CN102268022A - 用于表征Cefroxadine的参照标准品及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于药物化学技术领域，具体涉及一种用于表征Cefroxadine的参照标准品及其制备方法和用途。本发明所述的用于表征Cefroxadine的参照标准品的化学结构式如化学结构式I所示。其中，当头孢母核的双键位置是在2位和3位间形成碳碳双键时，R为

；当头孢母核的双键位置是在3位和4位间形成碳碳双键时，R为H、或者 I。

Description

用于表征Cefroxadine的参照标准品及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于药物化学技术领域，具体涉及一种用于表征Cefroxadine的参照标准品及其制备方法和用途。

背景技术

β-内酰胺类抗生素是指化学结构式中具有β-内酰胺环的抗生素。它可通过共价键与细胞壁合成有关的青霉素结合蛋白(PBPs )结合，抑制细胞壁粘肽合成酶，从而阻碍细胞壁肽聚糖的合成，使细胞壁缺损，菌体破裂死亡。因其抗菌活性强、毒性低、对敏感细菌感染的疗效满意等优点，半个世纪以来，该类抗生素的研制和临床应用得到迅速发展。迄今为止，β-内酰胺类抗生素已由单纯生物来源发展为经半合成及全合成制备；其抗菌活性由仅对革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌有效，发展至广谱和超广谱抗菌，还出现了抗菌作用以外的生物活性。

Cefroxadine Hydrate是一类新的头孢类化合物，为Cefroxadine（如化学结构式II所示）的二水合物，Cefroxadine Hydrate的化学命名为：(6R,7R)-7-[[(2R)-2-氨基-2-(1,4-环己二烯)乙酰基]氨基]-3-甲氧基-8-羰基-5-硫杂-1-氮杂二环[4.2.0]-2-辛烯-2-羧酸二水合物。其化学结构式如结构式VIII所示。

II

VIII

Cefroxadine作为一种口服的头孢菌素类抗生素，对革兰氏阳性和阴性菌有广谱抗菌作用，其抗菌谱与头孢克洛相似。其抗菌活性强于头孢氨苄。临床上用于呼吸道、泌尿系统、皮肤和软组织、生殖系统（包括前列腺）等部位的感染，也常用于中耳炎。本品口服吸收良好，血清为1小时，12小时内大部分从尿排泄。在作为一种儿童用药中体现出巨大的优势。而且对高度危险性糖尿病病人无不良影响。

日本专利JP1991148282和美国专利US4073902均报道了该化合物的合成方法，但是所得产物很难是纯度足以符合日本药局方（第十五改正版）制药标准的单一化合物，在大多数情况下，会存在由于合成工艺所带来的杂质，在把包含在产物混合物中的Cefroxadine变成活性药物成分（“API”）的加工期间的某些阶段，必须分析Cefroxadine的纯度，通常通过HPLC或者GC分析，以确定是否适合连续加工或最终用于药品。Cefroxadine不需要是绝对纯的，绝对纯度是难以达到的理论上的理想。相反地，纯度标准意在确保API不会由于杂质的存在而降低临床使用的安全性。

通常，利用光谱方法和通过其他物理方法识别次要产物、副产物和附加试剂（总称为“杂质”），于是杂质与色谱中的峰位置（或薄层色谱板上的斑点）有关。此后，杂质可以通过其在所述色谱中的位置被识别出来，色谱中的位置通常用样品注射到柱上和特定的组分经检测器流出之间的时间以分钟计算，被称为“保留时间”。这一时间段基于使用仪器的条件和许多其他因素每天变化。为减轻这样变化对杂质准确鉴别的影响，专业人员使用“相对保留时间”（“RRT”）来鉴别杂质。杂质的RRT是其保留时间除以一些参考标记物的保留时间。理论上，Cefroxadine本身能被用作参考标记物，但实际上Cefroxadine在混合物中占有压倒性比例，使其趋向于饱和柱子，导致不能再现保留时间，即相对于Cefroxadine的峰最大值趋向漂移。因此，往往希望选择一种替代化合物，将其以足以可检测但不会饱和柱子的足够低的量加入或存在于所述混合物中，并且将化合物作为参考标记物使用。

