CN113039262B - 用于捕捉细胞外囊泡的器件、细胞外囊泡的保存方法和转送方法 - Google Patents
用于捕捉细胞外囊泡的器件、细胞外囊泡的保存方法和转送方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供操作程序简单且能够高效地捕捉EVs的器件。根据本发明,例如提供用于捕捉样品液中的细胞外囊泡的器件,其中,该器件包含能够捕捉细胞外囊泡的纳米结构体。
Description
技术领域
本申请中的发明涉及用于捕捉样品中包含的细胞外囊泡(ExtracellularVesicles、外泌体;以下有时记为“EVs”)的器件、细胞外囊泡的保存方法和转送方法。
背景技术
Evs是由生物体内的细胞分泌的具有约40nm~约1000nm的大小的膜囊泡体,存在于血液、尿、唾液、精液等体液中。在其表面存在来自于分泌细胞的膜蛋白质、粘附分子、酶等,在内部包含mRNA、miRNA等核酸。因此,通过传播、进入到其他细胞中而对受体细胞产生影响。
近年来,作为EVs在生物体内的功能之一,已知其具有癌转移的诱发性,从而备受关注。癌转移是指癌细胞从癌的发生部位经由血管、淋巴等向其他器官传播并增殖,癌所致的死亡率高也是由该转移引起的。关于该癌转移的发生,报道了来自癌原发灶的癌细胞的EVs通过血管向其他器官传播,形成癌转移性龛;来自癌细胞的EVs诱发正常细胞的异常增殖,使其发展为癌肿瘤形成等关于EVs与癌转移的研究(参考非专利文献1)。
另外还已知,EVs中所含的miRNA被用作针对疾病的生物标志物(参考非专利文献2和3)。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1:Sonia A.Melo,et al.,“Cancer Exosomes Perform Cell-Independent MicroRNA Biogenesis and Promote Tumorigenesis”,Cancer Cell 26,707-721,November 10,2014http://dx.doi.org/10.1016/j.ccell.2014.09.005
非专利文献2:Amanda Michael,et al.,“Exosomes from Human Saliva as aSource of microRNA Biomarkers”,Oral Dis.2010January;16(1):34-38.doi:10.1111/j.1601-0825.2009.01604.x.
非专利文献3:Kazuya Iwai,et al.,“Isolation of human salivaryextracellular vesicles by iodixanol density gradient ultracentrifugation andtheir characterizations”,Journal of Extracellular Vesicles2016,5:30829-http://dx.doi.org/10.3402/jev.v5.30829
发明内容
发明所要解决的问题
如上述非专利文献2和3中所记载,已知样品(非专利文献2和3中为唾液)中的EVs所包含的miRNA被用作针对疾病的生物标志物。非专利文献2和3中记载了,通过对样品液进行超速离心分离,从样品液中回收EVs。但是,通过超速离心进行的分离需要在超速离心后回收包含EVs的级分。
因此,必须进行超速离心分离步骤,存在操作程序增加的问题。此外,在样品液的量少的情况下,为了连样品液中包含的微量的miRNA也进行分析,在回收样品液中包含的EVs时,需要减少损失。但是,在通过超速离心分离回收EVs的方法中,存在如下问题:在采集包含EVs的级分的操作过程中,可能会舍弃样品中包含的一部分EVs。另外,作为样品液中的EVs的分离方法,除了超速离心法以外,还已知使用市售试剂盒的凝聚试剂法。但是,关于凝聚试剂法,也存在如下问题:在使样品液中的EVs凝聚后,需要通过离心分离等将凝聚的EVs分离,操作程序增加,并且EVs的分离操作中产生损失。因此,需要操作程序简单且用于高效地从样品液中捕捉样品液中的EVs的器件(以下有时仅记为“器件”)。
本申请中的发明是为了解决上述问题而完成的,反复进行深入研究的结果,新发现了:[1]通过使用包含能够捕捉EVs的纳米结构体的器件,使器件与样品液接触,能够将EVs捕捉到器件中;[2]通过使捕捉了EVs的器件直接与EVs的破碎液接触,[3]能够在无需对器件中捕捉的EVs进行分离的步骤的情况下从捕捉到器件中的EVs直接提取miRNA。另外,新发现了:若任意附加地采用使用纤维素纤维或纤维素纳米纤维制作的包含纳米孔的器件,则从样品液中捕捉到的EVs的保存稳定性提高,EVs的转送便利性提高。
即,本申请中的发明的目的在于提供操作程序简单且能够高效地捕捉EVs的器件。另外,还任意附加地提供EVs的保存方法和转送方法。
用于解决问题的方法
本申请中的发明涉及以下所示的器件、保存方法和转送方法。
(1)一种用于捕捉样品液中的细胞外囊泡的器件,其中,该器件包含能够捕捉细胞外囊泡的纳米结构体。
(2)如上述(1)所述的器件,其中,上述纳米结构体包含选自纳米线、使用纤维素纤维制作的结构体和使用纤维素纳米纤维制作的结构体中的任意一者。
(3)如上述(2)所述的器件,其中,上述纳米结构体为使用纤维素纳米纤维制作的结构体。
(4)如上述(3)所述的器件,其中,上述纳米结构体的纤维素纳米纤维彼此的间隙为1nm以上且小于1000nm。
(5)如上述(2)所述的器件,其中,上述纳米结构体包含选自下述中的任意一者:
使用纤维素纤维制作的、包含平均尺寸为10nm以上且小于1000nm的纳米孔的结构体;和
使用纤维素纳米纤维制作的、包含平均尺寸为10nm以上且小于1000nm的纳米孔的结构体。
(6)如上述(1)~(5)中任一项所述的器件,其中,上述样品液为无创生物样品液。
(7)如上述(6)所述的器件,其中,上述生物样品液为唾液。
(8)一种细胞外囊泡的保存方法,其中,该保存方法包括:
通过使上述(5)所述的器件与样品液接触而将样品液中的细胞外囊泡捕捉到器件中的细胞外囊泡捕捉步骤;
将浸渗到器件中的样品液的液体除去的干燥步骤;和
将干燥步骤中干燥后的捕捉了细胞外囊泡的器件进行保存的保存步骤。
(9)如上述(8)所述的保存方法,其中,上述保存步骤在室温下实施。
(10)一种细胞外囊泡的转送方法,其中,该转送方法包括:
通过使上述(5)所述的器件与样品液接触而将样品液中的细胞外囊泡捕捉到器件中的细胞外囊泡捕捉步骤;
将浸渗到器件中的样品液的液体除去的干燥步骤;和
将干燥步骤中干燥后的捕捉了细胞外囊泡的器件进行转送的转送步骤。
