CN109212068A - 一种齐多夫定的基因毒性杂质的高效液相检测方法 - Google Patents

一种齐多夫定的基因毒性杂质的高效液相检测方法 Download PDF

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Abstract

本申请公开了一种齐多夫定的基因毒性杂质的高效液相检测方法，所述方法包括：提供样品分析溶液；将样品分析溶液注入高效液相色谱仪进行色谱分析，并记录色谱图；其中色谱柱为反相色谱柱，流动相为酸铵盐溶液与有机相的混合液。通过上述方式，本申请能够提高基因毒性杂质的检测分离度和检测限度。

Description

一种齐多夫定的基因毒性杂质的高效液相检测方法
技术领域
本申请涉及药物分析技术领域，特别是涉及一种齐多夫定的基因毒性杂质的高效液相检测方法。
背景技术
齐多夫定，化学名为l-(3-叠氮-2,3-二脱氧-β-D-呋喃核糖基)-5-甲基嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮，其结构式为：
齐多夫定，即3’-叠氮-3’-脱氧胸苷，为天然胸腺嘧啶核苷的合成类似物。是第一个上市的用于治疗获得性免疫缺陷综合症(AIDS)的新药，它通过与病毒DNA聚合酶结合，中止DNA链增长，从而抑制病毒的复制。英国葛兰素公司首先研制成功并上市，临床已广泛用于治疗HIV感染、艾滋病和重症艾滋病相关综合症。
齐多夫定合成过程中生成的杂质imp2/imp3/imp4(具体结构请参阅表1)均含有磺酸酯结构，根据欧洲药品管理局于2006年6月28日颁布的《基因毒性杂质限度指南》所述，该类杂质均被认为含有警示结构，或者称为基因毒性杂质，因此需要细致而深入的研究，以确保其对产品的质量无影响。
本申请的发明人在长期的研发过程中，发现由于基因毒性杂质限度极低，检测过程中需要极大的进样浓度，而进样浓度变大时，样品分析溶液中的产品峰不可避免地会因样品过载出现拖尾现象，而与产品极性相近的杂质的定量不可避免地会受主峰拖尾的影响，不能很好的对基因毒性杂质进行定量控制，因此亟待需要开发一种检测齐多夫定的基因毒性杂质的方法。
发明内容
本申请主要解决的技术问题是提供一种齐多夫定的基因毒性杂质的高效液相检测方法，能够提高检测分离度和检测限度。
为解决上述技术问题，本申请采用的一个技术方案是：提供一种齐多夫定的基因毒性杂质的高效液相检测方法，所述方法包括：提供样品分析溶液；将样品分析溶液注入高效液相色谱仪进行色谱分析，并记录色谱图；其中所用色谱柱为反相色谱柱，所用流动相为酸铵盐溶液与有机相的混合液。
其中，利用甲醇、乙腈、甲醇-水混合液或乙腈-水混合液对样品进行溶解，制得样品分析溶液。
其中，样品为齐多夫定原料药、齐多夫定中间体或齐多夫定制剂。
其中，流动相中酸铵盐溶液与有机相的混合体积比为95:5～50:50，流动相的pH值为4.0～8.0。
其中，采用梯度洗脱的方式进行洗脱，其中，梯度洗脱时，在运行时间的0～10分钟范围内，流动相中酸铵溶液的体积比为90～30％，在运行时间的10～20分钟范围内，流动相中酸铵溶液的体积比为35～5％，在运行时间的20～21分钟范围内，流动相中酸铵溶液的体积比为5～90％，在运行时间的21～30分钟范围内，流动相中酸铵溶液的体积比为90～90％。
其中，酸铵盐溶液的浓度为0.001～0.05mol/L，酸铵盐溶液为甲酸铵盐溶液、乙酸铵盐溶液、碳酸氢铵盐溶液中的一种或多种。
其中，反相色谱柱为苯基硅烷键合硅胶色谱柱、氰基键合硅胶色谱柱、氨基键合硅胶色谱柱、十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱或八烷基硅烷键合硅胶色谱柱中的一种。
其中，反相色谱柱的柱长为100mm～300mm，内径为1mm～10mm，粒径为1μm～10μm。
其中，流动相的流速为0.8～1.3ml/min；色谱柱的柱温为25～50℃；检测波长为205～300nm；运行时间为40～70min。
其中，基因毒性杂质的化学结构式为
本申请的有益效果是：区别于现有技术的情况，本申请提供一种齐多夫定的基因毒性杂质的高效液相检测方法，通过利用反相色谱柱，并使用酸铵盐溶液与有机相的混合液进行洗脱，能够提高基因毒性杂质的检测分离度和检测限度。
