JP2023123592A - マイクロrnaを含む体液抽出物 - Google Patents
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Abstract
【課題】マイクロRNAによる、対象ががんである可能性を検査する方法の提供。【解決手段】マイクロRNAが細胞外小胞に含まれる、または、前記マイクロRNAが細胞外小胞から抽出されている、尿の抽出物の使用。【選択図】なし
Description
特許法第30条第2項適用申請有り (1)平成30年(2018年)9月18日発行の最新醫學、最新医学社発行、第73巻、第9号、第1230~1236頁 (2)平成30年(2018年)6月18日発行のコンバーテック、加工技術研究会発行、第46巻、第6号、第6~10頁 (3)平成30年(2018年)4月18日発行のライフライン21がんの先進医療:がん患者と家族に希望の光を与える情報誌、蕗書房発行、第29巻、第30~34頁 (4)平成30年(2018年)7月24日発行のConvertech international、第2巻、第6号、第54~59頁 (5)平成29年(2017年)12月16日に国立研究開発法人日本医療研究開発機構が、https://www.amed.go.jp/news/release_20171216.htmlに掲載 (6)平成29年(2017年)12月16日に国立研究開発法人科学技術振興機構が、http://www.jst.go.jp/pr/announce/20171216/に掲載 (7)平成29年(2017年)12月16日に国立研究開発法人国立がん研究センターが、https://www.ncc.go.jp/jp/information/pr_release/2017/1216/index.htmlに掲載 (8)平成30年(2018年)に安井 隆雄が、http://cd.engg.nagoya-u.ac.jp/press_e/research/r43_02.htmlに掲載 (9)平成29年(2017年)12月18日に国立大学法人九州大学が、https://www.kyushu-u.ac.jp/ja/researches/view/210に掲載 (10)平成29年(2017年)12月18日に国立大学法人名古屋大学が、http://www.nagoya-u.ac.jp/about-nu/public-relations/researchinfo/upload_images/20171218_engg_1.pdfに掲載
特許法第30条第2項適用申請有り (11)平成29年(2017年)12月25日に国立大学法人名古屋大学が、http://en.nagoya-u.ac.jp/research/activities/news/2017/12/development-of-a-nanowire-device-to-detect-cancer-with-a-urine-test.htmlに掲載 (12)平成29年(2017年)12月13日に国立研究開発法人科学技術振興機構が、文部科学記者会(東京都千代田区霞ヶ関3-2-2)に発表 (13)平成29年(2017年)12月13日に国立研究開発法人科学技術振興機構が、科学記者会(東京都千代田区丸の内2-5-1文部科学省5F)に発表 (14)平成29年(2017年)12月18日に国立研究開発法人科学技術振興機構が、株式会社加工技術研究会(東京都千代田区岩本町3-4-6 VORT岩本町I 6F)に発表 (15)平成29年(2017年)12月18日に国立研究開発法人科学技術振興機構が、株式会社誠文堂新光社(東京都文京区本郷3丁目3-11)に発表 (16)平成29年(2017年)12月18日に国立研究開発法人科学技術振興機構が、株式会社日経BP(東京都港区虎ノ門4丁目3番12号)に発表 (17)平成29年(2017年)12月18日に国立研究開発法人科学技術振興機構が、株式会社水産新聞社(北海道札幌市中央区南1条西8丁目9番地1エコネットビル5F)に発表 (18)平成29年(2017年)12月18日に国立研究開発法人科学技術振興機構が、株式会社ニュートンプレス(東京都文京区大塚3丁目11-6 大日本図書大塚三丁目ビル6階)に発表 (19)平成29年(2017年)12月18日に国立研究開発法人科学技術振興機構が、株式会社航空新聞社(東京都港区赤坂4-8-6 赤坂余湖ビル3階)に発表 (20)平成29年(2017年)12月18日に国立研究開発法人科学技術振興機構が、アイメディア株式会社(広島県広島市東区若草町12番1号 アクティブインターシティ広島9F)に発表
特許法第30条第2項適用申請有り (21)平成29年(2017年)12月18日に国立研究開発法人科学技術振興機構が、株式会社金属時評(東京都港区新橋2-20-15新橋駅前ビル1号館601号室)に発表 (22)平成29年(2017年)12月18日に国立研究開発法人科学技術振興機構が、株式会社ジェィツ・コンプレックス Motor Cars編集部及びNext Mobility編集部(東京都千代田区有楽町1-2-2東宝日比谷ビル18F)に発表 (23)平成29年(2017年)12月18日に国立研究開発法人科学技術振興機構が、株式会社日本農業新聞(東京都千代田区一番町23-3)に発表 (24)平成29年(2017年)12月18日に国立研究開発法人科学技術振興機構が、学校法人河合塾(愛知県名古屋市千種区今池2-1)に発表 (25)平成29年(2017年)12月18日に国立研究開発法人科学技術振興機構が、株式会社読売新聞東京本社(東京都千代田区大手町1-7-1)に発表 (26)平成29年(2017年)12月18日に国立研究開発法人科学技術振興機構が、株式会社日本水道新聞社(東京都千代田区九段南4丁目8番9号 日本水道会館1F)に発表 (27)平成29年(2017年)12月18日に国立研究開発法人科学技術振興機構が、株式会社新農林社(東京都千代田区神田錦町1-12-3 第一アマイビル2F)に発表 (28)平成29年(2017年)12月18日に国立研究開発法人科学技術振興機構が、株式会社メディアジーン(東京都渋谷区円山町23番2号アレトゥーサ渋谷6F)に発表 (29)平成29年(2017年)12月18日に国立研究開発法人科学技術振興機構が、一般財団法人日本電気協会(千代田区有楽町1-7-1 有楽町電気ビル北館4階)に発表 (30)平成29年(2017年)12月18日に国立研究開発法人科学技術振興機構が、株式会社食品化学新聞社(東京都千代田区神田神保町3-2-8 昭文館ビル)に発表
特許法第30条第2項適用申請有り (31)平成29年(2017年)12月13日に国立大学法人九州大学が、株式会社毎日新聞福岡本部(福岡県福岡市中央区天神1丁目16-1)に発表 (32)平成29年(2017年)12月13日に国立大学法人九州大学が、株式会社読売新聞西部本社 北九州総本部(福岡県北九州市小倉北区米町2-2-1)に発表 (33)平成29年(2017年)12月13日に国立大学法人九州大学が、株式会社朝日新聞社西部本社(福岡県北九州市小倉北区室町1-1-1)に発表 (34)平成29年(2017年)12月13日に国立大学法人九州大学が、株式会社西日本新聞社(福岡県福岡市中央区天神1-4-1)に発表 (35)平成29年(2017年)12月13日に国立大学法人九州大学が、株式会社日本経済新聞社西部支社(福岡県福岡市博多区博多駅東2-16-1)に発表 (36)平成29年(2017年)12月13日に国立大学法人九州大学が、株式会社産業経済新聞社九州総局(福岡県福岡市中央区渡辺通5-23-8 サンライトビル3階)に発表 (37)平成29年(2017年)12月13日に国立大学法人九州大学が、株式会社共同通信社福岡支社(福岡県福岡市中央区天神1-4-1)に発表 (38)平成29年(2017年)12月13日に国立大学法人九州大学が、株式会社時事通信社福岡支社(福岡県福岡市中央区天神2-13-7 福岡平和ビル7F)に発表 (39)平成29年(2017年)12月13日に国立大学法人九州大学が、株式会社日刊工業新聞社西部支社(福岡県福岡県福岡市博多区古門戸町1-1)に発表 (40)平成29年(2017年)12月13日に国立大学法人九州大学が、株式会社日本放送協会福岡放送局(福岡県福岡市中央区六本松1-1-10)に発表
特許法第30条第2項適用申請有り (41)平成29年(2017年)12月13日に国立大学法人九州大学が、九州朝日放送株式会社(福岡県福岡市中央区長浜1-1-1)に発表 (42)平成29年(2017年)12月13日に国立大学法人九州大学が、株式会社テレビ西日本(福岡県福岡市早良区百道浜2-3-2)に発表 (43)平成29年(2017年)12月13日に国立大学法人九州大学が、RKB毎日放送株式会社(福岡県福岡市早良区百道浜2丁目3-8)に発表 (44)平成29年(2017年)12月13日に国立大学法人九州大学が、株式会社TVQ九州放送(福岡市博多区住吉2-3-1)に発表 (45)平成29年(2017年)12月13日に国立大学法人名古屋大学が、株式会社朝日新聞名古屋本社(愛知県名古屋市中区栄1-3-3)に発表 (46)平成29年(2017年)12月13日に国立大学法人名古屋大学が、株式会社読売新聞東京本社中部支社(愛知県名古屋市中区栄1-2-1)に発表 (47)平成29年(2017年)12月13日に国立大学法人名古屋大学が、株式会社毎日新聞社中部本社(愛知県名古屋市中村区名駅4-7-1)に発表 (48)平成29年(2017年)12月13日に国立大学法人名古屋大学が、株式会社日本経済新聞社名古屋支社(愛知県名古屋市中区栄4-16-33)に発表 (49)平成29年(2017年)12月15日に国立大学法人名古屋大学が、株式会社日本経済新聞社東京支社(東京都千代田区大手町1-3-7)に発表 (50)平成29年(2017年)12月13日に国立大学法人名古屋大学が、株式会社中日新聞名古屋本社 編集局社会部及び教育報道部(愛知県名古屋市中区三の丸一丁目6番1号)に発表
特許法第30条第2項適用申請有り (51)平成29年(2017年)12月13日に国立大学法人名古屋大学が、株式会社共同通信社名古屋支社(愛知県名古屋市中区三の丸1-6-1)に発表 (52)平成29年(2017年)12月13日に国立大学法人名古屋大学が、株式会社時事通信社名古屋支社(名古屋市中区錦2-2-13センタービル8F)に発表 (53)平成29年(2017年)12月13日に国立大学法人名古屋大学が、株式会社日刊工業新聞社名古屋支社(愛知県名古屋市東区泉2-21-28)に発表 (54)平成29年(2017年)12月13日に国立大学法人名古屋大学が、株式会社日刊工業新聞社本社(東京都中央区日本橋小網町14-1)に発表 (55)平成29年(2017年)12月13日に国立大学法人名古屋大学が、株式会社中部経済新聞(愛知県名古屋市中村区名駅4-4-10)に発表 (56)平成29年(2017年)12月13日に国立大学法人名古屋大学が、日本放送協会名古屋放送局(愛知県名古屋市東区東桜1-13-3)に発表 (57)平成29年(2017年)12月13日に国立大学法人名古屋大学が、中京テレビ放送株式会社(愛知県名古屋市中村区平池町四丁目60番地11)に発表 (58)平成29年(2017年)12月13日に国立大学法人名古屋大学が、中部日本放送株式会社(愛知県名古屋市中区新栄1-2-8)に発表 (59)平成29年(2017年)12月13日に国立大学法人名古屋大学が、テレビ愛知株式会社(愛知県名古屋市中区大須2-4-8)に発表 (60)平成29年(2017年)12月13日に国立大学法人名古屋大学が、東海テレビ放送株式会社(愛知県名古屋市東区東桜一丁目14番27号)に発表
特許法第30条第2項適用申請有り (61)平成29年(2017年)12月13日に国立大学法人名古屋大学が、名古屋テレビ放送株式会社(愛知県名古屋市中区橘2-10-1)に発表 (62)平成29年(2017年)12月13日に国立研究開発法人国立がん研究センターが、厚生労働記者会(東京都千代田区霞ヶ関1-2-2 中央合同庁舎第5号館9F)に発表 (63)平成29年(2017年)12月13日に国立研究開発法人国立がん研究センターが、厚生日比谷クラブ(東京都千代田区霞ヶ関1-2-2 中央合同庁舎第5号館19F)に発表 (64)平成29年(2017年)12月13日に国立研究開発法人日本医療研究開発機構が、株式会社メディカルトリビューン(東京都港区虎ノ門3-8-21 虎ノ門33森ビル7階)に発表 (65)平成29年(2017年)12月13日に国立研究開発法人日本医療研究開発機構が、株式会社産業経済新聞社(東京都千代田区大手町1丁目7番2号)に発表 (66)平成29年(2017年)12月13日に国立研究開発法人日本医療研究開発機構が、株式会社日経BP(東京都港区虎ノ門4丁目3番12号)に発表 (67)平成29年(2017年)12月13日に国立研究開発法人日本医療研究開発機構が、株式会社日本経済新聞社(東京都千代田区大手町1-3-7)に発表 (68)平成29年(2017年)12月13日に国立研究開発法人日本医療研究開発機構が、日本放送協会(東京都渋谷区神南2-2-1)に発表 (69)平成29年(2017年)12月13日に国立研究開発法人日本医療研究開発機構が、株式会社日刊工業新聞社(東京都中央区日本橋小網町14-1)に発表 (70)平成29年(2017年)12月13日に国立研究開発法人日本医療研究開発機構が、株式会社化学工業日報社(東京都中央区日本橋浜町3-16-8)に発表
特許法第30条第2項適用申請有り (71)平成29年(2017年)12月13日に国立研究開発法人日本医療研究開発機構が、株式会社朝日新聞社(東京都中央区築地5-3-2)に発表 (72)平成29年(2017年)12月13日に国立研究開発法人日本医療研究開発機構が、株式会社毎日新聞社(東京都千代田区一ツ橋1-1-1)に発表 (73)平成29年(2017年)12月13日に国立研究開発法人日本医療研究開発機構が、株式会社科学新聞社(東京都港区浜松町1-2-13 江口ビル別館)に発表 (74)平成29年(2017年)12月13日に国立研究開発法人日本医療研究開発機構が、株式会社共同通信社(東京都港区東新橋1-7-1汐留メディアタワー)に発表 (75)平成29年(2017年)12月13日に国立研究開発法人日本医療研究開発機構が、株式会社薬事ニュース社(東京都千代田区神田猿楽町2-2-3NSビル)に発表 (76)平成29年(2017年)12月13日に国立研究開発法人日本医療研究開発機構が、株式会社じほう(東京都千代田区神田猿楽町1丁目5番15号 猿楽町SSビル)に発表 (77)平成29年(2017年)12月13日に国立研究開発法人日本医療研究開発機構が、株式会社ジャパンタイムズ本社(東京都千代田区紀尾井町3-12 紀尾井町ビル14F)に発表 (78)平成29年(2017年)12月13日に国立研究開発法人日本医療研究開発機構が、株式会社ライフ・サイエンス(東京都千代田区神田錦町3-11-1 NMF竹橋ビル)に発表 (79)平成29年(2017年)12月13日に国立研究開発法人日本医療研究開発機構が、株式会社読売新聞東京本社(東京都千代田区大手町1-7-1)に発表 (80)平成29年(2017年)12月13日に国立研究開発法人日本医療研究開発機構が、株式会社日経BP(東京都港区虎ノ門4丁目3番12号)に発表
特許法第30条第2項適用申請有り (81)平成29年(2017年)12月13日に国立研究開発法人日本医療研究開発機構が、株式会社日本テレビ放送網株式会社(東京都港区東新橋一丁目6-1)に発表 (82)平成29年(2017年)12月13日に国立研究開発法人日本医療研究開発機構が、株式会社岩手日報社(岩手県盛岡市内丸3-7)に発表 (83)平成29年(2017年)12月13日に国立研究開発法人日本医療研究開発機構が、株式会社フジテレビジョン(東京都港区台場二丁目4番8号)に発表 (84)平成29年(2017年)12月13日に国立研究開発法人日本医療研究開発機構が、株式会社シルバー産業新聞社(大阪市中央区上汐2丁目6番13号 喜多ビル)に発表 (85)平成29年(2017年)12月13日に国立研究開発法人日本医療研究開発機構が、株式会社日本経済新聞社(東京都千代田区大手町1-3-7)に発表 (86)平成29年(2017年)12月13日に国立研究開発法人日本医療研究開発機構が、株式会社読売新聞東京本社(東京都千代田区大手町1-7-1)に発表 (87)平成29年(2017年)12月13日に国立研究開発法人日本医療研究開発機構が、株式会社時事通信社(東京都中央区銀座5-15-8)に発表 (88)平成29年(2017年)12月13日に国立研究開発法人日本医療研究開発機構が、株式会社TBSテレビ(東京都港区赤坂5丁目3番6号)に発表 (89)平成29年(2017年)12月13日に国立研究開発法人日本医療研究開発機構が、ブルームバーグ・エル・ピー(東京都千代田区丸ノ内2-4-1丸ノ内ビルディング)に発表 (90)平成29年(2017年)12月13日に国立研究開発法人日本医療研究開発機構が、株式会社中日新聞社(愛知県名古屋市中区三の丸一丁目6番1号)に発表
特許法第30条第2項適用申請有り (91)平成29年(2017年)12月13日に国立研究開発法人日本医療研究開発機構が、株式会社テレビ東京(東京都港区六本木3-2-1六本木グランドタワー)に発表 (92)平成29年(2017年)12月13日に国立研究開発法人日本医療研究開発機構が、エムスリー株式会社(東京都港区赤坂1丁目11番44号 赤坂インターシティ10階)に発表 (93)平成29年(2017年)12月25日にAlphaGalileo(Coppergate House 16 Brune Street London E1 7NJ,United Kingdom)のウェブサイト(https://www.alphagalileo.org/ViewItem.aspx?ItemId=182304&CultureCode=en)に掲載 (94)平成29年(2017年)12月25日にAsia Research News(c/o Lakin Rose,Vision Park Pioneer House,Cambridge,Cambridgeshire CB24 9NL United Kingdom)のウェブサイト(http://www.researchsea.com/html/article.php/aid/11329/cid/1/research//nagoya_university/development_of_a_nanowire_device_to_detect_cancer_with_a_urine_test.html)に掲載
特許法第30条第2項適用申請有り (95)平成29年(2017年)12月26日にEurekAlert! (The American Association for the Advancement of Science,1200 New York Ave.,NW Washington,DC 20005,USA)のウェブサイト(https://www.eurekalert.org/pub_releases/2017-12/nu-doa122517.php)に掲載 (96)平成30年(2018年)12月5日に2018年度第38回キャピラリー電気泳動シンポジウム(SCE2018)於:大阪府立大学I-Siteなんば(〒556-0012大阪市浪速区敷津東2丁目1番41号 南海なんば第1ビル2階・3階)にて公開 (97)平成30年(2018年)11月3日に49回中部化学関係学協会支部連合秋季大会 於:国立大学法人名古屋大学(愛知県名古屋市千種区不老町1番)にて公開 (98)平成30年(2018年)10月30日に化学とマイクロ・ナノシステム学会 第38回研究会(38th CHEMINAS) 於:札幌市民交流プラザ(〒060-0001 北海道札幌市中央区北1条西1丁目)にて公開 (99)平成30年(2018年)5月21日に化学とマイクロ・ナノシステム学会 第37回研究会(37 th CHEMINAS) 於:産業技術総合研究所つくばセンター 共用講堂(茨城県つくば市東1-1-1 つくば中央第5)にて公開 (100)平成30年(2018年)3月20日に日本化学会 第98春季年会(2018)於:日本大学理工学部 船橋キャンパス(千葉県船橋市習志野台7-24-1)にて公開
特許法第30条第2項適用申請有り (101)平成30年(2018年)10月22日に第7回ユーザーフォーラム報告会 於:国立研究開発法人国立がん研究センター(東京都中央区築地5-1-1)にて公開 (102)平成30年(2018年)9月13日に東北大学セミナー 於:国立大学法人東北大学青葉山キャンパス(宮城県仙台市青葉区荒巻字青葉6-6)にて公開 (103)平成30年(2018年)3月25日に日本薬学会第138年会 於:金沢市アートホール(石川県金沢市本町2丁目15-1)にて公開 (104)平成30年(2018年)3月17日に第65回応用物理学会春季学術講演会 於:学校法人早稲田大学西早稲田キャンパス(東京都新宿区大久保3-4-1)にて公開 (105)平成30年(2018年)7月18日~20日にInternational Conference on Science and Technology of Emerging Materials 2018 於:Holiday Inn Pattaya(463/68,463/99 Pattaya Sai 1 Road,Nongprue Banglamung,Pattaya Chonburi 20150 Thailand)にて公開
特許法第30条第2項適用申請有り (106)平成30年(2018年)3月30日に2018 International Conference on Smart Science 於:Hotel&Resorts KYOTO-MIYAZU(京都府宮津市 字田井小字岩本58)にて公開 (107)平成29年(2017年)12月20日に名古屋市立大若手イブニングセミナー 於:国立大学法人名古屋大学(愛知県名古屋市千種区不老町1)にて公開 (108)平成30年(2018年)2月14日にSpetial guest lecture 於:King Mongkut’s Institute of Technology Ladkrabang (Thanon Chalong Krung,Lat Krabang,Khet Lat Krabang,Krung Thep Maha Nakhon 10520,Thailand)にて公開 (109)平成30年(2018年)3月15日にバイオインダストリー協会 ヘルスケア研究会 於:一般社団法人バイオインダストリー協会(東京都中央区八丁堀2-26-9)にて公開 (110)平成30年(2018年)3月27日に平成29年度 第1回 次世代バイオナノ研究会 於:国立大学法人名古屋大学(愛知県名古屋市千種区不老町1)にて公開
特許法第30条第2項適用申請有り (111)平成30年(2018年)4月25日にJSPS 116 Committee Nanyang University of Science and Technology Joint Symposium 於:Nanyang Technological University(50 Nanyang Avenue,Singapore 639798)にて公開 (112)平成30年(2018年)5月30日に東京大学大学院理学研究科 集中講義 無機化学持論III 於:国立大学法人東京大学理学部化学本館4階講義室(東京都文京区本郷7-3-1)にて公開 (113)平成30年(2018年)5月31日に東京大学大学院理学研究科 第1739回 化学教室雑誌会セミナー 於:国立大学法人東京大学理学部化学本館4階講義室(東京都文京区本郷7-3-1)にて公開 (114)平成30年(2018年)6月12日に創造機能化学講演会 於:学士会館(東京都千代田区神田錦町3-28)にて公開 (115)平成30年(2018年)7月6日に平成30年度東日本分析若手交流会 於:花ごころの湯 新富亭(宮城県宮城郡松島町松島字垣ノ内38-1)にて公開 (116)平成30年(2018年)8月24日に日本臨床化学会第58回年次学術集会 於:名古屋国際会議場(愛知県名古屋市熱田区熱田西町1番1号)にて公開 (117)平成30年(2018年)8月29日に25th International Symposium on Electro-and Liquid Phase-Separation Techniques 於:国立大学法人京都大学(京都市西京区京都大学桂)にて公開 (118)平成30年(2018年)9月12日に日本分析化学会第67年会 於:国立大学法人東北大学川内北キャンパス(宮城県仙台市青葉区川内41)にて公開 (119)平成30年(2018年)10月5日に名古屋産業研究所75周年記念講演会 於:TKPガーデンシティ名古屋ルーセントタワー(愛知県名古屋市西区牛島町6-1)にて公開 (120)平成30年(2018年)10月22日に東京大学大学院工学研究科 化学生命工学専攻 集中講義 於:国立大学法人東京大学工学部5号館(東京都文京区本郷7-3-1)にて公開
特許法第30条第2項適用申請有り (121)平成30年(2018年)10月30日に第35回「センサ・マイクロマシンと応用システム」シンポジウム 於:札幌市民交流プラザ(北海道札幌市中央区北1条西1丁目)にて公開 (122)平成30年(2018年)11月6日にNorth Carolina NU Tech 10th Anniversary Symposium 於:North Carolina State University(Peele Hall 10 Watauga Club Drive Raleigh,NC 27695-7002)にて公開 (123)平成30年(2018年)11月14日にThe Twenty Second International Conference on Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences 於:Kaohsiung Exhibition Center(No.39,Chenggong 2nd Road,Qianzhen Dist.,Kaohsiung 806,Taiwan,ROC)にて公開 (124)平成30年(2018年)11月23日にThe 45th anniversary Celebration of the Diplomatic Establishment between Vietnam and Japan 於:Hanoi Medical University(No1.Ton That Tung Street,Dong Da District)にて公開 (125)平成30年(2018年)11月24日にThe 1st ASEAN-Japan International Conference on Innovative Biology,Medicine,and Engineering in Vietnam 於:Hanoi Medical University(No1.Ton That Tung Street,Dong Da District)にて公開
特許法第30条第2項適用申請有り (126)平成30年(2018年)11月30日に東京大学大学院工学系研究科 医工学概論 於:国立大学法人東京大学工学部5号館(東京都文京区本郷7-3-1)にて公開 (127)平成30年(2018年)8月19日に9th International Conference on Nanotechnology Fundamentals and Applications 於:Novotel Madrid Center(Calle de O’Donnell,53,28009,Madrid,Spain)にて公開 (128)平成29年(2017年)12月13日に株式会社日経BP(東京都港区虎ノ門4丁目3番12号)へ公開 (129)平成29年(2017年)12月13日に株式会社朝日新聞社(愛知県名古屋市中区栄1-3-3)へ公開 (130)平成29年(2017年)12月13日に株式会社朝日新聞社(東京都中央区築地5-3-2)へ公開
特許法第30条第2項適用申請有り (131)平成29年(2017年)12月13日に株式会社読売新聞東京本社(東京都千代田区大手町1-7-1)へ公開 (132)平成29年(2017年)12月13日に国立大学法人名古屋大学が、株式会社産業経済新聞社中部総局(愛知県名古屋市中村区名駅南2-14-19 住友生命名古屋ビル8階)に発表 (133)平成29年(2017年)12月13日に株式会社共同通信社(東京都港区東新橋1-7-1 汐留メディアタワー)へ公開 (134)平成29年(2017年)12月13日に国立大学法人九州大学が、株式会社福岡放送(福岡県福岡市中央区清川2丁目22番8号)に発表
本開示は、マイクロRNAを含む体液抽出物に関する。
エクソソーム、マイクロベシクル、およびアポトーシス小体などの細胞外小胞(以下、単に「EV」ということがある)(非特許文献1~4)の内部にマイクロRNA(miRNA)が含まれていることが、健常者および疾患患者を含む様々な体液において見出されている(非特許文献6~20)。ヒトの2群間でのEV内包miRNAの相違は、様々な疾患を警告するサインとなり得る(非特許文献20)。miRNAのEVへの内包はRNA分解に対するリボヌクレアーゼの効果を低減することができるという利点があると考えられ(非特許文献21)、EV中のmiRNAは、遊離した浮遊miRNAよりも安定であると考えられる。
これまで、EVの回収には、3つの手法:超遠心分離法または分画遠心法、免疫親和性に基づく捕捉、およびサイズ排除クロマトグラフィが用いられてきた(非特許文献4)。ポリマー沈殿法(非特許文献22)、マイクロ流体に基づくプラットフォーム(非特許文献23~26)、サイズに基づくろ過法(非特許文献27)などの期待できる代替法が報告されてきた。しかしながら、これらの現存するEV内包miRNAの回収方法は、とても低い濃度(<0.01体積%)でEVを含む尿からのEVの回収には十分ではなかった(非特許文献28)。例えば、超遠心法は尿のEVの回収のために最もよく用いられている方法であるが、超遠心法によって尿中に200~300種類のmiRNAが同定されている(非特許文献29~31)。ヒトmiRNAは2,000種類を超えるとされており、残りの90%が果たして尿に存在するのかしないのかが明らかではなかった。
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本開示は、マイクロRNAを含む体液抽出物を提供する。
本発明者らは、溶液中(特に尿のpH)において正の荷電を有するナノワイヤ(ナノロッド)と細胞外小胞(EV)を含む溶液とを接触させると、EVを効率的にナノワイヤ上に捕捉できることを見出した。本発明者らは、尿と当該ナノワイヤとを接触させることによって、尿中のEVおよびmiRNAを効果的に捕捉することができること、およびこれにより従来手法では抽出することができなかった種類のmiRNAを含む尿抽出物を得ることができることを見出した。
本開示はこのような知見に基づく。
本開示はこのような知見に基づく。
本開示によれば、以下の産業上利用可能な発明が提供され得る。
(1)データS1または表2に記載のいずれかのマイクロRNAを含む、尿の抽出物。
(2)細胞外小胞を含み、前記マイクロRNAが細胞外小胞に含まれる、または、前記マイクロRNAが細胞外小胞から抽出されている、上記(1)に記載の尿の抽出物。
(3)前記RNAが、遊離マイクロRNAの形態である、上記(1)に記載の尿の抽出物。
(4)マイクロRNAが、miR-3117-5p、miR-3118、miR-3121-3p、miR-3121-5p、miR-3126-5p、miR-3128、miR-3133、miR-3134、miR-3136-3p、miR-3136-5p、miR-3139、miR-3142、miR-3143、miR-3145-3p、miR-3163、miR-3166、miR-3167、miR-16-1-3p、miR-424-3p、miR-519c-5p、miR-525-5p、miR-551b-5p、miR-558、miR-921、miR-942-3p、miR-3126-3p、miR-3127-5p、miR-3129-5p、miR-3144-5p、miR-3150a-5p、miR-3152-5p、miR-3155a、miR-3157-3p、miR-3159、miR-3165、miR-3678-3p、miR-4321、miR-4521、miR-4800-3p、miR-4999-5p、miR-5096、miR-5187-5p、miR-6874-5p、miR-3127-3p、miR-3130-5p、miR-3131、miR-3141、miR-3150b-5p、miR-3151-3p、miR-3151-5p、miR-3154、miR-3160-3p、miR-3160-5p、miR-378a-5p、miR-520c-3p、miR-526b-3p、miR-3150a-3p、miR-3162-5p、及びmiR-4254からなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAである、上記(1)~(3)のいずれかに記載の尿の抽出物。
(5)マイクロRNAが、miR-3163、miR-16-1-3p、miR-424-3p、miR-558、miR-3127-5p、及びmiR-4521からなる群から選択される少なくとも1種のマイクロRNAまたは全てのマイクロRNAである、上記(1)~(4)のいずれかに記載の尿の抽出物。
(6)マイクロRNAが、miR-378a-5p、miR-520c-3p、及びmiR-526b-3pからなる群から選択される少なくとも1種のマイクロRNAまたは全てのマイクロRNAである、上記(1)~(4)のいずれかに記載の尿の抽出物。
(7)尿が、肺がんを有する対象の尿である、上記(1)~(6)のいずれかに記載の尿の抽出物。
(8)マイクロRNAが、let-7i-3p、miR-183-5p、miR-202-5p、miR-409-5p、miR-4661-5p、miR-4800-3p、miR-5587-5p、miR-372-3p、miR-378b、miR-520b、miR-1266-3p、miR-3605-5p、miR-3612、miR-4645-3p、miR-4694-3p、miR-4752、miR-6816-3p、miR-8087、let-7f-2-3p、miR-15a-3p、miR-20a-3p、miR-33b-3p、miR-34c-5p、miR-93-5p、miR-130a-5p、miR-135a-5p、miR-135b-5p、miR-185-5p、miR-203a-3p、miR-302d-5p、miR-337-3p、miR-378c、miR-422a、miR-449c-5p、miR-483-5p、miR-506-3p、miR-511-5p、miR-520c-3p、miR-654-3p、miR-668-5p、miR-670-5p、miR-671-3p、miR-744-3p、miR-1178-3p、miR-1254、miR-1284、miR-1323、miR-2116-5p、miR-2355-3p、miR-3132、miR-3138、miR-3164、miR-3186-3p、miR-3189-3p、miR-3198、miR-3200-5p、miR-3657、miR-3667-5p、miR-3680-5p、miR-3692-5p、miR-3713、miR-3921、miR-3936、miR-4273、miR-4299、miR-4306、miR-4316、miR-4319、miR-4421、miR-4429、miR-4435、miR-4441、miR-4473、miR-4506、miR-4633-5p、miR-4658、miR-4733-5p、miR-4733-3p、miR-5004-3p、miR-5194、miR-5197-5p、miR-5571-5p、miR-6083、miR-6717-5p、miR-6720-5p、miR-6767-3p、miR-6781-3p、miR-6811-3p、miR-6821-3p、miR-6828-5p、miR-6832-5p、miR-6837-3p、miR-6841-5p、miR-6853-5p、miR-6871-3p、miR-6875-5p、miR-6878-5p、miR-7112-3p、miR-7703、miR-7848-3p、及びmiR-7856-5pからなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAである、上記(1)~(3)のいずれかに記載の尿の抽出物。