(11)如上述(10)所述的转送方法,其中,上述转送步骤在室温下实施。
(12)如上述(1)所述的器件,其中,能够捕捉细胞外囊泡的纳米结构体为包含纤维素纤维的无纺布。
(13)如上述(12)所述的器件,其中,纤维素纤维为纤维素纳米纤维。
发明效果
利用本申请中公开的器件,能够捕捉样品液中的EVs,然后能够从捕捉到器件中的EVs直接提取miRNA。另外,作为任意附加的效果,若采用使用纤维素纤维或纤维素纳米纤维制作的包含纳米孔的器件,则EVs的保存稳定性提高,EVs的转送便利性提高。
附图说明
图1A至图1D是示出第三实施方式的器件1的一例的图。
图2是用于说明第三实施方式的器件1的一例的图,该例是在基板2的第一面上形成有纳米线3的器件1a的制作步骤的一例。
图3A至图3C是示出罩构件4的各种方式的图。图3D示出在第一面上形成有纳米线的基板2。
图4是用于说明第四实施方式的器件1b的制作步骤的一例的图。
图5是提取方法的第一实施方式的流程图。
图6是保存方法的实施方式的流程图。
图7是转送方法的实施方式的流程图。
图8A至图8E是附图代用照片,分别是实施例1至5中制作的器件的照片。
图9是示出利用压汞法测定实施例1、3和4中制作的膜的孔的尺寸分布的结果的图。图9A是示出将孔尺寸的标尺(スケール)设定为1nm~100nm时的分布的图,图9B是示出将孔尺寸的标尺设定为1nm~100μm时的分布的图。
图10A和图10B是附图代用照片,(a)是miRNA提取后将器件从离心管中取出后的离心管的照片,(b)是从离心管取出的器件的照片。
图11A和图11B是附图代用照片,(a)是miRNA提取步骤刚结束后的离心管的照片,(b)是miRNA提取后将器件从离心管取出后的离心管的照片,(c)是从离心管取出的器件的照片。
图12是示出使用实施例1~4的器件提取出的miRNA提取液中包含的miRNA的种类的图。
图13是示出实施例5和6以及比较例1的分析结果的图。
图14是附图代用照片,图14A是实施例5中滴加唾液前的SEM照片。另外,图14B是实施例5中滴加唾液后的SEM照片。
具体实施方式
以下,参考附图对器件进行详细说明。需要说明的是,本说明书中,对于具有同种功能的构件,附以相同或类似的符号。另外,对于附以相同或类似的符号的构件,有时省略重复的说明。
本申请中公开的器件的特征在于,包含能够捕捉EVs的纳米结构体。需要说明的是,本说明书中,“纳米结构体”是指,能够通过相互作用吸附EVs、并且通过与同种且同量的材料的最小面积相比使比表面积增大而提高了EVs的吸附效率的结构体。纳米结构体例如可以通过使用具有微细的孔(纳米孔)的材料、或者使微细的纤维(线)凝聚(密集)等而制作。需要说明的是,本说明书中,“纳米孔”是指,平均尺寸为10nm以上且小于1000nm的纳米尺寸的开口部或纤维间隔。另外,在记为“有纳米孔”或“包含纳米孔”的情况下,是指具有以纳米级(1nm以上且小于1000nm)分布的孔、并且仅纳米级的孔的平均尺寸为10nm以上且小于1000nm。因此,只要包含“纳米孔”,则可以包含微米级(1μm以上且小于1000μm)的孔,但微米级的孔不作为“纳米孔”的平均尺寸的计算依据。另外,在记为“无纳米孔”的情况下,是指不包含纳米级的孔、或者仅纳米级的孔的平均尺寸偏离上述“纳米孔”的平均尺寸。另外,对包含纳米结构体的器件的形状没有特别限制,例如可以为膜状;线(绳)状;圆柱状、棱柱状或不定形状等立体形状;等中的任意一种。以下对使用膜状和纳米线的器件的各实施方式进行说明,但下述器件的实施方式仅是例示,只要满足上述“纳米结构体”的定义,器件不限于以下例示的实施方式。纳米孔的平均尺寸可以利用压汞法进行测定。
(器件的第一实施方式)
器件的第一实施方式中,将使用纤维素纳米纤维制作的膜作为纳米结构体使用。为了得到纤维素纳米纤维,首先,从木屑中取出木材纤维(纤维素纤维)并制成纸浆。该纤维素纤维是使无数纤维素纳米纤维成束而构成的。接着,对于该纤维素纤维,在TEMPO催化剂的存在下在溶剂中在高压下使纤维彼此碰撞,使成束的纤维素纤维拆解,由此能够得到纤维素纳米纤维。需要说明的是,上述的纤维素纳米纤维的制作方法仅是例示,也可以为其他方法。第一实施方式的器件可以通过对包含所得到的纤维素纳米纤维的溶剂进行抽滤,利用表面张力使纤维素纳米纤维彼此凝聚、成膜而制作。作为将纤维素纳米纤维分散的溶剂,可以列举水等。在某一方式中,所制作的膜可以为无纺布。
需要说明的是,第一实施方式的器件中,所制作的膜的纤维素纳米纤维彼此可以具有间隙(纳米孔)。通过调节纳米孔的尺寸,能够提高EVs的捕捉效率。关于纳米孔的平均尺寸,例如可以将下限值设定为10nm以上、15nm以上、20nm以上、25nm以上、30nm以上,将上限值设定为小于1000nm、500nm以下、200nm以下、100nm以下。需要说明的是,在将第一实施方式的器件用于EVs的保存方法或转送方法的情况下,如后述实施例所示,优选将EVs封入纳米孔内。由于各纳米孔的尺寸具有分布,因此,即使在纳米孔的平均尺寸为10nm的情况下,也存在能够将EVs封入的尺寸的纳米孔。但是,为了将更多的EVs封入到纳米孔中,可以将纳米孔的平均尺寸的下限设定为例如40nm以上、45nm以上、50nm以上、60nm以上等。纳米孔的尺寸通过压汞法、图像处理等来测定即可。
纳米孔可以通过在进行抽滤而凝聚的湿润状态的纤维素纳米纤维中添加表面张力低的液体(以下有时记为“低表面张力溶剂”)并继续抽吸,将凝聚的纤维素纳米纤维的块中包含的溶剂用低表面张力溶剂置换并进行干燥而形成。纳米孔的尺寸可以通过改变所添加的低表面张力溶剂来调节。低表面张力溶剂的表面张力只要为小于水的表面张力(20℃、72.75mN/m)且能够制作纳米孔的范围则没有特别限制。例如,20℃下的表面张力可以设定为35mN/m以下、30mN/m以下、25mN/m以下、20mN/m以下等。作为低表面张力溶剂的具体例,可以列举叔丁醇(20.7mN/m)、乙醇(22.55mN/m)、异丙醇(20.8mN/m)等。需要说明的是,上述的纳米孔的形成和尺寸的调节仅是例示,也可以利用其他方法进行纳米孔的形成和尺寸的调节。例如,可以通过改变使纤维素纤维拆解的高压处理条件或纸浆的种类、细菌、海鞘等纤维素原料来改变纤维素纳米纤维的宽度、调节纳米孔的尺寸。在设置有纳米孔的情况下,捕捉的EVs增多,能够进行很多种类的miRNA的分析。
(器件的第二实施方式)
器件的第二实施方式与第一实施方式的不同点在于,将使用纤维素纤维(纸浆)代替纤维素纳米纤维而制作的膜作为纳米结构体使用。除了代替纤维素纳米纤维而将纤维素纤维(纸浆)分散于溶剂中以外,第二实施方式的器件通过与器件的第一实施方式同样的过程进行制作即可。纤维素纤维彼此的间隙和存在于纤维素纤维表面的纤维素纳米纤维彼此的间隙也可以通过与第一实施方式同样的过程进行制作和尺寸的调节。需要说明的是,由于纤维素纳米纤维的宽度为约3nm~约100nm,因此形成与第一实施方式相同尺寸的纳米孔。另一方面,纤维素纤维的宽度为约20μm~约40μm。因此,间隙的尺寸与第一实施方式不同,为nm~μm级,为约10nm~1000nm和约1μm~约100μm的多标尺。