药物生产的研究人员和开发者知道，相对纯状态的化合物能被用作“参考标准品”（“参考标记物”类似于参考标准品，但它用来做定性分析）以确定化合物在未知混合物中的数量。当所述化合物用作“外标物”时，以与未知混合物相同的技术来分析所述化合物的已知浓度的溶液。所述化合物在混合物中的数量可以通过比较检测器响应值的大小来确定。

如果已经预先确定出弥补检测器对两种化合物灵敏度差别的“相应因子”，那么所述参照标准品化合物也可以用于确定混合物中另一化合物的数量。为此目的，可以将所述参照标准品化合物直接加入到混合物，而在这样情况下它被称作“内标物”。

通过使用称作“标准品添加”技术，其中至少两种样品是通过加入已知的和不同量的内标物制备的，使未知混合物包含一些参照标准品化合物时，所述参照标准品化合物甚至可以作为内标物。最初在混合物中的参照标准品化合物对应的检测器响应值的比例，可以通过将检测器响应值对加入到各个样品中的参照标准品化合物的量所作的图外推至零来确定。

发明内容

       本发明的技术目的，在于提供一种用于表征Cefroxadine的参照标准品；另外一个技术目的在于提供改参照标准品的制备方法；最后一个技术目的在于提供利用参照标准品表征Cefroxadine的方法。

为了实现本发明的技术目的，本发明的技术方案涉及以下三点。

一、一种用于表征Cefroxadine的参照标准品，其特征在于其化学结构式如化学结构式I所示：

I

其中，当头孢母核的双键位置是在2位和3位间形成碳碳双键时，R为

；

当头孢母核的双键位置是在3位和4位间形成碳碳双键时，R为H、

或者

。

具体的，化学结构式为I的化合物涉及以下六种物质。

（1）当头孢母核的双键位置为2位和3位之间，R为时，该化合物即Cefroxadine，化学结构式如II所示：

II。

（2）当头孢母核的双键位置为2位和3位之间，R为H时，该化合物为已知化合物，化学结构式如III所示：

III。

（3）当头孢母核的双键位置为2位和3位之间，R为

时，该化合物为化学结构式IV所示的新化合物：

IV。

（4）当头孢母核的双键位置为3位和4位之间，R为H时，该化合物为化学结构式V所示的新化合物：

V。

（5）当头孢母核的双键位置为3位和4位之间，R为时，该化合物为化学结构式VI所示的新化合物：

VI。

（6）当头孢母核的双键位置为3位和4位之间，R为

时，该化合物为化学结构式VII所示的新化合物：

VII。

二、本发明所述的用于表征Cefroxadine的参照标准品的制备方法。

具体的：

（1）当头孢母核的双键位置为3位和4位之间，R为H时的化学结构式V所示的新化合物的制备方法为：将化学结构式III的化合物在诱导剂的作用下进行异构化反应，诱导剂为DMAP、三乙胺或N,N-二甲基苯胺，溶剂为DMF或丙酮，其中化合物III和诱导剂的摩尔比为1:0.5~1:3，化合物与溶剂的质量比为1:5~1:20，反应温度为20~80℃，反应时间为4~30 h。

    

V                            III

或者（2）当头孢母核的双键位置为3位和4位之间，R为

时的化学结构式VI所示的新化合物的制备方法为：第（1）点中所示化合物V与D-2-氨基-2-(1,4-环己二烯)乙酰氯盐酸盐反应制得，催化剂为尿素，反应溶剂为DCM，其中化合物V与酰氯的摩尔比为1:1~1:2，化合物V与催化剂的摩尔比为1:1~1:3，化合物V与溶剂的质量比为1:5~1:50。

     

