JP5513411B2 - 生物材料中の感染性化合物のインビトロ検出及び／又は定量及び／又は同定の方法 - Google Patents
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Description
本発明は、生物材料中の感染性化合物のインビトロ検出及び／又は定量及び／又は同定の方法に関する。
本明細書において「生物材料」とは、感染性化合物を含んでいてもよい、天然又は非天然の生物組織、生物組織に由来する調製物若しくは抽出物、液体若しくは固体、又は媒体、例えば果実及び野菜を洗うための流水若しくは水などを意味する。このような材料は、先に規定された材料の少なくとも２種の混合物であってもよい。よってこれらは、特に感染症に罹患した患者の組織、臓器、糞便若しくは体液から調製されたものでも、又は「インビトロ」培養から得られたものでもよい。かかる生物材料は、血清、血漿、尿、脳脊髄液、滑液、腹水、胸膜液、精液又は酢酸液(acetic fluid)であってもよい。
本出願において感染性化合物（今後は略号「ＣＩ」で総称する）とは、感染因子を構成する化合物（特にタンパク質）と、感染性化合物を含む構造体の双方を意味する。これら構造体は、特に、完全又は不完全な、内在性又は外来性の、感染因子、その代謝産物、あるいは、これら感染因子の構成化合物を含み、その感染因子の一部特性（特に感染性化合物に特異的なある種の抗体によって検出される特性）を示す複合物である。また、ＣＩは、上記定義のＣＩにより、又は異常発現する遺伝子の発現により、生体内で特異的に誘導される化合物であってもよい。ＣＩの例としては、ウイルス、細菌、真菌、マイコプラズマ、寄生虫、異常動物細胞等が挙げられる。
血漿糖タンパク質の一種であるβ２−糖タンパク質Ｉ、略称「β２ＧＰＩ」は既報である。このヒト糖タンパク質の配列は、特に、J. LOZIERらの論文、Proc. Natl. Acad. Sci. ISA, 81, 3640-3644 (1984年7月)、及びT. KRISTENSENらの論文、FEBS Letters, 289, 183-186 (1991)に記載される。このβ２ＧＰＩタンパク質は多型を示す。本明細書ではβ２ＧＰＩという名称を、全ての型の総称として解する。
国際出願ＷＯ９４／１８５６９は、特定の種の（特にタンパク質性の）感染性化合物が、仏国特許第２７０１２６３号に開示のβ２ＧＰＩ型に結合することを指摘する。文献ＷＯ９４／１８５６９はウイルス性化合物の検出及び／又はアッセイの方法を提示し、本方法では感染性ウイルス性化合物が、使用されるβ２ＧＰＩの型に結合される。従ってこのβ２ＧＰＩ型は、生物材料中に含まれる感染性ウイルス性化合物に添加され、その後こうして捕捉されたウイルス性化合物を検出及び／又はアッセイするべく分離する。欧州特許第ＥＰ７７５３１５号には、感染性化合物、特にタンパク質性化合物と任意のβ２ＧＰＩ型との複合体の形成が開示されている。この感染性化合物は、特に細菌であることができる。これらの文献から、β２ＧＰＩは、マイクロタイトレーションプレートのウェルの底のような、平坦な固形支持体に結合することが可能であること、及びこうしてこの平坦な固形支持体へ接着しているβ２ＧＰＩは、非常に低濃度で臨床試料、生物学的試料又は環境的試料の中に存在する感染性化合物に結合することが可能であることは明らかである。更にそのような試料は、病原体の検出を少なくとも部分的に阻害する物質、結果的に検出の感度を低下し得る物質を含有することができることは公知である。従ってそれらの検出を阻害する物質を排除するために、これらの病原体を捕捉しかつ濃縮することができることは重要である。
本出願人の会社(Applicant company)の研究は、タイトレーションプレートのウェルの底へのβ２ＧＰＩの結合は、β２ＧＰＩの特定の高次構造によって起こり、この高次構造はその後のβ２ＧＰＩの感染性化合物との複合体の形成を可能にすることを示す。この文献は更に、このβ２ＧＰＩの高次構造は、固体表面へのその結合部位で変動することを報告している(Matsuuraら、J. Exp. Med. 179, 457-462 (1994))。それにウイルスが接着するスルホン化された磁気マイクロビーズを使用する、ウイルスの濃縮の方法が、既に説明されており(A. IWATAら、Biol. Pharm. Bull. 26(8), 1065-1069 (2003))、このウイルスの濃縮は、これらのマイクロビーズには磁性があり、磁界の作用により感染性媒体から分離されることに基づき得られた。残念なことに、この技術の結果は、本質的にはマイクロビーズへのウイルスの接着機能であった。この文献は、ある種のエンベロープを持たないウイルスは、ポリエチレン−イミンで製造されたマイクロビーズには結合しないこと、及びある種のウイルスを濃縮するためには、スルホン化されたマイクロビーズを使用することが必須であることを詳細に説明している。更にある種のウイルスに関しては、Ｚｎ２＋やＣｕ２＋等の二価のカチオンを培地に添加する必要があった。この知見から、マイクロビーズを構成するポリマーをグラフトするか否かは、また、二価のイオンが必要か否かは、ウイルスの性質に応じて異なることが分かる。よって、これらのビーズは、濃縮すべきウイルスに応じて適宜(ad hoc)調製する必要がある。同じ知見が、ヒトＡ型、Ｂ型及びＣ型肝炎ウイルスの濃縮に関連するE. UCHIDAらの論文(Journal of Virological Methods, 143, 95-103 (2007))からも明らかになっている。従って、検出すべき未同定のウイルスを含む試料の存在下で、どの種のマイクロビーズが対象のウイルスを接着し得るかを決定するのは不可能であった。