第一和第二实施方式的器件可以将制作的膜切割为适当的尺寸后直接使用。或者,也可以将切割后的器件粘贴到后述的miRNA提取步骤时使用的离心管等上、通过粘贴到口罩上来捕捉咳嗽中的EVs、粘贴到毛巾等上来捕捉汗中的EVs。另外,器件的第一和第二实施方式为膜状,但也可以为其他形状。例如在制成线(绳)状的情况下,抽滤时使用以线(绳)状形成有槽的模型(抽滤器)即可。另外,也可以将分散有纤维素(纳米)纤维的溶剂注射到丙酮等凝固浴中进行纺丝。在制成规定的立体形状的情况下,使用形成规定形状的模型(抽滤器)进行抽滤即可。另外,在制成不定形的立体形状的情况下,首先,仅在抽滤器的一部分投入分散有纤维素(纳米)纤维的溶剂,通过抽滤制作纤维素(纳米)纤维凝聚而成的块,反复进行上述纤维素(纳米)纤维凝聚而成的块的制作,由此能够制作不定形的立体形状的纳米结构体。另外,也可以通过将分散有纤维素(纳米)纤维的溶剂装入期望形状的容器中进行冷冻干燥处理来制作立体形状的纳米结构体。另外,器件可以仅用纤维素(纳米)纤维来制作,也可以在不损害本发明目的的范围内添加填充剂等。可以列举例如:添加作为湿强剂的聚酰胺多胺环氧氯丙烷等填充剂;以单体添加纳米线(纳米线参考后述的第三实施方式);等。
(器件的第三实施方式)
器件的第三实施方式中,将纳米线作为器件使用。图1A至图1D是示出第三实施方式的器件1的一例的图。图1A为器件1a的俯视图,图1B为图1A的X-X’截面图,图1C为图1A的Y-Y’截面。另外,图1D是图1C所示的实施方式的变形例的截面图。器件1a至少包含基板2、纳米线3、罩构件4,在图1B~图1D(以下有时将与图1共通的说明仅记为“图1”。在以下的段落中也同样)所示的器件1a中,包含用于形成纳米线3的催化剂层5。器件1a中,在基板2上形成有用于形成纳米线3的催化剂层5,在催化剂层5上形成有纳米线3。需要说明的是,本说明书中,“第一面”是指基板2的形成有纳米线3的一侧的面的最表面。因此,如后所述,在记载为基板2的“第一面”与罩构件的“第二面”液密地密合的情况下,“第一面”的构件根据制法而成为基板2、催化剂层5或被覆层。此外,也有在与罩构件的“第二面”密合的“第一面”上生长有纳米线的情况,这种情况下将位于纳米线的根部的平坦部作为“第一面”。另外,本说明书中,纳米线的“前端”是指纳米线的两个端部中更远离基板2的第一面的纳米线的端部,基板2的第一面侧的纳米线的端部在本说明书中直接记为“端部”。
罩构件4包含罩构件用基材41、形成在罩构件用基材41中的流道42。需要说明的是,本说明书中,“第二面”是指罩构件用基材41的形成流道42的一侧的面(在将流道42的开口部分作为假想平面的情况下,与该假想平面连续的面)。在图1B所示的例子中,罩构件用基材41的与催化剂层5接触的面相当于第二面。另外,在图1C所示的例子中,罩构件4包含样品投入孔43和样品回收孔44。如图1C所示,样品投入孔43和样品回收孔44以贯通流道42和与第二面相反一侧的面45的方式形成在罩构件用基板41上。需要说明的是,图1C所示的例子示出了从器件1a的上方投入和回收样品液的例子,但只要投入的样品液从形成纳米线3的区域通过且通过后能够回收样品液,则样品投入孔43和样品回收孔44的位置没有特别限制。例如,如图1D所示,也可以在流道42的侧壁上形成样品投入孔43和样品回收孔44。
第三实施方式的器件1a可以使用光刻技术来制作。图2是用于说明第三实施方式的器件1的一例的图,该例是在基板2的第一面上形成有纳米线3的器件1a的制作步骤的一例。需要说明的是,图2表示图1A的X-X’方向的截面图。
(1)准备基板2。
(2)在基板2上,将纳米线3制作用的粒子进行ECR(Electron CyclotronResonance,电子回旋共振)溅射或将催化剂进行ECR溅射、EB(Electron Beam,电子束)蒸镀、PLD(Pulsed Laser Deposition,脉冲激光沉积)、ALD(Atomic Layer Deposition,原子层沉积),由此形成催化剂层5。需要说明的是,本说明书中记载为“催化剂层”的情况下,是指纳米线制作用的“粒子”或“催化剂”的“层”。
(3a、3b)涂布光刻用的抗蚀剂6,通过光刻将生长纳米线3的部位进行图案化。光刻的图案化只要以希望生长纳米线3的图案形成即可。例如,在希望随机生长纳米线3的情况下,以使基板2上的形成纳米线3的区域的催化剂层5全部露出的方式进行图案化即可(参考3a)。另外,在以规定间隔生长纳米线3的情况下,以使催化剂层5以规定间隔的点状露出的方式进行图案化或基于光刻的描绘即可(参考3b)。在通过光刻进行图案化或者描绘后,将进行了图案化或描绘的部分的抗蚀剂6显影、除去。
(4a、4b)从除去抗蚀剂、露出催化剂层5的部位生长纳米线3。
(5a、5b)除去剩余的抗蚀剂,由此能够制作在形成于第一面的催化剂层5上形成有纳米线3的基板2。
图3A至图3C是示出罩构件4的各种方式的图。罩构件4可以通过对罩构件用基材41的第二面47进行切削、或者将凸状的模型向罩构件用基材41的材料按压而简单地制作。另外,在通过按压凸状的模型而制作罩构件4的情况下,样品投入孔43和样品回收孔44在转印后使用活检环钻、超声波钻头等来形成即可。例如如图3A和图3B所示,罩构件4可以通过改变切削范围、模型的形状而简单地改变流道42的截面积。另外,如图3C所示,也可以在流道42的任意的面上形成用于使通过的样品液产生湍流的非平面区域46。非平面区域46只要能够使通过的样品液产生湍流则没有特别限制,例如可以形成凸部等。可以准备流道42的截面积或形状不同的两种以上的罩构件4。
然后,使具有期望的截面积或形状的流道42的罩构件4被覆在通过图2所示的步骤制作的在第一面上形成有纳米线3的基板2(图3D)上,由此能够制作器件1a。
基板2只要能够层叠催化剂层5则没有特别限制。可以列举例如硅、石英玻璃、派热克斯(Pyrex)(注册商标)玻璃等。
关于催化剂层5,作为纳米线3制作用的粒子,可以列举例如ZnO。另外,作为纳米线3制作用的催化剂,可以列举例如金、铂、铝、铜、铁、钴、银、锡、铟、锌、镓、铬和它们的氧化物等。
作为光刻用的抗蚀剂6,只要是OFPR8600LB、SU-8等半导体领域中通常使用的抗蚀剂则没有特别限制。另外,作为抗蚀剂6的除去液,只要是二甲基甲酰胺和丙酮等半导体领域中的常规除去液则没有特别限制。