进一步地，本申请根据基因毒性杂质与样品的溶解性差异，改变样品分析溶液的溶剂，以增大样品分析溶液中杂质的浓度，同时降低产品的浓度；减小产品浓度过大对分离度带来的影响；同时能够有效防止色谱柱过载，提高色谱柱的使用寿命。
附图说明
图1是本申请齐多夫定的基因毒性杂质的高效液相检测方法第一实施方式的流程示意图；
图2是本申请实验例1的检测色谱图；
图3是本申请实验例2的检测色谱图；
图4是本申请实验例3的检测色谱图
图5是本申请实验例4的检测色谱图。
具体实施方式
为使本申请的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照附图并举实施例对本申请进一步详细说明。
本申请提供一种齐多夫定的基因毒性杂质的高效液相检测方法，其中，齐多夫定合成过程中生成的杂质imp2/imp3/imp4均含有磺酸酯结构，属于基因毒性杂质。而杂质imp2/imp3/imp4是在制备中间体ZI04(具体结构详见表1)工序中未转化完全的起始原料β-胸苷与甲磺酰氯发生副反应而产生的。从反应机理来看，由于β-胸苷的残留可控(通常该原料的残留<3％)，因此甲磺酰氯的摩尔配比就非常的大(根据甲磺酰氯的使用配比，甲磺酰氯与残留的β-胸苷摩尔配比>50eq)，导致imp2/imp3继续反应全部转化成为imp4。因此对齐多夫定基因毒性杂质的控制，主要是控制imp4的量。
由于基因毒性杂质限度极低，在检测时需要极大地进样浓度，而进样浓度变大时，样品分析溶液中的产品主峰不可避免地会因样品过载出现拖尾现象，而与产品极性相近的杂质imp4的定量不可避免地会受主峰拖尾的影响。
本申请的发明人经研究发现imp4在ZI04工序之后的反应中，不会进一步生成和增大，为了能够精确的控制齐多夫定中的基因毒性杂质，本申请利用反相高效液相色谱(Reversed-phase High Performance Liquid Chromatogra，RT-HPLC或RP-HPLC)法，在中间体环节进行基因毒性杂质imp4的控制。其中，齐多夫定的中间体ZI04、基因毒性杂质imp2、imp3、imp4的结构见表1。
表1：中间体ZI04、基因毒性杂质imp2/imp3/imp4的名称及结构
请参阅图1，图1是本申请齐多夫定的基因毒性杂质的高效液相检测方法第一实施方式的流程示意图。在该实施方式中，检测方法包括如下步骤：
S101：提供样品分析溶液。
其中，在制备样品分析溶液时，考虑到检测限问题，应控制样品分析溶液中杂质的含量在适当范围内，如杂质含量可以是10～100ng。
S102：将样品分析溶液注入高效液相色谱仪进行色谱分析，并记录色谱图；其中色谱柱为反相色谱柱，流动相为酸铵盐溶液与有机相的混合液。
其中，根据色谱仪的规格要求，先设定检测条件，待仪器运行稳定后，进样，利用流动相进行洗脱，并记录色谱图，对色谱图进行分析，得出杂质含量。
在该实施方式中，通过利用反相色谱柱，并使用酸铵盐溶液和有机相的混合溶剂进行洗脱，能够提高基因毒性杂质的检测分离度和检测限度。
其中，在一实施方式中，利用甲醇、乙腈单一溶剂，或甲醇-水的混合溶剂，或乙腈-水的混合溶剂作为溶剂溶解样品，进而制得样品分析溶液。
具体地，由于杂质imp2/imp3会转化成为imp4，因此可以不单独控制杂质imp2/imp3的含量，而是控制反应的投料，将杂质imp2/imp3全部转化成为imp4，通过控制imp4的含量来控制杂质的含量。同时，由于imp4在ZI04工序之后的反应中，不会进一步生成和增大，因此，可以在制备中间体ZI04这一工序中对杂质imp4进行控制。
其中，根据基因毒性杂质imp4和齐多夫定中间体ZI04在不同溶剂中的溶解性差异，本申请发明人通过对溶剂筛选，发现通过改变样品分析溶液的溶剂可以增大样品分析溶液中杂质的浓度，同时降低产品的浓度。例如杂质imp4在甲醇、乙腈、甲醇-水的混合溶剂、乙腈-水的混合溶剂中的溶解性较好，而中间体ZI04在这些溶剂中的溶解性较差，可以用上述溶液对样品进行溶解，静置后，过滤除去不溶物，取澄清溶液为样品分析溶液。
通过这种方法，能够降低样品分析溶液中样品的浓度，减小产品浓度过大对分离度带来的影响；同时能够有效防止色谱柱过载，提高色谱柱的使用寿命。
