CN107219312A - 一种检测磷酸特地唑胺异构体杂质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用液相色谱法测定磷酸特地唑胺及其异构体杂质含量的方法。所述方法包含以下步骤：1)取磷酸特地唑胺或含磷酸特地唑胺的制剂适量，用碱性磷酸酶溶液水解，反应后加乙腈溶解稀释，分离有机层，干燥后用无水乙醇溶解稀释；2)将步骤1)所得溶液注入液相色谱仪，完成磷酸特地唑胺与其对映异构体的分离测定。本发明所述方法可以有效分离检测磷酸特地唑胺样品中的对映异构体含量，且耐用性良好，从而有效控制磷酸特地唑胺及其制剂的质量。
Description
技术领域
本发明属于药物分析领域，特别是涉及一种用液相色谱法测定磷酸特地唑胺及其异构体杂质含量的方法。
背景技术
磷酸特地唑胺(Tedizolid phosphate，式(I))是由卡毕思特制药公司(CubistPharmaceuticals)研制的一种噁唑烷酮类抗生素，于2014年6月10日获得FDA批准上市，商品名为Sivextro，用于治疗金黄色葡萄球菌和各种链球菌属和粪肠球菌等革兰氏阳性细菌引起的急性细菌性皮肤和皮肤结构感染。磷酸特地唑胺属于噁唑烷酮类抗生素，与其他类别的抗生素之间不易产生交叉耐药，同首个噁唑烷酮类抗生素利奈唑胺相比，疗效更好、安全性更高。
磷酸特地唑胺分子结构中含有1个手性碳原子，存在一对对映异构体，其中(R)-构型为活性构型，而 (S)-异构体为对映异构体杂质。在磷酸特地唑胺的分析检测过程中，二者难以分离、检测。然而，在药物定向合成过程以及终产物质量控制过程中，均需要控制对映异构体杂质的含量。因此，建立灵敏度高、专属性好的手性分析方法，实现磷酸特地唑胺与其对映异构体的分析测定，在磷酸特地唑胺的合成和制剂的制备过程中对控制药品质量具有重要意义。
目前，磷酸特地唑胺的质量标准在现行版《欧洲药典》及其药典论坛、《美国药典》及其药典论坛和中国药典2015版中均没有收载。现有技术中，“Infrared,Raman andultraviolet with circular dichroism analysis and theoretical calculations oftedizolid”，Katarzyna Michalska，等，Journal of Molecular Structure 1115，2016，136-143公开了在紫外-圆二色谱的基础上结合FT-IR以及拉曼光谱测定特地唑胺的对映体纯度的方法。此外，CN105085570A公开了一种以十八烷基硅烷键合硅胶填充色谱柱(XB-C18，4.6×300nm， 5μm)、0.025mol/L碳酸氢铵溶液-乙腈(95:5)和乙腈为流动相、梯度洗脱的方式分离样品中的磷酸特地唑胺及其光学异构体杂质的方法，然而结果表明峰拖尾情况较为严重(磷酸特地唑胺峰的拖尾因子为1.567)，不利于准确定量。可见，上述方法或者需要用到价格昂贵的仪器，或者分离状况不理想，均无法满足目前对磷酸特地唑胺中的异构体杂质进行有效、准确定量的需求。因此，开发新的能有效检测磷酸特地唑胺及其异构体杂质含量的方法是非常必要的。
发明内容
本发明的目的是提供一种用手性色谱柱分析测定磷酸特地唑胺及其光学异构体杂质含量的液相色谱方法，其可以将磷酸特地唑胺与其光学异构体进行有效分离，从而可以准确控制磷酸特地唑胺的质量，实现磷酸特地唑胺与其光学异构体的分离测定。
磷酸特地唑胺及其异构体杂质的结构如下：
本发明所述液相色谱方法分析测定磷酸特地唑胺及其光学异构体杂质含量的方法，其特征在于，首先采用碱性磷酸酶溶液对磷酸特地唑胺进行酶水解，使得磷酸特地唑胺及其异构体杂质TDPEN被水解为相应的醇产物(INA或INAEN)，反应式如下：
然后，经简单处理(萃取、干燥)后，再以三(3,5-二甲苯基)-氨基甲酸酯直链淀粉为填料的手性色谱柱，以正己烷-无水乙醇混合溶液为流动相进行液相色谱分析。
术语定义
术语“峰纯度”是指HPLC检测中，用于判断某一色谱峰是否只是由一种物质引起的一个考察参数，一般认为峰纯度在0.990-1.000之间即认为所考察的某一色谱峰纯净，该色谱峰是某单一物质的色谱峰；
术语“RT”是指HPLC检测中的色谱峰的保留时间，单位是分钟(min)；
