ES2306731T3 - Microorganismos que se han hecho no patogenos. - Google Patents

Microorganismos que se han hecho no patogenos. Download PDF

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Abstract

Un microorganismo purificado que comprende proteínas superficiales y componentes nucleares sustancialmente intactos, en el que una o más proteínas superficiales se han modificado irreversiblemente por un reactivo modificador, de tal modo que el microorganismo se ha hecho por ello no patógeno; y en el que la modificación irreversible se selecciona entre: (i) incorporación covalente de un compuesto que comprende uno o más grupos funcionales reactivos a uno o más lugares reactivos en dichas proteínas superficiales; o (ii) al menos digestión parcial por una enzima.

Description

Microorganismos que se han hecho no patógenos.
Campo de la invención
La presente invención se refiere en general al área de detección de virus en muestras biológicas. Más particularmente, la presente invención se refiere a una composición material que puede servir como un testigo fiable en la detección de virus por métodos de multiplicación de ácidos nucleicos.
Descripción de la técnica relacionada
La presencia de virus, tales como el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV), en muestras biológicas se identifica típicamente por métodos indirectos, es decir, detectando anticuerpos dirigidos contra un virus particular o un componente del virus. Este método de detección está limitado en su capacidad para detectar pequeñas cantidades de virus porque los anticuerpos no se desarrollan típicamente en niveles detectables hasta después de crecer el virus o reproducirse considerablemente dentro del cuerpo. Así, por ejemplo, en métodos de examen de suministros de sangre para transfusión, los métodos indirectos existentes pueden no ser adecuados para examinar sangre infectada. En un esfuerzo por diagnosticar infecciones víricas en una fase más temprana, se han desarrollado técnicas de multiplicación de ácidos nucleicos para detectar y cuantificar virus en muestras biológicas. Tales técnicas incluyen reacción en cadena de polimerasa (PCR), multiplicación mediada por transcripción (TMA), multiplicación basada en señales de ácidos nucleicos (NASBA) y reacción en cadena de ligasa (LCR). Estas tecnologías son útiles en la diagnosis de infección vírica y para comprobar la carga vírica en individuos infectados durante el tratamiento. Además, estas tecnologías son útiles para examinar sangre antes de la transfusión.
Comenzando en la primavera de 1999, la American Red Cross y 16 laboratorios miembros de los America's Blood Centers empezaron ensayar en sangre de donantes el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) tipo 1 y el virus de la hepatitis C con un nuevo ensayo genético diseñado para detectar infecciones víricas en sus fases muy tempranas. Estos ensayos, denominados Ensayos de ácidos nucleicos (NAT), son capaces de detectar pequeñas cantidades de un virus antes de que el cuerpo del donante de sangre organice una respuesta inmune. El poder de los NAT es su capacidad para detectar la presencia de infección ensayando directamente los ácidos nucleicos genómicos víricos en lugar de ensayar indirectamente la presencia de anticuerpos. Además, los NAT son mucho más sensibles que otros métodos de detección directos tales como ensayo de detección de antígeno p24 de HIV porque NAT puede detectar tan poco como 50 partículas víricas en especímenes clínicos. Los NAT podrían potencialmente detectar HIV en sangre aproximadamente 10 días después de la infección. La U.S. Food and Drug Administration (FDA) está fomentando fuertemente bancos de sangre para comenzar ensayos NAT y hospitales para usar sangre examinada por NAT (Komman et al., 1999, Cancer Control, Volumen 6, Número 5).
Están disponibles varios juegos y servicios de NAT comerciales para el ensayo de HIV, el virus de la hepatitis C (HCV) y el virus de la hepatitis B (HBV), tales como los comercializados por Roche Diagnostics (Indianapolis, IN), National Genetics Institute, Inc. (Los Angeles, CA), Bayer Corporation (Tarrytown, NY) y Gen-Probe, Inc. (San Diego, CA). Estos juegos y servicios de ensayo emplean ensayos de múltiples etapas en los que la etapa inicial es la extracción o purificación parcial del ácido nucleico objetivo, seguida por multiplicación y detección del ácido nucleico. Los testigos positivos desarrollados para detección basada en NAT son hasta aquí: 1) plasma o suero de individuos infectados y 2) ácidos nucleicos sintéticos y clonados. Estos testigos tienen varios inconvenientes. Por ejemplo, aunque plasma o suero de individuos infectados sirve como testigo del procedimiento completo para todas las etapas en un procedimiento de diagnóstico, contiene sustancias infecciosas y no es estable a temperaturas de refrigerador (2-8ºC). Los ácidos nucleicos sintéticos o clonados no sirven como testigos para la etapa de extracción y no son por tanto testigos del procedimiento completo. Además, los ácidos nucleicos sintéticos y clonados son extremadamente sensibles a nucleasas y requieren por tanto cuidado especial en manipulación. Se ha desarrollado un "ARN blindado" resistente a nucleasas. Sin embargo, este material blindado no está contenido dentro de una partícula de virus intacta y no se extrae así similar a plasma infectado víricamente. Así, el material blindado no sirve como testigo para el procedimiento de extracción y tampoco se multiplica con TMA y LCR.
La rama Center for Biologics Evaluation and Research (CBER) de la FDA ha publicado directrices para materiales testigo de NAT de HIV. Las directrices (Guidance for Industry, In the Manufacture and Clinical Evaluation of in vitro Tests to Detect Nucleic Acid Sequences of Human Immunodeficiency Viruses Types 1 and 2, BBS, FDA, CBER, Diciembre de 1999) proporcionan las recomendaciones de la FDA para el formato y funcionamiento de testigos y calibradores para juegos basados en NAT. Según estas directrices, el material testigo debe actuar como un testigo del procedimiento completo, es decir, debe actuar como testigo para todas las etapas del procedimiento de manipulación de la muestra y detección. Además, bajo las directrices, el material debe ser no infeccioso y basarse en un microorganismo bien validado. Por consiguiente, el testigo ideal debe proporcionar una indicación de las etapas de ultracentrifugación, extracción, multiplicación, hibridación, cuantificación y de posible contaminación.
Así, a la vista de las directrices de la FDA y de los inconvenientes identificados con los materiales testigo existentes, hay una necesidad en las técnicas de detección vírica del desarrollo de testigos positivos que puedan servir como testigos del procedimiento completo, sean estables a temperaturas de refrigerador y sean de manejo seguro.
Por consiguiente, un objeto de la presente invención es proporcionar un testigo del procedimiento completo positivo no infeccioso para detectar microorganismos por técnicas de multiplicación de ácidos nucleicos.
Otro objeto de la presente invención es proporcionar un método para producir los testigos internos de la invención.
Otro objetivo de la invención es proporcionar un método de examen en muestras biológicas de la presencia de microorganismos por técnicas de multiplicación de ácidos nucleicos.
Éstos y objetivos adicionales se satisfacen por la presente invención, que comprende partículas de microorganismos inactivados no rotos usadas como material testigo positivo en técnicas de detección de multiplicación de ácidos nucleicos. El material testigo está constituido por microorganismo inactivado no roto y puede formularse en una matriz de plasma estabilizado. El material testigo es no infeccioso, estable en almacenamiento no congelado (tal como 2-8ºC) y produce resultados reproducibles en ensayos de multiplicación de ácidos nucleicos. El material testigo de la presente invención puede guardarse a temperaturas de refrigerador. Además, puesto que el material testigo comprende partículas de microorganismo completo, se rige como un testigo del procedimiento completo y se manipula y trata así de exactamente la misma manera que la muestra biológica ensayada. Como testigo del procedimiento completo, el material puede usarse en la etapa de preparación de muestras y extenderse por el procedimiento de detección total. Así, los materiales testigos de la presente invención se capacitan por cumplir las directrices de la FDA.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona un material testigo positivo, que puede servir como testigo fiable para técnicas de multiplicación de ácidos nucleicos. El material testigo positivo de la invención comprende generalmente un virus o parásito que se ha hecho no infeccioso, aunque conserva los componentes nucleares sustancialmente intactos para ser susceptible a procedimientos de multiplicación de ácidos nucleicos y detección. Las técnicas existentes para inactivar microorganismos, tales como las descritas en los documentos US 4.613.501, EP 0997529 y US 5.552.269, causan daño a componentes nucleares, y, en el caso del documento US 5.552.269, usan una inactivación por calor no dirigida más que un reactivo modificador. Así, tales técnicas no proporcionan un control fiable para técnicas de multiplicación de ácidos nucleicos.
