CN105092720A - 一种测定甲磺酸达比加群酯中基因毒性杂质的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种测定甲磺酸达比加群酯中基因毒性杂质的方法。选择十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，以有机相与缓冲液的混合溶剂梯度洗脱作为流动相直接进行检测。该检测方法检测灵敏度高、专属性强、精密度高、准确性强、操作方便，且该方法的适用性很广，有效控制原料药的质量。

Description

一种测定甲磺酸达比加群酯中基因毒性杂质的方法

技术领域

本发明属于药物分析领域，具体地，涉及一种利用HPLC（高效液相色谱）测定甲磺酸达比加群酯中基因毒性杂质的方法。

背景技术

甲磺酸达比加群酯为达比加群的前药，系德国勃林格殷格翰公司开发，于2008年4月在德国和英国率先上市，这是继华法林之后50年来上市的首个新类别口服抗凝血药物，是抗凝血治疗领域和潜在致死性血栓预防领域的一项重大进展，具有里程碑意义。

然而在甲磺酸达比加群酯药物合成中，磺酸类物质与微量的低级醇在合成反应中生成烷基磺酸酯如甲磺酸甲酯（MMS）、甲磺酸乙酯（EMS），这些物质可与DNA发生烷基化反应，从而可能成为引发癌症的诱因。

磺酸酯类化合物作为潜在的基因毒性杂质，可以尽量控制条件或改变工艺路径来避免这些杂质的生成，同时各种分析技术手段用于研究检测磺酸酯类物质的限度，如GC-MS、HPLC-MS和手性色谱法，以及各种新型的检测器类型如MS、ELSD得到应用，提高了检测效率和灵敏度。目前对磺酸酯类杂质的检测研究仍然以GC-MS和HPLC-MS为主。

本专利申请人发现，用以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，有机相与磷酸缓冲液的混合溶剂作为流动相梯度洗脱，可检测出甲磺酸达比加群酯中磺酸酯类杂质，且灵敏度高，可以有效控制原料药质量，解决了基因毒性无法定性定量分析检测的难题。

发明内容

本发明提供一种利用HPLC测定甲磺酸达比加群酯中磺酸酯类基因毒性杂质的方法，从而实现对甲磺酸达比加群酯中磺酸酯类基因毒性杂质在原料药中的控制。

本发明的技术方案：提供一种利用HPLC测定磺酸酯类基因毒性杂质的方法，

选择十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以有机相与缓冲液的混合溶剂作为流动相梯度洗脱。

检测步骤如下：采用色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以有机相与缓冲液的混合溶剂作为流动相梯度洗脱，柱温20℃～30℃，流速为0.6～1.0mL/min。

所述有机相为选自乙腈。

所述缓冲液为磷酸缓冲液。缓冲液的浓度范围为0.005mol/L～0.05mol/L，优选0.01mol/L。

所述的磷酸可以用用醋酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾代替。

所述缓冲液的pH值为4.0～5.0。

所述流动相为有机相与缓冲液的混合溶剂梯度洗脱，以有机相为流动相A,以缓冲液为流动相B，按0-20分钟，流动相A比例为90%，流动相B比例为10%，20-30分钟，流动相A比例为70%，流动相B比例为30%，30-50分钟，流动相A比例为90%，流动相B比例为10%进行梯度洗脱。

所述的检测条件：柱温20℃～30℃，优选25℃；流速为0.6～1.0mL/min，优选0.8mL/min。检测波长为220nm±10nm，优选220nm。

本发明所述的检测方法，可以依照以下方法实现：

（1）取待检测样品适量，用乙腈或它与水的混合溶剂溶解，配制成合适浓度的样品溶液。

（2）取磺酸酯类杂质适量，用乙腈或它与水的混合溶剂溶解，配制成合适浓度的对照品溶液。

（3）设置流动相的流速为0.8mL/min；检测波长220nm；色谱柱温度为25℃。

（4）分别取（1）、2）的样品溶液和对照品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，完成甲磺酸达比加群酯中磺酸酯类毒性杂质的含量测定。