VI                             V

或者（3）当头孢母核的双键位置为3位和4位之间，R为时的化学结构式VII所示的新化合物的制备方法为：第（1）点中所示化合物V与D-2-氨基-2-苯基乙酰氯盐酸盐反应制得，催化剂为尿素，反应溶剂为DCM，其中化合物V与酰氯的摩尔比为1:1~1:2，化合物V与催化剂的摩尔比为1:1~1:3，化合物V与溶剂的质量比为1:5~1:50。

VII                              V

或者（4）当头孢母核的双键位置为2位和3位之间，R为

时的化学结构式IV所示的新化合物的制备方法为：化合物III与D-2-氨基-2-苯基乙酰氯盐酸盐反应制得，催化剂为尿素，反应溶剂为DCM，其中化合物III与酰氯的摩尔比为1:1~1:2，化合物III与催化剂的摩尔比为1:1~1:3，化合物III与溶剂的质量比为1:5~1:50。

IV                             III。

三、本发明提供一种分析Cefroxadine样品的方法，包括以下步骤：

a） 对Cefroxadine样品进行色谱法检测得到数据；

b）将数据与本发明所述的用于表征Cefroxadine的参照标准品的色谱数据比较。

进一步的，所述的色谱包括高效液相色谱或者薄层层析色谱。

说明书附图

图1是化合物III的HPLC色谱图。

图2是化合物IV的HPLC色谱图。

图3是化合物V的HPLC色谱图。

图4是化合物VI的HPLC色谱图。

图5是化合物VII的HPLC色谱图。

具体实施方式

在此使用的术语“参照标准品”是指可用于活性药物成分的定量和定性分析的化合物。例如，将所述化合物在HPLC中的保留时间设置为相对保留时间，从而使定性分析成为可能。将注入HPLC柱前所述化合物在溶液中的浓度用于比较HPLC色谱图中峰下的面积，从而使定量分析成为可能。

“参照标记物”用于定性分析是根据它们在例如色谱图中或薄层层析（TLC）板上的位置来鉴定混合物中的组分。为此目的，如果所述化合物存在于混合物中，则不必将该化合物加入混合物。“参照标记物”只用于定性分析，但参照标准品可用于定量或定性分析，或两者。因此，参照标记物是参照标准品的子集，而且包括在参照标准品的定义内。

虽然到目前为止已经概括地描述了本领域关于参照标准品的一些知识，但是本领域的技术人员同样理解所述检测器响应值可以是，例如从HPLC体系的洗脱剂，通过UV或折射指数检测，或者，利用从气象色谱的洗脱剂，通过火焰电离检测或热导检测，得到的色谱图的峰高或积分峰面积，或其他检测器响应值，利用荧光薄层色谱板上斑点的UV吸收率，参照标准品的位置可用于计算Cefroxadine和其他杂质的相对保留时间。

Cefroxadine工艺杂质化合物V的制备方法为以化合物III为原料，在诱导剂的作用下，制得化合物V，所选的诱导剂可以为DMAP，三乙胺和N，N-二甲基苯胺，溶剂为DMF或丙酮，反应温度为室温至100℃，反应时间为2小时至30小时，其中诱导剂和化合物III的摩尔比为0.2:1~3:1，溶剂与化合物III的质量比为20:1~200:1。

日本专利JP1991148282制备Cefroxadine的方法是化合物Cefroxadine Hydrate与D-2-氨基-2-(1,4-环己二烯)乙酰氯盐酸盐反应制得，催化剂为尿素，反应溶剂为DCM。可参考该方法，制备化合物VI，化合物VII和化合物IV，其中催化剂与相应头孢母核的摩尔比为1:1~3:1，头孢母核和侧链酰氯盐酸盐的摩尔比为1:1~1:2，溶剂与化合物V的质量比为5:1~50:1。

制备的化合物IV的¹H NMR图谱具有以下特征δ（ppm）：3.23~3.59（dd，2H，4-H），3.89（s，3H，OCH ₃ ），5.12（s，1H，PhCHNH），5.25（s，1H，6-H），5.44（s，1H，7-H），5.39（m，5H，Ph-H）。