纳米线3利用公知的方法从催化剂层5生长即可。例如,在使用ZnO微粒作为催化剂层5的情况下,可以使用水热合成方法来制作。具体而言,可以使加热后的基板2浸渍在使硝酸锌六水合物(Zn(NO3)2·6H2O)、六亚甲基四胺(C6H12N4)溶解在去离子水中而成的前体溶液中,由此从露出有ZnO粒子(催化剂层5)的部分生长ZnO纳米线3。
在使用催化剂作为催化剂层5的情况下,可以通过下述步骤制作纳米线3。
(a)使用SiO2、Li2O、MgO、Al2O3、CaO、TiO2、Mn2O3、Fe2O3、CoO、NiO、CuO、ZnO、Ga2O3、SrO、In2O3、SnO2、Sm2O3、EuO等材料,通过脉冲激光沉积、VLS(Vapor-Liquid-Solid,气液固)法等物理蒸镀法形成芯纳米线。
(b)使用SiO2、TiO2等,通过溅射、EB(Electron Beam,电子束)蒸镀、PVD(PhysicalVapor Deposition,物理气相沉积)、ALD(Atomic Layer Deposition,原子层沉积)等常规的蒸镀法在芯纳米线的周围形成被覆层。需要说明的是,上述(b)的被覆层不是必需的,根据需要实施即可。
纳米线3的直径可以根据目的适当进行调节。关于纳米线3的直径,使用ZnO微粒形成的情况下,变更ZnO微粒的尺寸即可。另外,在所制作的纳米线3上形成被覆层的情况下,可以通过改变形成被覆层时的蒸镀时间来适当调节直径。
作为用于制作罩构件4的材料,只要能够进行切削或转印模型则没有特别限制。可以列举例如:聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚偏二氯乙烯、聚苯乙烯、聚乙酸乙烯酯、聚四氟乙烯、ABS(丙烯腈丁二烯苯乙烯)树脂、AS(丙烯腈苯乙烯)树脂、丙烯酸类树脂(PMMA)等热塑性树脂;酚醛树脂、环氧树脂、三聚氰胺树脂、脲树脂、不饱和聚酯树脂、醇酸树脂、聚氨酯、热固性聚酰亚胺、硅橡胶等热固性树脂。
需要说明的是,图1至图3所示的例子只不过是器件1的例示,只要在基板2上形成有纳米线则没有特别限制。例如,可以通过国际公开第2015/137427号中记载的过程在形成于基板2上的流道内形成纳米线。
(器件的第四实施方式)
第四实施方式的器件1b的不同点在于,纳米线3的端部埋入到基板2a的第一面中,以及制作基板2a的材料与第三实施方式的器件1a不同,在其他方面与第三实施方式的器件1a相同。
图4是用于说明第四实施方式的器件1b的制作步骤的一例的图。
(5)准备第三实施方式的器件1a中制作的、在第一面上形成有纳米线3的基板2作为模型。
(6)将形成基板2a的材料涂布到模型上。
(7)将基板2a从模型剥离,由此形成在第一面中埋入有纳米线3的一部分的基板2a。
(8)使埋入在基板2a的第一面中的纳米线3进一步生长,由此制作在纳米线3的端部埋入到第一面中的基板2a。纳米线3的生长可以通过与第一实施方式同样的过程来进行。
然后,虽省略图示,但通过将与第三实施方式同样的过程制作的罩构件4被覆在基板2a上,由此能够制作器件1b。
形成基板2a的材料只要能够将纳米线3埋入则没有特别限制,可以列举例如与罩构件4同样的材料。
接着,对使用上述器件的EVs的捕捉方法和捕捉后的miRNA提取方法(以下有时简记为“提取方法”)的实施方式进行说明。
(提取方法的第一实施方式)
参考图5对提取方法的第一实施方式进行说明。图5是提取方法的第一实施方式的流程图。提取方法的第一实施方式包括细胞外囊泡(EVs)捕捉步骤(ST1)、miRNA提取步骤(ST2)。在细胞外囊泡(EVs)捕捉步骤(ST1)中,通过使样品液与能够捕捉EVs的器件接触,将样品液中的EVs捕捉到器件中。在miRNA提取步骤(ST2)中,通过使捕捉了EVs的器件与EVs的破碎液接触而将EVs破碎,将miRNA从EVs提取到破碎液中。
作为样品液,只要包含EVs则没有特别限制,可以列举血液、淋巴液、骨髓液、精液、母乳、羊水、尿、唾液、鼻涕、汗、泪、胆汁、脑脊液等生物样品液。另外,作为生物样品液以外的样品液,可以列举细胞培养上清、在培养基或缓冲液等中添加有EVs的实验用的样品液等。在使用生物样品液作为样品液的情况下,考虑到减轻患者负担,优选尿、唾液、鼻涕、汗、泪等无创样品液。
需要说明的是,如后述实施例所示,对使用本申请中公开的器件提取出的miRNA进行分析时,能够分析很多种类的miRNA。换言之,使用本申请中公开的器件时,对于利用现有方法无法分析的微量的miRNA也能够进行分析。因此,使用本申请中公开的器件时,若是相同种类的样品液,能够以较少的量提取出miRNA。另外,一般认为,为了通过超速离心分离对EVs进行分级、回收,需要约几毫升的样品液。但是,也存在例如唾液、泪等采集几毫升的量会对患者造成很大负担的生物样品液。在提取方法的第一实施方式中,通过使用本申请中公开的器件,与现有的利用超速离心分离的方法相比,即使样品液的量少也能够提取miRNA,因此对于唾液中的EVs中包含的miRNA的提取特别有用。
EVs的破碎液只要能够将EVs破碎则没有特别限制,例如使用市售的细胞裂解缓冲液(Cell Lysis Buffer)即可。作为细胞裂解缓冲液,可以列举细胞裂解缓冲液M(富士胶片和光纯药株式会社制、038-21141)、RIPA缓冲液(富士胶片和光纯药株式会社制、182-02451)等。需要说明的是,将器件在破碎液中浸渍的时间只要能够将EVs而取出miRNA则没有特别限制。需要说明的是,上述例子示出了先将EVs捕捉到器件中的例子,但也可以通过使利用破碎液破碎Evs而得到的溶液流到器件中而将miRNA直接捕捉到器件中。
(提取方法的第二实施方式)
提取方法的第二实施方式与提取方法的第一实施方式的不同点在于,在图5所示的细胞外囊泡(EVs)捕捉步骤(ST1)与miRNA提取步骤(ST2)之间包括对捕捉了EVs的器件进行清洗的器件清洗步骤,其他方面与提取方法的第一实施方式相同。从生物体提取出的生物样品液、例如唾液、汗、鼻涕等中,为了保护生物体免受从外部侵入的病毒等的影响,包含作为对病毒等异物的RNA进行分解的酶的RNA酶(RNase)。因此,在从唾液、汗、鼻涕等包含RNA酶的生物样品液中提取miRNA的情况下,在细胞外囊泡捕捉步骤时,RNA酶可能会吸附到器件上。并且,若使用吸附有RNA酶的器件实施miRNA提取步骤,则从EVs中提取出的miRNA可能会被RNA酶分解。
因此,在器件清洗步骤中,通过对捕捉了EVs的器件进行清洗,从器件除去RNA酶。在器件清洗步骤中,将捕捉了EVs的器件在清洗液中浸渍规定时间来进行清洗即可。清洗时间没有特别限制,但若过短则清洗效果降低,若过长则捕捉到的EVs容易脱落、EVs的收量可能降低。例如,鉴于上述观点,将器件在清洗液中浸渍约1秒~约2000秒即可。作为清洗液,可以列举纯水、PBS、NaCl、生理盐水、PBS等各种缓冲液等。需要说明的是,在使用纯水作为清洗液的情况下,为了使利用浸透压的关系捕捉到的EVs不发生爆裂,优选与缓冲液等相比将清洗时间设定得较短。
