CN107202848B - 一种氯法齐明的液相色谱分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种有效的氯法齐明液相色谱的分析方法，通过调整稀释液pH范围或者采用适宜材质的进样瓶，有效避开常规玻璃色谱进样瓶引起的干扰杂质。
Description
技术领域
本发明涉及医药分析技术领域，涉及一种氯法齐明的液相色谱分析方法。
背景技术
氯法齐明(Clofazimine)，于1969年上市用于治疗对氨苯砜耐药的麻风杆菌感染引起的麻风病，其化学名为10-(对-氯苯基)-2,10-二氢-3-(对-氯苯氨基)-2-异丙亚氨基吩嗪，分子式C27H22Cl2N4，分子量为473.40，其结构式如下：
有关物质检测及主成分含量检测是药品质量控制中非常关键的一个环节，如何克服在分析方法开发及日常检测过程中分析方法带来的自身缺陷，如分析方法参数选用不当导致的干扰杂质控制也是很重要的质量研究内容。
发明内容
本发明的目的是提供一种专属性高，耐用性好、干扰杂质少的氯法齐明液相色谱分析方法，所述方法包括以下步骤：
所述方法包括以下步骤：
(1)将含有氯法齐明样品溶解于稀释液中以制备样品溶液；
(2)将制备出来的样品溶液转移至色谱进样瓶中；
(3)对色谱进样瓶中的溶液进行色谱分析；
其中：
方法(a)：当步骤(2)色谱进样瓶为未进行过钝化表面处理的硼硅酸玻璃材质的进样瓶，则样品制备过程中所用的步骤(1)所用稀释液的pH值在4～10之间且可以溶解氯法齐明或其水合物的溶剂或溶液；
方法(b)：当步骤(2)的色谱进样瓶为钝化表面的硼硅酸玻璃材质的进样瓶或塑料材质的进样瓶，则步骤(1)所用的稀释液为任何pH值的可以溶解氯法齐明或其水合物的溶剂或溶液，
其中稀释液pH值检测方式为取体积比为1:1的溶媒与水进行混合，接着用pH计或pH试纸检测其均相混合液或水层的pH值。
本发明所述氯法齐明样品为含有氯法齐明及其水合物的原料药形式，或者氯法齐明与药物辅料组成的任意组合物。
其中所述稀释液选自：
有机溶剂或有机溶剂与水组成的混合物，所述有机溶剂选自：甲醇、乙醇、异丙醇，乙腈、四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜、二氯甲烷、三氯甲烷；或
有机酸与水或上述有机溶剂组成的混合溶液；所述有机酸选自：三氟乙酸、甲酸、乙酸。
稀释液中还可以包括下列任意一种化合物或它们的混合物，所述化合物选自：磷酸盐、磷酸、醋酸盐、甲酸盐、三氟乙酸、全氟丁酸、甲酸、乙酸、十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸钾、十二烷基硫酸镁、四烷基铵盐。
方法(a)中的的稀释液pH值优选范围在5.5-7.0之间。
查阅已有的文献报道方法及各国药典，氯法齐明的样品溶液均为pH值为3.0左右的流动相A，而玻璃制备过程中，会加入适量的硝酸盐及亚硝酸当消泡剂及提高透光率的改性添加剂。本发明人发现，当使用pH值为3.0左右的流动相A作为氯法齐明的样品溶液时，玻璃材质的色谱进样瓶中的亚硝酸盐及硝酸盐会被释放出来，并与氯法齐明的大共轭杂环发生亲核取代即可产生氯法齐明亚硝酸酯杂质，当环境温度超过20℃时，该杂质含量可超过0.20％，对氯法齐明检测造成了非常严重的干扰。
为了进一步确认氯法齐明亚硝酸酯的结构式，我们把亚硝酸钠溶液与氯法齐明溶液混合，接着室温下搅拌反应24小时，反应结束后，用0.1％甲酸水溶液与乙腈当流动相，用制备液相方法分离出该杂质标准品，经过高分辨质谱(HRMS)及核磁共振(NMR)确认，目标杂质为11-氯法齐明亚硝酸酯，其结构表征过程如下：获得的目标杂质经高分辨质谱检测，其[M+H+]精确分子量为518.1145，匹配误差为0.34ppm，匹配分子式为C27H22Cl2N5O2，与11-氯法齐明亚硝酸酯理论精确分子量518.1146几乎完全一致。通过核磁1H-NMR及13C-NMR数据(溶剂：CDCl3，数据汇总见表一及表二)，我们确定目标杂质为11-氯法齐明亚硝酸酯，目标化合物结构式原子编号如下：