术语“约”在本发明中是指在所述数值的±10％以内；
术语“50％乙醇”是指流动相中乙醇的体积百分比为50％，即100ml流动相中含有50ml的乙醇。
本发明所述的方法，所述酶水解反应的温度为35～39℃，优选为约37℃；酶水解反应的时间为1.5～2.5h，优选为约2.0h。
所述酶水解反应的pH范围为pH8.8～pH9.2，优选为约pH9.0；所加入的磷酸酶与反应底物的质量比为 (3.6～4.4)：(8～12)。
本发明所述的方法，所述碱性磷酸酶溶液的制备方法为：称取碱性磷酸酶适量，加pH缓冲溶液溶解，摇匀，配制成质量浓度为2mg/ml的溶液，优选临用新制。
进一步地，所述pH缓冲溶液的制备方法为：称取硼酸适量，加水溶解，加入适量1mol/L NaOH溶液和0.1mol/L MgCl2溶液，然后加水稀释摇匀，即得。
所述液相色谱法包括高效液相色谱法或高效液相色谱法-质谱法联用。
所述手性色谱柱选自牌号为CHIRALPAK AD和CHIRALPAK AD-H的色谱柱，优选CHIRALPAK AD-H，250mm×4.6mm，5μm。
本发明所述的方法，其流动相中正己烷与无水乙醇的体积比为40:60～60:40，优选为44:56～50:50。
上述流动相中，所述正己烷-无水乙醇溶液还包含选自甲酸、乙酸、三氟乙酸中的一种或多种酸，且其占正己烷-无水乙醇溶液的体积比为0.05％～0.15％，优选占比0.1％，进一步地，所述酸优选为三氟乙酸。
进一步地，所述流动相为正己烷：无水乙醇：三氟乙酸的体积比更优选为约47:53:0.1。
本发明所述的方法，检测波长为300±2nm。
本发明所述的方法，其流动相流速常见的范围一般为0.5ml/min～2ml/min，本发明优选0.5～1.0ml/min，更优选0.7ml/min。
本发明所述的检测方法，色谱柱温度为35～45℃，优选为40℃；样品进样量10～30μl。
本发明所述异构体含量测定方法，可按以下方法实现：
1)取磷酸特地唑胺或含磷酸特地唑胺的制剂适量，用碱性磷酸酶溶液水解，反应后加乙腈溶解稀释，分离有机层，干燥后用无水乙醇溶解稀释；
2)将步骤1)所得溶液注入液相色谱仪，完成磷酸特地唑胺与其对映异构体的分离测定。
其中：
液相色谱仪：岛津2010高效液相色谱仪或Agilent1100高效液相色谱仪；
色谱柱：大赛路CHIRAPAK AD-H手性色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；
流动相：正己烷-无水乙醇-三氟乙酸(47：53：0.1)；
检测波长：300nm；
柱温：40℃；
流速：0.7ml/min；
进样体积：10μl。
所述的分离测定方法，按照高效液相色谱法(中国药典2010年版二部附录ⅤD)测定。
本发明采用碱性磷酸酶溶液先对磷酸特地唑胺样品进行酶水解，然后对获得的醇产物(INA与INAEN) 进行色谱分离，采用CHIRALPAK AD-H手性色谱柱能够有效分离测定INA与其光学异构体INAEN，选用进样体积为10μl，柱温为40℃，提高了色谱峰的对称性。本发明解决了分离测定磷酸特地唑胺及其对映体杂质的测定问题，能简单、快速、准确地分离、检测出磷酸特地唑胺及其光学异构体杂质，从而保证了磷酸特地唑胺及其制剂的质量可控。
附图说明
图1为磷酸特地唑胺对照品于0.5h酶水解后的HPLC分析图。
图2为磷酸特地唑胺对照品于1.0h酶水解后的HPLC分析图。
图3为磷酸特地唑胺对照品于1.5h酶水解后的HPLC分析图。
图4为磷酸特地唑胺对照品于2.0h酶水解后的HPLC分析图。
图5为TDPEN对照品于0.5h酶水解后的HPLC分析图。
图6为TDPEN对照品于1.0h酶水解后的HPLC分析图。
图7为TDPEN对照品于1.5h酶水解后的HPLC分析图。
图8为TDPEN对照品于2.0h酶水解后的HPLC分析图。
图9为磷酸特地唑胺精制品在酶水解后的HPLC分析图。
图10为不经磷酸酶水解下的TDP及TDPEN混合溶液的HPLC分析图。
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。本发明的实施例仅是用于说明本发明，而不是对本发明的限制，因此在本发明的方法基础上对本发明的简单改进或替换均属于本发明要求保护的范围。