(miRNA的分析方法的实施方式)
miRNA的分析方法的实施方式包括对通过提取方法的第一或第二实施方式提取出的破碎液中的miRNA进行分析的分析步骤。miRNA的分析使用公知的miRNA分析方法即可。可以列举例如:(1)使用miRNeasy Mini试剂盒(QIAGEN)提取包含miRNA的总RNA,使用3D-Gene(注册商标)miRNA芯片从约2500种miRNA中进行网罗性分析,将芯片图像进行数值化,进行表达比的计算、变异基因分析、聚类分析;(2)使用miRNeasy血清/血浆试剂盒(Qiagen),单离破碎液中的总miRNA,使用miScript II RT试剂盒(Qiagen)合成cDNA,接着利用定量性实时PCR进行定量;等方法。
在使用第一和第二实施方式所示的膜状的器件作为器件的情况下,在细胞外囊泡捕捉步骤(ST1)中,向膜上滴加样品液或者将膜浸渍于样品液中即可。另外,在使用第三和第四实施方式的在基板上形成有纳米线的器件1a、1b作为器件的情况下,在细胞外囊泡捕捉步骤(ST1)中,从样品投入孔投入样品液即可。
另外,在使用第一和第二实施方式所示的膜状的器件作为器件的情况下,在miRNA提取步骤(ST2)中,将膜浸渍于破碎液中即可。另外,在使用第三和第四实施方式的在基板上形成有纳米线的器件作为器件的情况下,在miRNA提取步骤(ST2)中,从样品投入孔投入破碎液并回收包含提取出的miRNA的破碎液即可。
需要说明的是,上述第三和第四实施方式的器件1a、1b形成有罩构件4,但也可以不设置罩构件4。这种情况下,在细胞外囊泡捕捉步骤(ST1)中,将样品液滴加至纳米线上、或者将器件以使纳米线接触的方式浸渍于装有样品液的容器中即可。另外,在miRNA提取步骤(ST2)中,将纳米线部分浸渍于装有破碎液的容器中即可。
此外,上述第三和第四实施方式的器件1a、1b在基板的第一面上形成有纳米线3,但也可以将纳米线3单独地作为器件。这种情况下,在细胞外囊泡捕捉步骤(ST1)中,通过将纳米线投入到装有样品液的管等中而使纳米线与样品液接触即可。另外,在miRNA提取步骤(ST2)中,从管中除去样品液后将破碎液投入到管中即可。在将纳米线3单独地作为器件使用的情况下,也能够从捕捉到器件中的EVs直接提取miRNA。在将纳米线3单独地作为器件的情况下,例如从基板的第一面回收纳米线3即可。
如后述实施例所示,上述各实施方式所示的器件能够捕捉样品液中的EVs。需要说明的是,在利用破碎液将EVs破碎并对提取出的miRNA进行网罗性分析的情况下,若器件被破碎液破坏,则有时破坏的残渣会对分析步骤产生不良影响。因此,器件对破碎液具有耐久性,例如对破碎液具有至少5分钟、优选30分钟以上的耐久性即可。
在上述实施方式中,纳米线或由纤维素纳米纤维构成的膜对破碎液具有耐久性,因此可以说是更优选的器件。
需要说明的是,上述器件仅是例示,只要能够吸附EVs(优选对破碎液具有耐久性),并不限于上述实施方式的器件。作为这样的器件,可以列举在表面存在很多小孔的多孔材料。具体而言,可以列举活性炭、沸石等微孔材料、二氧化硅(介孔二氧化硅)、氧化铝等介孔材料、浮石等大孔材料等。另外,除了多孔材料以外,还可以列举由熔融玻璃、聚合物制作的过滤器。
(细胞外囊泡(EVs)的保存方法的实施方式)
参考图6对细胞外囊泡(EVs)的保存方法(以下有时仅记为“保存方法”)的实施方式进行说明。图6是保存方法的实施方式的流程图。保存方法的实施方式包括细胞外囊泡捕捉步骤(ST11)、干燥步骤(ST12)和保存步骤(ST13)。细胞外囊泡捕捉步骤(ST11)使用包含纳米孔的器件作为器件来实施。更具体而言,使用第一实施方式所示的纤维素纳米纤维彼此具有间隙(纳米孔)的器件、第二实施方式所示的纤维素纤维彼此具有间隙(纳米孔)的器件来实施。除了使用包含纳米孔的器件以外,细胞外囊泡捕捉步骤(ST11)使用样品液通过与提取方法的第一实施方式的细胞外囊泡捕捉步骤(ST1)同样的过程来实施即可。
在干燥步骤(ST12)中,将浸渗到器件中的样品液的液体除去。如上所述,使用本申请中公开的器件时,样品液的量可以较少。因此,干燥步骤中,进行在室温下使液体蒸发的自然干燥即可。
在保存步骤(ST13)中,将干燥步骤(ST12)中干燥后的捕捉了细胞外囊泡的器件进行保存。如后述实施例所示,在保存步骤(ST13)后对细胞外囊泡进行分析时,在保存温度存在差异、例如冷藏保存(4℃)和室温下保存的情况下,细胞外囊泡的分析结果没有大的差异。因此,在日后对采集的样品进行分析的情况下,可以在放置于室温的状态下保存,因此样品的处理的便利性提高。需要说明的是,本申请中,室温是指例如10℃~30℃,可以超过15℃且为30℃以下。
(细胞外囊泡(EVs)的转送方法的实施方式)
参考图7对细胞外囊泡(EVs)的转送方法(以下有时仅记为“转送方法”)的实施方式进行说明。图7是转送方法的实施方式的流程图。转送方法的实施方式包括细胞外囊泡捕捉步骤(ST21)、干燥步骤(ST22)和转送步骤(ST23)。细胞外囊泡捕捉步骤(ST21)和干燥步骤(ST22)与上述保存方法的细胞外囊泡捕捉步骤(ST11)和干燥步骤(ST12)相同。因此,为了避免重复的说明,省略详细的说明。
转送步骤(ST23)中,将干燥步骤(ST22)中干燥后的捕捉了细胞外囊泡的器件进行转送。通过对细胞外囊泡中包含的miRNA等进行分析,可期待进行癌症的诊断等,但多数情况下,地方的医疗机构或个人难以从自身的生物样品中提取细胞外囊泡来进行分析。另一方面,如上所述,在本申请中公开的细胞外囊泡的保存方法中,保存时的温度对分析精度没什么影响。因此,在地方的医疗机构等中,使从患者采集到的生物样品与器件接触并干燥,接着通过邮寄物等将器件转送到具有细胞外囊泡的分析功能的医疗机构等,由此,无论是居住在哪个地区的患者,都能够接受适当的诊断。对生物样品进行转送时,通常需要冷藏或冷冻保存。另一方面,本申请中公开的方法能够在室温下转送器件,因此转送样品时的便利性大幅提高。
以下,列举实施例对本申请中公开的实施方式具体地进行说明,但该实施例只是用于说明实施方式。并非对本申请中公开的发明的范围进行限定或限制。
实施例
[器件的制作]
<实施例1>
通过以下的过程由纤维素纳米纤维制作具有纳米孔的膜状的器件。
(1)使用SUGINO MACHINE公司制造的湿式微粒化装置(Starburst HJP-25005E)对针叶树漂白牛皮纸浆进行处理,将所得到的宽度15~100nm的纳米纤维素400mg投入到200mL的水中,得到纳米纤维素水分散液。
(2)使用过滤装置(KG-90、ADVANTEC东洋滤纸株式会社)和抽吸装置(抽吸器AS-01、AS ONE株式会社),通过亲水性聚四氟乙烯(PTFE)膜滤器(H020A090C、ADVANTEC东洋滤纸株式会社)对上述纳米纤维素水分散液进行过滤脱水。