表1. 11-氯法齐明亚硝酸酯核磁共振氢谱数据
| 质子类型 | 化学位移(ppm) | 峰型 | 归属H编号 | 质子数 |
| C-H | 1.15 | d | H-20/21 | 6 |
| C-H | 3.49 | m | H-19 | 1 |
| C-H | 5.32 | s | H-8 | 1 |
| C-H | 6.54 | d | H-4 | 1 |
| C-H | 6.97 | d | H-23/27 | 2 |
| C-H | 7.20 | t | H-3 | 1 |
| C-H | 7.25 | s | H-24/26 | 2 |
| C-H | 7.27 | o | H-2 | 1 |
| C-H | 7.31 | d | H-14/18 | 2 |
| C-H | 7.74 | d | H-15/17 | 2 |
| C-H | 7.81 | d | H-1 | 1 |
注：o代表重叠信号，与CDCl3中CHCl3氢信号重叠。
表2. 11-氯法齐明亚硝酸酯核磁共振碳谱数据
而采用本发明的技术方案，11-氯法齐明亚硝酸酯将会降低至检测限以下(＜0.02％)，因此能避免人为降解杂质，可以完全反映产品的真实质量情况，不会出现现有技术方法中出现高含量的11-氯法齐明亚硝酸酯杂质的干扰。
附图说明
图1为参考实施例1氯法齐明HPLC检测结果图。
图2为参考实施例2氯法齐明HPLC检测结果图。
图3为实施例1氯法齐明HPLC检测结果图。
图4为实施例5氯法齐明HPLC检测结果图。
具体实施方式
参照实施例1
色谱条件
仪器：高效液相色谱仪配备紫外检测器
色谱柱：YMC-Triart C8,150mm*4.6mm；3.0μm
流动相：称取2.25g十二烷基硫酸钠，0.85g四丁基硫酸氢铵，0.885g磷酸氢二钠溶于500mL水中，用磷酸(10％，m/m)调pH＝3.0,抽滤，备用。量取此缓冲盐350mL，与650mL乙腈，混匀，超声。
检测波长：280nm
流速：1.0mL/min
进样体积：20μL
柱温：25℃
运行时间：30min，流动相等度梯度运行
稀释液：同流动相
pH值检测：取1.0mL稀释液，再加入1.0mL水，混合均匀后用pH试纸检测得pH值为3.5
供试品溶液：称取50mg供试品，精密称定于100mL容量瓶中，用稀释液溶解并稀释至刻度，混匀，转移至硼硅酸玻璃液相进样小瓶中，HPLC方法检测氯法齐明供试品溶液，其中11-氯法齐明亚硝酸酯杂质峰面积归一化法含量0.20％。
参照实施例2
色谱条件
仪器：高效液相色谱仪配备紫外检测器
色谱柱：Waters XTerra MS C18,150mm*4.6mm；3.5μm
流动相：称取2.25g十二烷基硫酸钠，0.85g四丁基硫酸氢铵，0.885g磷酸氢二钠溶于500mL水中，用磷酸(10％，m/m)调pH＝3.0,抽滤，备用。量取此缓冲盐350mL，与650mL乙腈，混匀，超声。
检测波长：280nm
流速：1.0mL/min
进样体积：20μL
柱温：25℃
运行时间：30min，流动相等度梯度运行
稀释液：0.1％三氟乙酸乙腈溶液(体积比)
pH值检测：取1.0mL稀释液，再加入1.0mL水，混合均匀后用pH试纸检测得pH值为2.8
空白溶液：同稀释液
供试品溶液：称取50mg供试品，精密称定于100mL容量瓶中，用稀释液溶解并稀释至刻度，混匀，转移至硼硅酸玻璃液相进样小瓶中，HPLC方法检测氯法齐明供试品溶液，其中11-氯法齐明亚硝酸酯杂质峰面积归一化法含量0.25％。
实施例1
色谱条件