(9)マイクロRNAが、miR-183-5p、miR-202-5p、及びmiR-409-5pからなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAである、上記(8)に記載の尿の抽出物。
(10)マイクロRNAが、miR-372-3p、miR-520b、miR-15a-3p、miR-34c-5p、miR-135a-5p、miR-185-5p、miR-337-3p、miR-422a、miR-506-3p、miR-520c-3p、miR-1284、miR-1323、及びmiR-4273からなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAである、上記(8)に記載の尿の抽出物。
(11)尿が、膵がんを有する対象の尿である、上記(8)~(10)のいずれかに記載の尿の抽出物。
(12)マイクロRNAが、miR-4521、let-7c-3p、let-7i-5p、miR-16-1-3p、miR-26a-1-3p、miR-28-5p、miR-105-5p、miR-195-3p、miR-200b-5p、miR-219a-2-3p、miR-297、miR-300、miR-330-3p、miR-374b-5p、miR-431-5p、miR-454-5p、miR-513c-5p、miR-548ax、miR-593-5p、miR-623、miR-664a-5p、miR-942-3p、miR-1205、miR-1276、miR-1288-3p、miR-1297、miR-3678-3p、miR-4283、miR-4295、miR-4439、miR-4524b-5p、miR-4703-3p、miR-4768-5p、miR-4800-3p、miR-5187-5p、miR-5696、miR-7161-5p、let-7i-2-3p、及びmiR-520c-3pからなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAである、上記(1)~(3)のいずれかに記載の尿の抽出物。
(13)マイクロRNAが、miR-16-1-3p、miR-28-5p、miR-297、miR-300、miR-330-3p、miR-454-5p、miR-1297、及びmiR-4295からなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAである、上記(12)に記載の尿の抽出物。
(14)マイクロRNAが、miR-520c-3pである、上記(12)に記載の尿の抽出物。
(15)尿が、肝がんを有する対象の尿である、上記(12)~(14)のいずれかに記載の尿の抽出物。
(16)マイクロRNAが、miR-16-1-3p、miR-23b-3p、miR-28-5p、miR-92a-2-5p、miR-142-3p、miR-195-3p、miR-196b-5p、miR-299-3p、miR-492、miR-513b-5p、miR-601、miR-619-5p、miR-1285-3p、miR-3155a、miR-3162-5p、miR-3678-3p、miR-4283、miR-4295、miR-4311、miR-4531、miR-5096、miR-5187-5p、let-7f-2-3p、miR-520c-3p、及びmiR-4783-5pからなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAである、上記(1)~(3)のいずれかに記載の尿の抽出物。
(17)マイクロRNAが、miR-16-1-3p、miR-23b-3p、miR-28-5p、miR-142-3p、miR-195-3p、miR-299-3p、及びmiR-4295からなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAである、上記(16)に記載の尿の抽出物。
(18)マイクロRNAが、miR-520c-3pである、上記(16)に記載の尿の抽出物。
(19)尿が、膀胱がんを有する対象の尿である、上記(16)~(18)のいずれかに記載の尿の抽出物。
(20)マイクロRNAが、miR-4531、miR-28-5p、miR-103a-2-5p、miR-105-5p、miR-124-3p、miR-151a-5p、miR-151b、miR-200a-5p、miR-300、miR-424-3p、miR-519c-5p、miR-551b-5p、miR-617、miR-873-3p、miR-921、miR-1288-3p、miR-3124-5p、miR-3155a、miR-3917、miR-4283、miR-4727-3p、miR-5096、miR-5187-5p、miR-6074、miR-6874-5p、miR-6892-5p、miR-15a-3p、miR-135b-5p、miR-520c-3p、miR-4783-5p、及びmiR-7849-3pからなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAである、上記(1)~(3)のいずれかに記載の尿の抽出物。
(21)マイクロRNAが、miR-28-5p、miR-105-5p、miR-124-3p、miR-151a-5p、及びmiR-300からなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAである、上記(20)に記載の尿の抽出物。
(22)マイクロRNAが、miR-15a-3p及びmiR-520c-3pからなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAである、上記(20)に記載の尿の抽出物。
(23)尿が、前立腺がんを有する対象の尿である、上記(20)~(22)のいずれかに記載の尿の抽出物。
(24)尿が、健常者の尿である、上記(1)~(6)、(8)~(10)、(12)~(14)、(16~(18)、及び(20)~(22)のいずれかに記載の尿の抽出物。
(25)対象ががんである可能性を検査する方法であって、
以下(a)~(e)からなる群から選択される1以上を含む、方法:
(a)対象から得られる尿または尿の抽出物においてmiR-3163、miR-16-1-3p、miR-424-3p、miR-558、miR-3127-5p、及びmiR-4521からなる群から選択される少なくとも1種のマイクロRNAまたは全てのマイクロRNAを検出すること、ここで、マイクロRNAの量が所定の値よりも高い場合には、対象が肺がんである可能性があることを示す;
(b)対象から得られる尿または尿の抽出物において、miR-183-5p、miR-202-5p、及びmiR-409-5pからなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAを検出すること、ここで、マイクロRNAの量が所定の値よりも高い場合には、対象が膵がんである可能性があることを示す;
(c)対象から得られる尿または尿の抽出物において、miR-16-1-3p、miR-28-5p、miR-297、miR-300、miR-330-3p、miR-454-5p、miR-1297、及びmiR-4295からなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAを検出すること、ここで、マイクロRNAの量が所定の値よりも高い場合には、対象が肝がんである可能性があることを示す;
(d)対象から得られる尿または尿の抽出物において、、miR-16-1-3p、miR-23b-3p、miR-28-5p、miR-142-3p、miR-195-3p、miR-299-3p、及びmiR-4295からなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAを検出すること、ここで、マイクロRNAの量が所定の値よりも高い場合には、対象が膀胱がんである可能性があることを示す;
(e)対象から得られる尿または尿の抽出物においてmiR-28-5p、miR-105-5p、miR-124-3p、miR-151a-5p、及びmiR-300からなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAを検出すること、ここで、マイクロRNAの量が所定の値よりも高い場合には、対象が前立腺がんである可能性があることを示す。
(26)上記(25)に記載の方法であって、
(A)~(E)からなる群から選択される1以上を含む、方法:
(A)前記(a)において対象から得られる尿または尿の抽出物において、miR-378a-5p、miR-520c-3p、及びmiR-526b-3pからなる群から選択される少なくとも1種のマイクロRNAまたは全てのマイクロRNAをさらに検出することと、ここで、マイクロRNAの量が所定の値よりも低い場合には、対象が肺がんである可能性があることを示す;
(B)前記(b)において対象から得られる尿または尿の抽出物において、miR-372-3p、miR-520b、miR-15a-3p、miR-34c-5p、miR-135a-5p、miR-185-5p、miR-337-3p、miR-422a、miR-506-3p、miR-520c-3p、miR-1284、miR-1323、及びmiR-4273からなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAをさらに検出することと、ここで、マイクロRNAの量が所定の値よりも低い場合には、対象が膵がんである可能性があることを示す;
(C)前記(c)において対象から得られる尿または尿の抽出物において、miR-520c-3pをさらに検出することと、ここで、マイクロRNAの量が所定の値よりも低い場合には、対象が肝がんである可能性があることを示す;
(D)前記(d)において対象から得られる尿または尿の抽出物において、miR-520c-3pをさらに検出することと、ここで、マイクロRNAの量が所定の値よりも低い場合には、対象が膀胱がんである可能性があることを示す;
(E)前記(e)において対象から得られる尿または尿の抽出物において、miR-15a-3p及びmiR-520c-3pからなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAをさらに検出することと、ここで、マイクロRNAの量が所定の値よりも低い場合には、対象が前立腺がんである可能性があることを示す。
(27)ナノワイヤと尿とを接触させ、前記ナノワイヤに結合した構成成分を抽出して得られる、尿の抽出物。
(27a)ナノワイヤと接触させる尿のpHは、2、3、4、または5を下限値とし、11、10、9、8、7、6、または5を上限値とする数値範囲である、上記(27)に記載の尿の抽出物。
(27b)ナノワイヤが、金属酸化物のナノワイヤであるか、または、金属酸化物で表面が被覆されたナノワイヤである、上記(27)または(27a)に記載の尿の抽出物。
(27c)金属酸化物が、遷移金属の酸化物である、上記(27b)に記載の尿の抽出物。
(27d)ナノワイヤが、酸化亜鉛のナノワイヤであるか、または、酸化亜鉛で表現が被覆されたナノワイヤである、上記(27)、(27a)、(27b)または(27c)に記載の尿の抽出物。
(27e)ナノワイヤと尿とを、中性のpH条件下で接触させる、上記(27)、(27a)、(27b)、(27c)、(27d)または(27e)に記載の尿の抽出物。
(28)データS1または表2に記載のいずれかのマイクロRNAを含む、上記(27)に記載の尿の抽出物。
(29)尿中に含まれる細胞外小胞の20%以上の小胞を含む、上記(27)、(27a)、(27b)、(27c)、(27d)または(27e)に記載の尿の抽出物。
(29’)尿中に含まれる細胞外小胞の25%以上の小胞を含む、上記(27)、(27a)、(27b)、(27c)、(27d)または(27e)に記載の尿の抽出物。
(29a)尿中に含まれる細胞外小胞の30%以上の小胞を含む、上記(27)、(27a)、(27b)、(27c)、(27d)または(27e)に記載の尿の抽出物。
(29a’)尿中に含まれる細胞外小胞の35%以上の小胞を含む、上記(27)、(27a)、(27b)、(27c)、(27d)または(27e)に記載の尿の抽出物。
(29b)尿中に含まれる細胞外小胞の40%以上の小胞を含む、上記(27)、(27a)、(27b)、(27c)、(27d)または(27e)に記載の尿の抽出物。
(29b’)尿中に含まれる細胞外小胞の45%以上の小胞を含む、上記(27)、(27a)、(27b)、(27c)、(27d)または(27e)に記載の尿の抽出物。
(29c)尿中に含まれる細胞外小胞の50%以上の小胞を含む、上記(27)、(27a)、(27b)、(27c)、(27d)または(27e)に記載の尿の抽出物。
(29c’)尿中に含まれる細胞外小胞の55%以上の小胞を含む、上記(27)、(27a)、(27b)、(27c)、(27d)または(27e)に記載の尿の抽出物。
(29d)尿中に含まれる細胞外小胞の60%以上の小胞を含む、上記(27)、(27a)、(27b)、(27c)、(27d)または(27e)に記載の尿の抽出物。
(29d’)尿中に含まれる細胞外小胞の65%以上の小胞を含む、上記(27)、(27a)、(27b)、(27c)、(27d)または(27e)に記載の尿の抽出物。
(29e)尿中に含まれる細胞外小胞の70%以上の小胞を含む、上記(27)、(27a)、(27b)、(27c)、(27d)または(27e)に記載の尿の抽出物。
(29e’)尿中に含まれる細胞外小胞の75%以上の小胞を含む、上記(27)、(27a)、(27b)、(27c)、(27d)または(27e)に記載の尿の抽出物。
(29f)尿中に含まれる細胞外小胞の80%以上の小胞を含む、上記(27)、(27a)、(27b)、(27c)、(27d)または(27e)に記載の尿の抽出物。
(29f’)尿中に含まれる細胞外小胞の85%以上の小胞を含む、上記(27)、(27a)、(27b)、(27c)、(27d)または(27e)に記載の尿の抽出物。
(29g)尿中に含まれる細胞外小胞の90%以上の小胞を含む、上記(27)、(27a)、(27b)、(27c)、(27d)または(27e)に記載の尿の抽出物。
(29h)尿中に含まれる細胞外小胞の95%以上の小胞を含む、上記(27)、(27a)、(27b)、(27c)、(27d)または(27e)に記載の尿の抽出物。
(29i)尿中に含まれる細胞外小胞の97%以上の小胞を含む、上記(27)、(27a)、(27b)、(27c)、(27d)または(27e)に記載の尿の抽出物。
(29j)尿中に含まれる細胞外小胞の99%以上の小胞を含む、上記(27)、(27a)、(27b)、(27c)、(27d)または(27e)に記載の尿の抽出物。
(30)濃縮された前記マイクロRNAを含む、上記(1)に記載の尿の抽出物。
(31)尿中に存在するマイクロRNAを500種類以上含む、尿の抽出物。
(31A)尿中に存在するマイクロRNAを500種類以上含む、上記(1)または(31)に記載の尿の抽出物。
(1)データS1または表2に記載のいずれかのマイクロRNAを含む、尿の抽出物。
(2)細胞外小胞を含み、前記マイクロRNAが細胞外小胞に含まれる、または、前記マイクロRNAが細胞外小胞から抽出されている、上記(1)に記載の尿の抽出物。
(3)前記RNAが、遊離マイクロRNAの形態である、上記(1)に記載の尿の抽出物。
(4)マイクロRNAが、miR-3117-5p、miR-3118、miR-3121-3p、miR-3121-5p、miR-3126-5p、miR-3128、miR-3133、miR-3134、miR-3136-3p、miR-3136-5p、miR-3139、miR-3142、miR-3143、miR-3145-3p、miR-3163、miR-3166、miR-3167、miR-16-1-3p、miR-424-3p、miR-519c-5p、miR-525-5p、miR-551b-5p、miR-558、miR-921、miR-942-3p、miR-3126-3p、miR-3127-5p、miR-3129-5p、miR-3144-5p、miR-3150a-5p、miR-3152-5p、miR-3155a、miR-3157-3p、miR-3159、miR-3165、miR-3678-3p、miR-4321、miR-4521、miR-4800-3p、miR-4999-5p、miR-5096、miR-5187-5p、miR-6874-5p、miR-3127-3p、miR-3130-5p、miR-3131、miR-3141、miR-3150b-5p、miR-3151-3p、miR-3151-5p、miR-3154、miR-3160-3p、miR-3160-5p、miR-378a-5p、miR-520c-3p、miR-526b-3p、miR-3150a-3p、miR-3162-5p、及びmiR-4254からなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAである、上記(1)~(3)のいずれかに記載の尿の抽出物。
(5)マイクロRNAが、miR-3163、miR-16-1-3p、miR-424-3p、miR-558、miR-3127-5p、及びmiR-4521からなる群から選択される少なくとも1種のマイクロRNAまたは全てのマイクロRNAである、上記(1)~(4)のいずれかに記載の尿の抽出物。
(6)マイクロRNAが、miR-378a-5p、miR-520c-3p、及びmiR-526b-3pからなる群から選択される少なくとも1種のマイクロRNAまたは全てのマイクロRNAである、上記(1)~(4)のいずれかに記載の尿の抽出物。
(7)尿が、肺がんを有する対象の尿である、上記(1)~(6)のいずれかに記載の尿の抽出物。
(8)マイクロRNAが、let-7i-3p、miR-183-5p、miR-202-5p、miR-409-5p、miR-4661-5p、miR-4800-3p、miR-5587-5p、miR-372-3p、miR-378b、miR-520b、miR-1266-3p、miR-3605-5p、miR-3612、miR-4645-3p、miR-4694-3p、miR-4752、miR-6816-3p、miR-8087、let-7f-2-3p、miR-15a-3p、miR-20a-3p、miR-33b-3p、miR-34c-5p、miR-93-5p、miR-130a-5p、miR-135a-5p、miR-135b-5p、miR-185-5p、miR-203a-3p、miR-302d-5p、miR-337-3p、miR-378c、miR-422a、miR-449c-5p、miR-483-5p、miR-506-3p、miR-511-5p、miR-520c-3p、miR-654-3p、miR-668-5p、miR-670-5p、miR-671-3p、miR-744-3p、miR-1178-3p、miR-1254、miR-1284、miR-1323、miR-2116-5p、miR-2355-3p、miR-3132、miR-3138、miR-3164、miR-3186-3p、miR-3189-3p、miR-3198、miR-3200-5p、miR-3657、miR-3667-5p、miR-3680-5p、miR-3692-5p、miR-3713、miR-3921、miR-3936、miR-4273、miR-4299、miR-4306、miR-4316、miR-4319、miR-4421、miR-4429、miR-4435、miR-4441、miR-4473、miR-4506、miR-4633-5p、miR-4658、miR-4733-5p、miR-4733-3p、miR-5004-3p、miR-5194、miR-5197-5p、miR-5571-5p、miR-6083、miR-6717-5p、miR-6720-5p、miR-6767-3p、miR-6781-3p、miR-6811-3p、miR-6821-3p、miR-6828-5p、miR-6832-5p、miR-6837-3p、miR-6841-5p、miR-6853-5p、miR-6871-3p、miR-6875-5p、miR-6878-5p、miR-7112-3p、miR-7703、miR-7848-3p、及びmiR-7856-5pからなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAである、上記(1)~(3)のいずれかに記載の尿の抽出物。
(9)マイクロRNAが、miR-183-5p、miR-202-5p、及びmiR-409-5pからなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAである、上記(8)に記載の尿の抽出物。
(10)マイクロRNAが、miR-372-3p、miR-520b、miR-15a-3p、miR-34c-5p、miR-135a-5p、miR-185-5p、miR-337-3p、miR-422a、miR-506-3p、miR-520c-3p、miR-1284、miR-1323、及びmiR-4273からなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAである、上記(8)に記載の尿の抽出物。
(11)尿が、膵がんを有する対象の尿である、上記(8)~(10)のいずれかに記載の尿の抽出物。
(12)マイクロRNAが、miR-4521、let-7c-3p、let-7i-5p、miR-16-1-3p、miR-26a-1-3p、miR-28-5p、miR-105-5p、miR-195-3p、miR-200b-5p、miR-219a-2-3p、miR-297、miR-300、miR-330-3p、miR-374b-5p、miR-431-5p、miR-454-5p、miR-513c-5p、miR-548ax、miR-593-5p、miR-623、miR-664a-5p、miR-942-3p、miR-1205、miR-1276、miR-1288-3p、miR-1297、miR-3678-3p、miR-4283、miR-4295、miR-4439、miR-4524b-5p、miR-4703-3p、miR-4768-5p、miR-4800-3p、miR-5187-5p、miR-5696、miR-7161-5p、let-7i-2-3p、及びmiR-520c-3pからなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAである、上記(1)~(3)のいずれかに記載の尿の抽出物。
(13)マイクロRNAが、miR-16-1-3p、miR-28-5p、miR-297、miR-300、miR-330-3p、miR-454-5p、miR-1297、及びmiR-4295からなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAである、上記(12)に記載の尿の抽出物。
(14)マイクロRNAが、miR-520c-3pである、上記(12)に記載の尿の抽出物。
(15)尿が、肝がんを有する対象の尿である、上記(12)~(14)のいずれかに記載の尿の抽出物。
(16)マイクロRNAが、miR-16-1-3p、miR-23b-3p、miR-28-5p、miR-92a-2-5p、miR-142-3p、miR-195-3p、miR-196b-5p、miR-299-3p、miR-492、miR-513b-5p、miR-601、miR-619-5p、miR-1285-3p、miR-3155a、miR-3162-5p、miR-3678-3p、miR-4283、miR-4295、miR-4311、miR-4531、miR-5096、miR-5187-5p、let-7f-2-3p、miR-520c-3p、及びmiR-4783-5pからなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAである、上記(1)~(3)のいずれかに記載の尿の抽出物。
(17)マイクロRNAが、miR-16-1-3p、miR-23b-3p、miR-28-5p、miR-142-3p、miR-195-3p、miR-299-3p、及びmiR-4295からなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAである、上記(16)に記載の尿の抽出物。
(18)マイクロRNAが、miR-520c-3pである、上記(16)に記載の尿の抽出物。
(19)尿が、膀胱がんを有する対象の尿である、上記(16)~(18)のいずれかに記載の尿の抽出物。
(20)マイクロRNAが、miR-4531、miR-28-5p、miR-103a-2-5p、miR-105-5p、miR-124-3p、miR-151a-5p、miR-151b、miR-200a-5p、miR-300、miR-424-3p、miR-519c-5p、miR-551b-5p、miR-617、miR-873-3p、miR-921、miR-1288-3p、miR-3124-5p、miR-3155a、miR-3917、miR-4283、miR-4727-3p、miR-5096、miR-5187-5p、miR-6074、miR-6874-5p、miR-6892-5p、miR-15a-3p、miR-135b-5p、miR-520c-3p、miR-4783-5p、及びmiR-7849-3pからなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAである、上記(1)~(3)のいずれかに記載の尿の抽出物。
(21)マイクロRNAが、miR-28-5p、miR-105-5p、miR-124-3p、miR-151a-5p、及びmiR-300からなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAである、上記(20)に記載の尿の抽出物。
(22)マイクロRNAが、miR-15a-3p及びmiR-520c-3pからなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAである、上記(20)に記載の尿の抽出物。
(23)尿が、前立腺がんを有する対象の尿である、上記(20)~(22)のいずれかに記載の尿の抽出物。
(24)尿が、健常者の尿である、上記(1)~(6)、(8)~(10)、(12)~(14)、(16~(18)、及び(20)~(22)のいずれかに記載の尿の抽出物。
(25)対象ががんである可能性を検査する方法であって、
以下(a)~(e)からなる群から選択される1以上を含む、方法:
(a)対象から得られる尿または尿の抽出物においてmiR-3163、miR-16-1-3p、miR-424-3p、miR-558、miR-3127-5p、及びmiR-4521からなる群から選択される少なくとも1種のマイクロRNAまたは全てのマイクロRNAを検出すること、ここで、マイクロRNAの量が所定の値よりも高い場合には、対象が肺がんである可能性があることを示す;
(b)対象から得られる尿または尿の抽出物において、miR-183-5p、miR-202-5p、及びmiR-409-5pからなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAを検出すること、ここで、マイクロRNAの量が所定の値よりも高い場合には、対象が膵がんである可能性があることを示す;
(c)対象から得られる尿または尿の抽出物において、miR-16-1-3p、miR-28-5p、miR-297、miR-300、miR-330-3p、miR-454-5p、miR-1297、及びmiR-4295からなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAを検出すること、ここで、マイクロRNAの量が所定の値よりも高い場合には、対象が肝がんである可能性があることを示す;
(d)対象から得られる尿または尿の抽出物において、、miR-16-1-3p、miR-23b-3p、miR-28-5p、miR-142-3p、miR-195-3p、miR-299-3p、及びmiR-4295からなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAを検出すること、ここで、マイクロRNAの量が所定の値よりも高い場合には、対象が膀胱がんである可能性があることを示す;
(e)対象から得られる尿または尿の抽出物においてmiR-28-5p、miR-105-5p、miR-124-3p、miR-151a-5p、及びmiR-300からなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAを検出すること、ここで、マイクロRNAの量が所定の値よりも高い場合には、対象が前立腺がんである可能性があることを示す。
(26)上記(25)に記載の方法であって、
(A)~(E)からなる群から選択される1以上を含む、方法:
(A)前記(a)において対象から得られる尿または尿の抽出物において、miR-378a-5p、miR-520c-3p、及びmiR-526b-3pからなる群から選択される少なくとも1種のマイクロRNAまたは全てのマイクロRNAをさらに検出することと、ここで、マイクロRNAの量が所定の値よりも低い場合には、対象が肺がんである可能性があることを示す;
(B)前記(b)において対象から得られる尿または尿の抽出物において、miR-372-3p、miR-520b、miR-15a-3p、miR-34c-5p、miR-135a-5p、miR-185-5p、miR-337-3p、miR-422a、miR-506-3p、miR-520c-3p、miR-1284、miR-1323、及びmiR-4273からなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAをさらに検出することと、ここで、マイクロRNAの量が所定の値よりも低い場合には、対象が膵がんである可能性があることを示す;
(C)前記(c)において対象から得られる尿または尿の抽出物において、miR-520c-3pをさらに検出することと、ここで、マイクロRNAの量が所定の値よりも低い場合には、対象が肝がんである可能性があることを示す;
(D)前記(d)において対象から得られる尿または尿の抽出物において、miR-520c-3pをさらに検出することと、ここで、マイクロRNAの量が所定の値よりも低い場合には、対象が膀胱がんである可能性があることを示す;
(E)前記(e)において対象から得られる尿または尿の抽出物において、miR-15a-3p及びmiR-520c-3pからなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAをさらに検出することと、ここで、マイクロRNAの量が所定の値よりも低い場合には、対象が前立腺がんである可能性があることを示す。
(27)ナノワイヤと尿とを接触させ、前記ナノワイヤに結合した構成成分を抽出して得られる、尿の抽出物。
(27a)ナノワイヤと接触させる尿のpHは、2、3、4、または5を下限値とし、11、10、9、8、7、6、または5を上限値とする数値範囲である、上記(27)に記載の尿の抽出物。
(27b)ナノワイヤが、金属酸化物のナノワイヤであるか、または、金属酸化物で表面が被覆されたナノワイヤである、上記(27)または(27a)に記載の尿の抽出物。
(27c)金属酸化物が、遷移金属の酸化物である、上記(27b)に記載の尿の抽出物。
(27d)ナノワイヤが、酸化亜鉛のナノワイヤであるか、または、酸化亜鉛で表現が被覆されたナノワイヤである、上記(27)、(27a)、(27b)または(27c)に記載の尿の抽出物。
(27e)ナノワイヤと尿とを、中性のpH条件下で接触させる、上記(27)、(27a)、(27b)、(27c)、(27d)または(27e)に記載の尿の抽出物。
(28)データS1または表2に記載のいずれかのマイクロRNAを含む、上記(27)に記載の尿の抽出物。
(29)尿中に含まれる細胞外小胞の20%以上の小胞を含む、上記(27)、(27a)、(27b)、(27c)、(27d)または(27e)に記載の尿の抽出物。
(29’)尿中に含まれる細胞外小胞の25%以上の小胞を含む、上記(27)、(27a)、(27b)、(27c)、(27d)または(27e)に記載の尿の抽出物。
(29a)尿中に含まれる細胞外小胞の30%以上の小胞を含む、上記(27)、(27a)、(27b)、(27c)、(27d)または(27e)に記載の尿の抽出物。
(29a’)尿中に含まれる細胞外小胞の35%以上の小胞を含む、上記(27)、(27a)、(27b)、(27c)、(27d)または(27e)に記載の尿の抽出物。
(29b)尿中に含まれる細胞外小胞の40%以上の小胞を含む、上記(27)、(27a)、(27b)、(27c)、(27d)または(27e)に記載の尿の抽出物。
(29b’)尿中に含まれる細胞外小胞の45%以上の小胞を含む、上記(27)、(27a)、(27b)、(27c)、(27d)または(27e)に記載の尿の抽出物。
(29c)尿中に含まれる細胞外小胞の50%以上の小胞を含む、上記(27)、(27a)、(27b)、(27c)、(27d)または(27e)に記載の尿の抽出物。
(29c’)尿中に含まれる細胞外小胞の55%以上の小胞を含む、上記(27)、(27a)、(27b)、(27c)、(27d)または(27e)に記載の尿の抽出物。
(29d)尿中に含まれる細胞外小胞の60%以上の小胞を含む、上記(27)、(27a)、(27b)、(27c)、(27d)または(27e)に記載の尿の抽出物。
(29d’)尿中に含まれる細胞外小胞の65%以上の小胞を含む、上記(27)、(27a)、(27b)、(27c)、(27d)または(27e)に記載の尿の抽出物。
(29e)尿中に含まれる細胞外小胞の70%以上の小胞を含む、上記(27)、(27a)、(27b)、(27c)、(27d)または(27e)に記載の尿の抽出物。
(29e’)尿中に含まれる細胞外小胞の75%以上の小胞を含む、上記(27)、(27a)、(27b)、(27c)、(27d)または(27e)に記載の尿の抽出物。
(29f)尿中に含まれる細胞外小胞の80%以上の小胞を含む、上記(27)、(27a)、(27b)、(27c)、(27d)または(27e)に記載の尿の抽出物。