(3)接着,进行在脱水处理后的纳米纤维素集合体上滴加叔丁醇(tBuOH、06104-25、Nacalai Tesque株式会社)200mL并过滤的溶剂置换步骤。
(4)将所得到的湿润状态的纳米纤维素集合体在110℃、1MPa、15分钟的条件下进行热压干燥处理(AYSR-5、神藤金属工业所株式会社)后,从PTFE膜滤器上剥离,由此得到膜。
(5)将所制作的膜裁切成边长为1cm的正方形,由此制作实施例1的器件。图8A是实施例1中制作的膜的SEM照片。图9是示出利用压汞法测定所制作的膜的孔的尺寸分布的结果的图。图9A是示出将孔尺寸的标尺设定为1nm~100nm时的分布的图,图9B是示出将孔尺寸的标尺设定为1nm~100μm时的分布的图。由图9A和图9B确认到,实施例1中制作的膜具有约4nm~约300nm的纳米孔的分布,平均尺寸为约60nm。
<实施例2>
除了不进行实施例1的利用tBuOH的置换步骤以外,通过与实施例1同样的过程由纤维素纳米纤维制作膜状的器件。图8B是实施例2中制作的膜的SEM照片。根据照片,实施例2中制作的器件在纤维素纳米纤维彼此之间未观察到纳米孔的形成。需要说明的是,由于不会完全不存在纳米孔,因此认为实施例2的纳米孔的尺寸为1nm。
<实施例3>
通过以下的过程由纸浆(纤维素纤维)制作具有微米尺寸的孔的膜状的器件。
(1)将针叶树漂白牛皮纸浆400mg投入到水200mL中,得到纸浆水分散液。
(2)使用过滤装置(KG-90、ADVANTEC东洋滤纸株式会社)和抽吸装置(抽吸器AS-01、AS ONE株式会社),通过不锈钢网过滤器(SUS304、300目、株式会社CLEVER)对上述纸浆水分散液进行过滤脱水。
(3)接着,进行在脱水处理后的纸浆集合体上滴加叔丁醇(tBuOH、06104-25、Nacalai Tesque株式会社)200mL并过滤的溶剂置换步骤。
(4)将所得到的湿润状态的纸浆集合体在110℃、1MPa、15分钟的条件下进行热压干燥处理(AYSR-5、神藤金属工业所株式会社)后,从不锈钢网过滤器上剥离,由此得到膜。
(5)将所制作的膜裁切成边长为1cm的正方形,由此制作实施例3的器件。图8C是实施例3中制作的膜的照片。图9A和图9B示出利用压汞法测定的孔尺寸的分布。由图9A和图9B表明,所制作的膜的孔的尺寸为约7nm~约100nm和约1μm~约100μm的多标尺。
<实施例4>
除了不进行实施例3的利用tBuOH的置换步骤以外,通过与实施例3同样的过程由纸浆(纤维素纤维)制作膜状的器件。图8D是实施例4中制作的膜的照片。图9A和图9B示出利用压汞法测定的孔尺寸的分布。由图9A和图9B表明,所制作的膜的孔的尺寸为约1μm~约100μm。
<实施例5>
通过以下的过程制作将纳米线埋入到形成于基板上的流道中的器件。
(1)首先,在Si(100)基板(Advantech Co.,Ltd.)上进行PDMS埋入型纳米线器件的流道图案化。利用旋涂机(MS-A100、MIKASA株式会社)在500rpm(5秒)、3000rpm(120秒)的条件下将正抗蚀剂(OFPR-8600LB,Tokyo Ohka Kogyo Co.Ltd.)旋涂至Si基板表面上,然后,在加热板上进行90℃、12分钟的加热,由此使溶剂蒸发,使抗蚀剂固定在基板上。在加热后的基板上载置玻璃掩模,利用曝光机照射600mJ/cm2的i线,由此进行抗蚀剂的软化。最后将该基板在显影液(NMD-3、Tokyo Ohka Kogyo Co.,Ltd.)中浸渍约10秒,由此进行软化的抗蚀剂的剥离,从显影液中取出基板,进行流水清洗。接着,在加热板上进行90℃、5分钟的加热,由此完成图案化。
(2)接着,在基板表面上进行成为纳米线生长的籽晶层的Cr层的制作。Cr层制作的溅射装置(EIS-200ERT-YN、ELIONIX株式会社)的条件为1.2×10-2Pa、14分钟,堆积135nm的Cr层。将该基板在加热板上浸渍在加温至70℃的2-丙醇中40分钟后,利用超声波设备进行2分钟的超声波处理,由此将流道外的抗蚀剂大致去除。然后,将基板转移至装在另一容器中的70℃的2-丙醇中,浸渍10分钟后进行1分钟的超声波处理,由此将流道外的抗蚀剂完全去除。最后,进一步利用装在另一容器中的70℃的2-丙醇进行漂洗,去除附着在基板上的细小的Cr粒子。通过这些过程,在基板上形成仅在流道部分堆积有Cr层的状态。将该基板在400℃的电炉中加热2小时,由此使Cr层氧化,完成纳米线生长的籽晶层制作。
(3)将六亚甲基四胺(HMTA;085-00335,Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)以达到15mM的方式溶解于超纯水200mL中,利用搅拌器搅拌7分钟。然后,进一步以达到15mM的方式溶解硝酸锌六水合物(12323,Alfa Aesar)后,搅拌7分钟,由此制成纳米线生长溶液。在此,在76mm×52mm×0.8~1.0mm的载破片上利用碳胶带粘贴2片通过上述过程准备的以流道的形状蒸镀有氧化Cr层的基板,浸渍于生长溶液中,利用送风恒温高温器在95℃下加热3小时,由此使纳米线生长。然后,将基板从烧杯中取出,为了除去非特异性生长的纳米线,利用超纯水进行冲洗。
(4)将上述(3)中制作的生长有纳米线的基板粘贴到培养皿上。将PDMS预聚物(Silpot 184、Dow Corning Toray Ind.,Ltd.)和固化剂(Silpot184CAT,Dow CorningToray Ind.,Ltd.)以10:1的重量比放入容器中后,以2000rpm、2分钟、2200rpm、6分钟的条件混合,将所得物注入上述培养皿中。对其进行2小时抽真空,由此去除聚合物中的气泡,接着,在80℃的加热板上加热2小时,由此进行聚合,使聚合物固化。通过这些操作,将Si基板上的纳米线埋入PDMS中。将该埋入有纳米线的PDMS从Si基板上剥离,将PDMS埋入型纳米线粘贴到载玻片上。然后,在与上述(3)同样的条件下使PDMS埋入型纳米线生长。生长后,将埋入型纳米线从烧杯中取出,通过用超纯水冲洗而去除非特异性生长的纳米线,由此完成PDMS埋入型纳米线的制作。
(5)利用旋涂机在Si基板上涂布负型光致抗蚀剂(SU-8 3025、日本化药株式会社),被覆能够将流道部分曝光的形状的光掩模,进行曝光、显影,由此制作形成流道的部分成为凸状的模型。接着,将所制作的模型放入培养皿中。接着,将与上述(4)同样的PDMS预聚物和固化剂以10:1的重量比放入容器中后,以2000rpm下2分钟、2200rpm下6分钟的条件进行混合,将所得物注入培养皿中,进行2小时抽真空,由此去除聚合物中的气泡。经过2小时后,在80℃的加热板上加热2小时,由此进行聚合,使聚合物固化。切下该固化后的聚合物,利用0.32mm的冲头在流道中开出投入孔和回收孔,由此制作罩构件。