La presente invención proporciona un microorganismo purificado que comprende proteínas superficiales y componentes nucleares sustancialmente intactos, en el que una o más proteínas superficiales se han modificado irreversiblemente por un reactivo modificador de tal modo que el microorganismo se ha hecho por ello no patógeno, y en el que la modificación irreversible se selecciona entre incorporación covalente de un compuesto que comprende uno o más grupos funcionales reactivos a uno o más lugares reactivos en dichas proteínas superficiales, o al menos digestión parcial por una enzima.
La invención proporciona además una composición material que comprende un microorganismo purificado que comprende proteínas superficiales y componentes nucleares intactos, en el que una o más proteínas superficiales se han modificado irreversiblemente por un reactivo modificador de tal modo que el microorganismo se ha hecho por ello no patógeno, y una matriz líquida que simula un fluido biológico.
La invención proporciona también un método para producir un microorganismo purificado no patógeno que comprende proteínas superficiales y componentes nucleares intactos, y modificar irreversiblemente una o más proteínas superficiales usando un reactivo modificador como se ha detallado antes mientras se dejan los componentes nucleares sustancialmente no modificados, de tal modo que el microorganismo se hace por ello no patógeno.
Esta invención proporciona también un método para detectar un microorganismo que comprende proteínas superficiales en una muestra biológica por multiplicación de componentes nucleares de dicho microorganismo, cuyo método comprende la adición de un microorganismo testigo purificado a la muestra biológica, en el que el microorganismo testigo comprende proteínas superficiales y componentes nucleares sustancialmente intactos, y en el que una o más proteínas superficiales de dicho microorganismo testigo se han modificado irreversiblemente usando un reactivo modificador como se ha detallado antes, de tal modo que dicho microorganismo testigo se hace por ello no patógeno.
Además, esta invención proporciona un juego para analizar en una muestra biológica la presencia de un microorganismo que tiene proteínas superficiales, en el que el juego comprende una composición de testigo positivo que comprende un microorganismo purificado que comprende proteínas superficiales y componentes nucleares intactos, en el que una o más proteínas superficiales se han modificado irreversiblemente usando un reactivo modificador como se ha detallado antes, de tal modo que el microorganismo se hace por ello no patógeno.
Esta invención proporciona también un método para detectar un microorganismo que comprende proteínas superficiales en una muestra biológica por técnicas de multiplicación de ácidos nucleicos, cuyo método comprende co-multiplicación de un testigo interno positivo de la muestra biológica, en el que el testigo interno positivo comprende un microorganismo purificado como se ha descrito antes.
Otros aspectos y ventajas de la invención se evidenciarán de las siguientes descripción detallada y reivindicaciones.
Descripción detallada de la invención
Esta invención proporciona un microorganismo purificado que comprende proteínas superficiales y componentes nucleares sustancialmente intactos, en el que una o más proteínas superficiales se han modificado irreversiblemente usando un reactivo modificador como se ha detallado antes, de tal modo que el microorganismo se hace por ello no patógeno.
Los microorganismos considerados en la práctica de la invención son aquellos que son patógenos, y cuya detección ayudaría en la detección o tratamiento de una enfermedad. Según se usa aquí, el término "microorganismo" incluye cualquier organismo microscópico infeccioso que contiene proteínas superficiales que ayudan o favorecen en la capacidad del organismo para infectar un hospedante. Por ejemplo, gp120 está presente en la superficie del virus HIV y actúa como proteína receptora que permite al virus incorporarse a monocitos y linfocitos mediante la unión a sus receptores CD4. (Maddon et al., 1986, Cell, 47:333; MacDougal et al., 1986, Science, 231:382; Moore et al., 1993, en J. Bentz (red.), Virus Fusion Mechanisms, CRC Press, Boca Raton, Fla. En realizaciones preferidas separadamente, el microorganismo puede ser un virus o un parásito intracelular. Según se usa aquí, el término "virus" trata de incluir virus envueltos o no envueltos y aquellos que contienen ARN o ADN como material nuclear. Los ejemplos incluyen, aunque sin limitarse a ellos, el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV), el virus de la hepatitis A, el virus de la hepatitis B, el virus de la hepatitis C, citomegalovirus, virus linfotrófico humano, virus de Epstein-Barr, parvovirus, virus de herpes simplex, virus de herpes humano 8. Los ejemplos de parásitos intracelulares incluyen, aunque sin limitarse a ellos, Chlamydia trachomatis, Chlamydia psittaci, Rickettsia prowazeki, Rickettsia typhi, Rickettsia rickettsi, Rickettsia sibtricus, Rickettsia conori, Rickettsia australis, Rickettsia akari, Rickettsia tsutsugamushi, Coxiella bumeti y Rochalimaea quintana.
Para la preparación del material testigo de la invención, el microorganismo deseado puede desarrollarse por métodos estándares. Por ejemplo, para el virus HIV, se describen métodos para desarrollarlo en la Patente de los EE.UU. Nº 5.135.864, que describe la producción y purificación de HIV. Como fuente alternativa, puede aislarse el microorganismo de fluidos biológicos infectados, tal como de la sangre de un animal infectado. Las técnicas son similares a las usadas cuando se purifica virus de cultivo de células. Véase Davis et al., Microbiology, 2ª Ed. (Harper & Row, 1980). Así, por ejemplo, los virus de la hepatitis B y C pueden purificarse de la sangre de individuos infectados por este método. Además, la producción en masa del microorganismo deseado puede derivarse de linajes celulares infectados crónicamente que están disponibles de, por ejemplo, el AIDS Research and Reference Reagent Program de los National Institutes of Health (NIH) y la American Type Culture Collection (ATCC).
Una vez que está disponible material de cultivo suficiente, el microorganismo puede purificarse usando técnicas conocidas por los de experiencia ordinaria en la técnica. Un método típico de purificación es como sigue. La primera etapa en la purificación de microorganismos implica la separación de células y restos de células. Esto puede conseguirse por técnicas de separación basadas en tamaño o masa, tales como filtración o centrifugación a baja velocidad. Después de esto, el microorganismo puede concentrarse por filtración usando un tamaño de poros adecuado o centrifugación a alta velocidad para formar una preparación de microorganismo purificada parcialmente. La preparación purificada parcialmente puede someterse después a ultracentrifugación y técnicas de purificación por gradiente de densidad para obtener una preparación de microorganismo purificada. El material purificado en masa obtenido tras la purificación se guarda generalmente a -70ºC y se puede ensayar su actividad vírica o parásita por técnicas de cultivo, y la integridad de ácidos nucleicos por técnicas de multiplicación según métodos conocidos en la técnica o como se describe aquí.
Después de la purificación, el microorganismo se hace no patógeno según los métodos de esta invención por modificación selectiva de sus proteínas superficiales usando un reactivo modificador como se ha detallado antes, por lo que el microorganismo se hace no infeccioso mientras los componentes nucleares se dejan sustancialmente intactos. Así, la invención proporciona un método para producir un microorganismo no patógeno que comprende proporcionar un microorganismo purificado que comprende proteínas superficiales y componentes nucleares intactos, y modificar irreversiblemente una o más proteínas superficiales usando un reactivo modificador como se ha detallado antes mientras se dejan los componentes nucleares sustancialmente no modificados, de tal modo que se hace por ello al microorganismo no patógeno.