本发明具体实施方式中使用的原料、试剂、设备均为已知产品，通过购买市售产品、自制或者按照本发明所描述的方法制备而得。
例如，以下实施例中磷酸特地唑胺与其对映异构体对照品、INA与INAEN对照品以及磷酸特地唑胺精制品均为自制品，且其中磷酸特地唑胺对照品和精制品中的INA和INAEN均低于检测限。
本发明所使用的分析试剂及溶液符合中国药典2010版附录的要求，除另有说明外。
实施例一 采用磷酸酶水解法的磷酸特地唑胺及其异构体的高效液相色谱分析
1、磷酸酶水解条件的选择
溶液配制：
pH9.0缓冲溶液：精密称取硼酸3.1g，置1L容量瓶中，加500ml水溶解，精密加入21ml 1mol/L NaOH 溶液和10ml 0.1mol/L MgCl2溶液，加水稀释至刻度，摇匀，作为pH9.0缓冲溶液。
碱性磷酸酶溶液(临用新制)：精密称取碱性磷酸酶100mg，置50ml量瓶，加pH9.0缓冲溶液溶解，并定容至刻度，摇匀，作为碱性磷酸酶溶液。
取磷酸特地唑胺(TDP)和其异构体TDPEN对照品各约10mg，精密称定，分别置10ml量瓶中，加2ml碱性磷酸酶溶液，37℃水浴，强力震摇，分别于0.5h、1h、1.5h、2h取样品50μl，用乙腈定容至1ml，采用以下色谱分析条件检测TDP和TDPEN分别水解为INA和INAEN(即INA的对映异构体)的情况(面积归一化)。结果见表1和说明书附图图1-图8。
色谱分析条件——高效液相色谱仪为岛津2010或Agilent1100；色谱柱为WatersXterra C18(150*4.6mm, 3.5μm)；用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；检测器为UV检测器，检测波长为300nm；以25mmol/L醋酸氨(用氨水调pH至8.5)为流动相A，以乙腈:四氢呋喃(90：10)为流动相B，流速为1.0ml/min；柱温为40℃；理论板数按磷酸特地唑胺或其异构体峰计算不低于3000；按下表进行梯度洗脱：
| 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 99 | 1 |
| 30 | 53 | 47 |
| 40 | 53 | 47 |
| 42 | 99 | 1 |
| 52 | 99 | 1 |
表1磷酸特地唑胺及其异构体在磷酸酶作用下的水解情况
结果表明，TDP和TDPEN在该条件下均可以被磷酸酶水解，生成INA和INAEN；而且1.5h后水解情况基本稳定，2h时INA和INAEN的转化率达到了98.5％以上，因此该水解条件可用于将TDP转化为 INA来进行异构体测定。
2、磷酸特地唑胺及其异构体的分离
取磷酸特地唑胺精制品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加2ml上述碱性磷酸酶溶液(临用新制)，37℃水浴，强力震摇2h，加乙腈溶解稀释至刻度，摇匀，静置；精密量取上清液2.5ml，置10ml量瓶中，加无水硫酸钠0.5g，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，作为供试品溶液。另分别取INAEN、 INA对照品适量，加乙腈适量溶解，并用无水乙醇定量稀释制成每1ml中含INAEN为2μg、INA为200μg 的混合溶液，作为系统适用性溶液。按照高效液相色谱法(中国药典2010年版二部附录ⅤD)试验，用大赛路CHIRAPAK AD-H手性色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；以正己烷-无水乙醇-三氟乙酸(47：53：0.1) 为流动相；检测器为UV检测器，检测波长为300nm；柱温为40℃，流速为0.7ml/min。理论板数按INA 峰计算不低于3000。精密量取系统适用性溶液10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，出峰顺序依次为杂质INAEN和INA。精密量取供试品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图。供试品溶液中如有与INAEN出峰时间相同杂质峰，按面积归一化法计算。结果见表2和说明书附图图9。