その結果、上記の欠点を考慮すると、当業者であれば、感染性化合物の性質がどうであるかや感染性化合物が何であるかに関係なくマイクロビーズが感染性化合物を引っ掛けることのできる好ましい環境条件を求めようとするあろう。それが、そもそもはUchidaが上記の論文で行なったことである。彼は、ウイルスＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶを直接捕獲する上で特に有利な条件を記載している。しかし出願人の会社は、このやり方とは逆に、本発明により、マイクロビーズと、その表面に固定する感染性化合物（ＣＩ）との間にβ２ＧＰＩ分子を置くことを提案する。現在の技術により、タンパク質β２ＧＰＩがうまく引っ掛かることのできる固体支持体の性質を明らかにすることができた。したがってマイクロビーズの表面へのβ２ＧＰＩの固定は、あとで固定する感染性化合物に応じてマイクロビーズのポリマーを変化させる必要なく実施される。さらに、マイクロビーズの表面にβ２ＧＰＩを固定することによってβ２ＧＰＩの表面への感染性化合物の引っ掛かりが乱されないことも確認された。ところでこの最後の点はまったく予想外であった。というのも、マイクロビーズの表面に固定されるβ２ＧＰＩのコンホメーションが、この糖タンパク質の表面に病原体が引っ掛かるのを可能にしているとは予想できなかったからである。しかし補足しておくならば、β２ＧＰＩは自己重合する傾向を有するとわかっていたことが、本発明の完成を妨げる１つの要素であった（Thrombosis Research、第１０８巻、１７５〜１８０ページ、２００３年参照）。そのため、β２ＧＰＩを担持したマイクロビーズの凝集が起こる危険性がある。凝集により、もちろん、β２ＧＰＩ分子の表面に病原体が固定されることは考えられなくなる。
最後に、本発明により、β２ＧＰＩを担持したマイクロビーズの表面に感染性化合物が接着されると、β２ＧＰＩとＣＩの両方を担持したマイクロビーズが適切な媒体と直接接触することで、接着されたＣＩを検出又は定量又は同定できる場合があることが確認された。ウイルスの場合には、媒体は、マイクロビーズによって捕獲されたウイルスが感染できる細胞培養物である。
本発明の別の特徴によれば、出願人の会社は、並行して、接着が起こる環境に作用を及ぼすことで、β２ＧＰＩを担持したマイクロビーズの表面にＣＩがうまく引っ掛かるようにしようとした。出願人の会社は、この目的が、ＣＩの性質に関係なく、特にウイルス又は細菌において、懸濁媒体の中に酸化性金属のイオンを添加すると達成されることを確認した。斯かる金属としてはＣｕ２＋が挙げられるが、この効果は（上記のIwataの論文の研究から考えられるのとは異なり）Ｃｕが２価であることが原因ではない。というのもIwataは、Ｚｎ２＋又はＣｕ２＋で満足のゆく結果を得たと述べているのに対し、出願人は、本発明を実施するのにＺｎは有意な結果を与えないことを確認したからである。そもそも、Ｚｎ又はＦｅイオンの存在は、ウイルスのβ２ＧＰＩの表面への接着によってはのに不利であることがすでに指摘されていた（Stefas他、Hepatology、第３３巻（１）、２０７〜２１７ページ、２００１年）。ところでマイクロビーズの中に磁性元素が存在していると、鉄イオンがマイクロビーズを懸濁させた媒体の中に拡散する可能性がある。出願人の会社は、媒体中における酸化性イオンの存在によりβ２ＧＰＩの表面へのＣＩの固定には顕著な不利が生じないことを確認した。
従って、本発明の主題は、生物材料を構成する液状媒体Ｍ内に存在する感染性化合物の検出及び／又は定量及び／又は同定のためのインビトロの方法であって、公知の手法により、マイクロビーズの液状懸濁媒体中懸濁液が調製され、前記マイクロビーズは、タンパク質を結合可能な固体ポリマー物質により構成された外表面により境界画定されるとともに、前記方法は：
ａ）懸濁液中のマイクロビーズに対するβ２ＧＰＩタンパク質の導入を、十分量のβ２ＧＰＩタンパク質とのカップリングにより、懸濁媒体中で受動的に、又は公知の化学結合プロトコルを用いて達成する段階；
ｂ）マイクロビーズにより担持されたβ２ＧＰＩタンパク質に対する感染性化合物の十分な結合を達成するべく、容器内で、少なくとも１種類の酸化性金属のイオンを添加することにより、β２ＧＰＩタンパク質が導入された前記マイクロビーズを、適切な条件下で液状媒体Ｍと接触させる段階；
ｃ）前記により調製されたマイクロビーズをその懸濁媒体から分離し、前記懸濁媒体を容器から排出し、任意により緩衝液による洗浄後に、高濃度の感染性化合物を含む残渣を得る段階；
ｄ）並びに、前記により得られた濃縮された残渣から感染性化合物を検出及び／又は定量及び／又は同定する段階
を含むことを特徴とする。
ａ）懸濁液中のマイクロビーズに対するβ２ＧＰＩタンパク質の導入を、十分量のβ２ＧＰＩタンパク質とのカップリングにより、懸濁媒体中で受動的に、又は公知の化学結合プロトコルを用いて達成する段階；