Según se usa aquí, la expresión "sustancialmente intacto" considera un contacto mínimo de los componentes intracelulares del microorganismo con los agentes modificadores para preservar suficiente contenido nuclear, en particular el contenido de ácidos nucleicos de la célula, de degradación por los reactivos modificadores de tal manera que el ácido nucleico sea susceptible a las técnicas de multiplicación nucleica discutidas aquí. Según se usa aquí, la expresión "no patógeno" significa que, como resultado de la modificación de las proteínas superficiales según los métodos de la invención, el microorganismo no es capaz de infectar células, replicarse o causar enfermedad a pesar de tener sus contenidos nucleares sustancialmente intactos.
En un aspecto de la invención, el microorganismo purificado se modifica por incorporación covalente de un compuesto que comprende uno o más grupos funcionales reactivos a uno o más lugares reactivos en las proteínas superficiales, de tal modo que el microorganismo se hace por ello no patógeno. Según se usa aquí, los "compuestos" usados son los capaces de conjugarse covalentemente a una proteína superficial o reticular dos o más proteínas superficiales en el microorganismo. Las proteínas superficiales contienen típicamente varios lugares reactivos en los que son factibles la incorporación covalente de compuestos y la reticulación. Por ejemplo, los grupos amina pueden modificarse por acilación; los grupos sulfhidrilo pueden modificarse por reacciones de adición y alquilaciones; los grupos carbonilo y carboxilo pueden modificarse por acilación; y los grupos aldehído e hidroxilo pueden modificarse por aminación y aminación reductora. Puede usarse una o más de estas reacciones de modificación en la preparación de los microorganismos no patógenos de la invención.
Según esta realización de la invención, la modificación de proteínas superficiales implica generalmente unión covalente a la proteína mediante reacciones con residuos de aminoácidos expuestos. Aunque puede usarse cualquier tipo de modificación covalente o reticulación conocida por los expertos en la técnica, es preferible usar modificación covalente o reticulación de residuos amino, sulfhidrilo y ácido carboxílico. Por ejemplo, los agentes de reiculación que modifican los grupos amina incluyen gluteraldehído y paraformaldehído. Cada uno de éstos son atacados fácilmente a pH > 7 por las aminas libres nucleófilas del término proteína o por residuos secundarios de lisina internos. El producto resultante es una base de Schiff con una amina libre de la proteína. El gluteraldehído también es atacado específicamente por estos residuos de amina reactivos y conduce a un alto grado de reticulación.
Los reactivos adecuados para modificación de proteínas a través de sus residuos de sulfhidrilo son el agente de bloqueo irreversible de sulfhidrilo N-etilmaleimida (NEM) o un reticulador de bismaleimida n-sustituido. La NEM es un reactivo de alquilación que reacciona con enlaces sulfhidrilo formando un enlace tioéter estable. Esta reacción puede realizarse a pH 6,0 para impedir la reacción con aminas libres. Pueden usarse también otros reactivos con sulfhidrilo tales como bismaleimidohexano (BMH). El BMH es un reticulador homobifuncional con un espaciador de seis carbonos entre lugares activos. Este reticulador forma también un enlace tioéter estable a pH 7,0.
En realizaciones preferidas separadamente, los agentes modificadores químicos que pueden usarse incluyen reticuladores monofuncionales, que contienen un grupo funcional reactivo simple, tal como un grupo aldehído. Los ejemplos de agentes que contienen grupos funcionales aldehído incluyen, aunque sin limitarse a ellos, formalina (formaldehído), acetaldehído, propionaldehído, n-butiraldehído, benzaldehído, p-nitrobenzaldehído, p-tolualdehído, salicilaldehído, fenilacetaldehído, 2-metilpentanal, 3-metilpentanal y 4-metilpentanal. Alternativamente, los agentes modificadores químicos pueden incluir grupos funcionales tales como imidato de NHS, imidoéster, maleimida, cloroacetilo, fluoroacetal, yodoacetilo, bromoacetilo, amina, hidrazida, carbodiimida y derivados de estos grupos. En una realización preferida, el agente modificador químico comprenderá dos o más de tales grupos funcionales reactivos para facilitar la incorporación covalente múltiple con lugares reactivos en una proteína superficial simple o la reticulación de proteínas superficiales separadas. Se hace referencia aquí a compuestos que contienen dos grupos funcionales iguales como que tienen estructura homobifuncional y se hace referencia a los que contienen dos grupos funcionales diferentes como que tienen estructura heterobifuncional. Los reactivos homobifuncionales particularmente preferidos incluyen dialdehídos tales como paraformaldehído, glioxal, malondialdehído, succinialdehído, adipaldehído, gluteraldehído y ftaldehído.
Varios agentes de reticulación y de conjugación bifuncionales preferidos útiles en la práctica de esta invención están disponibles comercialmente de Pierce Chemical Company y pueden usarse según los métodos descritos en la bibliografía de productos disponible, cuyos contenidos se incorporan aquí en su integridad para describir el estado de la técnica. Los ejemplos de tales compuestos y los métodos generales son como sigue.
Hidrazida de N-(ácido \beta-maleimidopropiónico) (BMPH) (Producto Nº 22297 de Pierce Chemical Co.). La BMPH es un reactivo heterobifuncional que reacciona con sulfhidrilo y reacciona con carbonilo. El grupo hidrazida puede acoplarse covalentemente a residuos de hidrato de carbono en glicoproteínas y otros glicoconjugados después de oxidación para producir aldehídos. Los grupos azúcar pueden oxidarse mediante el uso de oxidasas específicas (tales como galactosa oxidasa) o mediante el uso de peryodato sódico. El tratamiento de glicoproteínas con peryodato sódico 1 mM a 0ºC oxida grupos ácido siálico para poseer carbonilos. La reacción con peryodato sódico 10 mM a temperatura ambiente (RT) creará aldehídos en todos los azúcares que contienen dioles. La reacción de BMPH con estos aldehídos crea enlaces hidrazona. El extremo maleimida del reticulador puede hacerse reaccionar con grupos sulfhidrilo en proteínas superficiales. Si no están presentes sulfhidrilos, pueden crearse a través de reducción de disulfuro o a través de tiolación con 2-iminotiolano o SATA. Las maleimidas reaccionan con grupos sulfhidrilo a un pH de 6,5-7,5, formando enlaces tioéter estables. La reacción de maleimida es típicamente completa en 2 horas a RT o en aproximadamente 4 horas a 4ºC.
Hidrocloruro de 1-etil-3(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (CAS 25952-53-8) (EDC) (Productos Nº 22980,
22981 de Pierce Chemical Co.). El EDC reacciona con un grupo carboxilo primero y forma un compuesto intermedio amina-reactivo, O-acilisourea. En procedimientos de conjugación de dos etapas usando soluciones acuosas, se consigue la estabilización del compuesto intermedio usando N-hidroxisuccinimida. La reacción con una amina producirá hidrólisis del compuesto intermedio, regeneración del carboxilo y liberación de una urea N-sustituida. Una reacción secundaria es la formación de una N-acilurea, que se restringe usualmente a los carboxilos situados en regiones hidrófobas de proteínas.