仪器：高效液相色谱仪配备紫外检测器
色谱柱：Agilent Zorbax Eclipse Plus C8,250mm*4.6mm,5μm
流动相：称取2.25g十二烷基硫酸钠，0.85g四丁基硫酸氢铵，0.885g磷酸氢二钠溶于500mL水中，用磷酸(10％，m/m)调pH＝3.0,抽滤，备用。量取此缓冲盐350mL，与650mL乙腈，混匀，超声。
检测波长：280nm
流速：1.0mL/min
进样体积：10μL
柱温：25℃
运行时间：30min，流动相等度梯度运行
稀释液：乙腈：水＝(7:3,V/V)
pH值检测：取1.0mL稀释液，再加入1.0mL水，混合均匀后用pH试纸检测得pH值为6.8
空白溶液：同稀释液
供试品溶液：称取100mg供试品，精密称定于100mL容量瓶中，用稀释液溶解并稀释至刻度，混匀，转移至硼硅酸玻璃液相进样小瓶中，HPLC方法检测氯法齐明供试品溶液，其中11-氯法齐明亚硝酸酯杂质未检出。
实施例2
色谱条件
仪器：高效液相色谱仪配备紫外检测器
色谱柱：Waters XTerra MS C18,150mm*4.6mm；3.5μm
流动相：称取2.25g十二烷基硫酸钠，0.85g四丁基硫酸氢铵，0.885g磷酸氢二钠溶于500mL水中，用磷酸(10％，m/m)调pH＝3.0,抽滤，备用。量取此缓冲盐350mL，与650mL乙腈，混匀，超声。
检测波长：280nm
流速：1.0mL/min
进样体积：20μL
柱温：25℃
运行时间：30min，流动相等度梯度运行
稀释液：0.1％三氟乙酸乙腈溶液(体积比)
pH值检测：取1.0mL稀释液，再加入1.0mL水，混合均匀后用pH试纸检测得pH值为2.8
空白溶液：同稀释液
供试品溶液：称取50mg供试品，精密称定于100mL容量瓶中，用稀释液溶解并稀释至刻度，混匀，转移至钝化表面的硼硅酸玻璃液相进样小瓶中，HPLC方法检测氯法齐明供试品溶液，其中11-氯法齐明亚硝酸酯杂质未检出。
实施例3
色谱条件
仪器：高效液相色谱仪配备紫外检测器
色谱柱：Inertsil C8-3,250mm*4.6mm；5.0μm
流动相A：0.1％甲酸水溶液
流动相B：乙腈
检测波长：280nm
流速：1.0mL/min
进样体积：10μL
柱温：45℃
运行时间：40min
流动相梯度：
稀释液：乙腈：水＝(7:3,V/V)
pH值检测：取1.0mL稀释液，再加入1.0mL水，混合均匀后用pH试纸检测得pH值为6.8
空白溶液：同稀释液
供试品溶液：称取100mg供试品，精密称定于100mL容量瓶中，用稀释液溶解并稀释至刻度，混匀，转移至硼硅酸玻璃液相进样小瓶中，HPLC方法检测氯法齐明供试品溶液，
其中11-氯法齐明亚硝酸酯杂质未检出。
实施例4
色谱条件
仪器：高效液相色谱仪配备紫外检测器
色谱柱：YMC-Triart C8,150mm*4.6mm；3.0μm
流动相：称取2.25g十二烷基硫酸钠，0.85g四丁基硫酸氢铵，0.885g磷酸氢二钠溶于500mL水中，用磷酸(10％，m/m)调pH＝3.0,抽滤，备用。量取此缓冲盐350mL，与650mL乙腈，混匀，超声。
检测波长：280nm
流速：1.0mL/min
进样体积：20μL
柱温：25℃
运行时间：30min，流动相等度梯度运行
稀释液：0.1％甲酸水溶液(体积比)
pH值检测：取1.0mL稀释液，再加入1.0mL水，混合均匀后用pH计检测得pH值为2.7空白溶液：同稀释液
供试品溶液：称取50mg供试品，精密称定于100mL容量瓶中，用稀释液溶解并稀释至刻度，混匀，转移至聚丙乙烯材质液相进样小瓶中，HPLC方法检测氯法齐明供试品溶液，其中11-氯法齐明亚硝酸酯杂质未检出。
实施例5
色谱条件
仪器：高效液相色谱仪配备紫外检测器
色谱柱：Agilent Zorbax Eclipse Plus C8,250mm*4.6mm,5μm