(29f’)尿中に含まれる細胞外小胞の85%以上の小胞を含む、上記(27)、(27a)、(27b)、(27c)、(27d)または(27e)に記載の尿の抽出物。
(29g)尿中に含まれる細胞外小胞の90%以上の小胞を含む、上記(27)、(27a)、(27b)、(27c)、(27d)または(27e)に記載の尿の抽出物。
(29h)尿中に含まれる細胞外小胞の95%以上の小胞を含む、上記(27)、(27a)、(27b)、(27c)、(27d)または(27e)に記載の尿の抽出物。
(29i)尿中に含まれる細胞外小胞の97%以上の小胞を含む、上記(27)、(27a)、(27b)、(27c)、(27d)または(27e)に記載の尿の抽出物。
(29j)尿中に含まれる細胞外小胞の99%以上の小胞を含む、上記(27)、(27a)、(27b)、(27c)、(27d)または(27e)に記載の尿の抽出物。
(30)濃縮された前記マイクロRNAを含む、上記(1)に記載の尿の抽出物。
(31)尿中に存在するマイクロRNAを500種類以上含む、尿の抽出物。
(31A)尿中に存在するマイクロRNAを500種類以上含む、上記(1)または(31)に記載の尿の抽出物。
本明細書では「対象」とは、尿検査の被検者を意味する。対象は、動物であり得る。対象は、爬虫類、哺乳類、両生類であってもよい。哺乳類はイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ハムスター、ネズミ、リス、およびサル、ゴリラ、チンパンジー、ボノボ、ヒトなどの霊長類であってもよい。
本明細書では、「尿」とは、腎臓により生産される液体状の排泄物を意味する。尿は、尿道を介して対外に排出されたもの、及び膀胱内で蓄積されたもののいずれであってもよい。尿は、体内から注射器などの抽出器を用いて抽出又は収集・採集されてもよい。本明細書では、尿は、特に限定されないが例えば、爬虫類、哺乳類、両生類の尿であってもよい。哺乳類はイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ハムスター、ネズミ、リス、およびサル、ゴリラ、チンパンジー、ボノボ、ヒトなどの霊長類であってもよい。「尿」は、健常対象の尿であってもよいし、特定の疾患(例えば、肺がん、肝臓がん、すい臓がん、膀胱がん、および前立腺がんなどのがんから選択されるがんなど)の対象の尿であってもよいし、特定の疾患に罹患している疑いのある対象の尿であってもよい。「尿」は、原液のままで使用されてもよく、または、原液を希釈若しくは濃縮された液体であってもよい。「尿」は、尿検体に添加剤を加えたものであってもよい。添加剤は例えば、安定化剤やpH調整剤を加えたものでであってもあってもよい。「尿」は、凍結状態の尿であってもよい。
本明細書では、「マイクロRNA」(「miRNA」ともいう)とは、タンパク質をコードしないと考えられているノンコーディングRNA(ncRNA)の一種である。マイクロRNAは、その前駆体からプロセッシングを受けて成熟体となる。成熟体となったマイクロRNAは、20~25塩基程度の長さを有することが知られている。ヒトのマイクロRNAは、hsaの名称が付される。前駆体は、mirが付され、成熟体にはmiRが付される。同定された順番に番号が付与されており、類似した配列に関しては、番号の後ろに小文字のアルファベットが付記される。ある前駆体の5’末端に由来するものと3’末端に由来するものとが存在する場合には、5’末端に由来するマイクロRNAには5pが付され、3’末端に由来するものには3pが付される。そして、これらの記号および数字はハイフンによって連結される。成熟したマイクロRNAは、二本鎖であり得る。
本明細書では、「細胞外小胞」(「EV」ともいう)は、細胞から放出される小胞であり、アポトーシスの過程で細胞から放出されるもの、および健康な細胞から放出されるものが挙げられる。細胞外小胞は、大きさおよび表面マーカーによって、エクソソーム(exosome)、マイクロベシクル(micro vesicle;MV)、およびアポトーシス小体(apoptosis body)に大別される。エクソソームは、通常、40~120nmの直径を有し、Alix、Tsg101、CD9、CD63、CD81、及びフロチリンからなる群から選択される1以上または全ての分子を発現し得る。マイクロベシクルは、通常、50~1,000nmの直径を有し、インテグリン、セレクチン、及びCD40からなる群から選択される1以上または全ての分子を発現し得る。アポトーシス小体は、通常、500~2,000nmの直径を有し、アネキシンVおよびホスファチジルセリンからなる群から選択される1以上の分子を発現し得る。エクソソームには、タンパク質や核酸(例えば、mRNA、miRNA、ncRNA)が含まれ得る。マイクロベシクルには、タンパク質や核酸(例えば、mRNA、miRNA、ncRNA)が含まれ得る。アポトーシス小体には、断片化された核やオルガネラが含まれると考えられている。
本明細書では、「抽出物」とは、抽出された物であって、かつ、特定の成分が抽出前よりも濃縮されている物を意味する。本明細書では、「尿の抽出物」とは、尿から抽出された物であって、特定の成分(特にマイクロRNA)が抽出前の尿におけるよりも濃縮されている物を意味する。尿の抽出物は、水溶液(溶液または懸濁液)であり得、または、それらを乾燥して得られる固形物であり得る。尿の抽出物において、尿中の細胞外小胞および核酸以外の構成成分が実質的に除去された抽出物は、尿の精製物とも呼ばれることがある。尿の抽出物は、界面活性剤(好ましくは非イオン性界面活性剤)を含んでいてもよい。尿の抽出物は、界面活性剤と細胞外小胞(例えば、エクソソームおよび/またはマイクロベシクル)の破片(debris)を含んでいてもよい。尿の抽出物は、界面活性剤と細胞外小胞(例えば、エクソソームおよび/またはマイクロベシクル)の破片(debris)からなる群から選択される1以上を含まない、または実質的に含まないものであってよい。尿の抽出物は、安定化剤(例えば、核酸の安定化剤)および/またはpH調整剤(例えば、緩衝剤)をさらに含んでいてもよい。尿の抽出物は、塩を含んでいてもよい。尿の抽出物は、尿成分、例えば、尿素、クレアチニン、尿酸、アンモニア、ウロビリン、リボフラビン、尿タンパク質、糖および尿のホルモン(例えば、絨毛性ゴナドトロピン)からなる群から選択される1以上の尿成分を含んでいてもよい。尿抽出物のpHは、2、3、4、または5などの値より大きくてもそれ以上であってもよい。尿抽出物のpHは、10、9、8、7、6、または5などの値より小さくてもそれ以下であってもよい。本開示では、尿抽出物は、マイクロRNAを含む。本開示では、尿抽出物は、濃縮されたマイクロRNA又はその群を含み得る。本開示では、尿抽出物は、本明細書で記載される抽出方法によって抽出されたマイクロRNAを含み得る。本開示では、尿抽出物は、データS1(または、データS1を開示する表3)にリストされるマイクロRNAの少なくとも1つまたは全てを含み得る。本開示では、尿抽出物は、尿のpH環境下において正電荷の表面を有するナノワイヤ(例えば、ZnO、SiO2、Li2O、MgO、Al2O3、CaO、TiO2、Mn2O3、Fe2O3、CoO、NiO、CuO、Ga2O3、SrO、In2O3、SnO2、Sm2O3、およびEuOからなる群から選択される少なくとも1種の表面を有するナノワイヤ)と尿を接触させ、その後、必要に応じて洗浄してから、非イオン性界面活性剤等を含む緩衝液で抽出して得られる物であり得る(このようにして得られる尿抽出物を「本開示の尿の抽出物」ということがある)。尿はまた、尿と上記ナノワイヤを接触させる際(前、後、または接触中)には、上記ナノワイヤの表面電荷が正となるようにpHを調整され得る。
本明細書では、「in situ抽出」とは、ナノワイヤ組み込みマイクロ流体デバイスを用いてナノワイヤ上に捕捉したEVを破壊して“その場で”小分子RNA(例えば、マイクロRNA)を抽出すること、またはナノワイヤ上に捕捉した小分子RNA(例えば、マイクロRNA)をナノワイヤから溶液中に抽出することを意味する。
本明細書では、「遊離」とは、尿中におけるマイクロRNAの存在形態の文脈で用いられる場合には、マイクロRNAが細胞外小胞に内包されておらず、また、細胞外小胞と会合していない状態で存在していることを意味する。本明細書では、「内包」とは、尿中におけるマイクロRNAの存在形態の文脈で用いられる場合には、マイクロRNAが細胞外小胞に組み込まれている(完全に内包されている場合、一部が部分的に内包されている場合のいずれであってもよい)ことを意味する。
本明細書では、「ナノワイヤ」は、ナノメートルオーダーの断面形状や直径などのサイズ(例えば、直径1~数百ナノメートルの直径)を有する棒状の構造体を意味する。ナノワイヤのサイズは、特に限定されないが例えば、1nm、5nm、10nm、15nm、20nm、25nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、105nm、110nm、115nm、120nm、125nm、130nm、135nm、140nm、145nm、150nm、155nm、160nm、165nm、170nm、175nm、180nm、185nm、190nm、195nm、200nm、210nm、220nm、230nm、240nm、250nm、260nm、270nm、280nm、290nm、300nm、310nm、320nm、330nm、340nm、350nm、360nm、370nm、380nm、390nm、400nm、410nm、420nm、430nm、440nm、450nm、460nm、470nm、480nm、または490nmであるか、前記数値群から選択される1つの下限値よりも大きくてもよい。ナノワイヤのサイズはまた、特に限定されないが例えば、1000nm、990nm、980nm、970nm、960nm、950nm、940nm、930nm、920nm、910nm、900nm、890nm、880nm、870nm、860nm、850nm、840nm、830nm、820nm、810nm、800nm、790nm、780nm、770nm、760nm、750nm、740nm、730nm、720nm、710nm、700nm、690nm、680nm、670nm、660nm、650nm、640nm、630nm、620nm、610nm、600nm、590nm、580nm、570nm、560nm、550nm、540nm.530nm、520nm、510nm、500nmであるか、前記数値群から選択される1つの下限値よりも小さくてもよい。ナノワイヤのサイズは、特に限定されないが例えば、上記上限値と下限値の間の任意のサイズであり得る。本開示のデバイスにおいては、ナノワイヤを用いることで表面積を増加させることができ、これによりEVの回収キャパシティーが増大し得る。また、ナノワイヤの長さは、特に限定されないが、例えば、500nm、600nm、700nm、800nm、900nm、1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、および10μmから選択される2つの値の間の任意の長さであり得る。ナノワイヤの長さおよび直径は、ナノワイヤの物理的強度や表面積に影響を与え得る。その使用環境に合わせて長さと直径を調整することができよう。
本明細書では、「フリー」とは、この用語の直前に記載された成分と組み合わせて用いられるときには、当該成分を実質的に含まない、または含まないことを意味する。ここで、「実質的に含まない」とは、抽出物中において除去できないレベルの当該成分を含むことを除外しない。
本発明者らは、pH6~8の環境下において正に荷電する表面(例えば、酸化亜鉛(ZnO)の表面)を有するナノワイヤと対象の尿とを接触させることにより、尿中の細胞外小胞(EV)(及び遊離miRNA)が効率良く、かつ破壊されることなくナノワイヤに吸着することを見出した。本発明者らはまた、ナノワイヤに吸着したEVおよびmiRNAを界面活性剤によって効果的に回収することができることを見出した。
本開示によれば、データS1(または表3)に記載のいずれか1以上のマイクロRNAを含む尿の抽出物が提供される。本開示によれば、データS1(または表3)に記載のすべてのマイクロRNAを含む尿の抽出物が提供される。本開示によれば、表2に記載のいずれか1以上のマイクロRNAを含む尿の抽出物が提供される。本開示によれば、表2に記載のすべてのマイクロRNAを含む尿の抽出物が提供される。
本開示のある態様では、データS1(または表3)に記載のいずれか1以上、または全てのマイクロRNAを含む尿の抽出物は、マイクロRNA(特に、尿中に存在するマイクロRNA)を500種類以上、600種類以上、700種類以上、800種類以上、900種類以上、1000種類以上、または1100種類以上含み得る。ある態様では、データS1(または表3)に記載のいずれか1以上、または全てのマイクロRNAを含む尿の抽出物は、マイクロRNA(特に、尿中に存在するマイクロRNA)を749種類以上、822種類以上、または1111種類以上含み得る。
本開示のある態様では、尿中に存在するマイクロRNAを500種類以上、600種類以上、700種類以上、800種類以上、900種類以上、1000種類以上、または1100種類以上含み得る。いくつかの実施形態では、尿に含まれるマイクロRNAの種類の数は、実際に含まれるマイクロRNAの種類の数であってもよい。いくつかの実施形態では、尿に含まれるマイクロRNAの種類の数は、マイクロRNAの検出方法又は検出技術によって定義されてもよい。例えば、尿に含まれるマイクロRNAの種類の数は、マイクロRNAの検出方法の検出限界に依存し得るものである。本発明の開示のある態様では、好ましくは、本開示のナノワイヤ組み込みデバイスを用いて尿から調製され得る。
本開示のある態様では、マイクロRNAは、データS1(または表3)に記載の数値(バックグラウンドの強度が控除された後にlog2変換された数値)において1以上、2以上、3以上、4以上、5以上、6以上、7以上、8以上、9以上、10以上、11以上、12以上、13以上、14以上、15以上、および16以上を示すマイクロRNAからなる群から選択されるマイクロRNAの少なくとも1つまたは全てを含み得る。本開示のある態様では、マイクロRNAは、データS1(または表3)に記載の数値(バックグラウンドの強度が控除された後にlog2変換された数値)において1以上2未満、2以上3未満、3以上4未満、4以上5未満、5以上6未満、6以上7未満、7以上8未満、8以上9未満、9以上10未満、10以上11未満、11以上12未満、12以上13未満、13以上14未満、14以上15未満、および16以上を示すマイクロRNAからなる群から選択されるマイクロRNAの少なくとも1つまたは全てを含み得る。この態様では、上記数値は、非がんドナー(例えば、健常者)における数値であり得、肺がん患者における数値であり得、膵がん患者における数値であり得、肝臓がん患者における数値であり得、膀胱がん患者における数値であり得、および/または、前立腺患者における数値であり得る。
本開示のある態様では、データS1(または表3)に記載のいずれか1以上、または全てのマイクロRNAを含む尿の抽出物は、マイクロRNA(特に、尿中に存在するマイクロRNA)を500種類以上、600種類以上、700種類以上、800種類以上、900種類以上、1000種類以上、または1100種類以上含み得る。ある態様では、データS1(または表3)に記載のいずれか1以上、または全てのマイクロRNAを含む尿の抽出物は、マイクロRNA(特に、尿中に存在するマイクロRNA)を749種類以上、822種類以上、または1111種類以上含み得る。
本開示のある態様では、尿中に存在するマイクロRNAを500種類以上、600種類以上、700種類以上、800種類以上、900種類以上、1000種類以上、または1100種類以上含み得る。いくつかの実施形態では、尿に含まれるマイクロRNAの種類の数は、実際に含まれるマイクロRNAの種類の数であってもよい。いくつかの実施形態では、尿に含まれるマイクロRNAの種類の数は、マイクロRNAの検出方法又は検出技術によって定義されてもよい。例えば、尿に含まれるマイクロRNAの種類の数は、マイクロRNAの検出方法の検出限界に依存し得るものである。本発明の開示のある態様では、好ましくは、本開示のナノワイヤ組み込みデバイスを用いて尿から調製され得る。
本開示のある態様では、マイクロRNAは、データS1(または表3)に記載の数値(バックグラウンドの強度が控除された後にlog2変換された数値)において1以上、2以上、3以上、4以上、5以上、6以上、7以上、8以上、9以上、10以上、11以上、12以上、13以上、14以上、15以上、および16以上を示すマイクロRNAからなる群から選択されるマイクロRNAの少なくとも1つまたは全てを含み得る。本開示のある態様では、マイクロRNAは、データS1(または表3)に記載の数値(バックグラウンドの強度が控除された後にlog2変換された数値)において1以上2未満、2以上3未満、3以上4未満、4以上5未満、5以上6未満、6以上7未満、7以上8未満、8以上9未満、9以上10未満、10以上11未満、11以上12未満、12以上13未満、13以上14未満、14以上15未満、および16以上を示すマイクロRNAからなる群から選択されるマイクロRNAの少なくとも1つまたは全てを含み得る。この態様では、上記数値は、非がんドナー(例えば、健常者)における数値であり得、肺がん患者における数値であり得、膵がん患者における数値であり得、肝臓がん患者における数値であり得、膀胱がん患者における数値であり得、および/または、前立腺患者における数値であり得る。
本開示によれば、miR-3117-5p、miR-3118、miR-3121-3p、miR-3121-5p、miR-3126-5p、miR-3128、miR-3133、miR-3134、miR-3136-3p、miR-3136-5p、miR-3139、miR-3142、miR-3143、miR-3145-3p、miR-3163、miR-3166、miR-3167、miR-16-1-3p、miR-424-3p、miR-519c-5p、miR-525-5p、miR-551b-5p、miR-558、miR-921、miR-942-3p、miR-3126-3p、miR-3127-5p、miR-3129-5p、miR-3144-5p、miR-3150a-5p、miR-3152-5p、miR-3155a、miR-3157-3p、miR-3159、miR-3165、miR-3678-3p、miR-4321、miR-4521、miR-4800-3p、miR-4999-5p、miR-5096、miR-5187-5p、miR-6874-5p、miR-3127-3p、miR-3130-5p、miR-3131、miR-3141、miR-3150b-5p、miR-3151-3p、miR-3151-5p、miR-3154、miR-3160-3p、miR-3160-5p、miR-378a-5p、miR-520c-3p、miR-526b-3p、miR-3150a-3p、miR-3162-5p、及びmiR-4254からなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAを含む、尿の抽出物が提供される。本開示によれば、miR-3163、miR-16-1-3p、miR-424-3p、miR-558、miR-3127-5p、及びmiR-4521からなる群から選択される少なくとも1種のマイクロRNAまたは全てのマイクロRNAを含む、尿の抽出物が提供される。本開示によれば、miR-378a-5p、miR-520c-3p、及びmiR-526b-3pからなる群から選択される少なくとも1種のマイクロRNAまたは全てのマイクロRNAを含む、尿の抽出物が提供される。これらのマイクロRNAは、肺がん患者の尿において検出され得る。従って、本開示によれば、尿は、肺がんを有する対象の尿であり得る。
本開示によれば、let-7i-3p、miR-183-5p、miR-202-5p、miR-409-5p、miR-4661-5p、miR-4800-3p、miR-5587-5p、miR-372-3p、miR-378b、miR-520b、miR-1266-3p、miR-3605-5p、miR-3612、miR-4645-3p、miR-4694-3p、miR-4752、miR-6816-3p、miR-8087、let-7f-2-3p、miR-15a-3p、miR-20a-3p、miR-33b-3p、miR-34c-5p、miR-93-5p、miR-130a-5p、miR-135a-5p、miR-135b-5p、miR-185-5p、miR-203a-3p、miR-302d-5p、miR-337-3p、miR-378c、miR-422a、miR-449c-5p、miR-483-5p、miR-506-3p、miR-511-5p、miR-520c-3p、miR-654-3p、miR-668-5p、miR-670-5p、miR-671-3p、miR-744-3p、miR-1178-3p、miR-1254、miR-1284、miR-1323、miR-2116-5p、miR-2355-3p、miR-3132、miR-3138、miR-3164、miR-3186-3p、miR-3189-3p、miR-3198、miR-3200-5p、miR-3657、miR-3667-5p、miR-3680-5p、miR-3692-5p、miR-3713、miR-3921、miR-3936、miR-4273、miR-4299、miR-4306、miR-4316、miR-4319、miR-4421、miR-4429、miR-4435、miR-4441、miR-4473、miR-4506、miR-4633-5p、miR-4658、miR-4733-5p、miR-4733-3p、miR-5004-3p、miR-5194、miR-5197-5p、miR-5571-5p、miR-6083、miR-6717-5p、miR-6720-5p、miR-6767-3p、miR-6781-3p、miR-6811-3p、miR-6821-3p、miR-6828-5p、miR-6832-5p、miR-6837-3p、miR-6841-5p、miR-6853-5p、miR-6871-3p、miR-6875-5p、miR-6878-5p、miR-7112-3p、miR-7703、miR-7848-3p、及びmiR-7856-5pからなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAを含む、尿の抽出物が提供される。本開示によれば、miR-183-5p、miR-202-5p、及びmiR-409-5pからなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAを含む、尿の抽出物が提供される。本開示によれば、miR-372-3p、miR-520b、miR-15a-3p、miR-34c-5p、miR-135a-5p、miR-185-5p、miR-337-3p、miR-422a、miR-506-3p、miR-520c-3p、miR-1284、miR-1323、及びmiR-4273からなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAを含む、尿の抽出物が提供される。これらのマイクロRNAは、膵がん患者の尿において検出され得る。従って、本開示によれば、尿は、膵がんを有する対象の尿であり得る。
本開示によれば、miR-4521、let-7c-3p、let-7i-5p、miR-16-1-3p、miR-26a-1-3p、miR-28-5p、miR-105-5p、miR-195-3p、miR-200b-5p、miR-219a-2-3p、miR-297、miR-300、miR-330-3p、miR-374b-5p、miR-431-5p、miR-454-5p、miR-513c-5p、miR-548ax、miR-593-5p、miR-623、miR-664a-5p、miR-942-3p、miR-1205、miR-1276、miR-1288-3p、miR-1297、miR-3678-3p、miR-4283、miR-4295、miR-4439、miR-4524b-5p、miR-4703-3p、miR-4768-5p、miR-4800-3p、miR-5187-5p、miR-5696、miR-7161-5p、let-7i-2-3p、及びmiR-520c-3pからなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAを含む、尿の抽出物が提供される。本開示によれば、miR-16-1-3p、miR-28-5p、miR-297、miR-300、miR-330-3p、miR-454-5p、miR-1297、及びmiR-4295からなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAを含む、尿の抽出物が提供される。本開示によれば、miR-520c-3pを含む、尿の抽出物が提供される。これらのマイクロRNAは、肝がんを有する対象の尿において検出され得る。従って、尿は、肝がんを有する対象の尿であり得る。
本開示によれば、miR-16-1-3p、miR-23b-3p、miR-28-5p、miR-92a-2-5p、miR-142-3p、miR-195-3p、miR-196b-5p、miR-299-3p、miR-492、miR-513b-5p、miR-601、miR-619-5p、miR-1285-3p、miR-3155a、miR-3162-5p、miR-3678-3p、miR-4283、miR-4295、miR-4311、miR-4531、miR-5096、miR-5187-5p、let-7f-2-3p、miR-520c-3p、及びmiR-4783-5pからなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAを含む、尿の抽出物が提供される。本開示によれば、miR-16-1-3p、miR-23b-3p、miR-28-5p、miR-142-3p、miR-195-3p、miR-299-3p、及びmiR-4295からなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAを含む、尿の抽出物が提供される。本開示によれば、miR-520c-3pを含む、尿の抽出物が提供される。これらのマイクロRNAは、膀胱がんを有する態様において検出され得る。従って、本開示では、尿は、膀胱がんを有する対象の尿であり得る。
本開示によれば、miR-4531、miR-28-5p、miR-103a-2-5p、miR-105-5p、miR-124-3p、miR-151a-5p、miR-151b、miR-200a-5p、miR-300、miR-424-3p、miR-519c-5p、miR-551b-5p、miR-617、miR-873-3p、miR-921、miR-1288-3p、miR-3124-5p、miR-3155a、miR-3917、miR-4283、miR-4727-3p、miR-5096、miR-5187-5p、miR-6074、miR-6874-5p、miR-6892-5p、miR-15a-3p、miR-135b-5p、miR-520c-3p、miR-4783-5p、及びmiR-7849-3pからなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAを含む、尿の抽出物が提供される。本開示によれば、miR-28-5p、miR-105-5p、miR-124-3p、miR-151a-5p、及びmiR-300からなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAを含む、尿の抽出物が提供される。本開示によれば、miR-15a-3p及びmiR-520c-3pからなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAを含む、尿の抽出物が提供される。これらのマイクロRNAは、前立腺がんを有する態様において検出され得る。従って、本開示では、尿は、前立腺がんを有する対象の尿であり得る。
本開示の別の側面では、対象ががんである可能性を検査する方法が提供される。がんである可能性を検査する方法は、がんであるかを診断する方法、がんであるかを診断するための予備的情報を取得する方法、対象の体内にがん細胞が存在するか否かを決定する方法、または対象ががんである可能性を判定する方法に読み替えることができる。本開示においては、対象ががんである可能性を検査する方法によって対象ががんである可能性があると決定された場合には、その後、医師等により確定診断をすることができる。本開示においては、本開示の方法によれば、がんであると診断することと、がんであると診断された患者に対して抗がん治療を行うこととを含む、方法が提供される。
本開示において、対象ががんである可能性は、体液試料におけるデータS1(または表3)に記載のマイクロRNAのいずれかの発現レベルを指標として決定することができる。
本開示のある態様では、体液試料とは、対象から得られる体液または当該体液に由来する試料を意味する。体液試料とは血液、血清、血漿、リンパ液であってもよく、組織間液、細胞間液、間質液などの組織液であってもよく、体腔液、漿膜腔液、胸水、腹水、心嚢液、脳脊髄液(髄液)、関節液(滑液)、眼房水(房水)であってもよい。体液は、唾液、胃液、胆汁、膵液、腸液などの消化液であってもよく、汗、涙、鼻水、尿、精液、膣液、羊水、乳汁であってもよい。体液は、動物の体液であってもよく、ヒトの体液であってもよい。本開示では好ましくは、体液試料としては、尿またはその抽出物が好ましく用いられ得る。本開示では好ましくは、尿の抽出物は、本開示の尿の抽出物であり得る。
がんは、特に限定されないが例えば、固形がんおよび造血器腫瘍等から選択される1以上のがんであり得る。がんとしては、例えば、肺がん、膵臓がん、肝がん、膀胱がん、および前立腺がんからなる群から選択される1以上が挙げられる。
対象ががんである可能性は、対象の体液試料のマイクロRNAレベルを指標として評価することができる。例えば、データS1(または表3)において、がんである対象において非がんである対象よりも高い発現を示したマイクロRNAに対しては、対象の体液試料のマイクロRNAレベルが所定の値(以下、「閾値」ということがある)よりも高いことを指標として、対象ががんである可能性が高いと決定することができる。上記において、データS1(または表3)において、例えば、がんである対象3人において非がんである対象3人のいずれよりも高い発現を示したマイクロRNAに対しては、対象の体液試料のマイクロRNAレベルが所定の値(以下、「閾値」ということがある)よりも高いことを指標として、対象ががんである可能性が高いと決定することができる。
また例えば、データS1(または表3)において、がんである対象において非がんである対象よりも高い発現を示したマイクロRNA(例えば、2倍以上、3倍以上、4以上、5以上、6以上、7以上、8以上、9以上、または10以上)に対しては、対象の体液試料のマイクロRNAレベルが所定の値(以下、「閾値」ということがある)よりも低いことを指標として、対象ががんである可能性が低いと決定することができる。上記において、データS1(または表3)において、例えば、がんである対象3人において非がんである対象3人のいずれよりも低い発現を示したマイクロRNA(例えば、2倍以上、3倍以上、4以上、5以上、6以上、7以上、8以上、9以上、または10以上)に対しては、対象の体液試料のマイクロRNAレベルが所定の値(以下、「閾値」ということがある)よりも低いことを指標として、対象ががんである可能性が低いと決定することができる。
これらの場合に、所定の値は、特に限定されないが例えば、がんである対象群における当該マイクロRNAレベルの平均値、中央値、第3四分位値、第1四分位値、及び最低値からなる群から選択される2つの値(統計値又は指標値)の間の任意の数値であり得る。また例えば、所定の値は、特に限定されないが例えば、非がんである対象群における当該マイクロRNAレベルの最大値、第3四分位値、平均値、中央値、及び第1子分位値からなる群から選択される2つの値の間の任意の数値であり得る。
本開示では、対象の体液試料のマイクロRNAのうち、測定するマイクロRNAの種類および/またはがんの可能性の指標となるマイクロRNAの種類を、例えば、1以上、2以上、3以上、4以上、5以上、6以上、7以上、8以上、9以上、10以上、20以上、30以上、40以上、50以上、60以上、70以上、80以上、90以上、100以上、200以上、300以上、400以上、500以上、600以上、700以上、800以上、900以上、1000以上、または1100以上とすることができる。対象の体液試料のマイクロRNAのうち、測定するマイクロRNAの種類および/またはがんの可能性の指標となるマイクロRNAの種類を、例えば、2000以下、1900以下、1800以下、1700以下、1600以下、1500以下、1400以下、1300以下、1200以下、1100以下、1000以下、900以下、800以下、700以下、600以下、500以下、400以下、300以下、200以下、100以下、90以下、80以下、70以下、60以下、50以下、40以下、30以下、20以下、または10以下とすることができる。マイクロRNAをがんの可能性の指標にする方法は、本明細書に開示される通りである。
また例えば、データS1(または表3)において、がんである対象において非がんである対象よりも高い発現を示したマイクロRNA(例えば、2倍以上、3倍以上、4以上、5以上、6以上、7以上、8以上、9以上、または10以上)に対しては、対象の体液試料のマイクロRNAレベルが所定の値(以下、「閾値」ということがある)よりも低いことを指標として、対象ががんである可能性が低いと決定することができる。上記において、データS1(または表3)において、例えば、がんである対象3人において非がんである対象3人のいずれよりも低い発現を示したマイクロRNA(例えば、2倍以上、3倍以上、4以上、5以上、6以上、7以上、8以上、9以上、または10以上)に対しては、対象の体液試料のマイクロRNAレベルが所定の値(以下、「閾値」ということがある)よりも低いことを指標として、対象ががんである可能性が低いと決定することができる。
これらの場合に、所定の値は、特に限定されないが例えば、がんである対象群における当該マイクロRNAレベルの平均値、中央値、第3四分位値、第1四分位値、及び最低値からなる群から選択される2つの値(統計値又は指標値)の間の任意の数値であり得る。また例えば、所定の値は、特に限定されないが例えば、非がんである対象群における当該マイクロRNAレベルの最大値、第3四分位値、平均値、中央値、及び第1子分位値からなる群から選択される2つの値の間の任意の数値であり得る。