Reticuladores imidoéster (Productos Nº 20660, 20663, 21667, 21666, 20700, 20665 de Pierce Chemical Co.). Los imidoésteres homobifuncionales poseen dos grupos idénticos que pueden reaccionar con grupos amina primaria para formar enlaces covalentes estables. Éstos incluyen adipimidato de dimetilo (DMA), pimelimidato de dimetilo (DMP), suberimidato de dimetilo (DMS) y 3,3'-ditiobisproprionimidato de dimetilo (DTBP). A diferencia de otras químicas de acoplamiento, los imidoésteres tienen una reactividad cruzada mínima con otros grupos nucleófilos en proteínas. En pHs suavemente alcalinos (7-10), los imidoésteres reaccionan sólo con aminas primarias para formar imidoamidas. La conjugación de imidoésteres se realiza habitualmente entre pH 8,5 y 9,0. Los imidoésteres tienen una ventaja sobre otros reactivos de reticulación porque no afectan a la carga global de la proteína. Llevan una carga positiva a pH fisiológico, como las aminas primarias que sustituyen. Las reacciones de imodiésteres se realizan a 0ºC o temperatura ambiente, porque las temperaturas elevadas pueden contribuir a malos rendimientos con estas reacciones. Los imidoésteres homobifuncionales están disponibles con distancias variables entre los grupos para diferentes necesidades de reticulación (por ejemplo, para medir distancias inter-residuos de proteínas y complejos moleculares y cerca de relaciones de vecinos entre proteínas). El DTBP, un reticulador homobifuncional divisible por tiol, se usa conjuntamente con las formas no divisibles de estos reticuladores para estudiar cerca de relaciones de vecinos. El DMP se ha usado para reticular anticuerpos a Proteína A inmovilizada en un soporte de agarosa.
Ésteres de N-hidroxisuccinimida (ésteres de NHS) (Productos Nº 21555, 21580, 21655, 21658, 22311, 22312, 22416, 22317, 22309, 22324, 22307, 22308 de Pierce Chemical Co.). El suberato de disuccinimidilo (DSS) es un éster de NHS homobifuncional insoluble en agua; el suberato de bis(sulfosuccinimidilo) (BS^{3}) es un análogo soluble en agua. Estos reticuladores son no divisibles y se usan ampliamente para conjugar ligandos radiomarcados a receptores de la superficie celular. Los ejemplos adicionales incluyen especies de maleimida tales como éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida (MBS), éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida (sulfo-MBS), 4-[p-maleimidofenil]butirato de succinimidilo (SMBP), 4-[p-maleimidofenil]butirato de sulfosuccinimidilo (sulfo-SMBP), éster de N-[\gamma-maleimidobutiriloxi]succinimida (GMBS), éster de N-[\gamma-maleimidobutiriloxi]sulfosuccinimida (sulfo-GMBS), éster de N-[\varepsilon-maleimidocapriloxi]succinimida (EMCS) y éster de N-[\varepsilon-maleimidocapriloxi]sulfosuccinimida (sulfo-EMCS) tienen grupos maleimida.
Las aminas primarias son objetivos principales para ésteres de NHS. Los grupos \alpha-amina accesibles presentes en los términos N de péptidos y proteínas reaccionan con ésteres de NHS. Sin embargo, las \alpha-aminas están raramente disponibles en una proteína, de modo que la reacción con cadenas secundarias de aminoácidos se hace importante. Mientras que cinco aminoácidos tienen nitrógeno en sus cadenas secundarias, sólo la \varepsilon-amina de lisina reacciona significativamente con ésteres de NHS. Se forma un enlace amida covalente cuando el reactivo de conjugación éster de NHS reacciona con aminas primarias. La reacción produce la liberación de N-hidroxisuccinimida.
Las reacciones de reticulación de ésteres de NHS se realizan más comúnmente en tampones fosfato, carbonato/bicarbonato, HEPES y borato. Pueden usarse también otros tampones siempre que no contengan aminas primarias. Se encuentran aminas primarias en la estructura de Tris, haciéndolo un tampón inaceptable para reacciones de ésteres de NHS. Un gran exceso de Tris a pH de neutro a básico puede añadirse al final de la reacción para apagarla. La glicina es una amina primaria que puede usarse de manera similar.
Los ésteres de NHS pueden agruparse en general en dos clases separadas con reactividad esencialmente idéntica con aminas primarias, formas solubles en agua e insolubles en agua. La solubilidad de los ésteres de NHS solubles en agua es debida al grupo sulfonato (-SO_{3}-) en el anillo N-hidroxisuccinimida. Los reactivos de reticulación ésteres de NHS sulfonados se suministran como sales sódicas y son solubles en agua hasta una concentración de 10 mM.
Las formas no sulfonadas de reactivos de conjugación ésteres de N-hidroxisuccinimida no son solubles en agua. Estos compuestos se disuelven primero en un disolvente orgánico y se añaden después a la mezcla de reacción acuosa. Los reticuladores ésteres de NHS insolubles en agua no poseen un grupo cargado. Son lipófilos y por tanto permeables a membranas. Son útiles para conjugación intracelular e intramembrana.
Los ésteres de NHS insolubles en agua pueden disolverse en un disolvente orgánico tal como DMSO o DMF. La solución de reticulador se añade después a la mezcla de reacción acuosa de manera que el volumen final contenga hasta 10% de disolvente orgánico. Los reticuladores comienzan a desprenderse de la solución a altas concentraciones como se observa por la aparición de una solución turbia lechosa. Aunque todavía puede tener lugar reticulación en tales condiciones, el método puede modificarse para asegurar una disolución completa del éster de NHS. Por ejemplo, la fase acuosa puede suplementarse con disolventes orgánicos adicionales.
El grupo maleimida es más selectivo para grupos sulfhidrilo cuando se mantiene el pH de la mezcla de reacción entre 6,5 y 7,5. A pH 7, la velocidad de reacción de maleimidas con sulfhidrilos es 1.000 veces más rápida que con aminas. Por encima de este intervalo de pH, la velocidad de reacción con aminas primarias se hace más significativa. Las maleimidas no reaccionan con tirosinas, histidinas o metioninas como lo hacen las yodoacetamidas. Se forma un enlace tioéter estable entre el grupo maleimida y el sulfhidrilo reaccionado, que no puede dividirse en condiciones fisiológicas. La hidrólisis de maleimidas a un ácido maleámico no reactivo puede competir con modificación de tiol, especialmente por encima de pH 8,0. La hidrólisis puede tener lugar antes o después de conjugación de tiol.
Pueden separarse antes de acoplar \beta-mercaptoetanol, ditiotreitol, mercaptoetilamina, cisteína y otros compuestos tioles. Las maleimidas en exceso pueden apagarse al final del período de incubación por adición de tioles libres tales como cisteína o \beta-mercaptoetanol. Puede incluirse EDTA en el tampón de acoplamiento para impedir la reoxidación de disulfuros.
1,4-bis-Maleimidobutano (BMB) (Producto Nº 222331 de Pierce Chemical Co.). El BMB es un reticulador homobifuncional reactivo con sulfhidrilo de longitud intermedia. Los extremos maleimida del reticulador pueden hacerse reaccionar con grupos sulfhidrilo en proteínas superficiales. Si no están presentes sulfhidrilos, pueden crearse a través de reducción de disulfuro o a través de la tiolación con 2-iminotiolano o SATA. Las maleimidas reaccionan con grupos -SH a un pH de 6,5-7,5, formando enlaces tioéter estables. La reacción de maleimidas es completa en 2 horas a temperatura ambiente o aproximadamente 4 horas a 4ºC.
Tras la reacción con el agente de reticulación o conjugación, se apaga la reacción usando un agente adecuado tal como uno que tenga el mismo grupo activo que el contenido en el grupo reactivo que se está modificando covalentemente. Por ejemplo, puede usarse glicina para apagar paraformaldehído reticulante.