流动相：称取2.25g十二烷基硫酸钠，0.85g四丁基硫酸氢铵，0.885g磷酸氢二钠溶于500mL水中，用磷酸(10％，m/m)调pH＝3.0，抽滤，备用。量取此缓冲盐350mL，与650mL乙腈，混匀，超声。
检测波长：280nm
流速：1.0mL/min
进样体积：10μL
柱温：25℃
运行时间：30min，等度梯度运行
稀释液：5mmol/L甲酸铵甲醇溶液-乙腈(35:65,V/V)
pH值检测：取1.0mL稀释液，再加入1.0mL水，混合均匀后用pH计检测得pH值为6.7空白溶液：同稀释液
供试品溶液：称取100mg供试品，精密称定于100mL容量瓶中，用稀释液溶解并稀释至刻度，混匀，转移至硼硅酸玻璃液相进样小瓶中，HPLC方法检测氯法齐明供试品溶液，其中11-氯法齐明亚硝酸酯杂质未检出。
实施例6
色谱条件
仪器：高效液相色谱仪配备紫外检测器
色谱柱：Inertsil C8-3,250mm*4.6mm；5.0μm
流动相：称取2.25g十二烷基硫酸钠，0.85g四丁基硫酸氢铵，0.885g磷酸氢二钠溶于500mL水中，用磷酸(10％，m/m)调pH＝3.0,抽滤，备用。量取此缓冲盐350mL，与650mL乙腈，混匀，超声。
检测波长：280nm
流速：1.0mL/min
进样体积：20μL
柱温：25℃
运行时间：30min，流动相等度梯度运行
稀释液：5mmol/L甲酸铵水溶液-乙腈(50:50,V/V)
pH值检测：取1.0mL稀释液，再加入1.0mL水，混合均匀后用pH计检测得pH值为6.7空白溶液：同稀释液
供试品溶液：称取50mg供试品，精密称定于100mL容量瓶中，用稀释液溶解并稀释至刻度，混匀，转移至硼硅酸玻璃液相进样小瓶中，HPLC方法检测氯法齐明供试品溶液，
其中11-氯法齐明亚硝酸酯杂质未检出。
实施例7
色谱条件
仪器：高效液相色谱仪配备紫外检测器
色谱柱：Waters symmertry C8,250mm*4.6mm；5.0μm
流动相A：0.1％甲酸水溶液
流动相B：乙腈
检测波长：280nm
流速：1.0mL/min
进样体积：10μL
柱温：25℃
运行时间：30min
流动相梯度：
稀释液：0.1％三氟乙酸水溶液(体积比)
pH值检测：取1.0mL稀释液，再加入1.0mL水，混合均匀后用pH试纸检测得pH值为2.2
空白溶液：同稀释液
供试品溶液：称取100mg供试品，精密称定于100mL容量瓶中，用稀释液溶解并稀释至刻度，混匀，转移至聚丙烯材质液相进样小瓶中，HPLC方法检测氯法齐明供试品溶液，其中11-氯法齐明亚硝酸酯杂质未检出。
实施例8
色谱条件
仪器：高效液相色谱仪配备紫外检测器
色谱柱：Hypersil ODS C18,250mm*4.6mm；5.0μm
流动相：称取2.25g十二烷基硫酸钠，0.85g四丁基硫酸氢铵，0.885g磷酸氢二钠溶于500mL水中，用磷酸(10％，m/m)调pH＝3.0,抽滤，备用。量取此缓冲盐350mL，与650mL乙腈，混匀，超声。
检测波长：280nm
流速：1.0mL/min
进样体积：20μL
柱温：25℃
运行时间：30min，流动相等度梯度运行
稀释液：乙腈：水＝(7:3,V/V)
pH值检测：取1.0mL稀释液，再加入1.0mL水，混合均匀后用pH试纸检测得pH值为6.8
空白溶液：同稀释液
供试品溶液：称取50mg供试品，精密称定于100mL容量瓶中，用稀释液溶解并稀释至刻度，混匀，转移至硼硅酸玻璃液相进样小瓶中，HPLC方法检测氯法齐明供试品溶液，其中11-氯法齐明亚硝酸酯杂质未检出。
实施例9
色谱条件
仪器：高效液相色谱仪配备紫外检测器
色谱柱：Waters Xbridge C18,150mm*4.6mm；3.5μm
流动相A：0.1％三氟乙酸水溶液