本開示では、対象の体液試料のマイクロRNAのうち、測定するマイクロRNAの種類および/またはがんの可能性の指標となるマイクロRNAの種類を、例えば、1以上、2以上、3以上、4以上、5以上、6以上、7以上、8以上、9以上、10以上、20以上、30以上、40以上、50以上、60以上、70以上、80以上、90以上、100以上、200以上、300以上、400以上、500以上、600以上、700以上、800以上、900以上、1000以上、または1100以上とすることができる。対象の体液試料のマイクロRNAのうち、測定するマイクロRNAの種類および/またはがんの可能性の指標となるマイクロRNAの種類を、例えば、2000以下、1900以下、1800以下、1700以下、1600以下、1500以下、1400以下、1300以下、1200以下、1100以下、1000以下、900以下、800以下、700以下、600以下、500以下、400以下、300以下、200以下、100以下、90以下、80以下、70以下、60以下、50以下、40以下、30以下、20以下、または10以下とすることができる。マイクロRNAをがんの可能性の指標にする方法は、本明細書に開示される通りである。
また例えば、データS1(または表3)において、がんである対象において非がんである対象よりも低い発現を示したマイクロRNAに対しては、対象の体液試料のマイクロRNAレベルが所定の値よりも低いことを指標として、対象ががんである可能性が高いと決定することができる。上記において、データS1(または表3)において、例えば、がんである対象3人において非がんである対象3人のいずれよりも低い発現を示したマイクロRNA(例えば、2倍以上、3倍以上、4以上、5以上、6以上、7以上、8以上、9以上、または10以上)に対しては、対象の体液試料のマイクロRNAレベルが所定の値(以下、「閾値」ということがある)よりも低いことを指標として、対象ががんである可能性が高いと決定することができる。
また例えば、データS1(または表3)において、がんである対象において非がんである対象よりも低い発現を示したマイクロRNAに対しては、対象の体液試料のマイクロRNAレベルが所定の値よりも高いことを指標として、対象ががんである可能性が低いと決定することができる。上記において、データS1(または表3)において、例えば、がんである対象3人において非がんである対象3人のいずれよりも低い発現を示したマイクロRNA(例えば、2倍以上、3倍以上、4以上、5以上、6以上、7以上、8以上、9以上、または10以上)に対しては、対象の体液試料のマイクロRNAレベルが所定の値(以下、「閾値」ということがある)よりも高いことを指標として、対象ががんである可能性が低いと決定することができる。
これらの場合に、所定の値は、特に限定されないが例えば、がんである対象群における当該マイクロRNAレベルの平均値、中央値、第3四分位値、第1四分位値、及び最低値からなる群から選択される2つの値の間の任意の数値であり得る。また例えば、所定の値は、特に限定されないが例えば、非がんである対象群における当該マイクロRNAレベルの最大値、第3四分位値、平均値、中央値、及び第1子分位値からなる群から選択される2つの値の間の任意の数値であり得る。
また例えば、データS1(または表3)において、がんである対象において非がんである対象よりも低い発現を示したマイクロRNAに対しては、対象の体液試料のマイクロRNAレベルが所定の値よりも高いことを指標として、対象ががんである可能性が低いと決定することができる。上記において、データS1(または表3)において、例えば、がんである対象3人において非がんである対象3人のいずれよりも低い発現を示したマイクロRNA(例えば、2倍以上、3倍以上、4以上、5以上、6以上、7以上、8以上、9以上、または10以上)に対しては、対象の体液試料のマイクロRNAレベルが所定の値(以下、「閾値」ということがある)よりも高いことを指標として、対象ががんである可能性が低いと決定することができる。
これらの場合に、所定の値は、特に限定されないが例えば、がんである対象群における当該マイクロRNAレベルの平均値、中央値、第3四分位値、第1四分位値、及び最低値からなる群から選択される2つの値の間の任意の数値であり得る。また例えば、所定の値は、特に限定されないが例えば、非がんである対象群における当該マイクロRNAレベルの最大値、第3四分位値、平均値、中央値、及び第1子分位値からなる群から選択される2つの値の間の任意の数値であり得る。
本開示によれば、対象が肺がんである可能性を検査する方法が提供される。本開示によれば、対象が肺がんである可能性を検査する方法は、当該対象の体液試料中における、データS1(または表3)から選択されるいずれか1以上のマイクロRNAレベルを指標として対象が肺がんである可能性を検査することができる。本開示によれば、当該対象の体液試料中における、miR-3117-5p、miR-3118、miR-3121-3p、miR-3121-5p、miR-3126-5p、miR-3128、miR-3133、miR-3134、miR-3136-3p、miR-3136-5p、miR-3139、miR-3142、miR-3143、miR-3145-3p、miR-3163、miR-3166、miR-3167、miR-16-1-3p、miR-424-3p、miR-519c-5p、miR-525-5p、miR-551b-5p、miR-558、miR-921、miR-942-3p、miR-3126-3p、miR-3127-5p、miR-3129-5p、miR-3144-5p、miR-3150a-5p、miR-3152-5p、miR-3155a、miR-3157-3p、miR-3159、miR-3165、miR-3678-3p、miR-4321、miR-4521、miR-4800-3p、miR-4999-5p、miR-5096、miR-5187-5p、miR-6874-5p、miR-3127-3p、miR-3130-5p、miR-3131、miR-3141、miR-3150b-5p、miR-3151-3p、miR-3151-5p、miR-3154、miR-3160-3p、miR-3160-5p、miR-378a-5p、miR-520c-3p、miR-526b-3p、miR-3150a-3p、miR-3162-5p、及びmiR-4254からなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAレベルを指標として、対象が肺がんである可能性を検査することができる。
本開示によればまた、対象の体液試料中における、miR-3163、miR-16-1-3p、miR-424-3p、miR-558、miR-3127-5p、及びmiR-4521からなる群から選択される少なくとも1種のマイクロRNAまたは全てのマイクロRNAレベルを指標として、当該対象が肺がんである可能性を検査することができる。体液試料中において、miR-3163、miR-16-1-3p、miR-424-3p、miR-558、miR-3127-5p、及びmiR-4521からなる群から選択される少なくとも1種のマイクロRNAまたは全てのマイクロRNAレベルが所定の値よりも高い場合、当該対象は肺がんである可能性を有すると決定し得る(および/または、所定の値よりも低い場合、当該対象は肺がんでない可能性を有すると決定しうる)。
本開示によればまた、対象の体液試料中における、miR-378a-5p、miR-520c-3p、及びmiR-526b-3pからなる群から選択される少なくとも1種のマイクロRNAまたは全てのマイクロRNAレベルを指標として、当該対象が肺がんである可能性を検査することができる。体液試料中において、miR-378a-5p、miR-520c-3p、及びmiR-526b-3pからなる群から選択される少なくとも1種のマイクロRNAまたは全てのマイクロRNAが所定の値よりも低い場合、当該対象は肺がんである可能性を有すると決定し得る(および/または、所定の値よりも高い場合、当該対象は肺がんでない可能性を有すると決定しうる)。
本開示によればまた、肺がんの指標となる尿中のマイクロRNAは、miR-3127-3p、miR-3130-5p、miR-3131、miR-3141、miR-3150b-5p、miR-3151-3p、miR-3151-5p、miR-3154、miR-3160-3p、及びmiR-3160-5pからなる群から選択される少なくとも1種または全てであり得る。
本開示によれば、肺がんの指標となる尿中のマイクロRNAは、miR-3117-5p、miR-3118、miR-3121-3p、miR-3121-5p、miR-3126-5p、miR-3128、miR-3133、miR-3134、miR-3136-3p、miR-3136-5p、miR-3139、miR-3142、miR-3143、miR-3145-3p、miR-3163、miR-3166、及びmiR-3167からなる群から選択される少なくとも1種または全てであり得る。
本開示によればまた、対象の体液試料中における、miR-3163、miR-16-1-3p、miR-424-3p、miR-558、miR-3127-5p、及びmiR-4521からなる群から選択される少なくとも1種のマイクロRNAまたは全てのマイクロRNAレベルを指標として、当該対象が肺がんである可能性を検査することができる。体液試料中において、miR-3163、miR-16-1-3p、miR-424-3p、miR-558、miR-3127-5p、及びmiR-4521からなる群から選択される少なくとも1種のマイクロRNAまたは全てのマイクロRNAレベルが所定の値よりも高い場合、当該対象は肺がんである可能性を有すると決定し得る(および/または、所定の値よりも低い場合、当該対象は肺がんでない可能性を有すると決定しうる)。
本開示によればまた、対象の体液試料中における、miR-378a-5p、miR-520c-3p、及びmiR-526b-3pからなる群から選択される少なくとも1種のマイクロRNAまたは全てのマイクロRNAレベルを指標として、当該対象が肺がんである可能性を検査することができる。体液試料中において、miR-378a-5p、miR-520c-3p、及びmiR-526b-3pからなる群から選択される少なくとも1種のマイクロRNAまたは全てのマイクロRNAが所定の値よりも低い場合、当該対象は肺がんである可能性を有すると決定し得る(および/または、所定の値よりも高い場合、当該対象は肺がんでない可能性を有すると決定しうる)。
本開示によればまた、肺がんの指標となる尿中のマイクロRNAは、miR-3127-3p、miR-3130-5p、miR-3131、miR-3141、miR-3150b-5p、miR-3151-3p、miR-3151-5p、miR-3154、miR-3160-3p、及びmiR-3160-5pからなる群から選択される少なくとも1種または全てであり得る。
本開示によれば、肺がんの指標となる尿中のマイクロRNAは、miR-3117-5p、miR-3118、miR-3121-3p、miR-3121-5p、miR-3126-5p、miR-3128、miR-3133、miR-3134、miR-3136-3p、miR-3136-5p、miR-3139、miR-3142、miR-3143、miR-3145-3p、miR-3163、miR-3166、及びmiR-3167からなる群から選択される少なくとも1種または全てであり得る。
本開示によれば、対象が膵臓がんである可能性を検査する方法が提供される。本開示によれば、対象が膵臓がんである可能性を検査する方法は、当該対象の体液試料中における、データS1(または表3)から選択されるいずれか1以上のマイクロRNAレベルを指標として対象が膵臓がんである可能性を検査することができる。本開示によれば、当該対象の体液試料中における、let-7i-3p、miR-183-5p、miR-202-5p、miR-409-5p、miR-4661-5p、miR-4800-3p、miR-5587-5p、miR-372-3p、miR-378b、miR-520b、miR-1266-3p、miR-3605-5p、miR-3612、miR-4645-3p、miR-4694-3p、miR-4752、miR-6816-3p、miR-8087、let-7f-2-3p、miR-15a-3p、miR-20a-3p、miR-33b-3p、miR-34c-5p、miR-93-5p、miR-130a-5p、miR-135a-5p、miR-135b-5p、miR-185-5p、miR-203a-3p、miR-302d-5p、miR-337-3p、miR-378c、miR-422a、miR-449c-5p、miR-483-5p、miR-506-3p、miR-511-5p、miR-520c-3p、miR-654-3p、miR-668-5p、miR-670-5p、miR-671-3p、miR-744-3p、miR-1178-3p、miR-1254、miR-1284、miR-1323、miR-2116-5p、miR-2355-3p、miR-3132、miR-3138、miR-3164、miR-3186-3p、miR-3189-3p、miR-3198、miR-3200-5p、miR-3657、miR-3667-5p、miR-3680-5p、miR-3692-5p、miR-3713、miR-3921、miR-3936、miR-4273、miR-4299、miR-4306、miR-4316、miR-4319、miR-4421、miR-4429、miR-4435、miR-4441、miR-4473、miR-4506、miR-4633-5p、miR-4658、miR-4733-5p、miR-4733-3p、miR-5004-3p、miR-5194、miR-5197-5p、miR-5571-5p、miR-6083、miR-6717-5p、miR-6720-5p、miR-6767-3p、miR-6781-3p、miR-6811-3p、miR-6821-3p、miR-6828-5p、miR-6832-5p、miR-6837-3p、miR-6841-5p、miR-6853-5p、miR-6871-3p、miR-6875-5p、miR-6878-5p、miR-7112-3p、miR-7703、miR-7848-3p、及びmiR-7856-5pからなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAレベルを指標として、対象が膵臓がんである可能性を検査することができる。
本開示によればまた、対象の体液試料中における、miR-183-5p、miR-202-5p、及びmiR-409-5pからなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAレベルを指標として、対象が膵臓がんである可能性を検査することができる。体液試料中において、miR-183-5p、miR-202-5p、及びmiR-409-5pからなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAレベルが所定の値よりも高い場合、当該対象が膵臓がんである可能性を有すると決定し得る(および/または低い場合、当該対象が膵臓がんではない可能性を有すると決定し得る)。
本開示によればまた、miR-372-3p、miR-520b、miR-15a-3p、miR-34c-5p、miR-135a-5p、miR-185-5p、miR-337-3p、miR-422a、miR-506-3p、miR-520c-3p、miR-1284、miR-1323、及びmiR-4273からなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAレベルを指標として、対象が膵臓がんである可能性を検査することができる。体液試料中において、miR-372-3p、miR-520b、miR-15a-3p、miR-34c-5p、miR-135a-5p、miR-185-5p、miR-337-3p、miR-422a、miR-506-3p、miR-520c-3p、miR-1284、miR-1323、及びmiR-4273からなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAレベルが所定の値よりも低い場合、当該対象が膵臓がんである可能性を有すると決定し得る(および/または、高い場合、当該対象が膵臓がんではない可能性を有すると決定し得る)。
本開示によればまた、膵臓がんの指標となる尿中のマイクロRNAは、miR-372-3p、miR-378b、miR-520b、miR-1266-3p、miR-3605-5p、miR-3612、miR-4645-3p、miR-4694-3p、miR-4752、miR-6816-3p、及びmiR-8087からなる群から選択される少なくとも1種または全てであり得る。
本開示によればまた、対象の体液試料中における、miR-183-5p、miR-202-5p、及びmiR-409-5pからなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAレベルを指標として、対象が膵臓がんである可能性を検査することができる。体液試料中において、miR-183-5p、miR-202-5p、及びmiR-409-5pからなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAレベルが所定の値よりも高い場合、当該対象が膵臓がんである可能性を有すると決定し得る(および/または低い場合、当該対象が膵臓がんではない可能性を有すると決定し得る)。
本開示によればまた、miR-372-3p、miR-520b、miR-15a-3p、miR-34c-5p、miR-135a-5p、miR-185-5p、miR-337-3p、miR-422a、miR-506-3p、miR-520c-3p、miR-1284、miR-1323、及びmiR-4273からなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAレベルを指標として、対象が膵臓がんである可能性を検査することができる。体液試料中において、miR-372-3p、miR-520b、miR-15a-3p、miR-34c-5p、miR-135a-5p、miR-185-5p、miR-337-3p、miR-422a、miR-506-3p、miR-520c-3p、miR-1284、miR-1323、及びmiR-4273からなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAレベルが所定の値よりも低い場合、当該対象が膵臓がんである可能性を有すると決定し得る(および/または、高い場合、当該対象が膵臓がんではない可能性を有すると決定し得る)。
本開示によればまた、膵臓がんの指標となる尿中のマイクロRNAは、miR-372-3p、miR-378b、miR-520b、miR-1266-3p、miR-3605-5p、miR-3612、miR-4645-3p、miR-4694-3p、miR-4752、miR-6816-3p、及びmiR-8087からなる群から選択される少なくとも1種または全てであり得る。
本開示によれば、対象が肝臓がんである可能性を検査する方法が提供される。本開示によれば、対象が肝臓がんである可能性を検査する方法は、当該対象の体液試料中における、データS1(または表3)から選択されるいずれか1以上のマイクロRNAレベルを指標として対象が肝臓がんである可能性を検査することができる。本開示によれば、miR-4521、let-7c-3p、let-7i-5p、miR-16-1-3p、miR-26a-1-3p、miR-28-5p、miR-105-5p、miR-195-3p、miR-200b-5p、miR-219a-2-3p、miR-297、miR-300、miR-330-3p、miR-374b-5p、miR-431-5p、miR-454-5p、miR-513c-5p、miR-548ax、miR-593-5p、miR-623、miR-664a-5p、miR-942-3p、miR-1205、miR-1276、miR-1288-3p、miR-1297、miR-3678-3p、miR-4283、miR-4295、miR-4439、miR-4524b-5p、miR-4703-3p、miR-4768-5p、miR-4800-3p、miR-5187-5p、miR-5696、miR-7161-5p、let-7i-2-3p、及びmiR-520c-3pからなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAレベルを指標として、対象が肝臓がんである可能性を検査することができる。
本開示では、miR-4521、let-7c-3p、let-7i-5p、miR-16-1-3p、miR-26a-1-3p、miR-28-5p、miR-105-5p、miR-195-3p、miR-200b-5p、miR-219a-2-3p、miR-297、miR-300、miR-330-3p、miR-374b-5p、miR-431-5p、miR-454-5p、miR-513c-5p、miR-548ax、miR-593-5p、miR-623、miR-664a-5p、miR-942-3p、miR-1205、miR-1276、miR-1288-3p、miR-1297、miR-3678-3p、miR-4283、miR-4295、miR-4439、miR-4524b-5p、miR-4703-3p、miR-4768-5p、miR-4800-3p、miR-5187-5p、miR-5696、miR-7161-5p、let-7i-2-3p、及びmiR-520c-3pからなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAレベルを指標として、対象が肝臓がんである可能性を検査することができる。体液試料中において、miR-16-1-3p、miR-28-5p、miR-297、miR-300、miR-330-3p、miR-454-5p、miR-1297、及びmiR-4295からなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAレベルが所定の値よりも高い場合、当該対象が肝臓がんである可能性を有すると決定することができる(および/または、低い場合、当該対象が肝臓がんでない可能性を有すると決定することができる)。
本開示では、miR-520c-3pのレベルを指標として、対象が肝臓がんである可能性を検査することができる。体液試料中において、miR-520c-3pのレベルが所定の値よりも低い場合、当該対象が肝臓がんである可能性を有すると決定することができる(および/または、高い場合、当該対象が肝臓がんでない可能性を有すると決定することができる)。
本開示によればまた、肝臓がんの指標となる尿中のマイクロRNAは、miR-4521であり得る。
本開示では、miR-4521、let-7c-3p、let-7i-5p、miR-16-1-3p、miR-26a-1-3p、miR-28-5p、miR-105-5p、miR-195-3p、miR-200b-5p、miR-219a-2-3p、miR-297、miR-300、miR-330-3p、miR-374b-5p、miR-431-5p、miR-454-5p、miR-513c-5p、miR-548ax、miR-593-5p、miR-623、miR-664a-5p、miR-942-3p、miR-1205、miR-1276、miR-1288-3p、miR-1297、miR-3678-3p、miR-4283、miR-4295、miR-4439、miR-4524b-5p、miR-4703-3p、miR-4768-5p、miR-4800-3p、miR-5187-5p、miR-5696、miR-7161-5p、let-7i-2-3p、及びmiR-520c-3pからなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAレベルを指標として、対象が肝臓がんである可能性を検査することができる。体液試料中において、miR-16-1-3p、miR-28-5p、miR-297、miR-300、miR-330-3p、miR-454-5p、miR-1297、及びmiR-4295からなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAレベルが所定の値よりも高い場合、当該対象が肝臓がんである可能性を有すると決定することができる(および/または、低い場合、当該対象が肝臓がんでない可能性を有すると決定することができる)。
本開示では、miR-520c-3pのレベルを指標として、対象が肝臓がんである可能性を検査することができる。体液試料中において、miR-520c-3pのレベルが所定の値よりも低い場合、当該対象が肝臓がんである可能性を有すると決定することができる(および/または、高い場合、当該対象が肝臓がんでない可能性を有すると決定することができる)。
本開示によればまた、肝臓がんの指標となる尿中のマイクロRNAは、miR-4521であり得る。
本開示によれば、対象が膀胱がんである可能性を検査する方法が提供される。本開示によれば、対象が膀胱がんである可能性を検査する方法は、当該対象の体液試料中における、データS1(または表3)から選択されるいずれか1以上のマイクロRNAレベルを指標として対象が膀胱がんである可能性を検査することができる。本開示によれば、miR-16-1-3p、miR-23b-3p、miR-28-5p、miR-92a-2-5p、miR-142-3p、miR-195-3p、miR-196b-5p、miR-299-3p、miR-492、miR-513b-5p、miR-601、miR-619-5p、miR-1285-3p、miR-3155a、miR-3162-5p、miR-3678-3p、miR-4283、miR-4295、miR-4311、miR-4531、miR-5096、miR-5187-5p、let-7f-2-3p、miR-520c-3p、及びmiR-4783-5pからなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAレベルを指標として、当該対象が膀胱がんである可能性を検査することができる。
本開示では、miR-16-1-3p、miR-23b-3p、miR-28-5p、miR-142-3p、miR-195-3p、miR-299-3p、及びmiR-4295からなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAレベルを指標として、対象が膀胱がんである可能性を検査することができる。体液試料中において、miR-16-1-3p、miR-23b-3p、miR-28-5p、miR-142-3p、miR-195-3p、miR-299-3p、及びmiR-4295からなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAレベルが所定の値よりも高い場合、当該対象が膀胱がんである可能性を有すると決定し得る(および/または、低い場合、当該対象が膀胱がんでない可能性を有すると決定し得る)。
本開示では、miR-520c-3pレベルを指標として、対象が膀胱がんである可能性を検査することができる。体液試料中において、miR-520c-3pレベルが所定の値よりも低い場合、当該対象が膀胱がんである可能性を有すると決定し得る(および/または、高い場合、当該対象が膀胱がんでない可能性を有すると決定し得る)。
本開示では、miR-16-1-3p、miR-23b-3p、miR-28-5p、miR-142-3p、miR-195-3p、miR-299-3p、及びmiR-4295からなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAレベルを指標として、対象が膀胱がんである可能性を検査することができる。体液試料中において、miR-16-1-3p、miR-23b-3p、miR-28-5p、miR-142-3p、miR-195-3p、miR-299-3p、及びmiR-4295からなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAレベルが所定の値よりも高い場合、当該対象が膀胱がんである可能性を有すると決定し得る(および/または、低い場合、当該対象が膀胱がんでない可能性を有すると決定し得る)。
本開示では、miR-520c-3pレベルを指標として、対象が膀胱がんである可能性を検査することができる。体液試料中において、miR-520c-3pレベルが所定の値よりも低い場合、当該対象が膀胱がんである可能性を有すると決定し得る(および/または、高い場合、当該対象が膀胱がんでない可能性を有すると決定し得る)。
本開示によれば、対象が前立腺がんである可能性を検査する方法が提供される。本開示によれば、対象が前立腺がんである可能性を検査する方法は、当該対象の体液試料中における、データS1(または表3)から選択されるいずれか1以上のマイクロRNAレベルを指標として対象が前立腺がんである可能性を検査することができる。本開示によれば、miR-4531、miR-28-5p、miR-103a-2-5p、miR-105-5p、miR-124-3p、miR-151a-5p、miR-151b、miR-200a-5p、miR-300、miR-424-3p、miR-519c-5p、miR-551b-5p、miR-617、miR-873-3p、miR-921、miR-1288-3p、miR-3124-5p、miR-3155a、miR-3917、miR-4283、miR-4727-3p、miR-5096、miR-5187-5p、miR-6074、miR-6874-5p、miR-6892-5p、miR-15a-3p、miR-135b-5p、miR-520c-3p、miR-4783-5p、及びmiR-7849-3pからなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAレベルを指標として対象が前立腺がんである可能性を検査することができる。
本開示では、miR-28-5p、miR-105-5p、miR-124-3p、miR-151a-5p、及びmiR-300からなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAレベルを指標として対象が前立腺がんである可能性を検査することができる。体液試料中において、miR-28-5p、miR-105-5p、miR-124-3p、miR-151a-5p、及びmiR-300からなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAレベルが所定の値よりも高い場合、対象が前立腺がんである可能性を有すると決定し得る(および/または、低い場合、対象が前立腺がんではない可能性を有すると決定し得る)。
本開示では、miR-15a-3p及びmiR-520c-3pからなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAレベルを指標として、対象が肝臓がんである可能性を検査することができる。体液試料中において、miR-15a-3p及びmiR-520c-3pからなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAレベルが所定の値よりも低い場合、当該対象が前立腺がんである可能性を有すると決定することができる(および/または、高い場合、当該対象が前立腺がんでない可能性を有すると決定することができる)。
本開示によればまた、前立腺がんの指標となる尿中のマイクロRNAは、miR-4531であり得る。
本開示では、miR-28-5p、miR-105-5p、miR-124-3p、miR-151a-5p、及びmiR-300からなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAレベルを指標として対象が前立腺がんである可能性を検査することができる。体液試料中において、miR-28-5p、miR-105-5p、miR-124-3p、miR-151a-5p、及びmiR-300からなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAレベルが所定の値よりも高い場合、対象が前立腺がんである可能性を有すると決定し得る(および/または、低い場合、対象が前立腺がんではない可能性を有すると決定し得る)。
本開示では、miR-15a-3p及びmiR-520c-3pからなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAレベルを指標として、対象が肝臓がんである可能性を検査することができる。体液試料中において、miR-15a-3p及びmiR-520c-3pからなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAレベルが所定の値よりも低い場合、当該対象が前立腺がんである可能性を有すると決定することができる(および/または、高い場合、当該対象が前立腺がんでない可能性を有すると決定することができる)。
本開示によればまた、前立腺がんの指標となる尿中のマイクロRNAは、miR-4531であり得る。
本開示では、複数のマイクロRNAを指標として対象ががんまたは特定のがんである可能性を検査する場合には、いくつかの実施形態では、複数のマイクロRNAレベルをそれぞれ所定の値と比較してもよいし、または、いくつかの実施形態では、複数のマイクロRNAレベルを重み付けして得られるスコアに対して、同様に重み付けして得られる所定の値と比較してもよい。複数のマイクロRNAレベルをそれぞれ所定の値と比較する場合には、がんである可能性を示唆するマイクロRNAの数とがんではない可能性を示唆するマイクロRNAの数を対比させて、がんである可能性が高いのか、がんではない可能性が高いのかを決定することができる。本開示ではまた、複数のマイクロRNAレベルを重み付けしてスコアを得る場合(例えば、マイクロRNAシグネチャーをスコア化する場合)には、各マイクロRNAレベルを正規化し、その上で、重み付けをして、若しくは重み付けせずに、正規化した数値を加算または乗算してスコア化することができる(例えば、Z-スコアを得ることができる)。このようにして得られたマイクロRNAスコアは、同様にして得られる所定の値(すなわち、がん患者または非がんの対象から同様に得られるスコア等)と対比させて、がんである可能性が高いのか、がんではない可能性が高いのかを決定することができる。重み付けは、非がんの対象の体液試料と比較して、がんの対象の体液試料において量が多いものは、プラスとし、量の少ない物はマイナスとする(またはその逆)ことができる。重み付けはまた、がんの対象と非がんの対象とで差が大きいもの、または相関が大きいものに対して、より大きな数値を乗算することによって行うことができる。
いくつかの実施形態では、機械学習されたコンピュータ又は人工知能を用いて複数のマイクロRNAレベルから疾病の有無の判定、疾病の特定やその疾病が発症する確率の算出を行わせてもよい。この際、機械学習又は人工知能では、例えば複数のマイクロRNAレベルを疾病の有無の判定、疾病の特定やその疾病が発症する確率と関連付けて学習させることによって機械(コンピュータ)又は人工知能(AI)を学習させることができる。ここで、機械学習又は人工知能に対する学習は、