El virus purificado puede inactivarse también por conjugación de aminoácidos a residuos de ácidos carboxílicos en la proteína. Como ejemplo de agente de conjugación, está peryodato sódico, que oxida hidroxilo de hidrato de carbono y ácidos carboxílicos terminales en la proteína para formar compuestos intermedios aldehídos activos. Este grupo activado se expone después a un nucleófilo a pH elevado en forma de glicina o lisina, que produce una conjugación irreversible del aminoácido a la proteína. La variación del tiempo de acoplamiento, la temperatura y la velocidad de oscilación para optimizar los métodos de acoplamiento está bien dentro del alcance de los expertos en la técnica.
En un segundo aspecto de la invención, el microorganismo puede hacerse no patógeno por digestión con enzimas de las proteínas superficiales mediante métodos disponibles comercialmente. Las enzimas que pueden usarse para modificación de proteínas superficiales incluyen, aunque sin limitarse a ellas, bromelina, quimiotripsina, clostripaína, colagenasa, elastasa, ficina, kalikreína, metaloendopeptidasa, proteinasa, aminopeptidasa, carboxipeptidasa, factor Xa, papaína, quimiopapaína, pepsina, staphylococcus aureaus proteasa (cepa V-8), tripsina, solas o en combinación. En este aspecto de la invención, los microorganismos se hacen reaccionar con preparaciones de enzimas en una mezcla de reacción en condiciones y durante un período de tiempo suficiente para digerir al menos parcialmente las proteínas superficiales del microorganismo para hacerlo no patógeno, conservando a pesar de todo el contenido de ácidos nucleicos del microorganismo sustancialmente intacto. Los métodos para preparar soluciones de enzimas para tales reacciones y los métodos para realizar las reacciones son conocidos por los de experiencia ordinaria en la técnica y pueden encontrarse guías en textos tales como The Worthington Enzyme Manual (Worthington Biochemical Corporation).
La elección de cualquier enzima particular puede depender de factores tales como disponibilidad, facilidad de uso y especificidad del sustrato, cada uno de los cuales puede valorarse por los de experiencia ordinaria en la técnica. Las reacciones pueden controlarse por la extensión de tiempo en la que el microorganismo está expuesto a la enzima o por reacciones de apagado con inhibidores de enzimas. Por ejemplo, la papaína, y de modo similar la quimiopapaína, hidrolizan un cierto número de enlaces péptido y éster y se activan por ejemplo por cisteína, sulfuro y sulfito y se inhiben por adición de reactivos tales como reactivos de sulfhidrilo que incluyen metales pesados, reactivos de carbonilo y ácido ascórbico. La quimiotripsina, una endopeptidasa, actúa fácilmente sobre amidas y ésteres de aminoácidos susceptibles, tiene especificidad para enlaces que implican aminoácidos aromáticos y cataliza la hidrólisis de residuos leucilo, metionilo, asparaginilo y glutamilo. La enzima se inhibe por ejemplo por metales pesados y compuestos organofosforados. La tripsina, una enzima proteolítica, cataliza la hidrólisis de enlaces péptido entre el grupo carboxi de arginina o lisina y el grupo amino de otro aminoácido, y se inhibe por ejemplo mediante compuestos organofosforados, 4-guanidinobenzoato de bencilo y 4-guanidinobenzoato de 4'-nitrobencilo. La pepsina es una endopeptidasa que cataliza la hidrólisis de una variedad de enlaces péptido y se inhibe por bromuros de fenilacilo, alcoholes alifáticos y difenildiazometano.
El material del virus que se ha inactivado por el procedimiento anterior se separa de los otros materiales presentes en la mezcla de reacción final. Esto puede conseguirse por técnicas estándares de purificación que incluyen, aunque sin limitarse a ellas, diálisis, filtración en gel y filtración tangencial. Puede ensayarse en las preparaciones inactivadas purificadas finales la presencia de virus activos por métodos conocidos por los de experiencia ordinaria en la técnica. Un método conveniente de ensayo de virus activos es ensayar la capacidad del virus para replicarse. Para HIV, por ejemplo, esto puede hacerse comprobando la producción de antígeno de HIV p24 en el medio de cultivo. Los microorganismos inactivados purificados de la presente invención pueden guardarse a temperaturas de no congelación, tales como 2-8ºC.
La invención proporciona además una composición material que comprende un microorganismo purificado, que comprende proteínas superficiales y componentes nucleares intactos, en el que una o más proteínas superficiales se han modificado irreversiblemente usando un reactivo modificador como se ha detallado antes, de tal modo que el microorganismo se hace por ello no patógeno, y una matriz de líquido. Así, cuando se prepara como material testigo positivo, el microorganismo inactivado purificado se suspende preferiblemente en una matriz de líquido que comprende fluidos biológicos estabilizados que corresponden a fluidos de los que se analizarán muestras biológicas. Tales fluidos incluyen, aunque sin limitarse a ellos, suero, plasma, plasma desfibrinado, agrupamiento de plasma estabilizado, fluido cerebroespinal (CSF), orina, saliva, semen y esputo. Alternativamente, la matriz de líquido puede comprender matrices sintéticas formuladas para simular tales fluidos biológicos. Los métodos para preparar fluidos biológicos sintéticos son muy conocidos en la técnica. Además, la matriz de líquido puede contener aditivos tales como antioxidantes, sales tampones, agentes de conservación, antibióticos y cargas estabilizantes de la matriz tales como azúcares (monosacáridos y polisacáridos), proteínas (incluyendo albúmina, ovalbúmina, gamma globulina, lisados de glóbulos rojos, caseína, leche en polvo seca y/u otras proteínas del suero), y estabilizantes sintéticos tales como polivinilpirrolidona, poli-l-lisina y albúmina de suero de bovino (BSA) metilada. La matriz de líquido puede modificarse también por liofilización para almacenamiento y estabilidad a largo plazo por adición, por ejemplo, de sacarosa y manosa.
Además, esta invención proporciona un juego para analizar en una muestra biológica la presencia de un microorganismo que tiene proteínas superficiales, en el que el juego comprende una composición de testigo positivo que comprende una muestra purificada de dicho microorganismo, que comprende proteínas superficiales y componentes nucleares sustancialmente intactos, en el que una o más proteínas superficiales se han modificado irreversiblemente usando un reactivo modificador como se ha detallado antes, de tal modo que el microorganismo se hace por ello no patógeno. En una realización preferida, el juego comprende el testigo microorganismo no patógeno en una matriz de líquido como se ha descrito antes. En la práctica de la invención, el juego puede comprender materiales adicionales necesarios para efectuar técnicas de multiplicación de ácidos nucleicos conocidas por los de experiencia ordinaria en la técnica. Además, la invención pretende abarcar la adición del microorganismo no patógeno de la invención a juegos y servicios existentes usados en técnicas de multiplicación de ácidos nucleicos. Tales juegos y servicios incluyen, aunque sin limitarse a ellos, los comercializados por Roche Diagnostics (Indianapolis, IN) con el nombre comercial COBAS AMPLICOR y los servicios de examen NAT comercializados por el National Genetics Institute, Inc. (Los Anageles, CA), Bayer Corporation (Tarrytown, NY) y Gen-Probe, Inc. (San Diego, CA).
El material testigo inactivado no infeccioso de la presente invención sirve como testigo positivo para el procedimiento completo de técnicas de multiplicación de ácidos nucleicos. Por ejemplo, el material testigo de la presente invención que comprende virus HIV inactivado puede tratarse a través de las etapas de (1) preparación de muestra (extracción con sal caotrófica/disolvente), (2) transcripción inversa de ARN para producir cADN si es necesario, (3) multiplicación de los ácidos nucleicos y (4) detección de los ácidos nucleicos multiplicados.