本发明的技术效果：通过利用HPLC，对甲磺酸达比加群酯原料药中基因毒性杂质（或疑似基因毒性）磺酸酯类毒性杂质进行痕量检测分析，灵敏度可达1ppm。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，需要说明的是下面描述的实施例是示例性的，仅

用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。另外，如果没有明确说明，在下面的实施例中所采用的所有试剂均为市场上可以购得的，或者可以按照文本或已知的方法合成的，对于没有列出的反应条件，也均为本领域技术人员容易获得的。

实施例1

仪器：Agilent1260高效液相色谱仪，1260紫外检测器

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(250×4.6mm，5μm)；

流动相A：乙腈

流动相B：0.01mol/L的磷酸缓冲液(pH4.5)

梯度洗脱见下表；

时间（min）	流动相 A(%)	流动相 B(%)
			0-20	90	10
20-30	70	30
			30-50	90	10

流速：0.8mL/min

检测波长：220nm

柱温：25℃

进样体积：10μL

稀释剂：乙腈

试验步骤：

供试品溶液：称取甲磺酸达比加群酯样品1.0014g置10mL量瓶，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀。

对照品溶液：分别精密称取甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯对照品各10.08mg，分别置100mL量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为贮备液A和B。精密量取1.0mL贮备液A和B，分别置100mL量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为贮备液C和D，精密量取1.0mL贮备液C和D，分别置10mL量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液（1ppm）。

分别取对照品、供试品溶液，在上述色谱条件下进行高效液相色谱分析，记录色谱图，图中保留时间为4.32min的色谱峰为甲磺酸甲酯色谱峰，保留时间为5.23的色谱峰为甲磺酸乙酯，采用面积归一化法计算杂质含量。

结论：甲磺酸达比加群酯样品中的甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯的含量均小于1ppm。

对照例

采用现有技术中的GC-MS方法对甲磺酸达比加群酯中的基因毒性杂质进行检测分析，进一步验证本发明所采用方法的准确度和灵敏度。

色谱柱：DB-1毛细管柱（30m×0.25mm，0.25μm）；

溶剂：正己烷；

载气：氦气；

进样口：分流，温度210℃；

柱温：程序升温100℃保持3分钟后以15℃每分钟升温到200℃保持5分钟；

柱流速：2.0ml/min；

分流进样：分流比10:1；

进样模式：顶空进样；

顶空进样器：炉温100℃保温10分钟，针温度100℃，进样量1ml；

MS参数：采用全扫描模式；采集质量数范围：40-510。

供试品溶液：称取甲磺酸达比加群酯样品适量，精密称定，先用少量水溶解，再用丙酮并定容制成10mg/ml溶液；

对照品溶液：分别精密称取甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯对照品适量，精密称定，用丙酮溶解并稀释配成0.02mg/ml溶液。

分别取对照品、供试品溶液，依法顶空进样，记录色谱图，计算色谱峰面积。

结果显示甲磺酸达比加群酯样品中甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯的含量与采用本发明的HPLC法测定的含量相符。

Claims (9)

1.一种测定甲磺酸达比加群酯中基因毒性杂质的方法，其特征在于：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以有机相与缓冲液的混合溶剂作为流动相梯度洗脱，柱温20℃～30℃，流速为0.6～1.0mL/min。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：以有机相为流动相A,以缓冲液为流动相B，按0-20分钟，流动相A比例为90%，流动相B比例为10%，20-30分钟，流动相A比例为70%，流动相B比例为30%，30-50分钟，流动相A比例为90%，流动相B比例为10%进行梯度洗脱。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述有机相为乙腈。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述缓冲液为选自磷酸缓冲液。

5.根据权利要求4所述的方法，其中磷酸用醋酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾代替。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述缓冲液的pH值为4.0～5.0。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：流动相的流速为0.8mL/min。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：柱温为25℃。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：检测波长为220±10nm。