表2磷酸特地唑胺精制品在酶水解后的HPLC分离情况
结论：该色谱条件下，空白干净，混合溶液中INA和INAEN的分离度为4.8，理论板数较高，因此上述条件可用于磷酸特地唑胺的异构体杂质控制。
对比例一 不经磷酸酶水解下的磷酸特地唑胺及其异构体的高效液相色谱分析
分别取TDPEN和TDP对照品适量，加正己烷：无水乙醇：三氟乙酸(50:50:0.1)溶解并稀释制成浓度为每1ml中200μg的溶液，作为各自的定位溶液；然后取TDP和TDPEN的定位溶液，等量混合，摇匀，得混合溶液。
按照实施例一中的色谱条件[即色谱柱：大赛璐AD-H(250×4.6mm,5μm)；流动相：正己烷:无水乙醇:三氟乙酸(47:53:0.1)；检测波长：300nm；流速：0.7ml/min；柱温：40℃]，精密量取上述混合溶液10μl 注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见表3和说明书附图图10。
表3不经磷酸酶水解下的磷酸特地唑胺及其异构体杂质的分离情况
| 样品 | RT(min) | 理论板数 | 分离度 |
| TDP | 8.420 | 583 | 0.0 |
| TDPEN | 10.954 | 701 | 1.7 |
试验结果显示，TDP与TDPEN分离度合格，但峰拖尾极其严重，且峰形难看，降低了分离质量和精度。
实施例二 磷酸酶水解法分离磷酸特地唑胺及其异构体杂质的方法学考察
参照中国药典2010版附录ⅩⅨA药品质量标准分析方法验证指导原则，对磷酸特地唑胺异构体测定方法进行验证，具体内容如下。
1、系统适用性考察
混合溶液的配制：取磷酸特地唑胺精制品约10mg，精密称定，置10ml量瓶，精密量加入TDPEN溶液(取TDPEN约10mg，精密称定，置10ml量瓶，加缓冲液溶解并稀释至刻度，摇匀，即得)100μl，加碱性磷酸酶溶液(取碱性磷酸酶适量，加缓冲液溶解并定量稀释制成浓度为每1ml含碱性磷酸酶2mg的溶液，摇匀，即得)(临用新制)2ml，37℃水浴中强力振摇2h，加乙腈溶解并稀释至刻度，静置。精密量取上清液2.5ml，置10ml量瓶中，加0.5g无水硫酸钠，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，作为系统适用性溶液。
精密量取上述混合溶液各10μl，注入液相色谱仪，进样6次，记录色谱图；考察保留时间及峰面积的相对标准偏差，结果见表4-表5。
表4异构体系统适用性
| 样品 | RT(min) | 分离度 | 理论板数 |
| INAEN | 26.908 | 0.0 | 7043 |
| INA | 33.950 | 4.8 | 6967 |
表5异构体系统适用性-系统精密度
结论：在该色谱条件下，混合溶液中INA和INAEN的分离度为4.8，理论板数较高；混合溶液连续进样6次，INAEN和INA的峰面积和保留时间的相对标准偏差均小于2.0％，符合规定，表明该系统稳定。
2、重复性
供试品溶液配制：取磷酸特地唑胺精制品约10mg，精密称定，置10ml量瓶，精密量加入TDPEN溶液100μl，加碱性磷酸酶溶液2ml，37℃水浴中强力振摇2h，加乙腈溶解并稀释至刻度，静置。精密量取上清液2.5ml，置10ml量瓶中，加0.5g无水硫酸钠，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，即得(平行配制6份)。
精密量取供试品溶液和对照溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图；考察TDPEN回收率的相对标准偏差，结果见表6。
表6异构体方法学-重复性
结论：平行六份样品，其TDPEN含量回收率结果为105.4％，RSD值为1.61％，表明方法重复性良好。
3、准确度
供试品溶液配制：取磷酸特地唑胺精制品约10mg，精密称定，置10ml量瓶，加碱性磷酸酶溶液2ml，37℃水浴中强力振摇2h，加乙腈溶解并稀释至刻度，静置。精密量取上清液2.5ml，置10ml量瓶中，加 0.5g无水硫酸钠，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，即得(平行配制2份)。