ｂ）マイクロビーズにより担持されたβ２ＧＰＩタンパク質に対する感染性化合物の十分な結合を達成するべく、容器内で、少なくとも１種類の酸化性金属のイオンを添加することにより、β２ＧＰＩタンパク質が導入された前記マイクロビーズを、適切な条件下で液状媒体Ｍと接触させる段階；
ｃ）前記により調製されたマイクロビーズをその懸濁媒体から分離し、前記懸濁媒体を容器から排出し、任意により緩衝液による洗浄後に、高濃度の感染性化合物を含む残渣を得る段階；
ｄ）並びに、前記により得られた濃縮された残渣から感染性化合物を検出及び／又は定量及び／又は同定する段階
を含むことを特徴とする。
本発明による方法の段階ｂ）において媒体Ｍに添加される酸化性金属のイオンが第二銅イオンであり、その媒体中の第二銅イオンの濃度は、そのイオンの添加後に１〜１００ｍＭであることが好ましい。
本発明による上記の方法の段階ｄ）を、感染力、特異的酵素反応、蛍光性トレーサー、放射性標識したトレーサー、標識したプローブとのハイブリダイゼーションによる特定の核酸の検出、ＰＣＲ反応、ＲＴ−ＰＣＲ反応、アッセイ、カウント、可視化、光学的方法、電子顕微鏡その他の顕微鏡による観察からなる群の中から選択した手段によって実現することが望ましい。
感染性化合物（ＣＩ）として特に細菌が可能である。
ＣＩが細菌である場合には、光学密度の読み取り、ＡＴＰ測定、ＰＣＲ（“ポリメラーゼ連鎖反応”）の何れかによってその細菌を検出及び／又は定量及び／又は同定することができる。
ＣＩがウイルスである場合には、本発明の方法の段階ｃ）の終わりに得られる濃縮された残留物から溶解によって標的となるＣＩの核酸を抽出し、標的となるＣＩのその核酸を、標的となるそのＣＩに合ったプライマを用いてＰＣＲ（又は、標的となるウイルスがレトロウイルスならばＲＴ−ＰＣＲ）によって増幅し、任意により得られる核酸をゲル上で可視化することで、標的となるＣＩの存在又は不在を明らかにする、及び／又は媒体Ｍに含まれる標的となるＣＩを定量する。本発明による方法の段階ｃ）に従って得られたマイクロビーズの表面に固定された標的となるウイルスを検出及び／又は同定するため、残留物を再び懸濁させ、標的となるウイルスに対する感受性のある細胞とマイクロビーズを接触させ、その細胞を培養し、細胞が標的となるそのウイルスに任意により感染していることを観察することが望ましい。細胞の感染を検出するには、例えば、細胞を適切に着色した後に感染性化合物の細胞病理効果を観察すること、又は細胞を固定し、感染性化合物の存在に対応するタンパク質を認識する蛍光性抗体と反応させた後に免疫蛍光を観察することができる。
マイクロビーズの外表面を構成する固体材料の選択は、プラスチック材料とエラストマーからなる群の中から行なうことが好ましい。そのときその材料は、マイクロビーズの外表面に引っ掛かる反応基を持つことで、又は持たずに、タンパク質β２ＧＰＩとの化学的結合を保証している。マイクロビーズは、ほぼ球形の形状を持っていて平均直径が１〜１００，０００ｎｍであることが望ましい。第１の変形例によれば、マイクロビーズは、そのマイクロビーズが懸濁された媒体から遠心分離によって分離する。しかし好ましい第２の変形例によれば、磁場によって懸濁媒体からマイクロビーズを分離できるようにするため、磁性材料の粒子で形成されたコアを有するマイクロビーズを選択する。このような磁性マイクロビーズは市場で入手することができる。磁性マイクロビーズは、例えば、ポリスチレンポリマー・マトリックスで覆われた磁性コアからなる。懸濁媒体からのマイクロビーズの分離を可能にする磁場は、単に永久磁石を中身に近づけて作り出し、本発明による方法の段階ｃ）が実現される。
マイクロビーズを構成する材料の選択に関する唯一の制約は、β２ＧＰＩがカップルできるかどうかである。例えば、メルク社が販売している商品名“Ｅｓｔａｐｏｒ（登録商標）超常磁性マイクロスフェア”の磁性マイクロビーズを用いることができる。すでに指摘したように、マイクロビーズへのβ２ＧＰＩのカップリングは、受動的に実現すること、又は化学的カップリングのプロトコルを利用して実現することができる。マイクロビーズ（特に上記のマイクロビーズ“Ｅｓｔａｐｏｒ（登録商標）”）との受動的なカップリングを実現するには、β２ＧＰＩを含むｐＨが３．５〜１０．５、より好ましくは５．５〜９．５の緩衝液にマイクロビーズを懸濁させることが望ましい。使用する緩衝液は、生物学で一般的な緩衝液の１つであり、特に酢酸塩緩衝液、リン酸塩緩衝液、ホウ酸塩緩衝液、トリスが可能である。マイクロビーズ／β２ＧＰＩの混合物は、撹拌（ゆっくりとした定常的な水平撹拌が好ましい）しながら４℃〜４０℃の温度にて１０分間〜２４時間の期間にわたってインキュベートすることが好ましい。その後、マイクロビーズを磁性又は遠心分離によって分離し、上清を除去する。マイクロビーズを含む沈殿物を保存用緩衝液の中に懸濁させる。この緩衝液は、あとでカップリングに用いるのと同じものであることが好ましい。この緩衝液のｐＨは６〜９である。マイクロビーズへのタンパク質β２ＧＰＩの担持は、マイクロビーズの乾燥重量１ｇにつき１０−６〜１００ｍｇのβ２ＧＰＩを含む水溶液として含む懸濁液体媒体の中で、このようにして構成された懸濁液を３０℃〜４５℃の温度にて１５〜６０分間にわたって撹拌しながら行なうことが好ましい。そのとき懸濁液体媒体のβ２ＧＰＩの濃度は１０−５〜１０μｇ／μｌである。