在其他实施方式中，该方法也可以适用于检测齐多夫定原料药和制剂中的杂质，即样品分析溶液中，样品可以是检测齐多夫定原料药、齐多夫定中间体或齐多夫定制剂。样品不同时，利用样品中制剂和杂质的溶解性差异，原料药与杂质的溶解性差异，选用不同的溶剂去溶解。其中齐多夫定制剂可以是片剂、胶囊剂、颗粒剂、眼用制剂、鼻用制剂、栓剂、丸剂、软膏剂乳膏剂、糊剂、吸入制剂、喷雾剂、气雾剂、凝胶剂、散剂、糖浆剂、搽剂、涂剂、涂膜剂、酊剂、贴剂、口服溶液剂、植入剂、膜剂、洗剂、冲洗剂、煎膏剂、膏药、露剂、搽剂等。
其中，在一实施方式中，利用反相高效液相色谱法进行检测，反相高效液相色谱法是由非极性固定相和极性流动相所组成的液相色谱体系，该方法适于分离非极性、极性或离子型化合物。因此所用色谱柱为反相色谱柱，反相色谱柱选自苯基硅烷键合硅胶色谱柱、氰基键合硅胶色谱柱、氨基键合硅胶色谱柱、十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱或八烷基硅烷键合硅胶色谱柱中的一种或多种。
反相色谱柱的具体规格为：柱长100mm～300mm，例如150mm、200mm、250mm等；内径1mm～10mm，例如2.5mm、5.0mm、8.0mm等；粒径1μm～10μm，例如2μm、3μm、5μm、7μm。例如可以是Agilent ZORBAX SB-CN(4.6mm×250mm，5μm)的氰基键合硅胶色谱柱。
流动相为水相和有机相的混合液，有机相为甲醇或乙腈；水相为酸铵盐溶液，例如甲酸铵盐溶液、乙酸铵盐溶液、碳酸氢铵盐溶液中的一种；酸铵盐溶液的浓度为0.001～0.050mol/L，例如0.005mol/L、0.010mol/L、0.020mol/L、0.250mol/L、0.040mol/L；pH值为2.0～7.0，例如pH值为2.5、3.5、5.5、6.0、6.5、7.0等。
其中，酸铵盐溶液-有机相的体积比为95:5～50:50，具体为90:10～50:50，例如85:15、75:25、70:30、60:40等。流动相的pH值为4.0～8.0，例如pH值为4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.2等。
具体地，设置色谱条件，其中流动相的流速为0.8～1.3ml/min，例如0.9ml/min、1.0ml/min、1.1ml/min、1.2ml/min等；色谱柱的柱温为25～50℃，例如30℃、35℃、40℃、45℃等；检测器的检测波长为205～300nm，例如225nm、256nm等；运行时间40～70min。
其中，在一实施方式中，采用梯度洗脱的方法进行洗脱，具体地，梯度洗脱时，在运行时间的0～10分钟范围内，流动相中酸铵溶液的体积比为90～30％，在运行时间的10～20分钟范围内，流动相中酸铵溶液的体积比为35～5％，在运行时间的20～21分钟范围内，流动相中酸铵溶液的体积比为5～90％，在运行时间的21～30分钟范围内，流动相中酸铵溶液的体积比为90％。通过利用梯度洗脱，配合相应的色谱柱，能够调整杂质和样品的保留时间，提高分离度。
下面，将通过几组具体实验例对本申请的方案进行说明、解释，但这些实验例仅是一些示例性方案，不应用来限制本申请的范围。其中，实验例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员所熟知的意义相同。
实验例1
(1)仪器与色谱条件
高效液相色谱仪：e2965高效液相色谱系统及工作站。
色谱柱：Thermo Syncronis C18(4.6mm×250mm，5μm)的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱。
流动相：配制0.020mol/L乙酸铵溶液，用冰醋酸调节pH值至4.5，将该乙酸铵溶液作为水相与甲醇进行混合制得流动相；其中，流动相中水相-甲醇的比例按0、8、20、25、35min时间点，水相体积比为90％、35％、10％、90％、90％进行混合。
检测条件：设置流动相流速为1.0ml/min，检测波长为265nm，柱温35℃。
(2)实验步骤
制备样品分析溶液：