20％供试品溶液配制：取磷酸特地唑胺精制品约10mg，精密称定，置10ml量瓶，精密量加入TDPEN 溶液20μl，加碱性磷酸酶溶液2ml，37℃水浴中强力振摇2h，加乙腈溶解并稀释至刻度，静置。精密量取上清液2.5ml，置10ml量瓶中，加0.5g无水硫酸钠，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，即得(平行配制3份)。
50％供试品溶液配制：取磷酸特地唑胺精制品约10mg，精密称定，置10ml量瓶，精密量加入TDPEN 溶液50μl，加碱性磷酸酶溶液2ml，37℃水浴中强力振摇2h，加乙腈溶解并稀释至刻度，静置。精密量取上清液2.5ml，置10ml量瓶中，加0.5g无水硫酸钠，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，即得(平行配制3份)。
100％供试品溶液配制：取磷酸特地唑胺精制品约10mg，精密称定，置10ml量瓶，精密量加入TDPEN 溶液100μl，加碱性磷酸酶溶液2ml，37℃水浴中强力振摇2h，加乙腈溶解并稀释至刻度，静置。精密量取上清液2.5ml，置10ml量瓶中，加0.5g无水硫酸钠，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，即得(平行配制3份)。
150％供试品溶液配制：取磷酸特地唑胺精制品约10mg，精密称定，置10ml量瓶，精密量加入TDPEN 溶液150μl，加碱性磷酸酶溶液2ml，37℃水浴中强力振摇2h，加乙腈溶解并稀释至刻度，静置。精密量取上清液2.5ml，置10ml量瓶中，加0.5g无水硫酸钠，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，即得(平行配制3份)。
精密量取上述供试品溶液和对照溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图；考察TDPEN回收率的相对标准偏差，结果见表7。
表7异构体方法学-准确度
结论：从试验结果可知，其INAEN在20％～150％范围内，回收率良好，其平均回收率为103.3％， RSD值为3.14％，表明方法准确度良好。
4、溶液稳定性
供试品溶液配制：取磷酸特地唑胺精制品约10mg，精密称定，置10ml量瓶，精密量加入TDPEN溶液100μl，加碱性磷酸酶溶液2ml，37℃水浴中强力振摇2h，加乙腈溶解并稀释至刻度，静置。精密量取上清液2.5ml，置10ml量瓶中，加0.5g无水硫酸钠，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，即得。
将供试品溶液在室温放置24小时，分别于0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h和24h进样，记录色谱图；考察TDPEN和TDP的峰面积变化。结果见表8。
表8异构体方法学-溶液稳定性
结论：从数据结果上可看出，本品溶液室温放置24小时，TDP和TDPEN峰面积几乎没有变化，表明溶液在24h稳定。
5、耐用性
磷酸特地唑胺耐用性考察主要针对磷酸酶水解条件中反应温度、反应时间、反应pH、磷酸酶量和样品量及色谱条件中柱温、流动相比例进行试验。具体方法如下：
5.1酶反应温度
考察不同酶反应温度(37±2℃)对磷酸特地唑胺异构体测定的影响，具体试验如下：
供试品溶液配制：取磷酸特地唑胺精制品约10mg，精密称定，置10ml量瓶，精密量加入TDPEN溶液100μl，加碱性磷酸酶溶液2ml，分别于35℃、37℃、39℃水浴中强力振摇2h，照重复性项下同法配制 (平行配制2份)。
精密量取供试品溶液和对照溶液各10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见表9。
表9异构体方法学耐用性-不同酶反应温度
结论：经试验，在不同酶反应温度37±2℃进行水解，TDPEN回收率基本一致，表明酶反应温度在35～ 39℃下耐用性好。