ＣＩを含むサンプルは、β２ＧＰＩを担持したマイクロビーズに直接接触させるか、ｐＨが５〜９（５．６〜８が好ましい）の緩衝液の中に希釈した後にマイクロビーズに接触させる。β２ＧＰＩとＣＩの間に形成される複合体は、その後、５分間〜２４時間（３０分間〜２時間が好ましい）の期間、４℃〜４０℃（約３７℃が好ましい）の温度にてインキュベートすることが望ましい。インキュベーションの後、マイクロビーズの表面に固定されたβ２ＧＰＩと反応しなかったサンプルをマイクロビーズの遠心分離又は磁化によって除去する。このようにして分離されたマイクロビーズは、ＣＩの検出及び／又は定量及び／又は同定に用いることができる。支持体にβ２ＧＰＩによって結合したＣＩの分離及び／又は定量及び／又はアッセイは、公知の任意の手段で実現できる。手段としては、例えば、感染力、特異的酵素反応、蛍光性トレーサー、放射性標識したトレーサー、標識したプローブとのハイブリダイゼーションによる特定の核酸の検出、ポリメラーゼ連鎖反応、アッセイ、カウント、可視化、光学的方法、電子顕微鏡その他の顕微鏡による観察がある。
本発明の目的の更なる理解のため、本発明の幾つかの実施例を以下に説明するが、これらは単なる例示に過ぎない。
［実施例１］
第二銅媒体におけるβ２ＧＰＩを担持したマイクロビーズの表面への細菌の固定
第二銅媒体におけるβ２ＧＰＩを担持したマイクロビーズの表面への細菌の固定
第１に、使用した細菌は、農業産物保存センター（ＣＰＡ）から提供された大腸菌株である。予備培養物を、ＬＢ（ルリア・ベルターニ）培地中で３７℃にて１６時間インキュベートする。ＬＢ培地は以下の組成を有する。
バクトトリプトン １０ｇ
酵母抽出物 ５ｇ
ＮａＣｌ １０ｇ
ｐＨ ７．５
水 １０００ｇになるまでの残量
この予備培養物はすぐに使用するか、４．５℃で保管する。
バクトトリプトン １０ｇ
酵母抽出物 ５ｇ
ＮａＣｌ １０ｇ
ｐＨ ７．５
水 １０００ｇになるまでの残量
この予備培養物はすぐに使用するか、４．５℃で保管する。
細菌を固定するためにこの実施例で用いるマイクロビーズは、メルク社が販売している商品名“Estapor（登録商標）超常磁性マイクロスフェア”磁性マイクロビーズである。このマイクロビーズは直径が０．３００〜０．５００μｍである。
β２ＧＰＩを含むｐＨ６．０の緩衝液の中にこれらマイクロビーズを懸濁させる。このカップリング用緩衝液中のβ２ＧＰＩの濃度は１００μｇ／ｍｌである。マイクロビーズをこの緩衝液の中でゆっくりと定常的に撹拌しながら２５℃にて３時間インキュベートする。次にマイクロビーズを１５００回転／分で遠心分離した後、上清を除去する。遠心分離の沈殿物を、後にβ２ＧＰＩのカップリングに用いるのと同じ緩衝液中に懸濁させる。これにより、試験対象のβ２ＧＰＩを担持したマイクロビーズの懸濁液が形成される。
あらかじめ培養した１０５個の細菌を、５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．６）、ＰＢＳ緩衝液（以下の組成参照）、２ｍＭのＣｕＳＯ４を含むか含まない５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（１０ｍＭのＨＣｌを用いてｐＨを５．６にする）、ＬＢ培地何れかの中に懸濁させる。大腸菌のさまざまな懸濁液を、一定量のマイクロビーズ（１０μｌ）とともに１ｍｌの溶血用試験管の中に入れる。試験管を水平に撹拌しながら３７℃にて６０分間にわたってインキュベートする。次に、各試験管の中で、試験管の壁面の外側に接して配置した永久磁石を用いてマイクロビーズを液相から分離した後、上清を排除する。次にマイクロビーズを無菌ＰＢＳで２回洗浄する。無菌ＰＢＳの組成は以下の通りである。
ＮａＣｌ ８０ｇ
ＫＣｌ ７４．５６２ｇ
ＫＨ２ＰＯ２ ２．４ｇ
Ｎａ２ＨＰＯ４／２Ｈ２Ｏ ２９ｇ
水 １０００ｇになるまでの残量
細菌の存在をＰＣＲによって評価する。得られた結果を表Ｉに示す。
ＮａＣｌ ８０ｇ
ＫＣｌ ７４．５６２ｇ
ＫＨ２ＰＯ２ ２．４ｇ
Ｎａ２ＨＰＯ４／２Ｈ２Ｏ ２９ｇ
水 １０００ｇになるまでの残量
細菌の存在をＰＣＲによって評価する。得られた結果を表Ｉに示す。
マイクロビーズによって捕獲された細菌から、細菌のＤＮＡを抽出する。マイクロビーズに１００μｌの“Ｃｈｅｌｅｘ ３０％”を添加することによって細菌を溶解させる。この混合物を９５℃にて１０分間にわたってインキュベートする。次に、１０分間にわたって１０，０００回／分で遠心分離する。ＤＮＡを含む上清を−２０℃で保管する。
３μｌのＤＮＡ抽出物を４７μｌの増幅溶液（ＡｑｕａＰｕｒｅゲノムＤＮＡ分離キット）に添加する。最終濃度は以下の通りである。
・５μｌ：２００ｍＭのｄＸＴＰ
・１０μｌ：緩衝液５×
・５μｌ：２ｍＭのＭｇＣｌ２
・１μｌの各プライマ：（２００ｍｌに希釈したプライマ）：
２７：ＧＴＧＣＴＧＣＡＧＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ（センス）
１４９２：ＣＡＣＧＧＡＴＣＣＴＡＣＧＧＧＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ（アンチセンス）