分别取预定量的齐多夫定中间体ZI04和杂质imp4，用乙腈-水(60:40)溶解，其中，因ZI04在该溶剂体系中的溶解性较差，溶解过程中会有部分不溶，过滤除去未溶解的ZI04，取滤清液并稀释得到样品分析溶液，使每1ml样品分析溶液中约含50ng杂质imp4。
样品分析溶液的测试：
精密量取上述分析溶液50μl，注入高效液相色谱仪，利用上述流动相进行梯度洗脱，并记录色谱图，具体色谱图见附图2。图2是本申请实验例1的检测色谱图，其中图中保留时间(RT)为6.881min的峰为杂质imp4的样品峰，RT约18min的峰为齐多夫定中间体ZI04的样品峰。
由色谱图可以看出，该方法下杂质imp4和中间体ZI04基本可以分离开，但该条件下ZI04中的未知杂质会干扰测定(保留时间5～6min有明显杂质峰包)。该方法需进一步优化调整。
实验例2
(1)仪器与色谱条件
高效液相色谱仪：e2965高效液相色谱系统及工作站。
色谱柱：Thermo Syncronis C18(4.6mm×250mm，5μm)的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱。
流动相：配制0.020mol/L乙酸铵溶液，用冰醋酸调节pH值至5.0，将该乙酸铵溶液作为水相与甲醇进行混合制得流动相；其中，流动相中水相-甲醇的比例按0、8、20、25、35min时间点，水相体积比为90％、30％、5％、90％、90％进行混合。
检测条件：设置流动相流速为1.0ml/min，检测波长为265nm，柱温40℃。
(2)实验步骤
制备样品分析溶液：
分别取预定量的齐多夫定中间体ZI04和杂质imp4，用乙腈-水(60:40)溶解，其中，因ZI04在该溶剂体系中的溶解性较差，溶解过程中会有部分不溶，过滤除去未溶解的ZI04，取滤清液并稀释得到样品分析溶液，使每1ml样品分析溶液中约含50ng杂质imp4。
样品分析溶液的测试：
精密量取上述分析溶液50μl，注入高效液相色谱仪，利用上述流动相进行梯度洗脱，并记录色谱图，具体色谱图见附图3。图3是本申请实验例2的检测色谱图，其中图中保留时间(RT)为12.604min的峰为杂质imp4的样品峰，RT约18min的峰为齐多夫定中间体ZI04的样品峰。
由色谱图可以看出，该条件下齐多夫定中间体ZI04主峰和杂质imp4峰能够完全分离，能够精确测得杂质含量。
实验例3
(1)仪器与色谱条件
高效液相色谱仪：e2965高效液相色谱系统及工作站。
色谱柱：Agilent ZORBAX SB-CN(4.6mm×250mm，5μm)的氰基键合硅胶色谱柱。
流动相：配制0.020mol/L乙酸铵溶液，用冰醋酸调节pH值至5.5，将该乙酸铵溶液作为水相与甲醇进行混合制得流动相；其中，流动相中水相-甲醇的比例按0、8、20、25、35min时间点，水相体积比为90％、30％、5％、90％、90％进行混合。
检测条件：设置流动相流速为1.0ml/min，检测波长为265nm，柱温40℃。
(2)实验步骤
制备样品分析溶液：
分别取预定量的齐多夫定中间体ZI04和杂质imp4，用乙腈-水(60:40)溶解，其中，因ZI04在该溶剂体系中的溶解性较差，溶解过程中会有部分不溶，过滤除去未溶解的ZI04，取滤清液并稀释得到样品分析溶液，使每1ml样品分析溶液中约含50ng杂质imp4。
样品分析溶液的测试：
精密量取上述分析溶液50μl，注入高效液相色谱仪，利用上述流动相进行梯度洗脱，并记录色谱图，具体色谱图见附图4。图4是本申请实验例3的检测色谱图，其中图中保留时间(RT)为12.425min的峰为杂质imp4的样品峰，RT约18min的峰为齐多夫定中间体ZI04的样品峰。
由色谱图可以看出，该条件下齐多夫定中间体ZI04主峰和杂质imp4峰也能够完全分离，能够精确测得杂质含量。
实验例4
(1)仪器与色谱条件
高效液相色谱仪：e2965高效液相色谱系统及工作站。
色谱柱：Agilent ZORBAX SB-CN(4.6mm×250mm，5μm)的氰基键合硅胶色谱柱。
流动相：配制0.025mol/L乙酸铵溶液，用冰醋酸调节pH值至5.5，将该乙酸铵溶液作为水相与甲醇进行混合制得流动相；其中，流动相中水相-甲醇的比例按0、10、20、21、30min时间点，水相体积比为90％、30％、5％、90％、90％进行混合。
检测条件：设置流动相流速为1.0ml/min，检测波长为265nm，柱温40℃。