制备的化合物V的¹H NMR图谱具有以下特征：3.59（s，3H，OCH ₃ ），4.74~4.75（d，1H， 6-H），4.97（s，1H，2-H），5.24（s，1H，4-H），5.32~5.33（d，1H， 7-H）。

制备的化合物VI的¹H NMR图谱具有以下特征：2.63~2.81（m，4H，CH ₂ CH=CHCH ₂ ），3.63（s，3H，OCH ₃ ），4.67（s，1H，CHNH₂）5.02（s，1H，6-H），5.42（s，1H，2-H），5.43（s，1H，4-H），5.55（s，1H， 7-H），5.78（m，2H，CH₂ CH=CHCH₂），6.17（s，1H，CH₂CH=CHCH₂ CH=C）。

制备的化合物VII的¹H NMR图谱具有以下特征：3.57（s，3H，OCH ₃ ），5.26（m，3H，Ph-H，2-H，6-H），5.53（s，1H，7-H），7.53（m，5H，Ph-H）。

其中s表示单峰，d表示二重峰，m表示多重峰。

可以纯化各种形式的工艺杂质，使得只存在一种异构体。纯化可以通过柱色谱、TLC、HPLC，或其他已知的纯化方法进行。

仪器

对于色谱法，可以使用氧化铝或优选硅胶装柱，至于洗脱剂，可以使用不同有机溶剂或其混合物，优选甲醇。

可以用¹H NMR分析来研究化合物IV、V、VI和VII的结构。

实施例1 化合物V的制备

在反应瓶中投入2.3g化合物III，23g DMF和1g三乙胺，60℃搅拌6小时后，将反应液倒入水中，抽滤，真空干燥，将得到的产物通过硅胶柱层析（洗脱剂为甲醇-DCM 1:4）分离，得到化合物V 1.3g。

实施例2 化合物V的制备

在反应瓶中投入2.3g化合物III，46g DMF和3.66gDMAP，80℃搅拌4小时后，将反应液倒入水中，抽滤，真空干燥，将得到的产物通过硅胶柱层析（洗脱剂为甲醇-DCM 1:4）分离，得到化合物V 1.0g。

实施例3 化合物V的制备

在反应瓶中投入2.3g化合物III，11.5 g DMF和0.6 g N,N-二甲基苯胺，20℃搅拌30小时后，将反应液倒入水中，抽滤，真空干燥，将得到的产物通过硅胶柱层析（洗脱剂为甲醇-DCM 1:4）分离，得到化合物V 0.9 g。

实施例4 化合物VI的制备

在反应瓶中投入2.3 g化合物V、46 g DCM和0.6 g尿素，溶解后冷却到-10℃，分批加入D-2-氨基-2-(1,4-环己二烯)乙酰氯盐酸盐，加毕后，升温至15℃反应30 min，后升至30℃反应30 min，减压浓缩后溶于水中，滤去不溶物，用氢氧化钠水溶液将溶液PH调节至5.0，搅拌析晶，抽滤得到化合物VI 2.4 g。

实施例5 化合物IV的制备

在反应瓶中投入2.3 g化合物III、10.5 g DCM和1.2 g尿素，溶解后冷却到-10℃，分批加入D-2-氨基-2-苯基乙酰氯盐酸盐，加毕后，升温至15℃反应30 min，后升至30℃反应30 min，减压浓缩后溶于水中，滤去不溶物，用氢氧化钠水溶液将溶液pH调节至5.0，搅拌析晶，抽滤得到化合物VI 2.2 g。

实施例6 化合物VII的制备

在反应瓶中投入2.3 g化合物V、105 g DCM和1.8 g尿素，溶解后冷却到-10℃，分批加入D-2-氨基-2-苯基乙酰氯盐酸盐，加毕后，升温至15℃反应30 min，后升至30℃反应30 min，减压浓缩后溶于水中，滤去不溶物，用氢氧化钠水溶液将溶液pH调节至5.0，搅拌析晶，抽滤得到化合物VI 2.0 g。