5.2酶反应时间
考察不同酶反应时间对本品异构体测定的影响，具体试验如下：
供试品溶液配制：取磷酸特地唑胺精制品约10mg，精密称定，置10ml量瓶，精密量加入TDPEN溶液100μl，加碱性磷酸酶溶液2ml，分别于37℃水浴中强力振摇1.5h、2.0h、2.5h，照重复性试验同法配制 (平行配制2份)。
精密量取供试品溶液和对照溶液各10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见表10。
表10异构体方法学耐用性-不同酶反应时间
结论：经试验，在不同酶反应时间2.0±0.5h进行水解，TDPEN回收率基本一致，表明酶反应时间在 1.5～2.5h下耐用性好。
5.3酶反应pH
考察不同酶反应pH对本品异构体测定的影响，具体试验如下：
不同pH缓冲液的配制：
pH9.0缓冲液：取3.1g硼酸至1000ml容量瓶中，加500ml水溶解，再加1mol/l氢氧化钠溶液21ml，再加0.1mol/l氯化镁溶液10ml，定容，摇匀。
pH8.8缓冲液：取pH9.0的缓冲液适量，加硼酸溶液(取0.3g硼酸至100ml容量瓶中，加水溶解并定容至刻度，摇匀)调节pH至8.8。
pH9.2缓冲液：取pH9.0的缓冲液适量，加1mol/l氢氧化钠调节PH至9.2，摇匀。
碱性磷酸酶溶液配制：取碱性磷酸酶适量，分别加pH8.8、9.0、9.2缓冲液溶解并定量稀释制成浓度为每1ml含碱性磷酸酶2mg的溶液，摇匀，即得(临用新制)。
供试品溶液配制：取磷酸特地唑胺精制品约10mg，精密称定，置10ml量瓶，精密量加入TDPEN溶液100μl，分别加入pH为8.8、9.0、9.2碱性磷酸酶溶液2ml，于37℃水浴中强力振摇2.0h，照重复性项下同法配制(平行配制2份)。
精密量取供试品溶液和对照溶液各10μl注入液相色谱仪，结果见表11。
表11异构体方法学耐用性-不同酶反应pH
结论：经试验，酶反应pH在9.0±0.2下进行水解，TDPEN回收率基本一致，表明酶反应pH在8.8～ 9.2下耐用性好。
5.4磷酸酶量
考察不同酶浓度对本品异构体测定的影响，具体试验如下：
供试品溶液配制：取磷酸特地唑胺精制品约10mg，精密称定，置10ml量瓶，精密量加入TDPEN溶液100μl，分别加入碱性磷酸酶溶液1.8ml、2.0ml、2.2ml，于37℃水浴中强力振摇2.0h，照重复性项下同法配制(平行配制2份)。
精密量取供试品溶液和对照溶液各10μl注入液相色谱仪，结果见表12。
表12异构体方法学耐用性-不同磷酸酶量
结论：经试验，酶反应量在2.0±0.2ml下进行水解，TDPEN回收率基本一致，表明酶反应量在1.8～ 2.2ml下耐用性好。
5.5反应底物量
考察不同样品量对磷酸特地唑胺异构体测定的影响，具体试验如下：
供试品溶液配制：分别取磷酸特地唑胺精制品约8、10、12mg，精密称定，置10ml量瓶，分别精密加入TDPEN溶液80、100、120μl，加入碱性磷酸酶溶液2.0ml，于37℃水浴中强力振摇2.0h，照重复性项下同法配制(平行配制2份)。
精密量取供试品溶液和对照溶液各10μl注入液相色谱仪，结果见表13。
表13异构体方法学耐用性-不同反应底物量
结论：经试验，反应底物在10±2mg下进行水解，TDPEN回收率基本一致，表明酶反应中底物量在8～ 12mg下耐用性好。
5.6柱温
考察不同柱温对磷酸特地唑胺异构体测定的影响，具体试验如下：
供试品溶液配制：取磷酸特地唑胺精制品约10mg，精密称定，置10ml量瓶，精密量加入TDPEN溶液100μl，加碱性磷酸酶溶液2ml，于37℃水浴中强力振摇2h，照重复性项下同法配制(平行配制2份)。
分别调节不同的柱温(40±5℃)，精密量取供试品溶液和对照溶液各10μl注入液相色谱仪，结果见表 14-表15。
表14异构体方法学耐用性-不同柱温分离度考察
表15异构体方法学耐用性-不同柱温
结论：经试验，采用不同柱温进行考察，除保留时间略有差异外，分离度和理论板数均符合规定，TDPEN 回收率基本一致。系统适用性溶液结果显示柱温在35～45℃范围内变化时，耐用性良好。
5.7流动相比例