Así, la invención proporciona también un método para detectar un microorganismo que comprende proteínas superficiales en una muestra biológica por multiplicación de componentes nucleares de dicho microorganismo, cuyo método comprende multiplicar los componentes nucleares de un material testigo purificado de esta invención. En una realización preferida, el método comprende las etapas de (a) preparar una muestra por adición del microorganismo no patógeno testigo de la invención a una muestra biológica en la que ensayar la presencia de un microorganismo correspondiente, (b) extraer ácido nucleico objetivo a multiplicar, (c) multiplicar ácido nucleico objetivo, (d) hibridar el ácido nucleico objetivo multiplicado con sondas de ácidos nucleicos marcadas detectablemente y (e) detectar el ácido nucleico objetivo multiplicado hibridado. Tales etapas individuales del método son muy conocidas por los de experiencia ordinaria en la técnica. Por ejemplo, puede conseguirse la multiplicación del ácido nucleico objetivo por reacción en cadena de polimerasa (PCR) en ADN o en ARN después de transcripción inversa del ARN a cADN. La hibridación y detección pueden conseguirse mediante el uso de, por ejemplo, sondas de ácidos nucleicos marcadas con fosfatasa alcalina, o por detección de amplicones con metodología de transferencia de energía. En una realización particularmente preferida, el método puede comprender además cuantificación del ácido nucleico objetivo contenido en la muestra biológica.
En la práctica de la invención, el método puede usarse como un método de examen, tal como para examinar fluidos biológicos antes de transfusión o trasplante, una herramienta de diagnóstico, tal como cuando se analiza la presencia de tales microorganismos en fluidos biológicos de individuos de los que se sospecha que albergan microorganismos patógenos, o como herramienta de comprobación de terapia, tal como cuando se analiza la presencia y cantidad de microorganismo en muestras biológicas de un paciente que experimenta tratamiento de infección.
Las diversas realizaciones y ventajas de la presente invención se entenderán mejor a partir de los ejemplos presentados seguidamente, que se pretende que sean ilustrativos y no restrictivos.
Ejemplo 1
Este Ejemplo describe la fabricación a gran escala de partículas de HIV purificadas. Se usó para proporcionar el virus un linaje celular infectado crónicamente, denominado BP-1. Este linaje celular es una variante de alta producción del linaje celular H-9 original, y se proporcionó por el Dr. Bernard Proiesz. El linaje celular se mantuvo en medio RPMI-1640 suplementado con FBS y antibióticos (penicilina y estreptomicina). Se establecieron Bancos de Células Matrices (MCB) y Bancos de Células de Trabajo (WCB) de cada linaje celular y se mantuvieron según directrices USFDA aceptadas para fabricación de productos biológicos. Típicamente, un MCB tiene de 30 a 50 viales de células congeladas. Un vial de MCB se descongela, se desarrolla en cultivo y se usa para preparar de 30 a 50 viales de células congeladas que constituyen los WCB. Los MCB y WCB se guardan en recipientes de nitrógeno líquido seguros y se mantienen registros para asegurar la trazabilidad.
Para fabricar HIV, un vial de WCB de un linaje celular se descongeló y expandió en cultivo que contenía RPMI-1640, suero de bovino fetal (FBS) y antibióticos. Inicialmente, las células se desarrollaron en matraces de cultivo de células estáticos hasta alcanzar un volumen de 1 litro. En este punto, las células se transfirieron a botellas de rodillos de 2 litros, que contenían 1 litro de fluido de cultivo por botella, y se expandieron adicionalmente hasta alcanzar una escala de producción de 60 o 70 botellas de rodillos. Los cultivos en botellas de rodillos se mantuvieron según procedimientos de funcionamiento estándares escritos y se hicieron ensayos rutinarios para controlar micoplasma y otros agentes adventicios.
Una vez que los cultivos alcanzaron escala de producción, se cosecharon las botellas de rodillos una vez por semana. Típicamente, se cosechó el 90% de cada cultivo, aunque esto podía variar ligeramente según la densidad de células en el momento de la cosecha. Los cultivos de células cosechadas se trataron en un sistema de flujo tangencial de trayectoria de flujo doble consistente en dos circuitos de filtración. El primer circuito usaba una membrana de
0,45 \mum de 0,929 m^{2} para separar células y restos de células y la segunda trayectoria de flujo usa una membrana de corte 300 kD de 0,929 m^{2} para concentrar los sobrenadantes de cultivo que contenían virus. El sistema se lavó dos veces con solución salina tamponada con tris y los sobrenadantes que contenían virus se concentraron hasta aproximadamente 2 litros.
Se aisló virus de sobrenadantes concentrados por ultracentrifugación (30.000 x g). Los viriones globulizados se resuspendieron en 50 ml de solución salina tamponada con tris. Este material se cargó después en un gradiente de sacarosa lineal del 22-66% de 1,2 litros y se purificó virus por ultracentrifugación con gradiente de densidad. Las fracciones de gradiente que contenían viriones se identificaron por índice de refracción y las fracciones agrupadas se diluyeron en solución salina tamponada con tris y se globulizaron de nuevo viriones. Los viriones se resuspendieron después en solución salina tamponada con fosfato.
Todas las actividades de fabricación que implicaban crecimiento y purificación de virus viables se realizaron en laboratorios de nivel biológico 3 (BL-3). Los desechos líquidos generados por estos procedimientos se trataron con hipoclorito o yodo activado antes de descargar en las aguas residuales municipales. Los desechos sólidos se trataron sometiendo a autoclave antes de separarse de los laboratorios BL-3.
Ejemplo 2
Este Ejemplo describe un método de inactivación del virus purificado según la invención reticulando proteínas superficiales. Como ilustración, se ensayó la reticulación con paraformaldehído de proteínas con envoltura de viriones, un fijativo usado comúnmente para preparación de tejidos y células. Las titulaciones del fijativo se preformaron por encima y por debajo de la concentración recomendada por CDC para inactivación de virus en fluidos biológicos (8 de Mayo, 1992/41 (RR-8);001 CDC Guidelines por the Performance of CD4+ T-Cell Determinations in Persons with Human Immunodeficiency Virus Infection). Inicialmente, el virus purificado se descongeló lentamente a 2-8ºC durante 6-8 horas para minimizar la lisis del virus. A continuación, mientras estaba en hielo, se diluyó el virus con PBS fría hasta una concentración final de aproximadamente 1 x 10^{10} copias/ml (cp/ml). El virus diluido se dividió después en cuatro partes alícuotas diferentes de 5 ml y se añadió paraformaldehído recién preparado a cada una con una concentración final de 0,625, 1,25, 2,5 o 5%. Las mezclas de reacción se incubaron después a 2-8ºC durante 60 minutos mientras se hacían oscilar suavemente. Para apagar la reacción, se añadió 1 ml de glicina 0,5 M (pH 7,4) y se dejó reaccionar con todo paraformaldehído residual. Después de la adición de glicina, las reacciones se hicieron oscilar suavemente durante 2 h a 2-8ºC. Para separar glicina y cualquier fijativo no apagado en exceso, se dializó después cada mezcla de reacción (corte de p.m. 10-14 k) frente a 1 l de PBS (pH 7,4, 2-8ºC) durante 4 cambios. El virus dializado se transfirió después a un tubo de 15 ml y se centrifugó durante 10 min a 3.000 x g para globulizar todo virus precipitado.
Se ensayó después en cultivo de células la presencia de virus infeccioso de una muestra de cada sobrenadante.
El virus inactivado restante se tituló en una matriz de plasma estabilizado que consistía en lo siguiente: plasma de origen humano recogido en 4% de citrato sódico, 1 ml de EDTA, 1 U/ml de inhibidor de ribonucleasa (placenta humana), 0,09% de NaN_{3}, ditiotreitol 1 mM, 0,05% de gentamicina, en solución salina tamponada con fosfato pH 7,4. Con el fin de optimizar la matriz para otros virus, pueden suprimirse uno o más de los aditivos.