实施例7 Cefroxadine的HPLC杂质分布测定

通过HPLC分析确定化合物I、II、III、IV和V的纯度。

HPLC条件：

仪器：岛津 LC-20AT/LC-SPD20；

色谱柱：C₁₈ 5 μm，4.6mm*10cm（购买自岛津公司）；

流动相：1.6057 g高氯酸钠溶于水-乙腈（489:11）的混合物溶剂（日本药局方第十五改正版）；

流速：1.5 mL/min；

检测器：254 nm；

样品体积：20 μL；

稀释剂：流动相。

为了达到所需要的系统适应性，可以改变流动相的流速。

样品制备

将大概10 mg Cefroxadine样品在50 mL量瓶中称重，用流动相定容。

标准品制备

将化合物III大约10 mg在50 mL量瓶中称重，用流动相定容。用稀释剂将1 mL制备好的溶液稀释至25 mL。

将化合物IV、V、VI和VII大约10 mg在50 mL量瓶中称重，用流动相溶解定容。

方法

将新制备的样品溶液注入色谱仪，每个样品的测定时间为40分钟，记录色谱图。

至此以参考具有的优选实施例方案描述了本发明并用实施例进行了举例说明，本领域的技术人员可以对描述和举例说明的本发明做适当的改进而不背离说明书中所公开的本发明的精神和范围。阐述实施例是为帮助理解本发明，但不想并且应视为是以任何方式限制本发明的范围。实施例不包括常规方法的详细说明。

Claims (4)

1.一种用于表征Cefroxadine的参照标准品，其特征在于其化学结构式如化学结构式I所示：

I；

其中，当头孢母核的双键位置是在2位和3位间形成碳碳双键时，R为

；

当头孢母核的双键位置是在3位和4位间形成碳碳双键时，R为H、

或者

。

2.权利要求1所述用于表征Cefroxadine的参照标准品的制备方法，其特征在于：

（1）当头孢母核的双键位置为3位和4位之间，R为H时的化学结构式V所示的新化合物的制备方法为：将化学结构式III的化合物在诱导剂的作用下进行异构化反应，诱导剂为DMAP、三乙胺或N,N-二甲基苯胺，溶剂为DMF或丙酮，其中化合物III和诱导剂的摩尔比为1:0.5~1:3，化合物与溶剂的质量比为1:5~1:20，反应温度为20~80℃，反应时间为4~30 h

   

V                            III；

或者（2）当头孢母核的双键位置为3位和4位之间，R为

时的化学结构式VI所示的新化合物的制备方法为：第（1）点中所示化合物V与D-2-氨基-2-(1,4-环己二烯)乙酰氯盐酸盐反应制得，催化剂为尿素，反应溶剂为DCM，其中化合物V与酰氯的摩尔比为1:1~1:2，化合物V与催化剂的摩尔比为1:1~1:3，化合物V与溶剂的质量比为1:5~1:50

VI                             V；

或者（3）当头孢母核的双键位置为3位和4位之间，R为

时的化学结构式VII所示的新化合物的制备方法为：第（1）点中所示化合物V与D-2-氨基-2-苯基乙酰氯盐酸盐反应制得，催化剂为尿素，反应溶剂为DCM，其中化合物V与酰氯的摩尔比为1:1~1:2，化合物V与催化剂的摩尔比为1:1~1:3，化合物V与溶剂的质量比为1:5~1:50

VII                              V；

或者（4）当头孢母核的双键位置为2位和3位之间，R为

时的化学结构式IV所示的新化合物的制备方法为：化合物III与D-2-氨基-2-苯基乙酰氯盐酸盐反应制得，催化剂为尿素，反应溶剂为DCM，其中化合物III与酰氯的摩尔比为1:1~1:2，化合物III与催化剂的摩尔比为1:1~1:3，化合物III与溶剂的质量比为1:5~1:50

IV                             III。

3.一种分析Cefroxadine样品的方法，包括以下步骤：

对Cefroxadine样品进行色谱法检测得到数据；

将数据与权利要求1所述的用于表征Cefroxadine的参照标准品的色谱数据比较。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的色谱是高效液相色谱或者薄层层析色谱。

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