(i)miR-3117-5p、miR-3118、miR-3121-3p、miR-3121-5p、miR-3126-5p、miR-3128、miR-3133、miR-3134、miR-3136-3p、miR-3136-5p、miR-3139、miR-3142、miR-3143、miR-3145-3p、miR-3163、miR-3166、miR-3167、miR-16-1-3p、miR-424-3p、miR-519c-5p、miR-525-5p、miR-551b-5p、miR-558、miR-921、miR-942-3p、miR-3126-3p、miR-3127-5p、miR-3129-5p、miR-3144-5p、miR-3150a-5p、miR-3152-5p、miR-3155a、miR-3157-3p、miR-3159、miR-3165、miR-3678-3p、miR-4321、miR-4521、miR-4800-3p、miR-4999-5p、miR-5096、miR-5187-5p、miR-6874-5p、miR-3127-3p、miR-3130-5p、miR-3131、miR-3141、miR-3150b-5p、miR-3151-3p、miR-3151-5p、miR-3154、miR-3160-3p、miR-3160-5p、miR-378a-5p、miR-520c-3p、miR-526b-3p、miR-3150a-3p、miR-3162-5p、及びmiR-4254からなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAの発現量とがんとの関連性データ;
(ii)let-7i-3p、miR-183-5p、miR-202-5p、miR-409-5p、miR-4661-5p、miR-4800-3p、miR-5587-5p、miR-372-3p、miR-378b、miR-520b、miR-1266-3p、miR-3605-5p、miR-3612、miR-4645-3p、miR-4694-3p、miR-4752、miR-6816-3p、miR-8087、let-7f-2-3p、miR-15a-3p、miR-20a-3p、miR-33b-3p、miR-34c-5p、miR-93-5p、miR-130a-5p、miR-135a-5p、miR-135b-5p、miR-185-5p、miR-203a-3p、miR-302d-5p、miR-337-3p、miR-378c、miR-422a、miR-449c-5p、miR-483-5p、miR-506-3p、miR-511-5p、miR-520c-3p、miR-654-3p、miR-668-5p、miR-670-5p、miR-671-3p、miR-744-3p、miR-1178-3p、miR-1254、miR-1284、miR-1323、miR-2116-5p、miR-2355-3p、miR-3132、miR-3138、miR-3164、miR-3186-3p、miR-3189-3p、miR-3198、miR-3200-5p、miR-3657、miR-3667-5p、miR-3680-5p、miR-3692-5p、miR-3713、miR-3921、miR-3936、miR-4273、miR-4299、miR-4306、miR-4316、miR-4319、miR-4421、miR-4429、miR-4435、miR-4441、miR-4473、miR-4506、miR-4633-5p、miR-4658、miR-4733-5p、miR-4733-3p、miR-5004-3p、miR-5194、miR-5197-5p、miR-5571-5p、miR-6083、miR-6717-5p、miR-6720-5p、miR-6767-3p、miR-6781-3p、miR-6811-3p、miR-6821-3p、miR-6828-5p、miR-6832-5p、miR-6837-3p、miR-6841-5p、miR-6853-5p、miR-6871-3p、miR-6875-5p、miR-6878-5p、miR-7112-3p、miR-7703、miR-7848-3p、及びmiR-7856-5pからなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAの発現量とがんとの関連性データ;
(iii)miR-4521、let-7c-3p、let-7i-5p、miR-16-1-3p、miR-26a-1-3p、miR-28-5p、miR-105-5p、miR-195-3p、miR-200b-5p、miR-219a-2-3p、miR-297、miR-300、miR-330-3p、miR-374b-5p、miR-431-5p、miR-454-5p、miR-513c-5p、miR-548ax、miR-593-5p、miR-623、miR-664a-5p、miR-942-3p、miR-1205、miR-1276、miR-1288-3p、miR-1297、miR-3678-3p、miR-4283、miR-4295、miR-4439、miR-4524b-5p、miR-4703-3p、miR-4768-5p、miR-4800-3p、miR-5187-5p、miR-5696、miR-7161-5p、let-7i-2-3p、及びmiR-520c-3pからなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAの発現量とがんとの関連性データ;
(iv)miR-16-1-3p、miR-23b-3p、miR-28-5p、miR-92a-2-5p、miR-142-3p、miR-195-3p、miR-196b-5p、miR-299-3p、miR-492、miR-513b-5p、miR-601、miR-619-5p、miR-1285-3p、miR-3155a、miR-3162-5p、miR-3678-3p、miR-4283、miR-4295、miR-4311、miR-4531、miR-5096、miR-5187-5p、let-7f-2-3p、miR-520c-3p、及びmiR-4783-5pからなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAの発現量とがんとの関連性データ;または
(v)miR-4531、miR-28-5p、miR-103a-2-5p、miR-105-5p、miR-124-3p、miR-151a-5p、miR-151b、miR-200a-5p、miR-300、miR-424-3p、miR-519c-5p、miR-551b-5p、miR-617、miR-873-3p、miR-921、miR-1288-3p、miR-3124-5p、miR-3155a、miR-3917、miR-4283、miR-4727-3p、miR-5096、miR-5187-5p、miR-6074、miR-6874-5p、miR-6892-5p、miR-15a-3p、miR-135b-5p、miR-520c-3p、miR-4783-5p、及びmiR-7849-3pからなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAの発現量とがんとの関連性データを用いて行うことができる。学習されたコンピュータまたは人工知能は、上記(i)から(v)からなる群から選択される1以上のデータを記録したメモリ(ROM、RAM、ハードディスク、SSD等の磁気的記録媒体および当該磁気的記録媒体を含むコンピュータを含む)を備え得る、または当該メモリと電子通信回路を介して接続され得る。学習されたコンピュータまたは人工知能は、上記(i)から(v)からなる群から選択される1以上のデータによりさらに学習され得る{この場合、学習に用いたデータは前記メモリにさらに追記されてもよい}。学習されたコンピュータまたは人工知能は、上記少なくとも1種または全てのマイクロRNAの発現量とがんとの関連性データと、対象の体液試料中の上記少なくとも1種または全てのマイクロRNAの発現量とに基づいて、対象ががんである可能性を決定することができる。上記関連性データによるコンピュータまたは人工知能の学習は、複数の上記関連性データを教師データとして用いて、非評価データを評価し、例えば、がんの検出の感度および/または特異度が所定の値を超えるまで、異なる上記関連性データを繰り返し学習させることによって行うことができる。所定の値は、感度および/または特異度への要求によって変わり得るが、例えば、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%以上とすることができる。一般的に、感度を高めると擬陽性が増え、感度を低くすると偽陰性が増える。従って、感度は、その検査の目的に応じて設定することが好ましい。また、一般に特異度を高めると偽陰性が増え、感度を低くすると擬陽性が増える。従って、特異度は、その検査の目的に応じて設定することが望ましい。
いくつかの実施形態では、機械学習されたコンピュータ又は人工知能を用いて複数のマイクロRNAレベルから疾病の有無の判定、疾病の特定やその疾病が発症する確率の算出を行わせてもよい。この際、機械学習又は人工知能では、例えば複数のマイクロRNAレベルを疾病の有無の判定、疾病の特定やその疾病が発症する確率と関連付けて学習させることによって機械(コンピュータ)又は人工知能(AI)を学習させることができる。ここで、機械学習又は人工知能に対する学習は、
(i)miR-3117-5p、miR-3118、miR-3121-3p、miR-3121-5p、miR-3126-5p、miR-3128、miR-3133、miR-3134、miR-3136-3p、miR-3136-5p、miR-3139、miR-3142、miR-3143、miR-3145-3p、miR-3163、miR-3166、miR-3167、miR-16-1-3p、miR-424-3p、miR-519c-5p、miR-525-5p、miR-551b-5p、miR-558、miR-921、miR-942-3p、miR-3126-3p、miR-3127-5p、miR-3129-5p、miR-3144-5p、miR-3150a-5p、miR-3152-5p、miR-3155a、miR-3157-3p、miR-3159、miR-3165、miR-3678-3p、miR-4321、miR-4521、miR-4800-3p、miR-4999-5p、miR-5096、miR-5187-5p、miR-6874-5p、miR-3127-3p、miR-3130-5p、miR-3131、miR-3141、miR-3150b-5p、miR-3151-3p、miR-3151-5p、miR-3154、miR-3160-3p、miR-3160-5p、miR-378a-5p、miR-520c-3p、miR-526b-3p、miR-3150a-3p、miR-3162-5p、及びmiR-4254からなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAの発現量とがんとの関連性データ;
(ii)let-7i-3p、miR-183-5p、miR-202-5p、miR-409-5p、miR-4661-5p、miR-4800-3p、miR-5587-5p、miR-372-3p、miR-378b、miR-520b、miR-1266-3p、miR-3605-5p、miR-3612、miR-4645-3p、miR-4694-3p、miR-4752、miR-6816-3p、miR-8087、let-7f-2-3p、miR-15a-3p、miR-20a-3p、miR-33b-3p、miR-34c-5p、miR-93-5p、miR-130a-5p、miR-135a-5p、miR-135b-5p、miR-185-5p、miR-203a-3p、miR-302d-5p、miR-337-3p、miR-378c、miR-422a、miR-449c-5p、miR-483-5p、miR-506-3p、miR-511-5p、miR-520c-3p、miR-654-3p、miR-668-5p、miR-670-5p、miR-671-3p、miR-744-3p、miR-1178-3p、miR-1254、miR-1284、miR-1323、miR-2116-5p、miR-2355-3p、miR-3132、miR-3138、miR-3164、miR-3186-3p、miR-3189-3p、miR-3198、miR-3200-5p、miR-3657、miR-3667-5p、miR-3680-5p、miR-3692-5p、miR-3713、miR-3921、miR-3936、miR-4273、miR-4299、miR-4306、miR-4316、miR-4319、miR-4421、miR-4429、miR-4435、miR-4441、miR-4473、miR-4506、miR-4633-5p、miR-4658、miR-4733-5p、miR-4733-3p、miR-5004-3p、miR-5194、miR-5197-5p、miR-5571-5p、miR-6083、miR-6717-5p、miR-6720-5p、miR-6767-3p、miR-6781-3p、miR-6811-3p、miR-6821-3p、miR-6828-5p、miR-6832-5p、miR-6837-3p、miR-6841-5p、miR-6853-5p、miR-6871-3p、miR-6875-5p、miR-6878-5p、miR-7112-3p、miR-7703、miR-7848-3p、及びmiR-7856-5pからなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAの発現量とがんとの関連性データ;
(iii)miR-4521、let-7c-3p、let-7i-5p、miR-16-1-3p、miR-26a-1-3p、miR-28-5p、miR-105-5p、miR-195-3p、miR-200b-5p、miR-219a-2-3p、miR-297、miR-300、miR-330-3p、miR-374b-5p、miR-431-5p、miR-454-5p、miR-513c-5p、miR-548ax、miR-593-5p、miR-623、miR-664a-5p、miR-942-3p、miR-1205、miR-1276、miR-1288-3p、miR-1297、miR-3678-3p、miR-4283、miR-4295、miR-4439、miR-4524b-5p、miR-4703-3p、miR-4768-5p、miR-4800-3p、miR-5187-5p、miR-5696、miR-7161-5p、let-7i-2-3p、及びmiR-520c-3pからなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAの発現量とがんとの関連性データ;
(iv)miR-16-1-3p、miR-23b-3p、miR-28-5p、miR-92a-2-5p、miR-142-3p、miR-195-3p、miR-196b-5p、miR-299-3p、miR-492、miR-513b-5p、miR-601、miR-619-5p、miR-1285-3p、miR-3155a、miR-3162-5p、miR-3678-3p、miR-4283、miR-4295、miR-4311、miR-4531、miR-5096、miR-5187-5p、let-7f-2-3p、miR-520c-3p、及びmiR-4783-5pからなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAの発現量とがんとの関連性データ;または
(v)miR-4531、miR-28-5p、miR-103a-2-5p、miR-105-5p、miR-124-3p、miR-151a-5p、miR-151b、miR-200a-5p、miR-300、miR-424-3p、miR-519c-5p、miR-551b-5p、miR-617、miR-873-3p、miR-921、miR-1288-3p、miR-3124-5p、miR-3155a、miR-3917、miR-4283、miR-4727-3p、miR-5096、miR-5187-5p、miR-6074、miR-6874-5p、miR-6892-5p、miR-15a-3p、miR-135b-5p、miR-520c-3p、miR-4783-5p、及びmiR-7849-3pからなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAの発現量とがんとの関連性データを用いて行うことができる。学習されたコンピュータまたは人工知能は、上記(i)から(v)からなる群から選択される1以上のデータを記録したメモリ(ROM、RAM、ハードディスク、SSD等の磁気的記録媒体および当該磁気的記録媒体を含むコンピュータを含む)を備え得る、または当該メモリと電子通信回路を介して接続され得る。学習されたコンピュータまたは人工知能は、上記(i)から(v)からなる群から選択される1以上のデータによりさらに学習され得る{この場合、学習に用いたデータは前記メモリにさらに追記されてもよい}。学習されたコンピュータまたは人工知能は、上記少なくとも1種または全てのマイクロRNAの発現量とがんとの関連性データと、対象の体液試料中の上記少なくとも1種または全てのマイクロRNAの発現量とに基づいて、対象ががんである可能性を決定することができる。上記関連性データによるコンピュータまたは人工知能の学習は、複数の上記関連性データを教師データとして用いて、非評価データを評価し、例えば、がんの検出の感度および/または特異度が所定の値を超えるまで、異なる上記関連性データを繰り返し学習させることによって行うことができる。所定の値は、感度および/または特異度への要求によって変わり得るが、例えば、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%以上とすることができる。一般的に、感度を高めると擬陽性が増え、感度を低くすると偽陰性が増える。従って、感度は、その検査の目的に応じて設定することが好ましい。また、一般に特異度を高めると偽陰性が増え、感度を低くすると擬陽性が増える。従って、特異度は、その検査の目的に応じて設定することが望ましい。
本開示では、がんの可能性を検査した後に、がんを有する可能性があること、および/またはがんを有しない可能性があることを示すデータを、電子媒体または紙等の媒体に出力することができる。出力されたデータは、医師および/または患者(またはその家族や親族等)に提示されていてもよく、その後の治療計画を検討することや、その後の更なる精密検査を検討することに(例えば、検査の選択に)用いることができる。がんの可能性を検査した後には、化学療法、放射線療法、および外科手術などの抗がん治療(例えば、有する可能性があると決定された特定のがんに対する抗がん治療)によって患者を処置することができる。
本開示では、対象の尿または尿抽出物中のマイクロRNAを検出する方法であって、
データS1(または表3)において、例えば、がんである対象3人において非がんである対象3人のいずれよりも高い発現を示したマイクロRNA群から選択される1つ以上を検出する方法が提供される。この態様において検出されるマイクロRNAは、例えば、がんである対象において非がんである対象よりも高い発現を示したマイクロRNA(例えば、2倍以上、3倍以上、4以上、5以上、6以上、7以上、8以上、9以上、または10以上)の群からされる1つ以上であり得る。る1以上のマイクロRNA(好ましくは、ヒトのマイクロRNA)を検出することができる。
本開示ではまた、対象の尿または尿抽出物中のマイクロRNAを検出する方法であって、
データS1(または表3)において、例えば、がんである対象3人において非がんである対象3人のいずれよりも低い発現を示したマイクロRNA群から選択される1つ以上を検出する方法が提供される。この態様において検出されるマイクロRNAは、例えば、がんである対象3人において非がんである対象3人のいずれよりも低い発現を示したマイクロRNA(例えば、2倍以上、3倍以上、4以上、5以上、6以上、7以上、8以上、9以上、または10以上)のマイクロRNAの群からされる1つ以上であり得る。そのようなマイクロRNAとしては、例えば、miR-3127-3p、miR-3130-5p、miR-3131、miR-3141、miR-3150b-5p、miR-3151-3p、miR-3151-5p、miR-3154、miR-3160-3p、miR-3160-5p、miR-3162-5p、miR-0015b-5p、miR-0034c-5p、miR-0093-5p、miR-0128-2-5p、miR-0135a-5p、miR-0149-3p、miR-0214-5p、miR-0320a、miR-0339-5p、miR-0365a-5p、miR-0372-3p、miR-0378b、miR-0424-5p、miR-0488-5p、miR-0498、miR-0512-3p、miR-0512-5p、miR-0580-3p、miR-0670-5p、miR-0671-5p、miR-0758-5p、miR-0933、miR-0937-3p、miR-0942-5p、miR-1178-3p、miR-1207-3p、miR-1224-3p、miR-1233-3p、miR-1233-5p、miR-1249-5p、miR-1266-3p、miR-2277-3p、miR-2277-5p、miR-3065-5p、miR-3122、miR-3135b、miR-3153、miR-3156-3p、miR-3158-5p、miR-3162-3p、miR-3174、miR-3180、miR-3529-5p、miR-3680-3p、miR-3689f、miR-4266、miR-4273、miR-4281、miR-4327、miR-4526、miR-4643、miR-4646-3p、miR-4675、miR-4698、miR-4706、miR-4718、miR-4728-3p、miR-4752、miR-4753-3p、miR-4801、miR-5192、miR-5195-5p、miR-5704、miR-6069、miR-6088、miR-6132、miR-6502-5p、miR-6505-3p、miR-6510-5p、miR-6511b-3p、miR-6516-5p、miR-6744-5p、miR-6749-3p、miR-6754-5p、miR-6757-3p、miR-6757-5p、miR-6765-5p、miR-6771-3p、miR-6775-5p、miR-6781-3p、miR-6800-5p、miR-6807-5p、miR-6811-3p、miR-6813-5p、miR-6822-5p、miR-6829-5p、miR-6832-3p、miR-6841-3p、miR-6845-3p、miR-6864-3p、miR-6865-5p、miR-6873-5p、miR-6877-3p、miR-6878-5p、miR-6881-5p、miR-6885-5p、miR-6886-5p、miR-7106-5p、miR-7111-3p、miR-7153-3p、miR-7848-3p、miR-7978、miR-8059、miR-0520b、miR-3605-5p、miR-3612、miR-4645-3p、miR-4694-3p、miR-6816-3p、miR-8087、miR-0015a-3p、miR-0135b-5p、miR-0185-5p、miR-0302d-5p、miR-0483-5p、miR-0671-3p、miR-1254、miR-1284、miR-1323、miR-3138、miR-3164、miR-3189-3p、miR-3200-5p、miR-3657、miR-3667-5p、miR-3692-5p、miR-3713、miR-4299、miR-4306、miR-4316、miR-4319、miR-4441、miR-4658、miR-5004-3p、miR-5194、miR-6083、miR-6720-5p、miR-6821-3p、miR-6832-5p、miR-6875-5p、miR-0001-5p、miR-0007-2-3p、miR-0025-5p、miR-0030c-1-3p、miR-0030c-2-3p、miR-0125a-3p、miR-0134-5p、miR-0146a-5p、miR-0183-3p、miR-0193a-5p、miR-0193b-3p、miR-0197-5p、miR-0198、miR-0212-5p、miR-0221-3p、miR-0299-5p、miR-0326、miR-0328-5p、miR-0374c-3p、miR-0423-5p、miR-0432-5p、miR-0433-5p、miR-0483-3p、miR-0505-5p、miR-0513a-5p、miR-0521、miR-0532-3p、miR-0550a-3-5p、miR-0550a-5p、miR-0550b-3p、miR-0551b-3p、miR-0589-3p、miR-0591、miR-0615-3p、miR-0642a-3p、miR-0642b-3p、miR-0650、miR-0652-5p、miR-0664b-3p、miR-0668-3p、miR-0675-5p、miR-0711、miR-0744-5p、miR-0764、miR-0939-3p、miR-1180-3p、miR-1185-1-3p、miR-1185-2-3p、miR-1193、miR-1199-3p、miR-1202、miR-1207-5p、miR-1228-5p、miR-1229-5p、miR-1238-5p、miR-1273h-5p、miR-1275、miR-1911-3p、miR-2276-3p、miR-2278、miR-2355-5p、miR-2861、miR-3074-5p、miR-3137、miR-3144-5p、miR-3147、miR-3184-5p、miR-3188、miR-3190-3p、miR-3202、miR-3610、miR-3622b-5p、miR-3666、miR-3679-5p、miR-3689d、miR-3911、miR-3918、miR-3919、miR-3927-5p、miR-3928-3p、miR-4251、miR-4259、miR-4265、miR-4271、miR-4279、miR-4288、miR-4290、miR-4294、miR-4298、miR-4301、miR-4322、miR-4329、miR-4419a、miR-4419b、miR-4447、miR-4462、miR-4472、miR-4476、miR-4483、miR-4484、miR-4492、miR-4496、miR-4499、miR-4513、miR-4523、miR-4632-5p、miR-4646-5p、miR-4655-5p、miR-4656、miR-4667-5p、miR-4685-5p、miR-4687-3p、miR-4697-5p、miR-4709-3p、miR-4722-3p、miR-4723-5p、miR-4726-3p、miR-4726-5p、miR-4728-5p、miR-4732-5p、miR-4739、miR-4743-5p、miR-4747-5p、miR-4748、miR-4751、miR-4756-5p、miR-4783-3p、miR-4788、miR-4800-5p、miR-5088-3p、miR-5698、miR-5702、miR-5739、miR-6085、miR-6086、miR-6087、miR-6124、miR-6133、miR-6501-5p、miR-6504-5p、miR-6513-3p、miR-6716-5p、miR-6727-3p、miR-6730-5p、miR-6733-3p、miR-6734-5p、miR-6735-3p、miR-6735-5p、miR-6741-5p、miR-6744-3p、miR-6745、miR-6746-5p、miR-6749-5p、miR-6750-5p、miR-6760-5p、miR-6769a-5p、miR-6769b-5p、miR-6774-5p、miR-6776-3p、miR-6779-5p、miR-6787-5p、miR-6788-3p、miR-6790-5p、miR-6792-5p、miR-6794-5p、miR-6797-5p、miR-6799-5p、miR-6803-5p、miR-6806-5p、miR-6812-5p、miR-6814-5p、miR-6815-5p、miR-6819-5p、miR-6822-3p、miR-6823-5p、miR-6824-5p、miR-6827-5p、miR-6830-5p、miR-6831-3p、miR-6831-5p、miR-6833-5p、miR-6842-5p、miR-6851-5p、miR-6858-5p、miR-6862-5p、miR-6866-3p、miR-6870-5p、miR-6872-5p、miR-6879-5p、miR-6883-5p、miR-6884-3p、miR-6891-5p、miR-6894-5p、miR-7107-5p、miR-7109-5p、miR-7110-3p、miR-7111-5p、miR-7112-5p、miR-7150、miR-7152-3p、miR-7154-3p、miR-7155-3p、miR-7706、miR-7843-5p、miR-7845-5p、miR-7846-3p、miR-7847-3p、miR-7973、miR-8052、miR-8058、miR-8074、miR-8089、miR-0378a-5p、miR-4489、miR-6511b-5p、miR-0187-5p、miR-0208a-5p、miR-0486-3p、miR-0511-5p、miR-0585-5p、miR-0643、miR-0663b、miR-1231、miR-3187-5p、miR-3665、miR-4446-3p、miR-4466、miR-4525、miR-4634、miR-4674、miR-4734、miR-4785、miR-4787-5p、miR-4794、miR-5008-5p、miR-6499-5p、miR-6510-3p、miR-6727-5p、miR-6814-3p、miR-6836-3p、miR-7704、miR-8069、miR-7849-3p、miR-0025-3p、miR-0092a-3p、miR-0092b-3p、miR-0099b-5p、miR-0128-1-5p、miR-0139-3p、miR-0149-5p、miR-0192-5p、miR-0205-5p、miR-0216b-3p、miR-0223-5p、miR-0346、miR-0371a-3p、miR-0378c、miR-0425-3p、miR-0503-3p、miR-0520a-3p、miR-0520h、miR-0548ay-3p、miR-0548q、miR-0557、miR-0631、miR-0636、miR-0638、miR-0659-3p、miR-0762、miR-0935、miR-1203、miR-1225-5p、miR-1237-5p、miR-1268a、miR-1469、miR-1539、miR-1909-3p、miR-1910-5p、miR-1914-5p、miR-2682-3p、miR-3064-5p、miR-3065-3p、miR-3130-3p、miR-3173-3p、miR-3178、miR-3
180-3p、miR-3196、miR-3935、miR-3937、miR-3940-5p、miR-3960、miR-4270、miR-4276、miR-4442、miR-4485-5p、miR-4488、miR-4505、miR-4508、miR-4632-3p、miR-4649-5p、miR-4676-3p、miR-4688、miR-4707-5p、miR-4708-5p、miR-4722-5p、miR-4730、miR-4738-3p、miR-4747-3p、miR-4761-3p、miR-4763-3p、miR-4773、miR-5196-3p、miR-5584-3p、miR-5787、miR-6089、miR-6090、miR-6508-5p、miR-6721-5p、miR-6722-5p、miR-6726-3p、miR-6729-5p、miR-6737-5p、miR-6738-5p、miR-6746-3p、miR-6767-3p、miR-6771-5p、miR-6784-5p、miR-6785-5p、miR-6786-5p、miR-6789-3p、miR-6789-5p、miR-6805-5p、miR-6816-5p、miR-6825-3p、miR-6833-3p、miR-6837-3p、miR-6847-3p、miR-6848-5p、miR-6850-5p、miR-6869-5p、miR-6871-3p、miR-6895-3p、miR-7155-5p、miR-7844-5p、miR-8072、miR-8485、およびmiR-9500が挙げられ、これらからなる群から選択される1以上のマイクロRNA(好ましくは、ヒトのマイクロRNA)を検出することができる。
これらの態様において、検出されるマイクロRNAの種類および指標として用いられるマイクロRNAの種類は、それぞれ独立して、例えば、1以上、2以上、3以上、4以上、5以上、6以上、7以上、8以上、9以上、10以上、20以上、30以上、40以上、50以上、60以上、70以上、80以上、90以上、100以上、200以上、300以上、400以上、500以上、600以上、700以上、800以上、900以上、1000以上、または1100以上とすることができる。これらの態様において、検出されるマイクロRNAの種類および指標として用いられるマイクロRNAの種類は、それぞれ独立して、例えば、2000以下、1900以下、1800以下、1700以下、1600以下、1500以下、1400以下、1300以下、1200以下、1100以下、1000以下、900以下、800以下、700以下、600以下、500以下、400以下、300以下、200以下、100以下、90以下、80以下、70以下、60以下、50以下、40以下、30以下、20以下、または10以下とすることができる。検出されるマイクロRNAの種類および指標として用いられるマイクロRNAの種類は、完全に同一であり得るが、または検出されるマイクロRNAの一部を指標として用い得る。
検出した後は、当該マイクロRNAの発現量や存在の有無を指標として本開示の通りにがんの診断を行い得る。がんである可能性を有すると診断された患者に対しては、治療(例えば、化学療法、抗がん剤療法、外科手術、免疫療法、及び放射線療法などのがん療法)を行い得る。
データS1(または表3)において、例えば、がんである対象3人において非がんである対象3人のいずれよりも高い発現を示したマイクロRNA群から選択される1つ以上を検出する方法が提供される。この態様において検出されるマイクロRNAは、例えば、がんである対象において非がんである対象よりも高い発現を示したマイクロRNA(例えば、2倍以上、3倍以上、4以上、5以上、6以上、7以上、8以上、9以上、または10以上)の群からされる1つ以上であり得る。る1以上のマイクロRNA(好ましくは、ヒトのマイクロRNA)を検出することができる。
本開示ではまた、対象の尿または尿抽出物中のマイクロRNAを検出する方法であって、
