동안 약하게 흔들면서 폐쇄(blocking)시켰다. 이후 0.5% 젤라틴과 0.5%트윈 20을 함유한 PBS에 한국형 C 형 간염환자의 혈청을 1:50으로 희석시켜 첨가하고 상온에서 1시간 동안 약하게 흔들면서 반응시켰다. 반응 후 막을 0.05%로 트윈 20을 함유하는 PBS로 5분씩 3회 세척하였다. 이 막에 0.5% 젤라틴과 0.05% 트윈 20을 함유한 PBS에 양고추 냉이 과산화 효소(horseradish peroxidase)로 표지된 항-사람 면역 글로불린 G(BIO-RAD Lab, anti-human IgG-HRP)를 1:500으로 희석시켜 첨가한 다음 상온에서 1시간 동안 진탕하면서 반응시키고, 0.05% 트윈 20 함유한 PBS로 5분씩 3회 걸쳐 세척하였다. 이후, 0.03%의 과산화 수소와 0.4mg/㎖의 4-클로로-1-나프톨이 함유된 50mM 트리스 완충액(pH 7.0)을 가하여 발생시켰다. 이 결과를 제3도에 나타내었다. 제3도에서, 제1열은 t-UBCORE518 단백질을, 제2열은 최종 정제된 UBCORE518 단백질을, 제3열은 봉입체 세척 후의 단백질을, 제4열은 세포 파쇄 후 회수된 봉입체를, 제5열은 표준 분자량의 단백질을 각각 나타낸다.

[비교예 1]

실시예 1의 단계1에서 얻은 세포 침전물에 200㎖의 완충용액 2를 넣어 균질화기를 이용하여 현탁시키고 1㎖ 씩 8개의 표준 시료를 취하여 원심분리튜브에 넣은 후, 미량원심분리기(microcentri-fuge 5415C, Eppendorf, Germany)로 14000 rpm에서 10분간 원심분리 하였다. 원심 분리한 후, 상층액을 완전히 제거하고, 각 튜브의 침전물에 1M,2M,3M,4M,5M,6M,7M 및 8M의 우레아를 각각 포함하는 완충용액(50mM 트리스, 10mM 2-머캅토에탄올, 5mM EDTA, 1mM PMSF, pH 9.0)을 1㎖씩 넣은 후 2 시간 동안 녹였다. 봉입체가 완전히 용해된 후 각각의 튜브를 상기 조건으로 원심분리하여 상층액을 취했다. 이 상층액을 15% SDS-PAGE하여 그 결과를 제4도에 나타내었다. 제4도에서, 제1열은 표준 분자량의 단백질을, 제2열은 1M 우레아 완충용액에 용해된 단백질을, 제3열은 2M 우레아 완충용액에 용해된 단백질을, 제4열은 3M 우레아 완충용액에 용해된 단백질을, 제5열은 4M 우레아 완충용액에 용해된 단백질을,

제6열은 5M 우레아 완충용액에 용해된 단백질을, 제7열은 6M 우레아 완충용액에 용해된 단백질을, 제8열은 7M 우레아 완충용액에 용해된 단백질을, 제9열은 8M 우레아 완충용액에 용해된 단백질을 각각 나타낸다.

이 결과에서 알 수 있듯이 선행 한국 특허출원 제93-6579호 등에 기재된 기존의 용해 조건인 4M 우레아로는 봉입체를 충분히 용해시킬 수 없으며 6 내지 8M 의 우레아 용액을 사용하는 것이 바람직하다.

[실시예 3] : 트리톤 X-100과 수크로즈를 사용한 봉입체의 세척

실시예 1 의 단계1에서 얻은 세포 침전물에 200㎖의 완충용액 3을 넣고 균질화기를 이용하여 현탁시킨 후, 비교예 1의 방법과 완충용액들을 동일하게 사용하여 얻은 시료를 15% SDS-PAGE하여 그 결과를 제5도에 나타내었다. 제5도에서 제1열은 표준 분자량의 단백질이고, 제2열 내지 제8열은 각각 1M 내지 7M의 우레아 완충용액에 용해된 단백질을 나타낸다. 이 결과로부터 기존의 용해 조건인 4M 우레아로는 봉입체를 충분히 녹여 낼 수 없음을 확인하였으며, 나아가 본 방법에 의해 대장균 유래 분해효소의 활성에 의한 t-UBCORE518의 생성을 현저히 방지할 수 있음을 확인하였다.

[실시예 4] : 구아니딘 염을 사용한 봉입체의 세척

실시예 1 의 단계1에서 얻은 세포 침전물에 200㎖의 완충용액 4을 넣고 균질화기를 이용하여 현탁시킨 후, 비교예 1의 방법과 완충용액들을 동일하게 사용하여 얻은 시료를 15% SDS-PAGE하여 그 결과를 제6 도에 나타내었다. 제6도에서 제1열은 표준 분자량의 단백질이고, 제2열 내지 제8열은 각각 1M 내지 7M의 우레아 완충용액에 용해된 단백질을 나타낸다. 이 결과로부터 기존의 용해 조건인 4M 우레아로는 봉입체를 충분히 녹여 낼 수 없음을 확인하였으며, 나아가 본 방법에 의해 대장균 유래 분해효소의 활성에 의한 t-UBCORE518의 생성을 현저히 방지할 수 있음을 확인하였다.

[실시예 5] : 절단된 UBCORE518 단백질(t-UBCORE518)의 N-말단 아미노산 서열 확인

실시예 1 의 방법에 따라 세포를 파쇄한 후 봉입체를 회수 하고, 여기에 100㎖의 완충용액 2를 가하여 봉입체를 세척하였다.