Ejemplo 3
Se ensayó el virus modificado producido como se ha descrito en el Ejemplo 2 para asegurar que el procedimiento inactivó el virus. Como ilustración, se usó como célula hospedante para estudios de infectividad vírica el linaje celular CEM, obtenido de la American Type Culture Collection. Las ventajas de usar este linaje son que el establecimiento de una infección por HIV in vitro requiere relativamente pocos viriones y que la infección es crónica antes que lítica, facilitando el análisis. Para estos estudios, la infección se detecta y sigue usando el antígeno p24 de HIV EIA de ZeptoMetrix (ZeptoMetrix, Buffalo, NY).
Las células CEM se cultivan en RPMI-1640 que contiene 10% de FBS en placas de 24 pocillos. Se ponen en placa las células a razón de 10^{5} células por pocillo en un volumen de 1 ml, y se añaden a pocillos individuales 100 \mul de diversas diluciones de virus, tratado o sin tratar. Se alimentan los cultivos dos veces por semana mediante sustitución del 50% del medio y se ensaya p24 de HIV en sobrenadantes de cultivo. Todos los cultivos contienen inicialmente p24 de HIV. Sin embargo, en cultivos en los que el virus es no infeccioso, los niveles de p24 de HIV disminuyen con el tiempo alcanzando eventualmente niveles de fondo. Los cultivos que contienen viriones infecciosos presentan niveles crecientes de p24 de HIV con el tiempo, permitiendo una discriminación fácil de cultivos que contienen virus infeccioso frente a no infeccioso. Así, comparando los resultados obtenidos usando diferentes diluciones de virus, se pueden estimar cuántos registros de VIH infeccioso se han inactivado por un procedimiento de tratamiento dado.
La Tabla 1 resume datos de experimentos en los que se trató HIV purificado con diferentes concentraciones de paraformaldehído durante 60 minutos. Aquí, se dividió en partes alícuotas HIV y se trató con 0,625%, 1,25%, 2,5% o 5,0% de paraformaldehído. Se pusieron después diferentes diluciones (1:8.000, 1:80.000 y 1:800.000) de virus tratado en cultivos de células CEM y se realizaron ensayos de p24 en sobrenadantes de cultivo los días 3, 7, 10 y 14 post-inoculación. Los datos se expresan como pg/ml de proteína p24 de HIV en los sobrenadantes de cultivo. La curva estándar para el ensayo de p24 es lineal desde 7,8 pg/ml hasta 125 pg/ml. Las concentraciones de p24 de HIV por debajo de 7,8 pg/ml se expresan como "<7,8 pg/ml" para indicar sensibilidad del ensayo y los valores por encima de 125 pg/ml se expresan como ">125 pg/ml", porque el ensayo es no lineal por encima de 125 pg/ml.
TABLA 1A Inactivación de virus usando diferentes concentraciones de paraformaldehído 3 días post-inoculación
1 
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TABLA 1B Inactivación de virus usando diferentes concentraciones de paraformaldehído 7 días post-inoculación
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TABLA 1C Inactivación de virus usando diferentes concentraciones de paraformaldehído 10 días post-inoculación
3
TABLA 1D Inactivación de virus usando diferentes concentraciones de paraformaldehído 14 días post-inoculación
4 
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El virus no tratado creció en todos los cultivos con todas las diluciones ensayadas, como se evidencia por la presencia de p24 de HIV en todos los cultivos durante el período de 14 días. Por otra parte, el tratamiento del virus con paraformaldehído produjo cantidades no detectables de p24 en los sobrenadantes de cultivo el día 14. Los niveles del p24 Ag de HIV que podían detectarse los días 3, 7 y 10 eran debidos a la adición de virus inactivado a los cultivos, como se evidencia por una disminución progresiva de estos niveles durante el período de 14 días. La Tabla 2 muestra los efectos de los métodos de inactivación de esta invención según el tiempo de exposición en minutos en que se incuba el virus con el reticulador.
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TABLA 2A Inactivación de virus con diferentes tiempos de exposición 3 días post-inoculaicón
5 
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TABLA 2B Inactivación de virus con diferentes tiempos de exposición 7 días post-inoculaicón
6
TABLA 2C Inactivación de virus con diferentes tiempos de exposición 10 días post-inoculaicón
7 
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TABLA 2D Inactivación de virus con diferentes tiempos de exposición 14 días post-inoculaicón
8 
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Ejemplo 4
Este Ejemplo proporciona un método para preparar el material testigo de la invención por digestión con enzimas de proteínas superficiales. Se incuba virus purificado (por ejemplo, producido como en el Ejemplo 1) durante aproximadamente 2 horas a 37ºC en una mezcla que comprende 0,25% de tripsina de bovino y 0,1% de EDTA en solución salina tamponada de Hank. Al final de la incubación, se detiene la reacción añadiendo un volumen igual de suero de bovino fetal. El material se purifica después según técnicas conocidas y se confirma la no patogenicidad por métodos como se indican en el Ejemplo 3.
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Ejemplo 5
Este Ejemplo demuestra que los ácidos nucleicos víricos están intactos para ser susceptibles a multiplicación siguiendo los procedimientos de inactivación descritos en el Ejemplo 3. Como ilustración, se realizaron experimentos para examinar si podía aún detectarse por PCR HIV inactivado químicamente. Se usó el ensayo COBAS AmpliScreen HIV-1 Monitor (Roche), un juego clínico basado en PCR que cuantifica el número de copias de ARN de HIV. Estos experimentos se realizaron titulando material de las reacciones de inactivación descritas en el Ejemplo 3 a una formulación de plasma estabilizado y administrándolo después a ADNsa, ARNsa y tubos de PCR exentos de pirógeno (Chasma Scientific, Cambridge, MA). La cuantificación del número de copias de ARN de HIV se determinó en muestras del virus congelado a fondo usando el ensayo COBAS de Roche. Las muestras se diluyeron 1:1000 y los datos se expresan como el número de copias con esta dilución. Estos datos se resumen en la siguiente Tabla 3.
TABLA 3
9 
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Ejemplo 6
Se ensayó la eficacia de varios reactivos de reticulación para inactivar HIV en diversas concentraciones. La Tabla 4 lista los materiales usados en los experimentos, su concentración, volumen, peso molecular y masa.
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TABLA 4
10 
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Para preparar el tampón de HIV pre-diluciones, el HIV vivo se descongela y pone en hielo. En una dilución, se añaden 0,5 ml de HIV a 20 ml de tampón PBS, se mezcla después suavemente y se guarda en hielo. En otra dilución, se añaden 0,5 ml de HIV a 20 ml de tampón MES, y se mezcla después suavemente y guarda en hielo.
Para la reacción de reticulación, se combinó HIV con uno de los reactivos de reticulación y/o diluyente (PBS o MES) según las Tablas 5 (para muestras de DMA) y 6 (para muestras de BMB) y se mezclaron suavemente a temperatura ambiente (rotador x, y, z) durante 2 horas. La reacción se apagó por adición de 0,5 ml (0,5 M) de glicina, donde se indica en las Tablas 5 y 6, durante una hora a RT. Se añadieron después 2,4 ml de mezcla de reacción a una columna de desalación PD-10 (preequilibrada con solución salina). El virus se eluyó con 3,5 ml de solución salina.
TABLA 5
11 
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TABLA 6
12
Para reticular con BMPH, el HIV se pretrata primero con peryodato de Na para oxidar hidratos de carbono. Se combinan peryodato de Na y HIV y se incuban en la oscuridad durante 30 minutos. Para reticular con BMPH, se añade BMPH al HIV pretratado y se mezcla suavemente a RT durante 2 horas. La reacción se apaga por adición de 0,5 ml (0,5 M) de glicina. Se incuba durante 1 hora a RT. Se añaden 2,5 ml de la mezcla de reacción a la columna de desalación. se eluyen con 3,5 ml de solución salina y se dividen en fracciones alícuotas de 0,5 ml. El HIV se diluyó 1:10 con agrupamiento de plasma desfibrinado. La Tabla 7 lista los materiales y cantidades ensayados.