(2)实验步骤
制备样品分析溶液：
分别取预定量的齐多夫定中间体ZI04和杂质imp4，用乙腈-水(60:40)溶解，其中，因ZI04在该溶剂体系中的溶解性较差，溶解过程中会有部分不溶，过滤除去未溶解的ZI04，取滤清液并稀释得到样品分析溶液，使每1ml样品分析溶液中约含50ng杂质imp4。
样品分析溶液的测试：
精密量取上述分析溶液50μl，注入高效液相色谱仪，利用上述流动相进行梯度洗脱，并记录色谱图，具体色谱图见附图5。图5是本申请实验例4的检测色谱图，其中图中保留时间(RT)为12.328min的峰为杂质imp4的样品峰，RT约17min的峰为齐多夫定中间体ZI04的样品峰。
由色谱图可以看出，该条件下齐多夫定中间体ZI04主峰和杂质imp4峰也能够完全分离，能够精确测得杂质含量。
以上方案，本申请所提供的检测方法，在预定的色谱柱和检测条件下都能够很好的分离杂质imp4，实现对其进行定量控制。其中，利用基因毒性杂质imp4和齐多夫定中间体ZI04在不同溶剂中的溶解性差异，优化前处理方式，减少样品浓度过大造成的影响，在中间体环节进行基因毒性杂质imp4的控制。简化了成品质量标准；同时能有效地防止色谱柱过载，提高色谱柱的使用寿命。
以上所述仅为本申请的实施方式，并非因此限制本申请的专利范围，凡是利用本申请说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本申请的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种齐多夫定的基因毒性杂质的高效液相检测方法，其特征在于，所述方法包括：
提供样品分析溶液；
将所述样品分析溶液注入高效液相色谱仪进行色谱分析，并记录色谱图；其中所用的色谱柱为反相色谱柱，所用的流动相为酸铵盐溶液与有机相的混合液。
2.根据权利要求1所述的齐多夫定的基因毒性杂质的高效液相检测方法，其特征在于，所述提供样品分析溶液包括：
利用甲醇、乙腈、甲醇-水混合液或乙腈-水混合液对样品进行溶解，制得所述样品分析溶液。
3.根据权利要求2所述的齐多夫定的基因毒性杂质的高效液相检测方法，其特征在于，所述样品为齐多夫定原料药、齐多夫定中间体或齐多夫定制剂。
4.根据权利要求1所述的齐多夫定的基因毒性杂质的高效液相检测方法，其特征在于，所述流动相中酸铵盐溶液与有机相的混合体积比为95:5～50:50，所述流动相的pH值为4.0～8.0。
5.根据权利要求1所述的齐多夫定的基因毒性杂质的高效液相检测方法，其特征在于，采用梯度洗脱的方式进行洗脱，其中，梯度洗脱时，在运行时间的0～10分钟范围内，所述流动相中酸铵溶液的体积比为90～30％，在运行时间的10～20分钟范围内，所述流动相中酸铵溶液的体积比为35～5％，在运行时间的20～21分钟范围内，所述流动相中酸铵溶液的体积比为5～90％，在运行时间的21～30分钟范围内，所述流动相中酸铵溶液的体积比为90～90％。
6.根据权利要求1所述的齐多夫定的基因毒性杂质的高效液相检测方法，其特征在于，所述酸铵盐溶液的浓度为0.001～0.05mol/L，所述酸铵盐溶液为甲酸铵盐溶液、乙酸铵盐溶液、碳酸氢铵盐溶液中的一种或多种。
7.根据权利要求1所述的齐多夫定的基因毒性杂质的高效液相检测方法，其特征在于，所述反相色谱柱为苯基硅烷键合硅胶色谱柱、氰基键合硅胶色谱柱、氨基键合硅胶色谱柱、十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱或八烷基硅烷键合硅胶色谱柱中的一种。
8.根据权利要求1所述的齐多夫定的基因毒性杂质的高效液相检测方法，其特征在于，所述反相色谱柱的柱长为100mm～300mm，内径为1mm～10mm，粒径为1μm～10μm。
9.根据权利要求1所述的齐多夫定的基因毒性杂质的高效液相检测方法，其特征在于，所述流动相的流速为0.8～1.3ml/min；所述色谱柱的柱温为25～50℃；检测波长为205～300nm；运行时间为40～70min。
10.根据权利要求1所述的齐多夫定的基因毒性杂质的高效液相检测方法，其特征在于，所述基因毒性杂质的化学结构式为
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