データS1(または表3)において、例えば、がんである対象3人において非がんである対象3人のいずれよりも低い発現を示したマイクロRNA群から選択される1つ以上を検出する方法が提供される。この態様において検出されるマイクロRNAは、例えば、がんである対象3人において非がんである対象3人のいずれよりも低い発現を示したマイクロRNA(例えば、2倍以上、3倍以上、4以上、5以上、6以上、7以上、8以上、9以上、または10以上)のマイクロRNAの群からされる1つ以上であり得る。そのようなマイクロRNAとしては、例えば、miR-3127-3p、miR-3130-5p、miR-3131、miR-3141、miR-3150b-5p、miR-3151-3p、miR-3151-5p、miR-3154、miR-3160-3p、miR-3160-5p、miR-3162-5p、miR-0015b-5p、miR-0034c-5p、miR-0093-5p、miR-0128-2-5p、miR-0135a-5p、miR-0149-3p、miR-0214-5p、miR-0320a、miR-0339-5p、miR-0365a-5p、miR-0372-3p、miR-0378b、miR-0424-5p、miR-0488-5p、miR-0498、miR-0512-3p、miR-0512-5p、miR-0580-3p、miR-0670-5p、miR-0671-5p、miR-0758-5p、miR-0933、miR-0937-3p、miR-0942-5p、miR-1178-3p、miR-1207-3p、miR-1224-3p、miR-1233-3p、miR-1233-5p、miR-1249-5p、miR-1266-3p、miR-2277-3p、miR-2277-5p、miR-3065-5p、miR-3122、miR-3135b、miR-3153、miR-3156-3p、miR-3158-5p、miR-3162-3p、miR-3174、miR-3180、miR-3529-5p、miR-3680-3p、miR-3689f、miR-4266、miR-4273、miR-4281、miR-4327、miR-4526、miR-4643、miR-4646-3p、miR-4675、miR-4698、miR-4706、miR-4718、miR-4728-3p、miR-4752、miR-4753-3p、miR-4801、miR-5192、miR-5195-5p、miR-5704、miR-6069、miR-6088、miR-6132、miR-6502-5p、miR-6505-3p、miR-6510-5p、miR-6511b-3p、miR-6516-5p、miR-6744-5p、miR-6749-3p、miR-6754-5p、miR-6757-3p、miR-6757-5p、miR-6765-5p、miR-6771-3p、miR-6775-5p、miR-6781-3p、miR-6800-5p、miR-6807-5p、miR-6811-3p、miR-6813-5p、miR-6822-5p、miR-6829-5p、miR-6832-3p、miR-6841-3p、miR-6845-3p、miR-6864-3p、miR-6865-5p、miR-6873-5p、miR-6877-3p、miR-6878-5p、miR-6881-5p、miR-6885-5p、miR-6886-5p、miR-7106-5p、miR-7111-3p、miR-7153-3p、miR-7848-3p、miR-7978、miR-8059、miR-0520b、miR-3605-5p、miR-3612、miR-4645-3p、miR-4694-3p、miR-6816-3p、miR-8087、miR-0015a-3p、miR-0135b-5p、miR-0185-5p、miR-0302d-5p、miR-0483-5p、miR-0671-3p、miR-1254、miR-1284、miR-1323、miR-3138、miR-3164、miR-3189-3p、miR-3200-5p、miR-3657、miR-3667-5p、miR-3692-5p、miR-3713、miR-4299、miR-4306、miR-4316、miR-4319、miR-4441、miR-4658、miR-5004-3p、miR-5194、miR-6083、miR-6720-5p、miR-6821-3p、miR-6832-5p、miR-6875-5p、miR-0001-5p、miR-0007-2-3p、miR-0025-5p、miR-0030c-1-3p、miR-0030c-2-3p、miR-0125a-3p、miR-0134-5p、miR-0146a-5p、miR-0183-3p、miR-0193a-5p、miR-0193b-3p、miR-0197-5p、miR-0198、miR-0212-5p、miR-0221-3p、miR-0299-5p、miR-0326、miR-0328-5p、miR-0374c-3p、miR-0423-5p、miR-0432-5p、miR-0433-5p、miR-0483-3p、miR-0505-5p、miR-0513a-5p、miR-0521、miR-0532-3p、miR-0550a-3-5p、miR-0550a-5p、miR-0550b-3p、miR-0551b-3p、miR-0589-3p、miR-0591、miR-0615-3p、miR-0642a-3p、miR-0642b-3p、miR-0650、miR-0652-5p、miR-0664b-3p、miR-0668-3p、miR-0675-5p、miR-0711、miR-0744-5p、miR-0764、miR-0939-3p、miR-1180-3p、miR-1185-1-3p、miR-1185-2-3p、miR-1193、miR-1199-3p、miR-1202、miR-1207-5p、miR-1228-5p、miR-1229-5p、miR-1238-5p、miR-1273h-5p、miR-1275、miR-1911-3p、miR-2276-3p、miR-2278、miR-2355-5p、miR-2861、miR-3074-5p、miR-3137、miR-3144-5p、miR-3147、miR-3184-5p、miR-3188、miR-3190-3p、miR-3202、miR-3610、miR-3622b-5p、miR-3666、miR-3679-5p、miR-3689d、miR-3911、miR-3918、miR-3919、miR-3927-5p、miR-3928-3p、miR-4251、miR-4259、miR-4265、miR-4271、miR-4279、miR-4288、miR-4290、miR-4294、miR-4298、miR-4301、miR-4322、miR-4329、miR-4419a、miR-4419b、miR-4447、miR-4462、miR-4472、miR-4476、miR-4483、miR-4484、miR-4492、miR-4496、miR-4499、miR-4513、miR-4523、miR-4632-5p、miR-4646-5p、miR-4655-5p、miR-4656、miR-4667-5p、miR-4685-5p、miR-4687-3p、miR-4697-5p、miR-4709-3p、miR-4722-3p、miR-4723-5p、miR-4726-3p、miR-4726-5p、miR-4728-5p、miR-4732-5p、miR-4739、miR-4743-5p、miR-4747-5p、miR-4748、miR-4751、miR-4756-5p、miR-4783-3p、miR-4788、miR-4800-5p、miR-5088-3p、miR-5698、miR-5702、miR-5739、miR-6085、miR-6086、miR-6087、miR-6124、miR-6133、miR-6501-5p、miR-6504-5p、miR-6513-3p、miR-6716-5p、miR-6727-3p、miR-6730-5p、miR-6733-3p、miR-6734-5p、miR-6735-3p、miR-6735-5p、miR-6741-5p、miR-6744-3p、miR-6745、miR-6746-5p、miR-6749-5p、miR-6750-5p、miR-6760-5p、miR-6769a-5p、miR-6769b-5p、miR-6774-5p、miR-6776-3p、miR-6779-5p、miR-6787-5p、miR-6788-3p、miR-6790-5p、miR-6792-5p、miR-6794-5p、miR-6797-5p、miR-6799-5p、miR-6803-5p、miR-6806-5p、miR-6812-5p、miR-6814-5p、miR-6815-5p、miR-6819-5p、miR-6822-3p、miR-6823-5p、miR-6824-5p、miR-6827-5p、miR-6830-5p、miR-6831-3p、miR-6831-5p、miR-6833-5p、miR-6842-5p、miR-6851-5p、miR-6858-5p、miR-6862-5p、miR-6866-3p、miR-6870-5p、miR-6872-5p、miR-6879-5p、miR-6883-5p、miR-6884-3p、miR-6891-5p、miR-6894-5p、miR-7107-5p、miR-7109-5p、miR-7110-3p、miR-7111-5p、miR-7112-5p、miR-7150、miR-7152-3p、miR-7154-3p、miR-7155-3p、miR-7706、miR-7843-5p、miR-7845-5p、miR-7846-3p、miR-7847-3p、miR-7973、miR-8052、miR-8058、miR-8074、miR-8089、miR-0378a-5p、miR-4489、miR-6511b-5p、miR-0187-5p、miR-0208a-5p、miR-0486-3p、miR-0511-5p、miR-0585-5p、miR-0643、miR-0663b、miR-1231、miR-3187-5p、miR-3665、miR-4446-3p、miR-4466、miR-4525、miR-4634、miR-4674、miR-4734、miR-4785、miR-4787-5p、miR-4794、miR-5008-5p、miR-6499-5p、miR-6510-3p、miR-6727-5p、miR-6814-3p、miR-6836-3p、miR-7704、miR-8069、miR-7849-3p、miR-0025-3p、miR-0092a-3p、miR-0092b-3p、miR-0099b-5p、miR-0128-1-5p、miR-0139-3p、miR-0149-5p、miR-0192-5p、miR-0205-5p、miR-0216b-3p、miR-0223-5p、miR-0346、miR-0371a-3p、miR-0378c、miR-0425-3p、miR-0503-3p、miR-0520a-3p、miR-0520h、miR-0548ay-3p、miR-0548q、miR-0557、miR-0631、miR-0636、miR-0638、miR-0659-3p、miR-0762、miR-0935、miR-1203、miR-1225-5p、miR-1237-5p、miR-1268a、miR-1469、miR-1539、miR-1909-3p、miR-1910-5p、miR-1914-5p、miR-2682-3p、miR-3064-5p、miR-3065-3p、miR-3130-3p、miR-3173-3p、miR-3178、miR-3
180-3p、miR-3196、miR-3935、miR-3937、miR-3940-5p、miR-3960、miR-4270、miR-4276、miR-4442、miR-4485-5p、miR-4488、miR-4505、miR-4508、miR-4632-3p、miR-4649-5p、miR-4676-3p、miR-4688、miR-4707-5p、miR-4708-5p、miR-4722-5p、miR-4730、miR-4738-3p、miR-4747-3p、miR-4761-3p、miR-4763-3p、miR-4773、miR-5196-3p、miR-5584-3p、miR-5787、miR-6089、miR-6090、miR-6508-5p、miR-6721-5p、miR-6722-5p、miR-6726-3p、miR-6729-5p、miR-6737-5p、miR-6738-5p、miR-6746-3p、miR-6767-3p、miR-6771-5p、miR-6784-5p、miR-6785-5p、miR-6786-5p、miR-6789-3p、miR-6789-5p、miR-6805-5p、miR-6816-5p、miR-6825-3p、miR-6833-3p、miR-6837-3p、miR-6847-3p、miR-6848-5p、miR-6850-5p、miR-6869-5p、miR-6871-3p、miR-6895-3p、miR-7155-5p、miR-7844-5p、miR-8072、miR-8485、およびmiR-9500が挙げられ、これらからなる群から選択される1以上のマイクロRNA(好ましくは、ヒトのマイクロRNA)を検出することができる。
これらの態様において、検出されるマイクロRNAの種類および指標として用いられるマイクロRNAの種類は、それぞれ独立して、例えば、1以上、2以上、3以上、4以上、5以上、6以上、7以上、8以上、9以上、10以上、20以上、30以上、40以上、50以上、60以上、70以上、80以上、90以上、100以上、200以上、300以上、400以上、500以上、600以上、700以上、800以上、900以上、1000以上、または1100以上とすることができる。これらの態様において、検出されるマイクロRNAの種類および指標として用いられるマイクロRNAの種類は、それぞれ独立して、例えば、2000以下、1900以下、1800以下、1700以下、1600以下、1500以下、1400以下、1300以下、1200以下、1100以下、1000以下、900以下、800以下、700以下、600以下、500以下、400以下、300以下、200以下、100以下、90以下、80以下、70以下、60以下、50以下、40以下、30以下、20以下、または10以下とすることができる。検出されるマイクロRNAの種類および指標として用いられるマイクロRNAの種類は、完全に同一であり得るが、または検出されるマイクロRNAの一部を指標として用い得る。
検出した後は、当該マイクロRNAの発現量や存在の有無を指標として本開示の通りにがんの診断を行い得る。がんである可能性を有すると診断された患者に対しては、治療(例えば、化学療法、抗がん剤療法、外科手術、免疫療法、及び放射線療法などのがん療法)を行い得る。
マイクロRNAは、体液中では、遊離形態および/またはEV内包型形態で存在し得る。従って、本開示によれば、マイクロRNAは、尿および尿の抽出物中では、遊離形態および/またはEV(特にエクソソームおよび/またはマイクロベシクル)内包型形態で存在し得る。
マイクロRNAの回収は、体液と本開示のナノワイヤ組み込みデバイスのナノワイヤとを接触させることによって行うことができる。マイクロRNAの回収は、ナノワイヤが正の表面電荷を有する条件下で行われ得る。例えば、ナノワイヤが正の表面電荷を有するpH条件下で体液とナノワイヤを接触させることによって、遊離形態およびEV内包形態のマイクロRNAはナノワイヤ上に捕捉することができる。従って、体液は、ナノワイヤが正の表面電荷を有するようにpHを調整されていてもよい。あるいは、体液のpHに適合するように、当該体液中で正の表面電荷を有する材質でナノワイヤが作られていてもよい。本開示のある態様では、体液のpHを調整することと、体液と本開示のナノワイヤ組み込みデバイスのナノワイヤとを接触させることを含む。体液のpHは、ナノワイヤと接触させる前、後、または接触中に、調整することができる。本開示のある実施形態では、体液のpHは、2、3、4、または5などの値より大きくてもそれ以上になるように調整されてもよい。体液のpHは、10、9、8、7、6、または5などの値より小さくてもそれ以下になるように調整されてもよい。本開示のある実施形態では、尿のpHは、6~8に調整されてもよい。本発明のある実施形態では、体液は尿であり、そのpHは6~8であるか、またはpH6~8に調整された尿である。本発明のある実施形態では、ナノワイヤは、酸化亜鉛のナノワイヤであるか、または酸化亜鉛で被覆されたナノワイヤであり得る。
本開示のある態様では/いくつかの実施形態では、実質的にナノワイヤは基板上に直接成長していてもよく(すわなち、組み込まれていなくてもよく)、および、基板内にその一部が組み込まれていてもよい。基板の素材は特に制限はなくポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリスチレン、ポリ酢酸ビニル、ポリテトラフルオロエチレン、ABS(アクリロニトリルブタジエンスチレン)樹脂、AS(アクリロニトリルスチレン)樹脂、アクリル樹脂(PMMA)等の熱可塑性樹脂;フェノール樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、尿素樹脂、不飽和ポリエステル樹脂、アルキド樹脂、ポリウレタン、ポリイミド、シリコーンゴム、ポリメチルメタクリレート(PMMA)、およびポリカーボネート(PC)から選択される素材であってもよい。
本開示のある態様では/いくつかの実施形態では、ナノワイヤのシード層(触媒層)として、金属および金属酸化物、例えばプラチナ、アルミニウム、銅、鉄、コバルト、銀、錫、インジウム、亜鉛、ガリウム、クロム、および、それらの酸化物を用いることができる。シード層からナノワイヤを成長させ、その後、上記基板の素材(液体形態である)をナノワイヤ上に注いで硬化させ、ナノワイヤを基板の素材中に組込むことができる。その後、基板から露出したナノワイヤからさらにナノワイヤを成長させることにより、基板に組込まれたナノワイヤを調製することができる。ナノワイヤが基板から露出していない場合には、適宜、切断及び/又は研磨することによりナノワイヤを露出させることができる。そのようにして得られるナノワイヤ組み込み基板は、本開示のデバイスにおいて、ナノワイヤを固定化した基板として用いることができ、物理化学的耐性が高く、有用であり得る。
ナノワイヤと体液試料とを接触させることによって、ナノワイヤ上にEVや遊離形態の小分子RNAが捕捉される。捕捉されたEV中に含まれる小分子RNAや遊離形態の小分子RNAは、緩衝液によってナノワイヤから解離させることにより取得することができる。ナノワイヤから小分子RNAを取得する際には、例えば、非イオン性界面活性剤を含む緩衝液を用いることができる。緩衝液には、RNaseの阻害剤が含まれていてもよい。
本開示によれば、データS1(または表3)および表2のいずれか1以上のまたは全てのマイクロRNAを含む尿の抽出物は、検査液に溶液置換されていてもよく、検査液の溶液組成を有していてもよい。
マイクロRNAの検査液は、マイクロRNA等のncRNAの存在や存在量を確認するための検査に適した溶液組成を有し得る。検査液は、例えば、界面活性剤(例えば、非イオン性界面活性剤)、塩(例えば、ナトリウム、およびカリウムなど)、核酸の安定化剤(例えば、RNA分解酵素の阻害剤等)、pH調整剤(例えば、緩衝剤)および水からなる群から選択される1以上または全てを含んでいてもよい。
マイクロRNAの検出は、定量的PCR法、miRNA検出用のマイクロアレイ、RNA-Seq法、およびマルチプレックスmiRNAプロファイリング法などの当業者に周知のmiRNAの検出方法を用いて行うことができる。本開示では、本開示のデバイスでマイクロRNAを抽出することにより得られる尿抽出物は、例えば、500種類以上のmiRNAを含み得る。そのため、これら全てのmiRNAの発現を確認するには、例えば、miRNA検出用のマイクロアレイ、RNA-Seq法、およびマルチプレックスmiRNAプロファイリング法などを用いることができる。また、尿抽出物中の特定のmiRNAの1つまたはいくつかを検出するには、定量的PCR法やマルチプレックスmiRNAプロファイリング法などを用いることができる。
マイクロアレイによるmiRNAの検出と分析は、miRNAを標識すること(例えば、標識として蛍光標識を用い得る)と、バイダイゼーション用の溶液を調製することと、試料中のmiRNAとマイクロアレイ上の核酸等のmiRNA検出試薬とをハイブリダイゼーションすることと、マイクロアレイを洗浄することと、その後、標識量(例えば、蛍光量)を測定することとを含みうる。抽出したRNAサンプルは、例えば、当業者に周知の方法または市販の装置及びキット{例えば、アジレント・テクノロジー株式会社製のAgilent 2100 BioanalyzerとRNA LabChip}を使用して20~30ヌクレオチドのサイズにピークが現れることを指標として、RNAサンプルの品質を確認してもよい。miRNAの標識は、例えば、当業者に周知の方法や市販のキット{例えば、3D-Gene(商標)miRNA labeling kit(東レ株式会社製)}を用いて行うことができる。また例えば、マイクロアレイによるmiRNAの分析は、東レ株式会社製の3D-Gene(商標)Human/Mouse/Rat/4animal miRNA Olico chip‐4plexを用いて、当該製品の製造者取扱説明書に従って行うことができる。
マイクロRNAを検出するためのマイクロアレイとしては、
データS1(または表3)において、例えば、がんである対象3人において非がんである対象3人のいずれよりも高い発現を示したマイクロRNA群から選択される1つ以上に対するプローブを含むマイクロアレイ;
データS1(または表3)において、例えば、がんである対象において非がんである対象よりも高い発現を示したマイクロRNA(例えば、2倍以上、3倍以上、4以上、5以上、6以上、7以上、8以上、9以上、または10以上)の群からされる1つ以上に対するプローブを含むマイクロアレイ;
データS1(または表3)において、例えば、がんである対象3人において非がんである対象3人のいずれよりも低い発現を示したマイクロRNA群から選択される1つ以上に対するプローブを含むマイクロアレイ;
データS1(または表3)において、例えば、がんである対象3人において非がんである対象3人のいずれよりも低い発現を示したマイクロRNA(例えば、2倍以上、3倍以上、4以上、5以上、6以上、7以上、8以上、9以上、または10以上)のマイクロRNAの群からされる1つ以上に対するプローブを含むマイクロアレイが上げられる。この態様において、検出されるマイクロRNAの種類(すなわち、マイクロアレイが搭載するプローブの種類)は、例えば、1以上、2以上、3以上、4以上、5以上、6以上、7以上、8以上、9以上、10以上、20以上、30以上、40以上、50以上、60以上、70以上、80以上、90以上、100以上、200以上、300以上、400以上、500以上、600以上、700以上、800以上、900以上、1000以上、または1100以上とすることができる。これらの態様において、検出されるマイクロRNAの種類(すなわち、マイクロアレイが搭載するプローブの種類)は、例えば、2000以下、1900以下、1800以下、1700以下、1600以下、1500以下、1400以下、1300以下、1200以下、1100以下、1000以下、900以下、800以下、700以下、600以下、500以下、400以下、300以下、200以下、100以下、90以下、80以下、70以下、60以下、50以下、40以下、30以下、20以下、または10以下とすることができる。マイクロアレイにおけるマイクロRNAに対するプローブは、当該マイクロRNAに対してハイブリダイズすることができる核酸およびその誘導体とすることができ、当業者であれば適宜設計することができる。
マイクロアレイによるmiRNAの検出と分析は、miRNAを標識すること(例えば、標識として蛍光標識を用い得る)と、バイダイゼーション用の溶液を調製することと、試料中のmiRNAとマイクロアレイ上の核酸等のmiRNA検出試薬とをハイブリダイゼーションすることと、マイクロアレイを洗浄することと、その後、標識量(例えば、蛍光量)を測定することとを含みうる。抽出したRNAサンプルは、例えば、当業者に周知の方法または市販の装置及びキット{例えば、アジレント・テクノロジー株式会社製のAgilent 2100 BioanalyzerとRNA LabChip}を使用して20~30ヌクレオチドのサイズにピークが現れることを指標として、RNAサンプルの品質を確認してもよい。miRNAの標識は、例えば、当業者に周知の方法や市販のキット{例えば、3D-Gene(商標)miRNA labeling kit(東レ株式会社製)}を用いて行うことができる。また例えば、マイクロアレイによるmiRNAの分析は、東レ株式会社製の3D-Gene(商標)Human/Mouse/Rat/4animal miRNA Olico chip‐4plexを用いて、当該製品の製造者取扱説明書に従って行うことができる。
マイクロRNAを検出するためのマイクロアレイとしては、
データS1(または表3)において、例えば、がんである対象3人において非がんである対象3人のいずれよりも高い発現を示したマイクロRNA群から選択される1つ以上に対するプローブを含むマイクロアレイ;
データS1(または表3)において、例えば、がんである対象において非がんである対象よりも高い発現を示したマイクロRNA(例えば、2倍以上、3倍以上、4以上、5以上、6以上、7以上、8以上、9以上、または10以上)の群からされる1つ以上に対するプローブを含むマイクロアレイ;
データS1(または表3)において、例えば、がんである対象3人において非がんである対象3人のいずれよりも低い発現を示したマイクロRNA群から選択される1つ以上に対するプローブを含むマイクロアレイ;
データS1(または表3)において、例えば、がんである対象3人において非がんである対象3人のいずれよりも低い発現を示したマイクロRNA(例えば、2倍以上、3倍以上、4以上、5以上、6以上、7以上、8以上、9以上、または10以上)のマイクロRNAの群からされる1つ以上に対するプローブを含むマイクロアレイが上げられる。この態様において、検出されるマイクロRNAの種類(すなわち、マイクロアレイが搭載するプローブの種類)は、例えば、1以上、2以上、3以上、4以上、5以上、6以上、7以上、8以上、9以上、10以上、20以上、30以上、40以上、50以上、60以上、70以上、80以上、90以上、100以上、200以上、300以上、400以上、500以上、600以上、700以上、800以上、900以上、1000以上、または1100以上とすることができる。これらの態様において、検出されるマイクロRNAの種類(すなわち、マイクロアレイが搭載するプローブの種類)は、例えば、2000以下、1900以下、1800以下、1700以下、1600以下、1500以下、1400以下、1300以下、1200以下、1100以下、1000以下、900以下、800以下、700以下、600以下、500以下、400以下、300以下、200以下、100以下、90以下、80以下、70以下、60以下、50以下、40以下、30以下、20以下、または10以下とすることができる。マイクロアレイにおけるマイクロRNAに対するプローブは、当該マイクロRNAに対してハイブリダイズすることができる核酸およびその誘導体とすることができ、当業者であれば適宜設計することができる。
実施例1:ポリジメチルシロキサン(PDMS)上に固定されたナノワイヤの作製
Si(100)基板(Advantech Co.Ltd.)を洗浄した後に(図6a参照)、正フォトレジスト(OFPR8600,Tokyo Ohka Kogyo Co.Ltd.)でSi基板上を被覆し、次いで、フォトリソグラフィによってチャンネルパターンを形成した(図6b参照)。スパッタリングによってその基板上に140nm厚のCr層(触媒層)を堆積させた(図6b参照)。フォトレジストの除去後に(図6d参照)、Cr層を400℃で2時間、熱酸化処理した。このCr層は、ZnOナノワイヤの成長のためのシード層とした。ZnOナノワイヤは、得られた基板を15mMヘキサメチレンテトラミン(HMTA;Wako Pure Chemical Industries Ltd.)と15mM硝酸亜鉛6水和物(Thermo Fisher Scientific Inc.)の混合溶液中に95℃で3時間浸漬することによって成長させた(図6e参照)。基板上で成長したナノワイヤは、Millipore水を用いて洗浄し、真空デシケーター中で一晩空気乾燥させた。その後、PDMS(Silpot 184,Dow Corning Corp.)をナノワイヤが成長した基板上に注ぎ、硬化させた(図6f参照)。基板からPDMSを剥がすと、ナノワイヤは、基板からPDMSに転写された。転写されたなのワイヤは、頭部を僅かに露出させつつ、PDMSに均一に深く埋め込まれており(図6h参照)(この埋め込まれた状態を本明細書では「組み込み」と述べることがある)、その頭部は、二次的ナノワイヤのための成長点を提供した。二次的ナノワイヤの成長は、15mM HMTAと15mM硝酸亜鉛6水和物の混合溶液中で、得られたPDMSを95℃で3時間浸漬することにより行った(図6i参照)。ナノワイヤを埋め込んだPDMS基板をMillipore水で洗浄した後に、真空デシケーター中で空気乾燥させ、ナノワイヤの直径とナノワイヤ間の間隔を電界放出型走査型電子顕微鏡(FESEM)(SUPRA 40VP,Carl Zeiss)を用いて測定した。
Si(100)基板(Advantech Co.Ltd.)を洗浄した後に(図6a参照)、正フォトレジスト(OFPR8600,Tokyo Ohka Kogyo Co.Ltd.)でSi基板上を被覆し、次いで、フォトリソグラフィによってチャンネルパターンを形成した(図6b参照)。スパッタリングによってその基板上に140nm厚のCr層(触媒層)を堆積させた(図6b参照)。フォトレジストの除去後に(図6d参照)、Cr層を400℃で2時間、熱酸化処理した。このCr層は、ZnOナノワイヤの成長のためのシード層とした。ZnOナノワイヤは、得られた基板を15mMヘキサメチレンテトラミン(HMTA;Wako Pure Chemical Industries Ltd.)と15mM硝酸亜鉛6水和物(Thermo Fisher Scientific Inc.)の混合溶液中に95℃で3時間浸漬することによって成長させた(図6e参照)。基板上で成長したナノワイヤは、Millipore水を用いて洗浄し、真空デシケーター中で一晩空気乾燥させた。その後、PDMS(Silpot 184,Dow Corning Corp.)をナノワイヤが成長した基板上に注ぎ、硬化させた(図6f参照)。基板からPDMSを剥がすと、ナノワイヤは、基板からPDMSに転写された。転写されたなのワイヤは、頭部を僅かに露出させつつ、PDMSに均一に深く埋め込まれており(図6h参照)(この埋め込まれた状態を本明細書では「組み込み」と述べることがある)、その頭部は、二次的ナノワイヤのための成長点を提供した。二次的ナノワイヤの成長は、15mM HMTAと15mM硝酸亜鉛6水和物の混合溶液中で、得られたPDMSを95℃で3時間浸漬することにより行った(図6i参照)。ナノワイヤを埋め込んだPDMS基板をMillipore水で洗浄した後に、真空デシケーター中で空気乾燥させ、ナノワイヤの直径とナノワイヤ間の間隔を電界放出型走査型電子顕微鏡(FESEM)(SUPRA 40VP,Carl Zeiss)を用いて測定した。
尿の細胞外小胞(EV)内包タイプのmiRNAのin situ抽出が可能なナノワイヤ組み込みマイクロ流体デバイス
尿のEV内包タイプのmiRNAのin situ抽出のためのナノワイヤ組み込みマイクロ流体デバイスは、ナノワイヤ組み込みPDMS基板とヘリングボーン構造のPDMS基板とを接着させることによって作製した。ヘリンボン構造のPDMS基板は、12μmの高さのヘリングボーン構造を伴うマイクロチャンネル(幅、2mm;長さ、2cm;及び高さ、50μm)を有した。ナノワイヤ組み込みPDMS基板とヘリングボーン構造のPDMS基板の表面をプラズマエッチング装置(Meiwafosis Co.Ltd.)で処理し、接着させた。この接着デバイスは、180℃で3分間加熱し、強い接着を達成させた(図6J参照)。次に、ヘリングボーン構造のPDMSを注入口および出口に関してポリエーテルエーテルケトン(PEEK)チューブ[0.5mm(外径)×0.26mm(内径);長さ、10cm;Institute of Microchemical Technology Co.Ltd.]に連結させた。このようにして表題のin situ抽出が可能なナノワイヤ組み込みマイクロ流体デバイス(以下、単に「ナノワイヤ組み込みデバイス」または「本開示のデバイス」ともいう)を得た。マイクロ流体ヘリングボーン構造は、回収効率の向上に寄与した(図15参照)。
尿のEV内包タイプのmiRNAのin situ抽出のためのナノワイヤ組み込みマイクロ流体デバイスは、ナノワイヤ組み込みPDMS基板とヘリングボーン構造のPDMS基板とを接着させることによって作製した。ヘリンボン構造のPDMS基板は、12μmの高さのヘリングボーン構造を伴うマイクロチャンネル(幅、2mm;長さ、2cm;及び高さ、50μm)を有した。ナノワイヤ組み込みPDMS基板とヘリングボーン構造のPDMS基板の表面をプラズマエッチング装置(Meiwafosis Co.Ltd.)で処理し、接着させた。この接着デバイスは、180℃で3分間加熱し、強い接着を達成させた(図6J参照)。次に、ヘリングボーン構造のPDMSを注入口および出口に関してポリエーテルエーテルケトン(PEEK)チューブ[0.5mm(外径)×0.26mm(内径);長さ、10cm;Institute of Microchemical Technology Co.Ltd.]に連結させた。このようにして表題のin situ抽出が可能なナノワイヤ組み込みマイクロ流体デバイス(以下、単に「ナノワイヤ組み込みデバイス」または「本開示のデバイス」ともいう)を得た。マイクロ流体ヘリングボーン構造は、回収効率の向上に寄与した(図15参照)。
断面FESEM像のEDS元素マッピング
ナノワイヤを有しないPDMS、ナノワイヤが埋没したPDMS(すなわち、ナノワイヤが露出していないPDMS)、及びZnOナノワイヤ組み込みPDMSの元素マッピングは、EDS機能を備えたFESEM(JSM-7610F,Jeol)によって得た。上面視像及び断面像に対しては、それぞれ5keV及び30keVの加速電圧条件を用いた。像は、512×384ピクセルであり、各ピクセルの遅延時間は0.1秒であった。像は、100サイクルに対して統合された。Si Kα(1.739keV)及びZn Lα(1.012keV)のピークを選択して、元素マッピング像を構築した。ZnO-Al2O3のコア-シェルナノワイヤの元素マッピングは、30keVの加速電圧条件でEDS機能を備えたFESEMによって実施した。走査透過電子顕微鏡(STEM)試料の調製のために、通常の切断刀を用いて基板からナノワイヤを切り取り、回収して密着法によってTEMグリッド(炭素マイクログリッドを備えたCuメッシュ,JEOL)上に載せ替えた。STEM像は、512×384ピクセルであり、各ピクセルの遅延時間は0.1msであった。像は、100サイクルに対して統合された。Zn Kα(8.630keV)、O Kα(0.525keV)、およびAl Kα(1.486keV)のピークを選択して、元素マッピング像を構築した。