・１μｌ：５Ｕ／μｌのＴａｑポリメラーゼ
・注射用水を５０μｌになるまで。
・５μｌ：２００ｍＭのｄＸＴＰ
・１０μｌ：緩衝液５×
・５μｌ：２ｍＭのＭｇＣｌ２
・１μｌの各プライマ：（２００ｍｌに希釈したプライマ）：
２７：ＧＴＧＣＴＧＣＡＧＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ（センス）
１４９２：ＣＡＣＧＧＡＴＣＣＴＡＣＧＧＧＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ（アンチセンス）
・１μｌ：５Ｕ／μｌのＴａｑポリメラーゼ
・注射用水を５０μｌになるまで。
ホモジナイゼーションの後、反応混合物をサーモサイクラー“エッペンドルフ”の中に入れ、以下のプログラムを実行する。
９４℃：１分間
６０℃：１分間
７２℃：２分間
７２℃：１０分間
を３５サイクル。
９４℃：１分間
６０℃：１分間
７２℃：２分間
７２℃：１０分間
を３５サイクル。
次にＤＮＡを１０℃に維持する。臭化エチジウムを含む０．５×のＰＢＥ緩衝液の中の２％アガロース・ゲル上で移動が起こる。次にゲルをＵＶ光のもとで観察する。ＰＣＲの結果から、細菌が存在していることがはっきりとわかる。すなわち強い陽性信号が確認される。次に、公知のシークエンシングによって細菌を同定する。ＰＣＲから、使用する緩衝液が何であれ、マイクロビーズの表面に細菌のＤＮＡが存在していることがわかる。Ｃｕ２＋が存在している酢酸塩緩衝液の場合には、より大きな信号になる。
第２に、緑膿菌、肺炎球菌、連鎖球菌（Staphylococcus aureus）で同様のテストを実施し、同じタイプの結果が得られた。
［実施例２］
第二銅媒体におけるβ２ＧＰＩを担持したマイクロビーズの表面へのヘルペスＯｓＨＶ−１ウイルスの固定
第二銅媒体におけるβ２ＧＰＩを担持したマイクロビーズの表面へのヘルペスＯｓＨＶ−１ウイルスの固定
このウイルスは牡蛎の中に存在する。牡蛎をホモジェネートにし、β２ＧＰＩを担持した磁性マイクロビーズを用いてＰＣＲによりＤＮＡを抽出する。β２ＧＰＩを担持したマイクロビーズは、実施例１に示したようにして調製する。
１００ｍｇの若い牡蛎を５００μｌのミリＱ品質の水の中でホモジェネートにする。ホモジェネート（５０μｌ）を異なる２種類の緩衝液の中に希釈する。すなわちＰＢＳ緩衝液（ｐＨ＝７〜７．４）（組成は実施例１と同じ）と、実施例１に記載した組成の酢酸塩／Ｃｕ２＋緩衝液（ｐＨ＝５．６）である。
このようにして構成した２種類の５００μｌの流体Ｍに、１０μｌ、又は２０μｌ、又はβ２ＧＰＩを担持した５０μｌの量のマイクロビーズを添加した。次にマイクロビーズを３７℃にて３０分間にわたってインキュベートした後、ＰＢＳ緩衝液で２回洗浄する。最後に、１００μｌの“Ｃｈｅｌｅｘ３０％”を添加してＤＮＡを抽出する。９５℃にて１０分間にわたってインキュベートした。すべてのエッペンドルフ管に対して１０，０００回転／分の遠心分離を行ない、ＤＮＡを含む上清を保存する。
次に、１μｌのＤＮＡ抽出物でＰＣＲを実行する。１９μｌの増幅溶液（ＰＣＲホット・マスターＴａｑエッペンドルフ・キット）を添加する。この増幅溶液の最終濃度は次の通りである。
緩衝液 １×
ｄＮＴＰ ２５０μＭ
プライマＣ２とＣ６ それぞれ０．２μＭ
Ｔａｑポリメラーゼ １．５Ｕ
プライマＣ２とＣ６は以下の通りである。
Ｃ２（センス）＝ＣＴＣＴＴＴＡＣＣＡＴＧＡＡＧＡＴＡＣＣＣＡＣＣ
Ｃ６（アンチセンス）＝ＧＴＧＣＡＣＧＧＣＴＴＡＣＣＡＴＴＴＴＴ
この反応混合物を均質にし、サーモサイクラー“マスター・サイクラー・パーソナル・エッペンドルフ”の中に入れ、以下のプログラムを実行する：
９４℃ ２分間
９４℃ １分間
５０℃ １分間
７０℃ ３０秒間
７０℃ ５分間
を３５サイクル。
緩衝液 １×
ｄＮＴＰ ２５０μＭ
プライマＣ２とＣ６ それぞれ０．２μＭ
Ｔａｑポリメラーゼ １．５Ｕ
プライマＣ２とＣ６は以下の通りである。
Ｃ２（センス）＝ＣＴＣＴＴＴＡＣＣＡＴＧＡＡＧＡＴＡＣＣＣＡＣＣ
Ｃ６（アンチセンス）＝ＧＴＧＣＡＣＧＧＣＴＴＡＣＣＡＴＴＴＴＴ
この反応混合物を均質にし、サーモサイクラー“マスター・サイクラー・パーソナル・エッペンドルフ”の中に入れ、以下のプログラムを実行する：
９４℃ ２分間
９４℃ １分間
５０℃ １分間
７０℃ ３０秒間
７０℃ ５分間
を３５サイクル。
次に、ＤＮＡを１０℃で保管する。牡蛎のホモジェネートを（牡蛎養殖場に由来する）５ｍｌ、１０ｍｌ、２０ｍｌの海水で置き換えて同じ作業を実施した。そのときのβ２ＧＰＩを担持したマイクロビーズの量は一定であり、５０μｌに等しい。
比較のため、上に示した２種類の溶解生成物により、β２ＧＰＩを担持したマイクロビーズをあらかじめ添加することなしに牡蛎のホモジェネートに対してウイルスのＤＮＡの直接抽出を行なった。そのとき同じ条件のＰＣＲを利用した。
どの場合にも、ＰＣＲで得られたＤＮＡを用い、臭化エチジウムを含む０．５×のＰＢＥ緩衝液の中の２％アガロース・ゲル上でサザンブロットを実施した。次にゲルをＵＶ光のもとで観察する。結果の全体を図１に示す。この図のレーン１〜１３は、表IIに示した実験を表わす。