(6)最后,在上述(4)中制作的具有纳米线的基板上被覆上述(5)制作的罩构件。另外,在投入孔和回收孔中插入PEEK管,用胶粘剂固定,由此制作实施例5的器件。图8E是实施例5中制作的器件的纳米线的放大照片。
[miRNA的提取和分析(提取/分析例1)]
使用唾液作为样品液,使用实施例1至4中制作的器件作为器件,通过以下的过程从唾液中包含的EVs中进行miRNA的提取和分析。
(1)样品液的调整
从受检者采集唾液。在提取/分析例1中,直接使用唾液,但为了去除唾液中的杂质,可以根据需要将唾液放入离心管中,通过离心分离去除杂质。需要说明的是,该离心分离只不过用于去除杂质,与用于将EVs分级、回收的超速离心分离不同。
(2)样品中的EVs的捕捉
将唾液样品10μl滴加到实施例1至4的器件中,放置约10秒钟,由此将唾液样品中的EVs捕捉到器件中。接着,用镊子夹住器件,在PBS中浸渍约10秒钟,由此进行RNA酶等的清洗。
(3)miRNA的提取
作为破碎液,使用细胞裂解缓冲液M(038-21141,Wako)。在离心管中加入破碎液1ml,接着将上述(2)中捕捉了EVs的器件投入到离心管中,通过涡旋搅拌约3秒后,静置5分钟,由此从捕捉了EVs的器件中直接溶解EVs,进行miRNA的提取。图10A是使用实施例1的器件时的照片,(a)是在miRNA提取后将器件从离心管取出后的离心管的照片,(b)是从离心管取出后的器件的照片。图10B是使用实施例2的器件时的照片,(a)是在miRNA提取后将器件从离心管取出后的离心管的照片,(b)是从离心管取出后的器件的照片。图11A是使用实施例3的器件时的照片,(a)是miRNA提取步骤刚结束后的离心管的照片,(b)是在miRNA提取后将器件从离心管取出后的离心管的照片,(c)是从离心管取出后的器件的照片。图11B是使用实施例4的器件时的照片,(a)是miRNA提取步骤刚结束后的离心管的照片,(b)是在miRNA提取后将器件从离心管取出后的离心管的照片,(c)是从离心管取出后的器件的照片。如图10A和图10B所示,在使用实施例1和实施例2的由纤维素纳米纤维制作的器件的情况下,即使在利用破碎液将EVs破碎后,在离心管内也未观察到来自器件的纤维等,另外,取出后的器件维持着原来的形状。因此,在miRNA的提取后,仅通过用镊子去除器件就能够制作miRNA提取液。
另一方面,如图11A和图11B所示,在使用实施例3和实施例4的由纸浆(纤维素纤维)制作的器件的情况下,在离心管内观察到从器件中分离出的纤维,取出后的器件发生部分缺损。因此,在实施例3和4中,通过离心分离将在后述的miRNA分析时作为杂质产生妨碍的来自器件的纤维除去。
(4)miRNA的分析
接着,使用3D-Gene(注册商标)(东丽株式会社制)人miRNA芯片,通过以下的过程对miRNA提取液中包含的miRNA的种类进行分析。
(a)按照试剂盒制造商的操作说明书,使用SeraMi Exosome RNA纯化柱试剂盒(System Biosciences Inc.)对miRNA提取液进行纯化。
(b)使用微阵列和3D-Gene人miRNA Oligo芯片ver.21(Toray Industries),对纯化后的miRNA提取液15μl分析miRNA谱(profiling)。3D-Gene包含2565个人miRNA探针,能够从miRNA提取液中分析最多为2565种的miRNA的表达。
(c)miRNA提取液中的各miRNA的表达水平通过计算出各微阵列中的所有miRNA的减去背景后的信号强度、然后进行全局标准化来进行分析。
图12是示出使用实施例1至4的器件提取出的miRNA提取液中包含的miRNA的种类的图。需要说明的是,各实施例均为3次分析结果的平均值。如图12所示,确认到:使用实施例1至4中的任意一个器件时,均能够从捕捉到器件中的EVs中直接提取miRNA。另外,如图10和图11所示,实施例3和实施例4的由纸浆制作的器件中,在EVs的破碎中发生器件的部分缺损,在离心管内观察到从器件分离出的纤维。因此表明,在从样品液中提取miRNA后继续进行miRNA的分析的情况下,更优选实施例1和实施例2的器件。
需要说明的是,在现有的对唾液进行超速离心分离来分离EVs并对miRNA进行分析的方法中,在上述非专利文献2中,如第10页所记载,为27种。另外,在上述非专利文献3中,如图7所记载,能够分析的miRNA为93种。此外,在非专利文献3记载的方法中,记载了使用5ml或15ml的唾液,但采集这样大量的唾液对受检者(患者)的负担非常大。另一方面,在使用实施例1至实施例4中记载的器件的情况下,使用仅仅10μl的唾液就成功地进行了超过700种的miRNA的分析。换言之,意味着对于含量为微量的miRNA也能够进行分析。
根据以上的结果,使用第一至第四实施方式的器件时,与现有的使用超速离心分离的EVs的分离方法等相比,能够简化从唾液样品液中的EVs提取miRNA的操作程序。另外,由于能够从捕捉了EVs的器件中直接提取miRNA(并且能够以高比例将唾液中的EVs捕捉到器件中),因此确认到miRNA提取操作中的损失减少、能够进行高精度的miRNA分析这样的显著效果。因此,本申请中公开的miRNA的提取方法作为样品液中包含的miRNA的分析方法时的样品制备方法是非常有用的。另外,能够从作为生物样品液的无创且难以大量采集的唾液中进行高精度的miRNA的分析,因此在健康诊断等时,期望通过使第一至第四实施方式所示的器件与舌头接触来一并实施癌症诊断。
[miRNA的提取和分析(提取/分析例2)]
使用尿作为样品液,使用实施例5中制作的器件作为器件,通过以下的过程从尿中包含的EVs进行miRNA的提取和分析。
(1)样品的调整
将市售的尿(Proteogenex、BioreclamationIVT、EW Biopharma)1mL分注到1.5mL离心管中,将该离心管设置于冷却离心机中,在3000×g、15分钟、4℃的条件下进行离心分离,由此使杂质沉淀。以下,将除去该杂质后的上清部分记载为尿样品。
(2)尿样品中的EVs的捕捉
利用注射泵在流量50μL/分钟的条件下将上述尿样品1mL导入至实施例5中制作的器件中,使尿样品中的EVs捕捉到纳米线中。
(3)miRNA的提取
作为破碎液,使用与提取/分析例1同样的细胞裂解缓冲液M,将破碎液1mL导入至器件中,由此将捕捉到的EVs溶解,制作miRNA提取液。
(4)miRNA的分析
通过与提取/分析例1同样的过程进行分析。
通过相同的过程进行228次实验,结果,使用实施例5的器件能够检测出平均1144种的miRNA。由以上的结果确认,能够从捕捉到纳米线中的EVs中直接提取miRNA。