ナノワイヤを有しないPDMS、ナノワイヤが埋没したPDMS(すなわち、ナノワイヤが露出していないPDMS)、及びZnOナノワイヤ組み込みPDMSの元素マッピングは、EDS機能を備えたFESEM(JSM-7610F,Jeol)によって得た。上面視像及び断面像に対しては、それぞれ5keV及び30keVの加速電圧条件を用いた。像は、512×384ピクセルであり、各ピクセルの遅延時間は0.1秒であった。像は、100サイクルに対して統合された。Si Kα(1.739keV)及びZn Lα(1.012keV)のピークを選択して、元素マッピング像を構築した。ZnO-Al2O3のコア-シェルナノワイヤの元素マッピングは、30keVの加速電圧条件でEDS機能を備えたFESEMによって実施した。走査透過電子顕微鏡(STEM)試料の調製のために、通常の切断刀を用いて基板からナノワイヤを切り取り、回収して密着法によってTEMグリッド(炭素マイクログリッドを備えたCuメッシュ,JEOL)上に載せ替えた。STEM像は、512×384ピクセルであり、各ピクセルの遅延時間は0.1msであった。像は、100サイクルに対して統合された。Zn Kα(8.630keV)、O Kα(0.525keV)、およびAl Kα(1.486keV)のピークを選択して、元素マッピング像を構築した。
ナノワイヤ組み込みマイクロ流体デバイスを用いた尿のEV内包型miRNAのin situ抽出
市販の尿(単一ドナーのヒト尿、Innovative Research Inc.)を使用前に遠心分離(15分、4℃、3000g)し、アポトーシス小体を除去した(文献5参照)。その後、1mL尿サンプルをシリンジポンプ(KDS-200,KD Scientific Inc.)を用いて50μL/分の流速でナノワイヤ組み込みデバイスに導入した。ナノワイヤ上に回収されたEVからのmiRNAの抽出は、細胞溶解緩衝液M[20mM tris-HCl(pH7.4),200mM塩化ナトリウム,2.5mM塩化マグネシウム,および0.05w/v% NP-40;Wako Pure Chemical Industries Ltd.]をシリンジポンプを用いて50μL/分の流速でナノワイヤ組み込みデバイスに導入することによって実施した。ナノワイヤの剥離を研究する実験においても同じ溶解緩衝液を50μL/分の流速で使用した(図1I~K、および図9)。
市販の尿(単一ドナーのヒト尿、Innovative Research Inc.)を使用前に遠心分離(15分、4℃、3000g)し、アポトーシス小体を除去した(文献5参照)。その後、1mL尿サンプルをシリンジポンプ(KDS-200,KD Scientific Inc.)を用いて50μL/分の流速でナノワイヤ組み込みデバイスに導入した。ナノワイヤ上に回収されたEVからのmiRNAの抽出は、細胞溶解緩衝液M[20mM tris-HCl(pH7.4),200mM塩化ナトリウム,2.5mM塩化マグネシウム,および0.05w/v% NP-40;Wako Pure Chemical Industries Ltd.]をシリンジポンプを用いて50μL/分の流速でナノワイヤ組み込みデバイスに導入することによって実施した。ナノワイヤの剥離を研究する実験においても同じ溶解緩衝液を50μL/分の流速で使用した(図1I~K、および図9)。
EV回収と超遠心を用いた尿中miRNAの抽出(超遠心法)
市販の尿(単一ドナーのヒト尿)を使用前に遠心分離(15分、4℃、3000g)し、アポトーシス小体を除去した(文献5参照)。その後、尿を遠心分離(15分、4℃、12000g)して細胞の残骸を除去した(文献29参照)。次に、20mLの尿サンプルを超遠心(2時間、4℃、110,000g)した(文献29参照)。上清を取り除き、回収されたEVに対して0.22μmフィルタでろ過したリン酸緩衝生理食塩水(PBS;Thermo Fisher Scientific Inc.)を20mL添加して、さらに超遠心した(70分、4℃、110,000g)。上清を取り除き、回収されたEVに対して0.22μmフィルタでろ過したリン酸緩衝生理食塩水(PBS;Thermo Fisher Scientific Inc.)を20mL添加して、3度目の超遠心(70分、4℃、110,000g)を行った。最後に、上清を除去し、溶解緩衝液を加えてmiRNAを抽出した。
市販の尿(単一ドナーのヒト尿)を使用前に遠心分離(15分、4℃、3000g)し、アポトーシス小体を除去した(文献5参照)。その後、尿を遠心分離(15分、4℃、12000g)して細胞の残骸を除去した(文献29参照)。次に、20mLの尿サンプルを超遠心(2時間、4℃、110,000g)した(文献29参照)。上清を取り除き、回収されたEVに対して0.22μmフィルタでろ過したリン酸緩衝生理食塩水(PBS;Thermo Fisher Scientific Inc.)を20mL添加して、さらに超遠心した(70分、4℃、110,000g)。上清を取り除き、回収されたEVに対して0.22μmフィルタでろ過したリン酸緩衝生理食塩水(PBS;Thermo Fisher Scientific Inc.)を20mL添加して、3度目の超遠心(70分、4℃、110,000g)を行った。最後に、上清を除去し、溶解緩衝液を加えてmiRNAを抽出した。
EV回収と市販のキットを用いたmiRNAの抽出(ポリマー沈殿法)
市販の尿(単一ドナーのヒト尿)を使用前に遠心分離(15分、4℃、3000g)し、アポトーシス小体を除去した。EVをキット(ExoQuick-TC,System Biosciences Inc.)の製造者取扱説明書に従って、1mLの尿サンプルから回収した。最後に、溶解緩衝液を添加してmiRNAを抽出した。
市販の尿(単一ドナーのヒト尿)を使用前に遠心分離(15分、4℃、3000g)し、アポトーシス小体を除去した。EVをキット(ExoQuick-TC,System Biosciences Inc.)の製造者取扱説明書に従って、1mLの尿サンプルから回収した。最後に、溶解緩衝液を添加してmiRNAを抽出した。
miRNAの発現のマイクロアレイ分析
miRNAの発現プロファイルは、東レ社の3D-Gene(Toray Industries)ヒトmiRNAチップを用いた。溶解緩衝液で抽出されたmiRNAは、SeraMir Exosome RNA Purification Col-umn Kit(System Biosciences Inc.)を用いてその製造者取扱説明書に従って精製した。15μLの精製miRNAを3D-Gene Human miRNA Oligo chip ver.21(Toray Industries)を用いたmiRNAのプロファイリングのために分析した。miRNAの発現のマイクロアレイ分析では、シグナル強度それぞれが一種のmiRNAに対応する。各miRNAの発現レベルは、各マイクロアレイにおけるすべてのmiRNAのシグナル強度(バックグラウンドを控除したもの)として表現される。同一の尿のmiRNAサンプルにおけるナノワイヤ組み込みデバイスを用いた抽出と遠心分離または市販のキットを用いた抽出とによるmiRNA間の発現レベルの対比においては、シグナル強度は全体を通して標準化された。全体を通して標準化され、10以上の強度(ナノワイヤ組み込みデバイスを用いた抽出による強度/超遠心または市販のキットを用いた抽出による強度)を示したものに対して散布図を作成した。従って、散布図上の各点は、標準化された強度である。同一の尿のmiRNAサンプルにおけるナノワイヤ組み込みデバイスを用いた抽出と遠心分離または市販のキットを用いた抽出とによるmiRNA間の発現レベルの対比に関しては、シグナル強度がlog2変換された。がんドナーのおよび非がんドナーの尿サンプル間でのmiRNAの比較に関しては、各サンプルの全体を通して標準化された強度がlog2変換された。標準化された強度は、ヒートマップ上では黒(強度=5)、青(強度≦2)および黄(強度≧8)で示された。
miRNAの発現プロファイルは、東レ社の3D-Gene(Toray Industries)ヒトmiRNAチップを用いた。溶解緩衝液で抽出されたmiRNAは、SeraMir Exosome RNA Purification Col-umn Kit(System Biosciences Inc.)を用いてその製造者取扱説明書に従って精製した。15μLの精製miRNAを3D-Gene Human miRNA Oligo chip ver.21(Toray Industries)を用いたmiRNAのプロファイリングのために分析した。miRNAの発現のマイクロアレイ分析では、シグナル強度それぞれが一種のmiRNAに対応する。各miRNAの発現レベルは、各マイクロアレイにおけるすべてのmiRNAのシグナル強度(バックグラウンドを控除したもの)として表現される。同一の尿のmiRNAサンプルにおけるナノワイヤ組み込みデバイスを用いた抽出と遠心分離または市販のキットを用いた抽出とによるmiRNA間の発現レベルの対比においては、シグナル強度は全体を通して標準化された。全体を通して標準化され、10以上の強度(ナノワイヤ組み込みデバイスを用いた抽出による強度/超遠心または市販のキットを用いた抽出による強度)を示したものに対して散布図を作成した。従って、散布図上の各点は、標準化された強度である。同一の尿のmiRNAサンプルにおけるナノワイヤ組み込みデバイスを用いた抽出と遠心分離または市販のキットを用いた抽出とによるmiRNA間の発現レベルの対比に関しては、シグナル強度がlog2変換された。がんドナーのおよび非がんドナーの尿サンプル間でのmiRNAの比較に関しては、各サンプルの全体を通して標準化された強度がlog2変換された。標準化された強度は、ヒートマップ上では黒(強度=5)、青(強度≦2)および黄(強度≧8)で示された。
EVのゼータ電位
超遠心工程の後で、EVのゼータ電位を動的光散乱装置(Zetasizer Nano ZS,Malvern Instruments Ltd.)を用いて測定した。
超遠心工程の後で、EVのゼータ電位を動的光散乱装置(Zetasizer Nano ZS,Malvern Instruments Ltd.)を用いて測定した。
尿の遊離浮遊物のサイズ分布と濃度
尿の遊離浮遊物のサイズ分布と濃度は、nanoparticle analyzing system(NanoSight,Malvern Instruments Ltd.)を用いて測定した。未処理の尿における、ナノワイヤ組み込みデバイスで処理された尿のフロースルー分画における、および超遠心後の尿における尿の遊離浮遊物の濃度は、それぞれ2.6×1012ml-1、5.8×109ml-1、および3.5×109ml-1であった。尿の遊離浮遊物のサイズ分布および濃度は、100-nm nanopore membrane(NP100,Meiwafosis Co.Ltd.)を装着したnanoparticle detector(qNano,Meiwafosis Co.Ltd.)を用いて測定した。未処理の尿における、ナノワイヤ組み込みデバイスで処理された尿のフロースルー分画における、および超遠心後の尿における尿の遊離浮遊物の濃度は、それぞれ1.4×1012ml-1、2.4×1010ml-1、および2.5×1010ml-1であった。
尿の遊離浮遊物のサイズ分布と濃度は、nanoparticle analyzing system(NanoSight,Malvern Instruments Ltd.)を用いて測定した。未処理の尿における、ナノワイヤ組み込みデバイスで処理された尿のフロースルー分画における、および超遠心後の尿における尿の遊離浮遊物の濃度は、それぞれ2.6×1012ml-1、5.8×109ml-1、および3.5×109ml-1であった。尿の遊離浮遊物のサイズ分布および濃度は、100-nm nanopore membrane(NP100,Meiwafosis Co.Ltd.)を装着したnanoparticle detector(qNano,Meiwafosis Co.Ltd.)を用いて測定した。未処理の尿における、ナノワイヤ組み込みデバイスで処理された尿のフロースルー分画における、および超遠心後の尿における尿の遊離浮遊物の濃度は、それぞれ1.4×1012ml-1、2.4×1010ml-1、および2.5×1010ml-1であった。
EVの蛍光分子標識
EVの脂質二重層に透過することができる蛍光分子であるPKH26(励起光/蛍光=551/567nm;Sigma-Aldrich Co.LLC)を用いてEVを標識した。0.22-μmフィルタにてろ過したMillipore水(240μL)中で、1.5×108ml-1のEVに対してPKH26を5mg添加した。PKH26で標識されたEVは、シリンジポンプを用いて10μl/分の流速でナノワイヤ組み込みデバイスに導入され、次いで、Millipore水を同じ流速でナノワイヤ組み込みデバイスに導入して、未回収のEV(ナノワイヤに結合しなかったEV)を除去した。最後に、蛍光顕微鏡(AZ100,Nikon Corp.)を用いてEVの蛍光を観察した。その後、ナノワイヤ組み込みデバイスを剥離し、FESEM(SUPRA 40VP,Carl Zeiss)を用いてEVを回収したナノワイヤを観察した。
EVの脂質二重層に透過することができる蛍光分子であるPKH26(励起光/蛍光=551/567nm;Sigma-Aldrich Co.LLC)を用いてEVを標識した。0.22-μmフィルタにてろ過したMillipore水(240μL)中で、1.5×108ml-1のEVに対してPKH26を5mg添加した。PKH26で標識されたEVは、シリンジポンプを用いて10μl/分の流速でナノワイヤ組み込みデバイスに導入され、次いで、Millipore水を同じ流速でナノワイヤ組み込みデバイスに導入して、未回収のEV(ナノワイヤに結合しなかったEV)を除去した。最後に、蛍光顕微鏡(AZ100,Nikon Corp.)を用いてEVの蛍光を観察した。その後、ナノワイヤ組み込みデバイスを剥離し、FESEM(SUPRA 40VP,Carl Zeiss)を用いてEVを回収したナノワイヤを観察した。
膜タンパク質の検出
ナノワイヤ組み込みデバイスにEVを導入した後にPBSを導入して未回収のEVを除去した。その後、当該デバイスに1%ウシ血清アルブミン(BSA)溶液(Kirkegaard & Perry Labora-tories Inc.)を導入して15分間静置した。PBSを用いて当該デバイスを洗浄し、Alexa Fluor488標識したマウス抗ヒトCD63モノクローナル抗体(10μg/ml;Santa Cruz Biotechnology Inc.)またはマウス抗ヒトCD81モノクローナル抗体(10μg/ml;Abcam PLC)を当該デバイスに導入し、15分間静置した。CD81の検出においては、当該デバイスを洗浄した後にAlexa Fluor488標識のヤギ抗マウスIgGポリクローナル抗体を二次抗体として当該デバイスに導入し、その後15分間静置した。最後に、PBSで当該デバイスを洗浄し、蛍光顕微鏡(Olympus Co.Ltd.)下で蛍光強度を観察した。バックグラウンドの値を得るために、EVサンプルの代わりにPBSを用いた。96穴プレート(Nunc Co.Ltd.)を用いた検出に関しては、プレートの穴にEVサンプルを注入し、6時間静置し、その後、穴をPBSで洗浄した。プレートの穴に1%BSA溶液を導入し、90分間静置した。その後、PBSで穴を洗浄し、Alexa Fluor488標識したマウス抗ヒトCD63モノクローナル抗体(10μg/ml)またはマウス抗ヒトCD81抗体(10μg/ml)をプレートの穴に導入し、45分間静置した。CD81の検出ではこれに加えて、PBSでプレートの穴を洗浄した後に、Alexa Fluor488標識のヤギ抗マウスIgGポリクローナル抗体(5μg/ml)を二次抗体としてプレートの穴に導入し、その後45分間静置した。最後に、PBSでプレートの穴を洗浄し、プレートリーダー(POLARstar OPTIMA,BMG Labtech Japan Ltd.)を用いて蛍光強度観察を行った。バックグラウンドの値を得るため、EVサンプルの代わりにPBSを用いた。
ナノワイヤ組み込みデバイスにEVを導入した後にPBSを導入して未回収のEVを除去した。その後、当該デバイスに1%ウシ血清アルブミン(BSA)溶液(Kirkegaard & Perry Labora-tories Inc.)を導入して15分間静置した。PBSを用いて当該デバイスを洗浄し、Alexa Fluor488標識したマウス抗ヒトCD63モノクローナル抗体(10μg/ml;Santa Cruz Biotechnology Inc.)またはマウス抗ヒトCD81モノクローナル抗体(10μg/ml;Abcam PLC)を当該デバイスに導入し、15分間静置した。CD81の検出においては、当該デバイスを洗浄した後にAlexa Fluor488標識のヤギ抗マウスIgGポリクローナル抗体を二次抗体として当該デバイスに導入し、その後15分間静置した。最後に、PBSで当該デバイスを洗浄し、蛍光顕微鏡(Olympus Co.Ltd.)下で蛍光強度を観察した。バックグラウンドの値を得るために、EVサンプルの代わりにPBSを用いた。96穴プレート(Nunc Co.Ltd.)を用いた検出に関しては、プレートの穴にEVサンプルを注入し、6時間静置し、その後、穴をPBSで洗浄した。プレートの穴に1%BSA溶液を導入し、90分間静置した。その後、PBSで穴を洗浄し、Alexa Fluor488標識したマウス抗ヒトCD63モノクローナル抗体(10μg/ml)またはマウス抗ヒトCD81抗体(10μg/ml)をプレートの穴に導入し、45分間静置した。CD81の検出ではこれに加えて、PBSでプレートの穴を洗浄した後に、Alexa Fluor488標識のヤギ抗マウスIgGポリクローナル抗体(5μg/ml)を二次抗体としてプレートの穴に導入し、その後45分間静置した。最後に、PBSでプレートの穴を洗浄し、プレートリーダー(POLARstar OPTIMA,BMG Labtech Japan Ltd.)を用いて蛍光強度観察を行った。バックグラウンドの値を得るため、EVサンプルの代わりにPBSを用いた。
ZnO-Al2O3のコア-シェルナノワイヤの作製
ZnOナノワイヤの作製の後に、原子層堆積装置(Savannah G2,Ultratech Inc.)を用いてなのワイヤを被覆した。Al2O3の積層に関しては、トリメチルアルミニウムとH2O前駆体を原子層堆積装置内のナノワイヤを含むチャンバーに流入させ150℃で反応させるサイクルを100サイクル繰り返すことによって行った。
ZnOナノワイヤの作製の後に、原子層堆積装置(Savannah G2,Ultratech Inc.)を用いてなのワイヤを被覆した。Al2O3の積層に関しては、トリメチルアルミニウムとH2O前駆体を原子層堆積装置内のナノワイヤを含むチャンバーに流入させ150℃で反応させるサイクルを100サイクル繰り返すことによって行った。
尿サンプルの情報とナノワイヤ組み込みデバイスを用いたEV内包みmiRNAのin situ抽出
以下の尿サンプル(BioreclamationIVT)を用いた:非がん患者(53歳、60歳、および50歳)、肺がん患者(68歳、ステージ2b;54歳、ステージ3a;50歳、ステージ3b)、膵臓がん患者(56歳、ステージ2a;61歳、ステージ2a;74歳、ステージ3)、肝がん患者(49歳、ステージ3;64歳、ステージ3a;18歳、ステージ3c)、膀胱がん患者(63歳、ステージ1;65歳、ステージ1;67歳、ステージ0a)、および、前立腺がん(58歳、ステージ4;57歳、ステージ2a;54歳、ステージ2b)の尿サンプル。これらの尿サンプルは、使用前に、遠心分離(15分、4℃、3000g)し、アポトーシス小体を除去した。1mlの尿サンプルをナノワイヤ組み込みデバイスにシリンジポンプを用いて50μl/分の流速で導入した。ナノワイヤ上に回収されたEVからのmiRNAの抽出は、当該デバイスにシリンジポンプを用いて50ml/分の流速で溶解緩衝液を導入することによってin situで行った。
以下の尿サンプル(BioreclamationIVT)を用いた:非がん患者(53歳、60歳、および50歳)、肺がん患者(68歳、ステージ2b;54歳、ステージ3a;50歳、ステージ3b)、膵臓がん患者(56歳、ステージ2a;61歳、ステージ2a;74歳、ステージ3)、肝がん患者(49歳、ステージ3;64歳、ステージ3a;18歳、ステージ3c)、膀胱がん患者(63歳、ステージ1;65歳、ステージ1;67歳、ステージ0a)、および、前立腺がん(58歳、ステージ4;57歳、ステージ2a;54歳、ステージ2b)の尿サンプル。これらの尿サンプルは、使用前に、遠心分離(15分、4℃、3000g)し、アポトーシス小体を除去した。1mlの尿サンプルをナノワイヤ組み込みデバイスにシリンジポンプを用いて50μl/分の流速で導入した。ナノワイヤ上に回収されたEVからのmiRNAの抽出は、当該デバイスにシリンジポンプを用いて50ml/分の流速で溶解緩衝液を導入することによってin situで行った。
がんのバイオマーカーとしての尿中miRNAの同定
Zスコア1.96(95%信頼水準および5%有意水準)および東レ社により提供されたlog2(強度)に対する変動変数(CV)(具体的数値を有しない)の関係に従って、95%信頼区間は、(平均)±1.96×(平均×CV/100)を用いて計算した。log2(強度)=3である関係においてCVに対してX%を用いると、信頼区間の上限は、8+0.16Xであった。log2(強度)=5または6におけるCV値は、その関係から0.7X%および0.5X%であった。5%有意水準を考慮すると、各事例に対するCVは、40および71%未満であった。図5では、70%を超えるCV値を合理的であるとはせず、統計学的に有意な閾値に対して3つの対数強度の相違を決定した。
Zスコア1.96(95%信頼水準および5%有意水準)および東レ社により提供されたlog2(強度)に対する変動変数(CV)(具体的数値を有しない)の関係に従って、95%信頼区間は、(平均)±1.96×(平均×CV/100)を用いて計算した。log2(強度)=3である関係においてCVに対してX%を用いると、信頼区間の上限は、8+0.16Xであった。log2(強度)=5または6におけるCV値は、その関係から0.7X%および0.5X%であった。5%有意水準を考慮すると、各事例に対するCVは、40および71%未満であった。図5では、70%を超えるCV値を合理的であるとはせず、統計学的に有意な閾値に対して3つの対数強度の相違を決定した。
結果
EV内包miRNAを回収する方法論を確立するために、マイクロ流体基板に組み込まれたナノワイヤを開発した。これらのナノワイヤは、EVの静電的回収のための固相として、その後は、EV内包miRNAのin situ抽出において重要な機能を果たすものである(図1A参照)。
EV内包miRNAを回収する方法論を確立するために、マイクロ流体基板に組み込まれたナノワイヤを開発した。これらのナノワイヤは、EVの静電的回収のための固相として、その後は、EV内包miRNAのin situ抽出において重要な機能を果たすものである(図1A参照)。
ナノワイヤ組み込みPDMS基板
ナノワイヤ組み込みPDMS基板は、4つの工程により作製した(文献40および図6参照)。第1の工程で、Si基板上の熱酸化処理したクロム層からナノワイヤを成長させた;第2の工程で、成長しているナノワイヤ上に硬化していないPDMSを注いだ;第3の工程で、ナノワイヤを備えたPDMSを硬化させ、剥離して、ナノワイヤを埋め込んだPDMSを得た(図1B参照);第4の工程で、埋め込まれたナノワイヤからナノワイヤを成長させた(図1C参照)。ここで得られたナノワイヤ組み込みPDMS基板と呼ぶ。
組み込まれたナノワイヤの鉛直断面の電界放出型走査型電子顕微鏡(FESEM)像は、ナノワイヤがその頭部を少しだけ露出させながらPDMSに均一にかつ深く埋め込まれていることを示し(図1B参照)、頭部は二次的ナノワイヤの成長起点を提供した(図1Cおよび図7参照)。ナノワイヤ無しのPDMSの断面FESEM像のエネルギー分散型X線分析(EDS)による元素マッピングをナノワイヤ組み込みPDMSと比較し(図8参照)、ナノワイヤ組み込みPDMSにおいてZnOナノワイヤがPDMSに埋め込まれていることを確認した。加えて、鉛直断面と全体FESEM像および、断面FESEM像のESD元素マッピングは、二次的ナノワイヤの成長が埋め込まれたナノワイヤ上で生じることを示した。このようにして、ナノワイヤ組み込みPDMS基板を作製することに成功した。ナノワイヤとEVとの接触を促進し、圧力降下を防ぐために、ナノワイヤ組み込みPDMS基板のカバーとしてナノワイヤ長(2μm)より大きなチャンネル高(50μm)を備えたマイクロ流体ヘリングボーン構造を有するPDMS基板(当該ヘリングボーン構造は溶液の良好な対流と分散を保証する)(文献41参照)を用いた(図1D参照)。尿中のEV内包miRNAを抽出するナノワイヤ組み込みデバイスは、ナノワイヤ組み込みPDMS基板をマイクロ流体ヘリングボーン構造を有するPDMS基板に接着させ、尿サンプルを導入し、および回収するためのポリエーテルエーテルケトン(PEEK)チューブに接続することによって完成させた(図1D参照)。PDMS基板に組み込まれたナノワイヤは、溶解緩衝液への暴露に対して機械的安定性を示し、PDMSに組み込まれていないナノワイヤに対して生じるような基板からのナノワイヤの剥離を防ぐことができた(図1EおよびF、並びに図9参照)。
ナノワイヤ組み込みPDMS基板は、4つの工程により作製した(文献40および図6参照)。第1の工程で、Si基板上の熱酸化処理したクロム層からナノワイヤを成長させた;第2の工程で、成長しているナノワイヤ上に硬化していないPDMSを注いだ;第3の工程で、ナノワイヤを備えたPDMSを硬化させ、剥離して、ナノワイヤを埋め込んだPDMSを得た(図1B参照);第4の工程で、埋め込まれたナノワイヤからナノワイヤを成長させた(図1C参照)。ここで得られたナノワイヤ組み込みPDMS基板と呼ぶ。
組み込まれたナノワイヤの鉛直断面の電界放出型走査型電子顕微鏡(FESEM)像は、ナノワイヤがその頭部を少しだけ露出させながらPDMSに均一にかつ深く埋め込まれていることを示し(図1B参照)、頭部は二次的ナノワイヤの成長起点を提供した(図1Cおよび図7参照)。ナノワイヤ無しのPDMSの断面FESEM像のエネルギー分散型X線分析(EDS)による元素マッピングをナノワイヤ組み込みPDMSと比較し(図8参照)、ナノワイヤ組み込みPDMSにおいてZnOナノワイヤがPDMSに埋め込まれていることを確認した。加えて、鉛直断面と全体FESEM像および、断面FESEM像のESD元素マッピングは、二次的ナノワイヤの成長が埋め込まれたナノワイヤ上で生じることを示した。このようにして、ナノワイヤ組み込みPDMS基板を作製することに成功した。ナノワイヤとEVとの接触を促進し、圧力降下を防ぐために、ナノワイヤ組み込みPDMS基板のカバーとしてナノワイヤ長(2μm)より大きなチャンネル高(50μm)を備えたマイクロ流体ヘリングボーン構造を有するPDMS基板(当該ヘリングボーン構造は溶液の良好な対流と分散を保証する)(文献41参照)を用いた(図1D参照)。尿中のEV内包miRNAを抽出するナノワイヤ組み込みデバイスは、ナノワイヤ組み込みPDMS基板をマイクロ流体ヘリングボーン構造を有するPDMS基板に接着させ、尿サンプルを導入し、および回収するためのポリエーテルエーテルケトン(PEEK)チューブに接続することによって完成させた(図1D参照)。PDMS基板に組み込まれたナノワイヤは、溶解緩衝液への暴露に対して機械的安定性を示し、PDMSに組み込まれていないナノワイヤに対して生じるような基板からのナノワイヤの剥離を防ぐことができた(図1EおよびF、並びに図9参照)。
miRNA発現のマイクロアレイ分析
miRNA発現のマイクロアレイ分析(2565種類)は、ナノワイヤ組み込みデバイスによる抽出が、従来の超遠心法や市販のキットを用いたポリマー沈殿法による抽出と比較して大きな多様性を有するmiRNA種(約1,000種)の抽出を可能とすることが明らかとなった(図2および図10A参照)。尿中のEV内包miRNAが40分間(吸着に20分間、および抽出に20分間)以内で完了することは、デバイスに尿サンプル(1ml)を導入してから溶解緩衝液(1ml)を導入することによって実証された。これに対して、超遠心法によるEVからのmiRNAの抽出では、20mlの尿が必要となり、かつ、吸着と抽出に5時間以上を要することが明らかとなった。本研究で用いた市販のキットは小分子RNAの収率に関して他のEV単離方法よりも優れていることが報告されている(図10のBおよびC参照)(文献22参照)ため、上記キットを用いて1mlの尿から回収したEVを1mlの溶解緩衝液で懸濁することによってmiRNAの抽出を行ったところ、この作業には、回収と抽出に14時間以上が必要とされることが明らかとなった。超遠心法によるmiRNAの抽出よりも20倍以下の尿の消費量であったにもかかわらず、本開示のナノワイヤ組み込みデバイスで抽出されたmiRNAの発現レベルは、超遠心法により得られるmiRNAよりもはるかに高いことが散布図およびヒストグラムから明らかとなった(図2AおよびB参照)。普通に考えれば、20倍量以上の尿を用いたのであるから、超遠心法で得られたmiRNAの量は、本開示のデバイスで得られるmiRNAの量よりも高くなるはずであるが、結果は逆であった。超遠心法と比較して、本開示のデバイスは、5倍高いmiRNA量をもたらし(図2A参照)、かつ、抽出可能なmiRNAの種類も多様であった(本開示のデバイスによるmiRNAの抽出量:749,822、種類:1,111種類;遠心法によるmiRNAの抽出量:171 261、種類:352種類)(図2B参照)。加えて、散布図とヒストグラムによれば、本開示のデバイスを用いて抽出されるmiRNAの量は、消費した尿サンプルの容量は同じであったにもかかわらず、上記キットによって得られるmiRNAの量よりもはるかに高かった(図2CおよびD参照)。上記キットと比較して、本開示のデバイスは、4倍高いmiRNA量をもたらし(図2C参照)、かつ、抽出可能なmiRNAの種類も多様であった(本開示のデバイスによるmiRNAの抽出量:749,822、種類:1,111種類;遠心法によるmiRNAの抽出量:337,355、種類:491種類)(図2D参照)。従って、本開示のデバイスは、従来法(超遠心法やポリマー沈降法)と比較して、miRNAの抽出効率(図2参照)、抽出時間(図10AおよびB参照)、および小分子RNAの抽出効率(図10C参照)に関して優れていることが結論付けられた。
miRNA発現のマイクロアレイ分析(2565種類)は、ナノワイヤ組み込みデバイスによる抽出が、従来の超遠心法や市販のキットを用いたポリマー沈殿法による抽出と比較して大きな多様性を有するmiRNA種(約1,000種)の抽出を可能とすることが明らかとなった(図2および図10A参照)。尿中のEV内包miRNAが40分間(吸着に20分間、および抽出に20分間)以内で完了することは、デバイスに尿サンプル(1ml)を導入してから溶解緩衝液(1ml)を導入することによって実証された。これに対して、超遠心法によるEVからのmiRNAの抽出では、20mlの尿が必要となり、かつ、吸着と抽出に5時間以上を要することが明らかとなった。本研究で用いた市販のキットは小分子RNAの収率に関して他のEV単離方法よりも優れていることが報告されている(図10のBおよびC参照)(文献22参照)ため、上記キットを用いて1mlの尿から回収したEVを1mlの溶解緩衝液で懸濁することによってmiRNAの抽出を行ったところ、この作業には、回収と抽出に14時間以上が必要とされることが明らかとなった。超遠心法によるmiRNAの抽出よりも20倍以下の尿の消費量であったにもかかわらず、本開示のナノワイヤ組み込みデバイスで抽出されたmiRNAの発現レベルは、超遠心法により得られるmiRNAよりもはるかに高いことが散布図およびヒストグラムから明らかとなった(図2AおよびB参照)。普通に考えれば、20倍量以上の尿を用いたのであるから、超遠心法で得られたmiRNAの量は、本開示のデバイスで得られるmiRNAの量よりも高くなるはずであるが、結果は逆であった。超遠心法と比較して、本開示のデバイスは、5倍高いmiRNA量をもたらし(図2A参照)、かつ、抽出可能なmiRNAの種類も多様であった(本開示のデバイスによるmiRNAの抽出量:749,822、種類:1,111種類;遠心法によるmiRNAの抽出量:171 261、種類:352種類)(図2B参照)。加えて、散布図とヒストグラムによれば、本開示のデバイスを用いて抽出されるmiRNAの量は、消費した尿サンプルの容量は同じであったにもかかわらず、上記キットによって得られるmiRNAの量よりもはるかに高かった(図2CおよびD参照)。上記キットと比較して、本開示のデバイスは、4倍高いmiRNA量をもたらし(図2C参照)、かつ、抽出可能なmiRNAの種類も多様であった(本開示のデバイスによるmiRNAの抽出量:749,822、種類:1,111種類;遠心法によるmiRNAの抽出量:337,355、種類:491種類)(図2D参照)。従って、本開示のデバイスは、従来法(超遠心法やポリマー沈降法)と比較して、miRNAの抽出効率(図2参照)、抽出時間(図10AおよびB参照)、および小分子RNAの抽出効率(図10C参照)に関して優れていることが結論付けられた。
EV回収能力
本開示のデバイスがEVを回収する能力を確認すると、本開示のデバイスは、効率良くEVを回収することができることが明らかとなった(図3参照)。具体的には、未処理の尿において、本開示のデバイスで処理された尿のフロースルー分画(投入量:1ml)において、および超遠心法で処理された尿(投入量:20ml)において、尿の遊離浮遊物の総量が、それぞれ3.4μl、8.8nl、および11.1nlであることを考慮すると、本開示のデバイスによる浮遊物の回収効率は99%以上であると見積もられ、超遠心法により得られる用量よりも大きな容量を回収することができた(図3A~3C参照)(回収されたEVの容量は、未処理の尿の容量から処理された尿の容量を控除することによって計算された)。蛍光標識EVを観察した後で、マイクロ流体ヘリングボーン構造を有するPDMS基板からナノワイヤ組み込みPDMSを剥離してそのFESEM像を取得した。これにより、ナノワイヤによって回収される遊離浮遊物がEVを含むことが明らかとなった(図3Cおよび3D参照)。ナノワイヤによって回収される遊離浮遊物がEVを含むことをさらに確認するために、EV上に発現する膜タンパク質であり、エクソソームの膜上に発現することが知られるCD63およびCD81を検出した(文献2および42~44参照)。ナノワイヤ上(または96穴プレートのウェル)に回収された尿中のEVの蛍光強度(濃度:1.4×108ml-1)は、ナノワイヤだけがこれらの膜タンパク質を回収することができることを示した(図3E参照)。このことは、本開示のデバイスにおいてナノワイヤ上でEVが効率的に回収できることを示す。次に、ZnOナノワイヤに代えて、ZnOのコアが10nm厚のAl2O3層によって完全に被覆されたZnO-Al2O3のコア-シェルナノワイヤを調製した(図11参照)。ZnO-Al2O3のコア-シェルナノワイヤは、Al2O3の等電点が約7.5であることから、pH6~8において電荷的にほぼ中性(若干陽性または若干陰性であり得る)の表面を有することとなる(文献45および46参照)。そこで、ZnO-Al2O3のコア-シェルナノワイヤを用いることによって、EVの回収に対してナノワイヤの表面の荷電状態が優勢な効果を有するのかを確認した(図12参照)。ZnOナノワイヤは、ZnOの等電点が約9.5であることから、pH6~8では正に荷電した表面を有するのに対して、尿中のEVはpH6~8では負に荷電した表面を有することから、ZnOナノワイヤが効率的なEVの回収を可能とすることが理解できる(文献47および48参照)。これらの結果から、ZnOナノワイヤがEVなどの200nmまでの直径を有する尿の遊離浮遊物を99%以上の回収効率で回収することができることが一層明らかになった。