図１から、レーン１〜８が同じ陽性信号を示していることがわかる。すなわち、直接的な抽出によって得られたウイルスのＤＮＡ（レーン７と８）は、まさにマイクロビーズ（レーン１〜６）のおかげで得られたＤＮＡである。すべてのＤＮＡのシークエンシングを行なった。マイクロビーズによって得られるアンプリコンは、ＯｓＨＶ−１ウイルスの糖タンパク質１００５の遺伝子の７０９塩基の配列に対応している。ホモジェネートをＰＢＳに希釈する場合には（レーン１〜３）、信号は、使用するマイクロビーズの量がどれだけであっても同じであるのに対し、Ｃｕ２＋イオンの存在下では（レーン４〜６）、信号は、マイクロビーズの量が多いほど強い。さらに、Ｃｕ２＋イオンの存在下では（レーン４〜６）、信号は、Ｃｕ２＋イオンの不在下（レーン１〜３）におけるよりも常に強い。これは、検出感度を改善するＣｕ２＋イオンが存在していることの利点を示している。
レーン９〜１１では、レーン１１に関して信号が弱いことがわかる。その一方で、海水での直接抽出では陰性の結果が得られたことがわかっていた。これも、Ｃｕ２＋イオンがないとマイクロビーズによる検出が弱いことを示している。
レーンＴ＋は、ＰＣＲがうまく機能することを明確にするためウイルスＤＮＡの配列を用いて得られる正の対照である。レーンＴｍｉｘは、ＰＣＲで用いる全成分だがウイルスＤＮＡは不在の状態で得られた対照である。
［実施例３］
Ｃ型肝炎ウイルス（ＶＨＣ）の検出
Ｃ型肝炎ウイルス（ＶＨＣ）の検出
Ｃ型肝炎ウイルスに感染した病人に由来する５０μｌの血清を、５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（１０ｍＭのＨＣｌを用いてｐＨ＝５．６にした）５００μｌに希釈する。この媒体に、β２ＧＰＩを担持した実施例１で調製したのと同じマイクロビーズを１０μｌ添加する。第二鉄塩、第二銅塩、亜鉛塩、マンガン塩も添加し、２ｍＭの金属イオンが存在する媒体を得る。この全体を回転させて撹拌しながら３７℃にて３０分間にわたってインキュベートする。次に、マイクロビーズを懸濁させた媒体からのマイクロビーズの分離を可能にする永久磁石を、サンプルを収容したチューブに沿って配置した後、上清を除去する。“ＱＩＡａｍｐウイルスＲＮＡミニキット（キアジェン社）”のプロトコルに従ってマイクロビーズを溶解させる。ウイルスの核酸に対してＲＴ−ＰＣＲのプロトコルを実施する。ＲＴ−ＰＣＲのプロトコルは、以前にＹｏｕｎｇらによって報告されている（J. Clin. Microbiol.、１９９３年、第３１巻（４）、８８２〜８８６ページ）。４μｌのＲＮＡ抽出物を２１μｌの増幅溶液（ＲＴ−ＰＣＲ一段階・キット、キアジェン社）に添加する。この増幅溶液の最終濃度は以下の通りである。
キアジェン緩衝液 １×
ｄＮＴＰ ４００μＭ
プライマ それぞれ０．６μＭ
Ｔａｑポリメラーゼ １．５Ｕ
ＲＮアーゼ阻害剤 １５Ｕ
使用したプライマは以下の通りである。
ＫＹ７８（センス）：ＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡＧＧＣＡＧＴ
ＫＹ８０（アンチセンス）：ＡＧＣＧＴＣＴＡＧＣＣＡＴＧＧＣＧＴ
キアジェン緩衝液 １×
ｄＮＴＰ ４００μＭ
プライマ それぞれ０．６μＭ
Ｔａｑポリメラーゼ １．５Ｕ
ＲＮアーゼ阻害剤 １５Ｕ
使用したプライマは以下の通りである。
ＫＹ７８（センス）：ＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡＧＧＣＡＧＴ
ＫＹ８０（アンチセンス）：ＡＧＣＧＴＣＴＡＧＣＣＡＴＧＧＣＧＴ
ホモジナイゼーションの後、反応混合物をサーモサイクラー“マスター・サイクラー・パーソナル・エッペンドルフ”の中に入れ、以下のプログラムを実行する：
５０℃：３分間
９５℃：１５分間
９５℃：１分間
５５℃：１分間
７０℃：１分間
７２℃：１分間
を３５サイクル。次にＤＮＡを４℃に維持し、図２に対応するサザンブロットを実施する。
５０℃：３分間
９５℃：１５分間
９５℃：１分間
５５℃：１分間
７０℃：１分間
７２℃：１分間
を３５サイクル。次にＤＮＡを４℃に維持し、図２に対応するサザンブロットを実施する。
図２から、Ｃｕ２＋の存在下では、Ｃ型肝炎ウイルスの検出感度が断然向上していることがわかる。逆に、Ｚｎ２＋の存在下ではウイルスを検出できない。しかもそれは、サンプルのｐＨに関係しない。
１ｍｌのサンプルにウイルスのゲノムが１３０コピー含まれたサンプル（血清又は血漿）で得られた結果を図３に示す。１６本のレーンに対応するサンプルの定義を表IIIに示す。図３から、β２ＧＰＩを担持した磁性マイクロビーズの不在下では、ウイルスの存在を示すいかなる信号もないことが確認される。すなわち、利用した方法の感度の限界に到達した。逆に、Ｃｕ２＋の存在下では、ウイルスの信号が見えるようになる。
さらに、Ｃｕ２＋イオンがサンプルには作用するがマイクロビーズには作用しないようにした。このため、β２ＧＰＩを担持したマイクロビーズに２ｍＭの酢酸第二銅を添加した。撹拌しながら３７℃にて３０分間にわたってインキュベートした。次にマイクロビーズを洗浄し、Ｃｕ２＋を含まない血清サンプルと接触させた。図４のレーン１〜６の各々に対応するテストの性質を表IVに示す。
［実施例４〜８］
他のウイルスの検出
他のウイルスの検出
ウイルスがＤＮＡウイルスであるかＲＮＡウイルスであるかに応じ、実施例２又は３で上に説明したのと同じテスト・プロトコルを利用した。