考察不同比例对本品异构体测定的影响，具体试验如下：
供试品溶液配制：取磷酸特地唑胺精制品约10mg，精密称定，置10ml量瓶，精密量加入TDPEN溶液100μl，加碱性磷酸酶溶液2ml，于37℃水浴中强力振摇2h，照重复性项下同法配制(平行配制2份)。
分别调节不同流动相比例(乙醇比例为：50％、53％、56％)，精密量取供试品溶液和对照溶液各10μl 注入液相色谱仪，结果见表16-表17。
表16异构体方法学耐用性-不同比例分离度考察
表17异构体方法学耐用性-不同比例
结论：经试验，采用不同流动相比例进行考察，除保留时间略有差异外，分离度和理论板数均符合规定，TDPEN回收率基本一致。系统适用性溶液结果显示流动相中乙醇比例在50～56％范围内变化时，耐用性良好。
综上所述，本发明研究发现，在采用碱性磷酸酶对磷酸特地唑胺样品进行酶水解后，以三(3,5-二甲苯基)-氨基甲酸酯直链淀粉填料手性柱为固定相，加入特定比例的流动相，可以有效分离检测磷酸特地唑胺样品中的对映异构体含量，且耐用性良好，可以快速、准确、灵敏地分离和分析其中对应异构体杂质的含量，从而有效控制磷酸特地唑胺及其制剂的质量。
Claims (10)
1.一种磷酸特地唑胺中对映异构体的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取磷酸特地唑胺或含磷酸特地唑胺的制剂适量，用碱性磷酸酶溶液水解，反应后加乙腈溶解稀释，分离有机层，干燥后用无水乙醇溶解稀释；
(2)将步骤(1)所得溶液注入液相色谱仪，完成磷酸特地唑胺与其对映异构体的分离测定；
其中，所述色谱分析采用三(3,5-二甲苯基)-氨基甲酸酯直链淀粉填料的手性色谱柱，以正己烷-无水乙醇溶液为流动相，且所述正己烷-无水乙醇溶液中包含选自甲酸、乙酸、三氟乙酸中的一种或多种酸，其体积百分浓度为0.05％～0.15％。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述步骤(1)中碱性磷酸酶溶液的pH范围为pH8.8～pH9.2，且所加入的磷酸酶与磷酸特地唑胺的质量比为(3.6～4.4)：(8～12)。
3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述碱性磷酸酶溶液的制备方法为：称取碱性磷酸酶适量，加pH缓冲溶液溶解，摇匀，配制成质量浓度为2mg/ml的溶液。
4.如权利要求3所述的检测方法，其中所述pH缓冲溶液的制备方法为：称取硼酸适量，加水溶解，加入适量1mol/L NaOH溶液和0.1mol/L MgCl2溶液，然后加水稀释摇匀，即得。
5.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述步骤(1)中酶水解反应的温度为35～39℃，酶水解反应的时间为1.5～2.5h。
6.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述步骤(2)中流动相中正己烷与无水乙醇的体积比为40:60～60:40。
7.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述步骤(2)的流动相为正己烷-无水乙醇-三氟乙酸混合溶液，正己烷：无水乙醇：三氟乙酸体积比约47:53:0.1。
8.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述步骤(2)中色谱柱为CHIRALPAK AD或CHIRALPAK AD-H。
9.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述步骤(2)中色谱柱为CHIRALPAK AD-H，250mm×4.6mm，5μm。
10.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述步骤(2)中色谱分析的检测波长为300±2nm，流动相流速为0.5ml/min～2ml/min，色谱柱温度为35～45℃，样品进样量为10～30μl。
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