本開示のデバイスがEVを回収する能力を確認すると、本開示のデバイスは、効率良くEVを回収することができることが明らかとなった(図3参照)。具体的には、未処理の尿において、本開示のデバイスで処理された尿のフロースルー分画(投入量:1ml)において、および超遠心法で処理された尿(投入量:20ml)において、尿の遊離浮遊物の総量が、それぞれ3.4μl、8.8nl、および11.1nlであることを考慮すると、本開示のデバイスによる浮遊物の回収効率は99%以上であると見積もられ、超遠心法により得られる用量よりも大きな容量を回収することができた(図3A~3C参照)(回収されたEVの容量は、未処理の尿の容量から処理された尿の容量を控除することによって計算された)。蛍光標識EVを観察した後で、マイクロ流体ヘリングボーン構造を有するPDMS基板からナノワイヤ組み込みPDMSを剥離してそのFESEM像を取得した。これにより、ナノワイヤによって回収される遊離浮遊物がEVを含むことが明らかとなった(図3Cおよび3D参照)。ナノワイヤによって回収される遊離浮遊物がEVを含むことをさらに確認するために、EV上に発現する膜タンパク質であり、エクソソームの膜上に発現することが知られるCD63およびCD81を検出した(文献2および42~44参照)。ナノワイヤ上(または96穴プレートのウェル)に回収された尿中のEVの蛍光強度(濃度:1.4×108ml-1)は、ナノワイヤだけがこれらの膜タンパク質を回収することができることを示した(図3E参照)。このことは、本開示のデバイスにおいてナノワイヤ上でEVが効率的に回収できることを示す。次に、ZnOナノワイヤに代えて、ZnOのコアが10nm厚のAl2O3層によって完全に被覆されたZnO-Al2O3のコア-シェルナノワイヤを調製した(図11参照)。ZnO-Al2O3のコア-シェルナノワイヤは、Al2O3の等電点が約7.5であることから、pH6~8において電荷的にほぼ中性(若干陽性または若干陰性であり得る)の表面を有することとなる(文献45および46参照)。そこで、ZnO-Al2O3のコア-シェルナノワイヤを用いることによって、EVの回収に対してナノワイヤの表面の荷電状態が優勢な効果を有するのかを確認した(図12参照)。ZnOナノワイヤは、ZnOの等電点が約9.5であることから、pH6~8では正に荷電した表面を有するのに対して、尿中のEVはpH6~8では負に荷電した表面を有することから、ZnOナノワイヤが効率的なEVの回収を可能とすることが理解できる(文献47および48参照)。これらの結果から、ZnOナノワイヤがEVなどの200nmまでの直径を有する尿の遊離浮遊物を99%以上の回収効率で回収することができることが一層明らかになった。
ナノワイヤによるEVの回収のメリット
超遠心法により回収できた物(すなわち、エクソソーム(9.0nl;図14A参照))の量を、回収されなかった物(11.1nl;図3C)に加算して得られる数値は、未処理の尿に含まれる浮遊物の容量3.4μlと一致しない(図3B)。未だエクソソームとマイクロベシクルとは完全に区別することは容易ではないが、このことは、超遠心法では、主にエクソソームが回収されていることが示唆される(文献4、5、及び29参照)。また、超遠心法でEVを回収すると、EVは超遠心チューブの内壁に対して押しつけられることによって、多くが融合および崩壊する可能性があり、また、この過程でマイクロベシクルに内包されたmiRNAが周辺に放出されてしまう可能性がある。超遠心によるEVの回収の仕組みは、回収される物に負荷される力と密度のバランスに基づくものである。従って、超遠心の実験的条件は、放出されたmiRNAの回収には適しないと考えられる。
超遠心法により回収できた物(すなわち、エクソソーム(9.0nl;図14A参照))の量を、回収されなかった物(11.1nl;図3C)に加算して得られる数値は、未処理の尿に含まれる浮遊物の容量3.4μlと一致しない(図3B)。未だエクソソームとマイクロベシクルとは完全に区別することは容易ではないが、このことは、超遠心法では、主にエクソソームが回収されていることが示唆される(文献4、5、及び29参照)。また、超遠心法でEVを回収すると、EVは超遠心チューブの内壁に対して押しつけられることによって、多くが融合および崩壊する可能性があり、また、この過程でマイクロベシクルに内包されたmiRNAが周辺に放出されてしまう可能性がある。超遠心によるEVの回収の仕組みは、回収される物に負荷される力と密度のバランスに基づくものである。従って、超遠心の実験的条件は、放出されたmiRNAの回収には適しないと考えられる。
他方で、ナノワイヤによるEV回収の仕組みは、正に荷電したナノワイヤと負に荷電した物との静電的相互作用に基づくものであると考えられ、これによりナノワイヤは、エクソソームおよびマイクロベシクルを回収することができると考えられる。また、miRNAなどの核酸は、pH6~8では負に荷電する表面特性を有するので、ナノワイヤではEV-フリーのmiRNA(遊離miRNA)を回収できると考えられる。しかし、遊離miRNAの回収は、超遠心法やポリマー沈降法では不可能であると考えられる。また、溶解緩衝液を導入することによるナノワイヤからのmiRNAの回収効率はほぼ100%であった(図14B参照)。正に荷電した表面を有するナノワイヤは、エクソソーム、マイクロベシクル、及び遊離miRNAなどの尿中の負に荷電した物質を回収する際に顕著な利益をもたらすであろう。回収効率、得られる物の選択性、及び尿中miRNAを回収できる能力などの特性(表1参照)を考慮すると、超遠心法は回収効率が高く、得られる物の選択性が高く(エクソソームのみしか回収できない)、かつ回収能力が低いのに対して、本開示のデバイスは、高い回収効率、低い選択性(エクソソーム、マイクロベシクル、及び遊離miRNAを広く回収できる)、及び高い回収能力を有する。また、ポリマー沈殿法を用いるキットでは、これらの特性において中途半端である。また、EVのプロタミン沈降法がプロタミン/ポリエチレングリコールを用いて4℃で一晩インキュベートする(ExoQuickと同様である)ことによって達成されるのであるが、そのようなEVの電荷に基づく単離手法(文献49参照)と比較しても、本開示のデバイスによるEV内包miRNAの抽出においては、室温で40分(回収または吸着に20分および抽出に20分)が必要されるのみであるとの利点がある。加えて、pH6.3以下で正に荷電した表面を生じるアミン基を有するキトサンポリマーを用いる遊離核酸のための荷電に基づく単離手法(文献50参照)と比較して、本開示のデバイスによるEV内包miRNAの抽出においては、pH6~8の尿においてナノワイヤが正に荷電することが保証されているという利点を有する。そしてこれらの知見から、ZnOナノワイヤへのEV(及び遊離miRNA)の静電相互作用による回収と、溶解緩衝液のアプライ中におけるPDMSに組み込まれたナノワイヤの機械的安定性は、重要な機構であり、尿のmiRNAの分析に基づいて疾患の早期診断や適時の健康診断が可能となると期待される。
様々ながん患者ドナーの尿サンプル由来miRNAの同定
次に、様々ながん患者ドナーの尿から未だ発見されたことのないmiRNAを同定することができるかについて検討した(図4参照)。この検討において、がん患者ドナーと健常者(非がんドナー)の尿サンプルから本開示のデバイスでmiRNAを抽出し、ヒートマップ上で比較した。図4に示されるように、がんに関連して発現量が変わる様々なmiRNAの存在を観察することができた。がん患者ドナーと非がんドナーとの比較により、尿中でがんと関連して減少しているmiRNAと増加しているmiRNAとが明らかになった(図5および表2参照)。ヒートマップにより、減少しているmiRNAと増加しているmiRNAそれぞれががんの新しい指標となること、およびこれらの組合せが、がんの新しい指標となり得ることが示唆された。
次に、様々ながん患者ドナーの尿から未だ発見されたことのないmiRNAを同定することができるかについて検討した(図4参照)。この検討において、がん患者ドナーと健常者(非がんドナー)の尿サンプルから本開示のデバイスでmiRNAを抽出し、ヒートマップ上で比較した。図4に示されるように、がんに関連して発現量が変わる様々なmiRNAの存在を観察することができた。がん患者ドナーと非がんドナーとの比較により、尿中でがんと関連して減少しているmiRNAと増加しているmiRNAとが明らかになった(図5および表2参照)。ヒートマップにより、減少しているmiRNAと増加しているmiRNAそれぞれががんの新しい指標となること、およびこれらの組合せが、がんの新しい指標となり得ることが示唆された。
公表された結果(文献52~95参照)との比較に基づいて、統計学的に有意に減少したmiRNAと増加したmiRNAを明確化する試みを行った。その結果、本開示のデバイスで抽出されたmiRNAには、2つのmiRNAの群:生理学的機能が不明なmiRNAの群および生理学的機能が報告されているmiRNAの群が含まれていた。生理学的機能が不明なmiRNAの群は、さらに2つのサブグループ:がんに関連するmiRNAの群および遊離miRNAに由来するアーティファクトの群に大別されうる。生理学的機能が報告されているmiRNAの群にも2つのサググループ:miR-520c-3p(がん抑制因子であり、全てのがん患者由来の尿中で減少していたmiRNA)などの疾患の転帰と正に相関するmiRNAの群(文献53~57参照)およびmiR-16-1-3p(胃がん細胞の浸潤と転移を抑制するmiRNAであり、肝がん患者および膀胱癌患者由来の尿において過剰発現していたmiRNA)などの機能と疾患との反直観的な相関を示すmiRNAの群とに大別された(文献60参照)。反直観的な事例においては、以下の3つの可能性が考えられた:第1の可能性は、患者が対応するリスクを有する;第2の可能性は、本研究ではmiRNAとがんの種類との関係をカバーできていない;第3の可能性として、miRNAがアーティファクトに帰される。膀胱がん患者由来の4mlの尿から市販のキットで抽出したこれまでに報告された尿のmiRNA(細胞フリーおよびエクソソーム由来の増加したmiRNAの上位25個として示された)(文献96参照)と本開示のデバイスで取得した過剰発現したmiRNAとを比較すると、miR-4454を含む20種のmiRNAが本研究により見出された(データS1または表3参照)。しかし、文献96で開示されたmiRNAは、本開示においては、がんの指標の候補として同定されたものではない。理由は、本開示においては、これらの文献96で開示されたmiRNAが非がんドナーの尿においても見出されたためであり、非がんドナーと膀胱がん患者の尿とで対数の蛍光強度に有意差は認められなかったためである。
関連文献リスト(以下、文献番号と共に示す)
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Claims (32)
- データS1または表2に記載のいずれかのマイクロRNAを含む、尿の抽出物。
- 細胞外小胞を含み、前記マイクロRNAが細胞外小胞に含まれる、または、前記マイクロRNAが細胞外小胞から抽出されている、請求項1に記載の尿の抽出物。
- 前記RNAが、遊離マイクロRNAの形態である、請求項1に記載の尿の抽出物。
- マイクロRNAが、miR-3117-5p、miR-3118、miR-3121-3p、miR-3121-5p、miR-3126-5p、miR-3128、miR-3133、miR-3134、miR-3136-3p、miR-3136-5p、miR-3139、miR-3142、miR-3143、miR-3145-3p、miR-3163、miR-3166、miR-3167、miR-16-1-3p、miR-424-3p、miR-519c-5p、miR-525-5p、miR-551b-5p、miR-558、miR-921、miR-942-3p、miR-3126-3p、miR-3127-5p、miR-3129-5p、miR-3144-5p、miR-3150a-5p、miR-3152-5p、miR-3155a、miR-3157-3p、miR-3159、miR-3165、miR-3678-3p、miR-4321、miR-4521、miR-4800-3p、miR-4999-5p、miR-5096、miR-5187-5p、miR-6874-5p、miR-3127-3p、miR-3130-5p、miR-3131、miR-3141、miR-3150b-5p、miR-3151-3p、miR-3151-5p、miR-3154、miR-3160-3p、miR-3160-5p、miR-378a-5p、miR-520c-3p、miR-526b-3p、miR-3150a-3p、miR-3162-5p、及びmiR-4254からなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAである、請求項1~3のいずれか一項に記載の尿の抽出物。
- マイクロRNAが、miR-3163、miR-16-1-3p、miR-424-3p、miR-558、miR-3127-5p、及びmiR-4521からなる群から選択される少なくとも1種のマイクロRNAまたは全てのマイクロRNAである、請求項1~4のいずれか一項に記載の尿の抽出物。
- マイクロRNAが、miR-378a-5p、miR-520c-3p、及びmiR-526b-3pからなる群から選択される少なくとも1種のマイクロRNAまたは全てのマイクロRNAである、請求項1~4のいずれか一項に記載の尿の抽出物。
- 尿が、肺がんを有する対象の尿である、請求項1~6のいずれか一項に記載の尿の抽出物。
- マイクロRNAが、let-7i-3p、miR-183-5p、miR-202-5p、miR-409-5p、miR-4661-5p、miR-4800-3p、miR-5587-5p、miR-372-3p、miR-378b、miR-520b、miR-1266-3p、miR-3605-5p、miR-3612、miR-4645-3p、miR-4694-3p、miR-4752、miR-6816-3p、miR-8087、let-7f-2-3p、miR-15a-3p、miR-20a-3p、miR-33b-3p、miR-34c-5p、miR-93-5p、miR-130a-5p、miR-135a-5p、miR-135b-5p、miR-185-5p、miR-203a-3p、miR-302d-5p、miR-337-3p、miR-378c、miR-422a、miR-449c-5p、miR-483-5p、miR-506-3p、miR-511-5p、miR-520c-3p、miR-654-3p、miR-668-5p、miR-670-5p、miR-671-3p、miR-744-3p、miR-1178-3p、miR-1254、miR-1284、miR-1323、miR-2116-5p、miR-2355-3p、miR-3132、miR-3138、miR-3164、miR-3186-3p、miR-3189-3p、miR-3198、miR-3200-5p、miR-3657、miR-3667-5p、miR-3680-5p、miR-3692-5p、miR-3713、miR-3921、miR-3936、miR-4273、miR-4299、miR-4306、miR-4316、miR-4319、miR-4421、miR-4429、miR-4435、miR-4441、miR-4473、miR-4506、miR-4633-5p、miR-4658、miR-4733-5p、miR-4733-3p、miR-5004-3p、miR-5194、miR-5197-5p、miR-5571-5p、miR-6083、miR-6717-5p、miR-6720-5p、miR-6767-3p、miR-6781-3p、miR-6811-3p、miR-6821-3p、miR-6828-5p、miR-6832-5p、miR-6837-3p、miR-6841-5p、miR-6853-5p、miR-6871-3p、miR-6875-5p、miR-6878-5p、miR-7112-3p、miR-7703、miR-7848-3p、及びmiR-7856-5pからなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAである、請求項1~3のいずれか一項に記載の尿の抽出物。
- マイクロRNAが、miR-183-5p、miR-202-5p、及びmiR-409-5pからなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAである、請求項8に記載の尿の抽出物。
- マイクロRNAが、miR-372-3p、miR-520b、miR-15a-3p、miR-34c-5p、miR-135a-5p、miR-185-5p、miR-337-3p、miR-422a、miR-506-3p、miR-520c-3p、miR-1284、miR-1323、及びmiR-4273からなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAである、請求項8に記載の尿の抽出物。
- 尿が、膵がんを有する対象の尿である、請求項8~10のいずれか一項に記載の尿の抽出物。
- マイクロRNAが、miR-4521、let-7c-3p、let-7i-5p、miR-16-1-3p、miR-26a-1-3p、miR-28-5p、miR-105-5p、miR-195-3p、miR-200b-5p、miR-219a-2-3p、miR-297、miR-300、miR-330-3p、miR-374b-5p、miR-431-5p、miR-454-5p、miR-513c-5p、miR-548ax、miR-593-5p、miR-623、miR-664a-5p、miR-942-3p、miR-1205、miR-1276、miR-1288-3p、miR-1297、miR-3678-3p、miR-4283、miR-4295、miR-4439、miR-4524b-5p、miR-4703-3p、miR-4768-5p、miR-4800-3p、miR-5187-5p、miR-5696、miR-7161-5p、let-7i-2-3p、及びmiR-520c-3pからなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAである、請求項1~3のいずれか一項に記載の尿の抽出物。
- マイクロRNAが、miR-16-1-3p、miR-28-5p、miR-297、miR-300、miR-330-3p、miR-454-5p、miR-1297、及びmiR-4295からなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAである、請求項12に記載の尿の抽出物。
- マイクロRNAが、miR-520c-3pである、請求項12に記載の尿の抽出物。
- 尿が、肝がんを有する対象の尿である、請求項12~14のいずれか一項に記載の尿の抽出物。
- マイクロRNAが、miR-16-1-3p、miR-23b-3p、miR-28-5p、miR-92a-2-5p、miR-142-3p、miR-195-3p、miR-196b-5p、miR-299-3p、miR-492、miR-513b-5p、miR-601、miR-619-5p、miR-1285-3p、miR-3155a、miR-3162-5p、miR-3678-3p、miR-4283、miR-4295、miR-4311、miR-4531、miR-5096、miR-5187-5p、let-7f-2-3p、miR-520c-3p、及びmiR-4783-5pからなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAである、請求項1~3のいずれか一項に記載の尿の抽出物。
- マイクロRNAが、miR-16-1-3p、miR-23b-3p、miR-28-5p、miR-142-3p、miR-195-3p、miR-299-3p、及びmiR-4295からなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAである、請求項16に記載の尿の抽出物。
- マイクロRNAが、miR-520c-3pである、請求項16に記載の尿の抽出物。
- 尿が、膀胱がんを有する対象の尿である、請求項16~18のいずれか一項に記載の尿の抽出物。
- マイクロRNAが、miR-4531、miR-28-5p、miR-103a-2-5p、miR-105-5p、miR-124-3p、miR-151a-5p、miR-151b、miR-200a-5p、miR-300、miR-424-3p、miR-519c-5p、miR-551b-5p、miR-617、miR-873-3p、miR-921、miR-1288-3p、miR-3124-5p、miR-3155a、miR-3917、miR-4283、miR-4727-3p、miR-5096、miR-5187-5p、miR-6074、miR-6874-5p、miR-6892-5p、miR-15a-3p、miR-135b-5p、miR-520c-3p、miR-4783-5p、及びmiR-7849-3pからなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAである、請求項1~3のいずれか一項に記載の尿の抽出物。
- マイクロRNAが、miR-28-5p、miR-105-5p、miR-124-3p、miR-151a-5p、及びmiR-300からなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAである、請求項20に記載の尿の抽出物。
- マイクロRNAが、miR-15a-3p及びmiR-520c-3pからなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAである、請求項20に記載の尿の抽出物。
- 尿が、前立腺がんを有する対象の尿である、請求項20~22のいずれか一項に記載の尿の抽出物。
- 尿が、健常者の尿である、請求項1~6、8~10、12~14、16~18、及び20~22のいずれか一項に記載の尿の抽出物。
- 対象ががんである可能性を検査する方法であって、
以下(a)~(e)からなる群から選択される1以上を含む、方法:
(a)対象から得られる尿または尿の抽出物においてmiR-3163、miR-16-1-3p、miR-424-3p、miR-558、miR-3127-5p、及びmiR-4521からなる群から選択される少なくとも1種のマイクロRNAまたは全てのマイクロRNAを検出すること、ここで、マイクロRNAの量が所定の値よりも高い場合には、対象が肺がんである可能性があることを示す;
(b)対象から得られる尿または尿の抽出物において、miR-183-5p、miR-202-5p、及びmiR-409-5pからなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAを検出すること、ここで、マイクロRNAの量が所定の値よりも高い場合には、対象が膵がんである可能性があることを示す;
(c)対象から得られる尿または尿の抽出物において、miR-16-1-3p、miR-28-5p、miR-297、miR-300、miR-330-3p、miR-454-5p、miR-1297、及びmiR-4295からなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAを検出すること、ここで、マイクロRNAの量が所定の値よりも高い場合には、対象が肝がんである可能性があることを示す;
(d)対象から得られる尿または尿の抽出物において、、miR-16-1-3p、miR-23b-3p、miR-28-5p、miR-142-3p、miR-195-3p、miR-299-3p、及びmiR-4295からなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAを検出すること、ここで、マイクロRNAの量が所定の値よりも高い場合には、対象が膀胱がんである可能性があることを示す;
(e)対象から得られる尿または尿の抽出物においてmiR-28-5p、miR-105-5p、miR-124-3p、miR-151a-5p、及びmiR-300からなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAを検出すること、ここで、マイクロRNAの量が所定の値よりも高い場合には、対象が前立腺がんである可能性があることを示す。 - 請求項25に記載の方法であって、
(A)~(E)からなる群から選択される1以上を含む、方法:
(A)前記(a)において対象から得られる尿または尿の抽出物において、miR-378a-5p、miR-520c-3p、及びmiR-526b-3pからなる群から選択される少なくとも1種のマイクロRNAまたは全てのマイクロRNAをさらに検出することと、ここで、マイクロRNAの量が所定の値よりも低い場合には、対象が肺がんである可能性があることを示す;
(B)前記(b)において対象から得られる尿または尿の抽出物において、miR-372-3p、miR-520b、miR-15a-3p、miR-34c-5p、miR-135a-5p、miR-185-5p、miR-337-3p、miR-422a、miR-506-3p、miR-520c-3p、miR-1284、miR-1323、及びmiR-4273からなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAをさらに検出することと、ここで、マイクロRNAの量が所定の値よりも低い場合には、対象が膵がんである可能性があることを示す;
(C)前記(c)において対象から得られる尿または尿の抽出物において、miR-520c-3pをさらに検出することと、ここで、マイクロRNAの量が所定の値よりも低い場合には、対象が肝がんである可能性があることを示す;
(D)前記(d)において対象から得られる尿または尿の抽出物において、miR-520c-3pをさらに検出することと、ここで、マイクロRNAの量が所定の値よりも低い場合には、対象が膀胱がんである可能性があることを示す;
(E)前記(e)において対象から得られる尿または尿の抽出物において、miR-15a-3p及びmiR-520c-3pからなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAをさらに検出することと、ここで、マイクロRNAの量が所定の値よりも低い場合には、対象が前立腺がんである可能性があることを示す。 - 対象ががんである可能性を検査する方法であって、
(i)miR-3117-5p、miR-3118、miR-3121-3p、miR-3121-5p、miR-3126-5p、miR-3128、miR-3133、miR-3134、miR-3136-3p、miR-3136-5p、miR-3139、miR-3142、miR-3143、miR-3145-3p、miR-3163、miR-3166、miR-3167、miR-16-1-3p、miR-424-3p、miR-519c-5p、miR-525-5p、miR-551b-5p、miR-558、miR-921、miR-942-3p、miR-3126-3p、miR-3127-5p、miR-3129-5p、miR-3144-5p、miR-3150a-5p、miR-3152-5p、miR-3155a、miR-3157-3p、miR-3159、miR-3165、miR-3678-3p、miR-4321、miR-4521、miR-4800-3p、miR-4999-5p、miR-5096、miR-5187-5p、miR-6874-5p、miR-3127-3p、miR-3130-5p、miR-3131、miR-3141、miR-3150b-5p、miR-3151-3p、miR-3151-5p、miR-3154、miR-3160-3p、miR-3160-5p、miR-378a-5p、miR-520c-3p、miR-526b-3p、miR-3150a-3p、miR-3162-5p、及びmiR-4254からなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAの発現量とがんとの関連性データ;
(ii)let-7i-3p、miR-183-5p、miR-202-5p、miR-409-5p、miR-4661-5p、miR-4800-3p、miR-5587-5p、miR-372-3p、miR-378b、miR-520b、miR-1266-3p、miR-3605-5p、miR-3612、miR-4645-3p、miR-4694-3p、miR-4752、miR-6816-3p、miR-8087、let-7f-2-3p、miR-15a-3p、miR-20a-3p、miR-33b-3p、miR-34c-5p、miR-93-5p、miR-130a-5p、miR-135a-5p、miR-135b-5p、miR-185-5p、miR-203a-3p、miR-302d-5p、miR-337-3p、miR-378c、miR-422a、miR-449c-5p、miR-483-5p、miR-506-3p、miR-511-5p、miR-520c-3p、miR-654-3p、miR-668-5p、miR-670-5p、miR-671-3p、miR-744-3p、miR-1178-3p、miR-1254、miR-1284、miR-1323、miR-2116-5p、miR-2355-3p、miR-3132、miR-3138、miR-3164、miR-3186-3p、miR-3189-3p、miR-3198、miR-3200-5p、miR-3657、miR-3667-5p、miR-3680-5p、miR-3692-5p、miR-3713、miR-3921、miR-3936、miR-4273、miR-4299、miR-4306、miR-4316、miR-4319、miR-4421、miR-4429、miR-4435、miR-4441、miR-4473、miR-4506、miR-4633-5p、miR-4658、miR-4733-5p、miR-4733-3p、miR-5004-3p、miR-5194、miR-5197-5p、miR-5571-5p、miR-6083、miR-6717-5p、miR-6720-5p、miR-6767-3p、miR-6781-3p、miR-6811-3p、miR-6821-3p、miR-6828-5p、miR-6832-5p、miR-6837-3p、miR-6841-5p、miR-6853-5p、miR-6871-3p、miR-6875-5p、miR-6878-5p、miR-7112-3p、miR-7703、miR-7848-3p、及びmiR-7856-5pからなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAの発現量とがんとの関連性データ;
(iii)miR-4521、let-7c-3p、let-7i-5p、miR-16-1-3p、miR-26a-1-3p、miR-28-5p、miR-105-5p、miR-195-3p、miR-200b-5p、miR-219a-2-3p、miR-297、miR-300、miR-330-3p、miR-374b-5p、miR-431-5p、miR-454-5p、miR-513c-5p、miR-548ax、miR-593-5p、miR-623、miR-664a-5p、miR-942-3p、miR-1205、miR-1276、miR-1288-3p、miR-1297、miR-3678-3p、miR-4283、miR-4295、miR-4439、miR-4524b-5p、miR-4703-3p、miR-4768-5p、miR-4800-3p、miR-5187-5p、miR-5696、miR-7161-5p、let-7i-2-3p、及びmiR-520c-3pからなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAの発現量とがんとの関連性データ;
(iv)miR-16-1-3p、miR-23b-3p、miR-28-5p、miR-92a-2-5p、miR-142-3p、miR-195-3p、miR-196b-5p、miR-299-3p、miR-492、miR-513b-5p、miR-601、miR-619-5p、miR-1285-3p、miR-3155a、miR-3162-5p、miR-3678-3p、miR-4283、miR-4295、miR-4311、miR-4531、miR-5096、miR-5187-5p、let-7f-2-3p、miR-520c-3p、及びmiR-4783-5pからなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAの発現量とがんとの関連性データ;または
(v)miR-4531、miR-28-5p、miR-103a-2-5p、miR-105-5p、miR-124-3p、miR-151a-5p、miR-151b、miR-200a-5p、miR-300、miR-424-3p、miR-519c-5p、miR-551b-5p、miR-617、miR-873-3p、miR-921、miR-1288-3p、miR-3124-5p、miR-3155a、miR-3917、miR-4283、miR-4727-3p、miR-5096、miR-5187-5p、miR-6074、miR-6874-5p、miR-6892-5p、miR-15a-3p、miR-135b-5p、miR-520c-3p、miR-4783-5p、及びmiR-7849-3pからなる群から選択される少なくとも1種または全てのマイクロRNAの発現量とがんとの関連性データ
と、対象の体液試料中の上記少なくとも1種または全てのマイクロRNAの発現量に基づいて、対象ががんである可能性を決定することを含む、方法。 - 酸化亜鉛からなる表面を有するナノワイヤと尿とを接触させ、前記ナノワイヤに結合した構成成分を抽出して得られる、尿の抽出物。
- データS1または表2に記載のいずれかのマイクロRNAを含む、請求項28に記載の尿の抽出物。
- 尿中に含まれる細胞外小胞の20%以上の小胞を含む、請求項28に記載の尿の抽出物。
- 濃縮された前記マイクロRNAを含む、請求項1に記載の尿の抽出物。
- 尿中に存在するマイクロRNAを500種類以上含む、尿の抽出物。
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