进而,在现有的通过超速离心分离来分离EV并对miRNA进行分析的方法中,通过相同的过程进行3次实验,结果,能够分析的miRNA为171、261、352种。另外,在采用使用树脂基的EVs吸附载体的市售的EVs浓缩试剂盒ExoQuick(funakoshi株式会社制)的实验中,能够分析的miRNA的种类为337、355、491种。
根据以上的结果,在使用唾液以外的生物样品、并且使用由木材纤维制作的器件以外的EVs捕捉用器件的情况下,也确认到与提取/分析例1记载的同样的显著效果。
[捕捉了细胞外囊泡的器件的保存温度和期间对细胞外囊泡的分析产生的影响]
<实施例6>
使用实施例1中制作的器件(纤维素纳米纤维;有纳米孔),通过以下的过程进行实验。
(1)样品液的调整
从受检者采集唾液。将采集的唾液放入离心管中,以3000g×15分钟离心分离,由此去除杂质。
(2)样品中的EVs的捕捉
将唾液样品10μl滴加到器件中,放置约10秒钟,由此将唾液样品中的EVs捕捉到器件中。
(3)器件的干燥
将滴加唾液样品后的器件在室温下放置10秒钟,由此进行干燥。
(4)器件的保存
将上述(3)中干燥后的器件在室温下保存0~6天、20天。需要说明的是,实验在10月~11月进行,白天实验室进行常规的换气。另外,各天数均以N=3进行。
(5)细胞外囊泡的分析
将保存后的器件在PBS中浸渍10秒钟,由此进行清洗,通过以下的过程测定sRNA浓度(ng/μl)。需要说明的是,实施例5中,通过考察RNA浓度的变化来调查保存对EVs的影响。由于miRNA的浓度难以测定,因此在实施例5中使用sRNA的浓度。
(a)对于单样本测定,将Qubit(注册商标)缓冲液199μL和Qubit试剂(荧光试剂;Thermo Fisher Scientific株式会社制)1μL混合,制作200μL的溶液(溶液A)。在进行N样本测定的情况下,准备[N+2(校准曲线用)]×200μL。
(b)将溶液A 190μL和0ng/μL的sRNA溶液(Thermo Fisher Scientific株式会社制)10μL混合,制作200μL的混合溶液。
(c)将溶液A 190μL和10ng/μL的sRNA溶液10μL混合,制作200μL的混合溶液。
(d)将上述(b)和(c)分别进行2~3秒钟涡旋,静置2分钟。
(e)实施(d)的步骤后,使用Qubit(注册商标)缓冲液199μL和Qubit试剂(荧光试剂;Thermo Fisher Scientific株式会社制)测定荧光强度,制作校准曲线。
(f)作为破碎液,使用细胞裂解缓冲液M(038-21141,Wako)。在离心管中加入破碎液1ml,接着将上述(4)中保存后的器件投入到离心管中,通过涡旋搅拌约3秒后,静置5分钟,由此制作从捕捉了EVs的器件中溶解出EVs的样品液。将溶液A 195μL和所制作的样品5μL混合,制作200μL的混合溶液。
(g)将上述(f)进行2~3秒钟涡旋,静置2分钟。
(h)与上述(e)同样地测定上述(g)的浓度,基于上述(e)中制作的校准性求出浓度。
<实施例7>
除了使保存温度为4℃以外,通过与实施例5同样的过程进行实验。
<比较例1>
除了使用实施例2中制作的器件(纤维素纳米纤维;无纳米孔)以外,通过与实施例5同样的过程进行实验。
图13是示出实施例5和6以及比较例1的结果的图。如图所示,在使用有纳米孔的器件的情况下(实施例5和6),与使用无纳米孔的器件的情况(比较例1)相比,在第2天以后在保存稳定性方面显示出显著的效果。另外,在使用有纳米孔的器件的情况下,未特别观察到保存温度、更具体而言室温(实施例5)与4℃(实施例6)的差异对细胞外囊泡的分析精度的影响。在由远距离的医疗机构将样品捕捉到器件中的情况下,为了转送至具有分析功能的医疗机构进行细胞外囊泡的分析,需要几天至一周左右。因此确认到,在使用本申请中公开的器件中的特别是具有纳米孔的器件的情况下,保存稳定性优良,并且能够以在室温下保存的状态进行转送,因此样品的转送便利性提高。
图14A是实施例5中滴加唾液前的SEM照片。另外,图14B是实施例5中滴加唾液并干燥后的SEM照片。如图14A所示,在实施例1的由利用tBuOH等表面张力低的介质实施了置换步骤的纤维素纳米纤维制作的器件的表面,形成有很多纳米孔。另一方面,如图14B所示,在滴加唾液并干燥后的器件的表面,纳米孔关闭。认为这是由于,与tBuOH相比,作为水系样品的唾液的表面张力大,因此在将唾液干燥的过程中,使纳米孔关闭的力发挥了作用(图14B的箭头表示露出了一部分的EVs)。如图13所示,认为在使用实施例1中制作的器件的情况下保存稳定性增加是由于,EVs被封入纤维素纳米纤维纤维之间,与空气的接触减少。
产业上的可利用性
通过使用本申请中公开的器件,能够从样品液中简单且高精度地提取和分析miRNA。因此,在医疗机构、大学、企业、研究机构等中,对于细胞实验等有用。
标号说明
1、1a~1b…器件、2、2a…基板、3…纳米线、4…罩构件、5…催化剂层、6…抗蚀剂、41…罩构件用基材、42…流道、43…样品投入孔、44…样品回收孔、45…与第二面相反一侧的面、46…非平面区域、47…第二面
Claims (6)
1.一种细胞外囊泡的保存方法,其为基于用于捕捉样品液中的细胞外囊泡的器件的细胞外囊泡的保存方法,
所述器件为使用纤维素纳米纤维制作的、包含平均尺寸为10nm以上且小于1000nm的纳米孔的纳米结构体,
该保存方法包括:
通过使所述器件与样品液接触而将所述样品液中的细胞外囊泡捕捉到所述器件中的细胞外囊泡捕捉步骤;
通过将浸渗到所述器件中的所述样品液的液体除去,所述纳米孔关闭,所述细胞外囊泡被被封入所述纳米孔内的干燥步骤,所述干燥步骤在室温下实施;和
将干燥步骤中干燥后的捕捉了所述细胞外囊泡的所述器件进行保存的保存步骤。
2.如权利要求1所述的保存方法,其中,所述纳米结构体形成为膜状。
3.如权利要求1或2所述的保存方法,其中,所述保存步骤在室温下实施。
4.一种细胞外囊泡的转送方法,其为基于用于捕捉样品液中的细胞外囊泡的器件的细胞外囊泡的转送方法,
所述器件为使用纤维素纳米纤维制作的、包含平均尺寸为10nm以上且小于1000nm的纳米孔的纳米结构体,
该转送方法包括:
通过使所述器件与样品液接触而将所述样品液中的细胞外囊泡捕捉到所述器件中的细胞外囊泡捕捉步骤;
通过将浸渗到所述器件中的所述样品液的液体除去,所述纳米孔关闭,所述细胞外囊泡被被封入所述纳米孔内的干燥步骤,所述干燥步骤在室温下实施;和
将干燥步骤中干燥后的捕捉了所述细胞外囊泡的所述器件进行转送的转送步骤。
5.如权利要求4所述的转送方法,其中,所述纳米结构体形成为膜状。
6.如权利要求4或5所述的转送方法,其中,所述转送步骤在室温下实施。
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