流动相B：乙腈
检测波长：280nm
流速：1.0mL/min
进样体积：10μL
柱温：25℃
运行时间：30min
流动相梯度：
稀释液：5mmol/L乙酸铵水溶液-乙腈(50:50,V/V)
pH值检测：取1.0mL稀释液，再加入1.0mL水，混合均匀后用pH计检测得pH值为6.7空白溶液：同稀释液
供试品溶液：称取100mg供试品，精密称定于100mL容量瓶中，用稀释液溶解并稀释至刻度，混匀，转移至硼硅酸玻璃液相进样小瓶中，HPLC方法检测氯法齐明供试品溶液，
其中11-氯法齐明亚硝酸酯杂质未检出。
实施例10
色谱条件
仪器：高效液相色谱仪配备紫外检测器
色谱柱：Waters symmertry C8,250mm*4.6mm；5.0μm
流动相：称取2.25g十二烷基硫酸钠，0.85g四丁基硫酸氢铵，0.885g磷酸氢二钠溶于500mL水中，用磷酸(10％，m/m)调pH＝3.0,抽滤，备用。量取此缓冲盐350mL，与650mL乙腈，混匀，超声。
检测波长：280nm
流速：1.0mL/min
进样体积：20μL
柱温：25℃
运行时间：30min，流动相等度梯度运行
稀释液：5mmol/L甲酸铵甲醇溶液-乙腈(50:50,V/V)
pH值检测：取1.0mL稀释液，再加入1.0mL水，混合均匀后用pH计检测得pH值为6.7空白溶液：同稀释液
供试品溶液：称取50mg供试品，精密称定于100mL容量瓶中，用稀释液溶解并稀释至刻度，混匀，转移至硼硅酸玻璃液相进样小瓶中，HPLC方法检测氯法齐明供试品溶液，其中11-氯法齐明亚硝酸酯杂质未检出。
Claims (5)
1.一种氯法齐明的液相色谱分析方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将含有氯法齐明样品溶解于稀释液中以制备样品溶液；
(2)将制备出来的样品溶液转移至色谱进样瓶中；
(3)对色谱进样瓶中的溶液进行色谱分析；
其中：
步骤(2)色谱进样瓶为未进行过钝化表面处理的硼硅酸玻璃材质的进样瓶，样品制备过程中所用的步骤(1)所用稀释液的pH值在5.5～7.0之间且可以溶解氯法齐明或其水合物的溶剂或溶液，
所述的硼硅酸玻璃材质的进样瓶在玻璃制备过程中，会加入适量的硝酸盐及亚硝酸当消泡剂及提高透光率的改性添加剂；
其中稀释液pH值检测方式为取体积比为1:1的溶媒与水进行混合，接着用pH计或pH试纸检测其均相混合液或水层的pH值。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述液相色谱方法选自HPLC，UPLC或LC-MS。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述氯法齐明样品为含有氯法齐明及其水合物的原料药形式，或者氯法齐明与药物辅料组成的任意组合物。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述稀释液选自：
有机溶剂或有机溶剂与水组成的混合物，所述有机溶剂选自：甲醇、乙醇、异丙醇，乙腈、四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、二氯甲烷、三氯甲烷；或
有机酸与水组成的混合溶液；所述有机酸选自：三氟乙酸、甲酸、乙酸。
5.根据权利要求4所述的方法，其中的稀释液中还包括下列任意一种化合物或它们的混合物，所述化合物选自：磷酸盐、磷酸、醋酸盐、甲酸盐、三氟乙酸、全氟丁酸、甲酸、乙酸、十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸钾、十二烷基硫酸镁、四烷基铵盐。
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