これらウイルスのすべてで結果は実施例２又は３に記載したのと同じであった。テストしたウイルスは、西ナイル・ウイルス、アンデス・タイプのハンタウイルス、デング熱ウイルスのサブタイプ１、２、３、４、ＨＩＶ１と２のウイルス、インフルエンザＨ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２のウイルスである。
［実施例９］
第二銅媒体におけるマイクロビーズによるインフルエンザＨ３Ｎ２ウイルスの捕獲と、ウイルスを担持したマイクロビーズを利用したそのウイルスの視覚的検出
第二銅媒体におけるマイクロビーズによるインフルエンザＨ３Ｎ２ウイルスの捕獲と、ウイルスを担持したマイクロビーズを利用したそのウイルスの視覚的検出
インフルエンザにかかった患者の咽頭サンプルを、２ｍＭの硫酸第二銅を含むＭＥＭ培地（“イーグル”の最少必須培地）の中に希釈する。そこに、実施例１で調製したようなマイクロビーズを１０μｌ添加する。したがってこれらマイクロビーズはβ２ＧＰＩを担持している。これらマイクロビーズを、サンプルが中に存在する５００μｌの培地と接触させる。そのときすべてを２ｍｌのエッペンドルフ管の中に入れる。この混合物を回転させて撹拌しながら３７℃にて３０分間にわたってインキュベートする。次にエッペンドルフ管を永久磁石と接触させる。マイクロビーズは磁場によって壁に引きつけられる。上清を吸引して除去する。エッペンドルフ管の中に１．５ｍｌのＰＢＳ緩衝液（実施例１の組成）を添加し、マイクロビーズの懸濁液を得る。エッペンドルフ管を再び永久磁石と接触させ、上清を吸引して除去する。マイクロビーズを洗浄するこの操作を合計３回繰り返した後、マイクロビーズを１ｍｌのＭＥＭ培地緩衝液の中に再び懸濁させる。
このようにして得られた懸濁液を３７℃にて２４時間にわたってＭＤＣＫ培地と接触させる。次に細胞を生理学的血清の中で２回洗浄し、新鮮なＭＥＭ培地を添加し、細胞を３７℃にて４日間にわたって培養する。ウイルスの感染を、クリスタル・バイオレットで細胞を着色した後の細胞病原効果によって確認する（図５参照）か、アセトンにより細胞を固定し、ウイルスのタンパク質を認識する蛍光性モノクローナル抗体と反応させた後に免疫蛍光によって確認する（図６Ａと図６Ｂ）。
図５では、左側のペトリ皿は６０００ｐｆｕ（１ｐｆｕによって溶解物のプラークを１つ形成することができる）のウイルスに対応しており、中央は２０００ｐｆｕのウイルスに対応しており、右側は２００ｐｆｕのウイルスに対応している。細胞が徐々に消えていくことから、マイクロビーズが確かに細胞病原効果のあるウイルスを担持していることがわかる。
図６Ａでは、ウイルスのタンパク質を有する細胞が蛍光によって探知されることが見られる。すなわち、ウイルスのサンプルを含む培地をＭＤＣＫ細胞と直接接触させ、細胞がほとんど蛍光を出さないことを確認する。これは、マイクロビーズを利用しないときにはウイルスの捕獲がわずかであることを示している。図６Ｂは、マイクロビーズを利用して得られた結果を示している。マイクロビーズがサンプルのウイルスを濃縮したことがわかる。したがってこうすることにより、担持されるウイルスがはるかに少なくても検出が可能になる。
［実施例１０］
β２ＧＰＩを担持したマイクロビーズによるワクチンのウイルスの捕獲と、そのマイクロビーズを利用した細胞の感染
β２ＧＰＩを担持したマイクロビーズによるワクチンのウイルスの捕獲と、そのマイクロビーズを利用した細胞の感染
実施例９で詳述したのと同じプロトコルを、β２ＧＰＩを担持したマイクロビーズに捕獲されたワクチンのウイルスをＨｅｐ２細胞に感染させるのに利用する。この実施例では溶解物のプラークを１０００個形成できる（１０００ｐｆｕ）ウイルス懸濁液を用いた。
図７Ａは、β２ＧＰＩを担持したマイクロビーズにワクチンのウイルスが捕獲されたときの状況を示している。多数の細胞が感染したことがわかる。逆に、図７Ｂは、β２ＧＰＩを担持したマイクロビーズなしでＨｅｐ２細胞がワクチンのウイルスに感染した場合を示している。蛍光を出す細胞の数がはるかに少ないことがわかる。したがって、β２ＧＰＩを担持したマイクロビーズにより、利用するウイルスの濃縮が可能である。というのも、ウイルスの量は図７Ａと図７Ｂのテストで同じだったからである。
図７Ｃは、マイクロビーズにβ２ＧＰＩとワクチンのウイルスを担持させた後にそのマイクロビーズの洗浄用緩衝液と接触させたＨｅｐ２細胞を示している。蛍光が見られないことが確認される。これは、マイクロビーズの表面に固定されたウイルスを洗浄用緩衝液がまったく連れ去らなかったことを意味する。
したがってβ２ＧＰＩを担持したマイクロビーズにより、ウイルスの検出感度を改善することができる。
Claims (18)
- 生物材料を構成する液状媒体Ｍ内に存在する感染性化合物の検出及び／又は定量及び／又は同定のためのインビトロの方法であって、公知の手法により、マイクロビーズの液状懸濁媒体中懸濁液が調製され、前記マイクロビーズは、タンパク質を結合可能な固体ポリマー物質により構成された外表面により境界画定されるとともに、前記方法は：
ａ）懸濁液中のマイクロビーズに対するβ２ＧＰＩタンパク質の導入を、十分量のβ２ＧＰＩタンパク質とのカップリングにより、懸濁媒体中で受動的に、又は公知の化学結合プロトコルを用いて達成する段階；