세척된 봉입체에 10㎖의 완충용액 5 를 넣어 2 시간 동안 상온에서 용해시킨후 고속 원심분리(10000 rpm/30분)하여 용해되지 않은 침전물은 제거하고 상층액만을 취했다.

상기 상층액 100㎖에 300㎖의 완충용액(6M 우레아, 20mM 아세트산 나트륨, 1mM PMSF, 1mM EDTA, 10mM 2-머캅토에탄올, pH6.0)을 넣어 희석한 후 동일 완충액으로 평형화 CM세파로스 칼럼(Pharmacia, Sweden, XK 50/20)에 분당 2㎖의 속도로 통과시켰다. 이어서 300㎖의 완충용액을 컬럼에 흘려 이온 교환수지에 흡착되지 않은 단백질들을 제거하였다. 그 다음, 0.0 내지 0.6M 선형 농도 구배의 염화 나트륨을 포함하는 1L의 동일 완충용액을 가하여 수지에 흡착된 단백질들을 분당 2㎖의 속도로 용출시켜 각 10㎖의 분획들을 수집하였다. 수집된 분획들을 15% SDS-PAGE하여 t-UBCORE518 단백질을 포함하는 특징 분획들만을 별도로 수집하였다.

상기에서 취합한 단백질 용액을 투석막(Spectrum, USA, molecular cut: 10000-12000)에 넣은 후, 4L 의 완충용액(20mM 아세트산 나트륨, 1mM PMSF, pH 5.0)이 들어 있는 용기에서 투석 하여 침전화 시켰다. 침전된 단백질에 20㎖의 완충용액 4를 넣어 용해시켰다. 용해 후, 12000rpm 에서 30 분간 고속 원심 분리하여 그 상층액을 취했다.

상기의 상층액 20㎖를 실시예 1의 단계8과 같이 젤 여과 크로마토그라피하여 수집된 분회들을 15% SDS-PAGE 하여 t-UBCORE518 단백질을 포함하는 특정 분획들만을 별도로 수집하였다. 상기 SDS-PAGE 결과를 제7도에 나타내었으며, 제7도에서 M열은 표준 분자량의 단백질을, L열은 젤 여과 크로마토그라피 칼럼에 투입된 단백질을, 그리고 나머지 열들은 용출된 분획내의 단백질을 용출순서대로 나타낸다.

상기에서 수집한 단백질 용액 투석막(Spectrum, USA)에 넣은후, 4L의 완충용액(20mM 에탄올아민, 0.4M NaCl, pH 9.3)이 들어 있는 용기에서 투석하였다.

아미노산 서열 분석기(모델 471A, 미국 Applied biosysterm사)를 이용하여 상기에서 얻은 단백질의 N-말단의 아미노산 서열을 확인하고, 그결과를 제 8 도에 나타내었다. 이 결과를 통하여 t-UBCORE518 단백질에는 핵 항원결정 부위의 중요 부분이 없음을 확인하였다.

Claims (11)

1. 대장균에서 발현된 UBCORE518 단백질을 정제하는데 있어서, 가) 세포를 파쇄시켜 가용성 단백질을 제거하고 봉입체를 회수하는단계, 나) 회수한 봉입체를 세척하는 단계, 다) 세척한 봉입체를 우레아 수용액을 이용하여 용해시킨 후 원심분리 하여 상층액을 회수하는 단계, 라) 양이온 교환 크로마토그라피 단계, 마) 라) 단계에서 용출된 단백질을 황산 암모늄을 이용하여 침전시킨 후 침전물을 세척하고 우레아를 이용하여 용해시키는 단계, 바) 음이온 교환 크로마토그라피 단계, 사) 바) 단계에서 용출된 단백질을 황산 암모늄을 이용하여 침전시키고 우레아를 이용하여 침전물을 용해시키는 단계, 아) 젤 여과 크로마토그라피 단계, 및 자) 우레아 제거를 위한 투석 단계를 포함하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 나) 단계의 세척용액이 4% 트리톤 X-100 및 6% 수크로즈를 포함하는 완충용액인 방법.
3. 제1항에 있어서, 나) 단계의 세척용액이 1M 구아니딘 염을 포함하는 완충용액인 방법.
4. 제1항에 있어서, 다) 단계의 우레아 농도가 6 내지 8M 인 방법.
5. 제1항에 있어서 , 라) 단계에서 양이온 교환 수지로 CM-세파로스를 사용하고, 6 내지 8M 의 우레아와 비스-트리스 완충제를 포함하는 pH 6.0 내지 7.0 의 완충용액을 사용하여 용출시키는 방법.
6. 제5항에 있어서, 용출시 0.0 내지 0.4M 의 염화 나트륨 직선 농도 구배를 사용하는 방법.
7. 제1항에 있어서, 마) 단계에 사용되는 황산 암모늄의 최종 농도가 45% 이상인 방법.
8. 제1항에 있어서, 바) 단계의 음이온 교환 수지로 DEAE-세파로스를 사용하고, 6 내지 8M 의 우레아가 포함된 pH 8.0 내지 9.0 의 완충용액을 사용하여 용출시키는 방법.
9. 제1항에 있어서, 용출시 0.0 내지 0.3M의 염화 나트륨 직선 농도 구배를 사용하는 방법.
10. 제1항에 있어서, 아) 단계의 젤 여과 크로마토그라피의 수지로 세파크릴100,200 또는 300을 사용하고, 6 내지 8M의 우레아가 포함된 완충액을 상용하여 용출시키는 방법.
11. 제1항에 있어서, 자) 단계의 완충액으로서, 완충제하이드록시에틸 피페라진 에탄설폰산(HEPES) 및 0.5 내지 1.5M의 염화 나트륨을 포함하는 pH 7.0 내지 7.5 의 완충용액을 사용하는 방법.