ｂ）マイクロビーズにより担持されたβ２ＧＰＩタンパク質に対する感染性化合物の十分な結合を達成するべく、容器内で、第二銅イオンを添加することにより、β２ＧＰＩタンパク質が導入された前記マイクロビーズを、適切な条件下で液状媒体Ｍと接触させる段階；
ｃ）前記により調製されたマイクロビーズをその懸濁媒体から分離し、前記懸濁媒体を容器から排出し、高濃度の感染性化合物を含む残渣を得る段階；
ｄ）並びに、前記により得られた濃縮された残渣から感染性化合物を検出及び／又は定量及び／又は同定する段階
を含むことを特徴とする方法。 - 段階ａ）において、マイクロビーズへの担持を、ｐＨが３．５〜１０．５の緩衝液の中で４〜４０℃の温度にて１０分間〜２４時間の時間にわたってインキュベートすることによって受動的に行なうことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
- マイクロビーズの乾燥重量１ｇ当たり１０−６〜１００ｍｇのβ２ＧＰＩを水溶液中に含有し、β２ＧＰＩの濃度が１０−５〜１０μｇ／μｌである懸濁液体媒体中で、前記マイクロビーズへのタンパク質β２ＧＰＩの担持を行なうことを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
- ｐＨが５〜９の緩衝液中で、４〜４０℃温度で、１０分間〜２４時間にわたってインキュベートすることにより、前記マイクロビーズへのタンパク質β２ＧＰＩの担持を行なうことを特徴とする、請求項１〜３の何れか１項に記載の方法。
- 段階ｂ）において、イオン添加後における流体Ｍ中の第二銅イオンの濃度が１ｍＭ〜１００ｍＭであることを特徴とする、請求項１〜４の何れか１項に記載の方法。
- 前記マイクロビーズの外表面を構成する前記固体材料がプラスチック材料及びエラストマーからなる群より選択され、前記材料は、タンパク質β２ＧＰＩとの化学結合を保証するべく、前記マイクロビーズの外表面にグラフトされる反応基を有し、又は有さないことを特徴とする、請求項１〜５の何れか１項に記載の方法。
- 選択されるマイクロビーズが略球形であり、平均直径が１〜１００，０００ｎｍであることを特徴とする、請求項１〜６の何れか１項に記載の方法。
- 選択されるマイクロビーズが、磁場により前記懸濁媒体からの前記マイクロビーズの分離を可能とするべく、磁性材料粒子で形成されたコアを有することを特徴とする、請求項１〜７の何れか１項に記載の方法。
- 前記マイクロビーズを、そのマイクロビーズが懸濁された媒体から遠心分離によって分離することを特徴とする、請求項１〜７の何れか１項に記載の方法。
- 段階ｄ）が、感染力、特異的酵素反応、蛍光性トレーサー、放射性標識したトレーサー、標識したプローブとのハイブリダイゼーションによる特定の核酸の検出、ＰＣＲ反応、ＲＴ−ＰＣＲ反応、アッセイ、カウント、可視化、光学的方法、電子顕微鏡その他の顕微鏡による観察からなる群から選択される手段によって行われることを特徴とする、請求項１〜９の何れか１項に記載の方法。
- 段階ｃ）において、高濃度の感染性化合物を含む残渣を得る前に、懸濁媒体を緩衝液で洗浄する、請求項１〜１０の何れか１項に記載の方法。
- 前記感染性化合物が細菌であることを特徴とする、請求項１〜１１の何れか１項に記載の方法。
- 前記感染性化合物がウイルスであることを特徴とする、請求項１〜１１の何れか１項に記載の方法。
- 残留物中における前記流体Ｍの細菌の検出及び／又は定量及び／又は同定を、光学密度の読み取り、ＡＴＰ測定、及びＰＣＲの何れかにより実施することを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
- 濃縮された残留物から標的となるＣＩの核酸を溶解法により抽出し、その標的ＣＩに応じたプライマーを用いて前記核酸をＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲによって増幅することにより、前記流体Ｍ内における標的ＣＩの存在又は不在の検出、及び／又は、前記流体Ｍ内に含まれる標的ＣＩのウイルス量を定量することを特徴とする、請求項１２〜１４の何れか１項に記載の方法。
- ＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲによって増幅された核酸をゲル上で可視化する、請求項１５に記載の方法。
- 段階ｃ）により得られたマイクロビーズの表面に固定化された標的ウイルスを検出及び／又は同定するべく、前記残留物を再び懸濁させ、標的ウイルスに対し感受性を有する細胞に前記マイクロビーズを接触させ、前記細胞を培養し、前記細胞が標的ウイルスに感染しているか否かを観察することを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
- 細胞の感染を検出するため、細胞を適切に着色した後にウイルスの細胞病理効果を観察すること、又は細胞を固定し、ウイルスの存在に対応するタンパク質を認識する蛍光性抗体と反応させた後に免疫蛍光を観察することを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
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