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TABLA 7
13
Para reticular con EDC, se combina HIV con glicina y se mezclan durante 2 minutos. Se añade EDC a agua, se titula, se añaden después 900 \mul a la mezcla de reacción y se incuban durante 2 horas a RT. La mezcla de reacción se purifica en columnas de desalación, se eluye con 3,5 ml de solución salina y se divide después en fracciones alícuotas de 0,5 ml. El HIV se diluyó 1:10 con agrupamiento de plasma desfibrinado. La Tabla 8 lista los materiales y cantidades ensayados.
TABLA 8
14 
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Los materiales testigo producidos así se ensayaron en el Cobas HIV-1 Monitor Assay de Roche descrito en el Ejemplo 5. Los resultados se describen en la Tabla 9.
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TABLA 9
15
Ejemplo 7 Inactivación de virus de hepatitis B
En este ejemplo, se aplica el método de la invención a la inactivación del virus de la hepatitis B usando paraformaldehído. Se inactivó virus purificado, preparado como se ha descrito aquí, usando el método descrito en el Ejemplo 2. Se empleó virus de la hepatitis B de pato (DHBV) como sustituto del virus de la hepatis B humano (HHBV) en estudios de inactivación porque preocupaciones éticas, disponibilidad y coste limitan el uso de chimpancés en estudios de inactivación de HBV. Este modelo usa hepatocitos de pato primarios (PDHs) como hospedante (Pugh et al., 1999). Se aislaron y mantuvieron PDHs de patitos White Pekin (Anas domesticus) seronegativos de menos de una semana de edad con modificaciones de procedimientos previos (Barry y Friend, 1969, Seglen. 1976, Pugh y Summers, 1989, Pugh et al., 2000, Tuttleman et al., 1986). Brevemente, se sometieron a eutanasia patos exponiéndolos a CO_{2} y se sometieron a perfusión los hígados dos veces por el atrio del corazón con aproximadamente 200 ml de cada una de dos soluciones. La primera solución consistía en medio SWIM's S-77 (Sigma) suplementado con 0,5 mmoles/l de EGTA, 2 mmoles/l de Hepes (pH 7,45) y 50 \mug/ml de penicilina y estreptomicina (Biofluids, Rockville, MD). La segunda solución contenía medio SWIM's S-77 suplementado con 2,5 mmoles/l de CaCl_{2}, 0,5 mg de colagenasa/ml (tipo I, Sigma, St. Louis) y 50 \mug/ml de penicilina y estreptomicina. Estos perfusionados se administraron a razón de aproximadamente 15 ml/minuto usando una bomba peristáltica y se ajustó la temperatura del perfusionado para mantener el hígado en 37ºC. Se separó el hígado, se desmenuzó con tijeras y se mezcló repetidamente con una pipeta de 25 ml para dispersión de hepatocitos en medio L-15 completo (Biofluids, Rockville, MD) suplementado con 0,05 por ciento (p/v) de bicarbonato sódico (Biofluids), 1 mmol/l de glutamina (Biofluids), 20 mmoles (l de HEPES (Biofluids), 50 \mug/ml de penicilina y estreptomicina (Biofluids), I (g/ml) de insulina (Sigma, St. Louis) y 10 (moles/l) de hemisuccinato de hidrocortisona (Sigma). Se filtraron las células a través de gasa estéril, se centrifugaron a 50 x g durante 4 minutos, y el glóbulo de células resultante se lavó tres veces con medio L-15 y se resuspendió en medio L-15. Se sembraron placas de 12 pocillos con aproximadamente dos ml de suspensión de células (aprox. 10^{5} células). Los medios de las células en placa se aspiraron cada dos días y se sustituyeron por medio L-15 reciente.
El suero de patitos infectado congénitamente de cuatro semanas de edad sirvió como la fuente de virus usada en estos experimentos. Se diluyeron en serie 10 veces muestras de glóbulos rojos sembradas con DHBV tratadas y testigo en medio L-15 y se inocularon a continuación volúmenes de un ml en monocapas de PDH por cuadruplicado. Los cultivos infectados se incubaron a 37ºC + 20ºC con 5 + 1% de CO_{2} durante la noche para incorporación y entrada del virus. Se separó después el inóculo, se lavaron las monocapas de células una vez con medio L-15 completo para separar glóbulos rojos en exceso, y se cubrió después cada pocillo con aproximadamente 2 ml de medio L-15 reciente. Las monocapas infectadas se incubaron 10-14 días más a 37ºC + 20ºC con 5 + 1% de CO_{2}, con cambios de medio cada 2 días.
Se detectó la presencia de hepatocitos de pato infectados con DHBV mediante un IFA. Brevemente, el medio de la monocapa de PDH se separó por aspiración, y las monocapas se lavaron con agitación durante 5-10 minutos con 1-2 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS). La solución de lavado se separó después por aspiración y se sustituyó por 1-2 ml de etanol de -20 + 2ºC. Las muestras cubiertas de etanol se fijaron durante 2-48 horas a 4 + 1ºC antes de separar el etanol., y después de un lavado con 1-2 ml de PBS, se incubaron las monocapas agitadas a temperatura ambiente durante al menos 2 horas con 0,25 ml de una dilución 1:2 de anticuerpo monoclonal anti-DHVB dirigido contra el pre-dominio S de envoltura de DHVB (1 H. 1) (Pugh et al., 1995) en PBS que contenía 0,5% de suero de bovino fetal a cada pocillo. La solución de anticuerpo se separó por agitación, y se lavó con PBS la monocapa coloreada de anticuerpo primario. Tras separar el lavado, se añadieron a cada pocillo 0,25 ml de una dilución 1:200 de IgG-FITC anti-ratón, de cabra, (conjugado de isotiocianato de fluoresceína) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA) en PBS que contenía 0,5% de suero de bovino fetal, y se incubó con agitación durante 2 horas a temperatura ambiente. Los anticuerpos secundarios se separaron por aspiración, y la monocapa coloreada fluorescentemente se lavó con PBS. Tras la separación de la PBS, se examinaron células invertidas por microscopía con luz ultravioleta usando un microscopio Nikon Diaphot, y se puntuaron positivas las monocapas que contenían uno o más hepatocitos positivos de antígeno superficial de DHBV. Los títulos de virus se determinaron anotando la dosis unitaria 50 formadora de foco de fluorescencia usando el método de Reed y Muench (1938).
Como se muestra en la Tabla 10, no se detectaron células infectadas con virus en ninguna de las muestras ensayadas.
TABLA 10 Efecto de paraformaldehído en la inactivación de virus de la hepatitis B de pato (DHBV) en suspensión durante 60 minutos a temperatura ambiente (20ºC)
16 
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Ejemplo 8 Inactivación del virus de la diarrea vírica de bovino (BVDV)
En este Ejemplo, se inactivó virus de diarrea vírica de bovino (BVDV), biotipo 1 (CPE), genotipo 1, hospedante: células de riñón de bovino Madin-Darby (MDBK), según los métodos discutidos en el Ejemplo 2.
Se usó en estos estudios virus de la diarrea vírica de bovino (BVDV), biotipo 1 (CPE), genotipo 1, que infecta células de riñón de bovino Madin-Darby (MDBK). El procedimiento para ensayar BVDV infeccioso fue el mismo descrito para DHBV (véase antes) con las siguientes diferencias: post-tratamiento de muestras de BVDV de ensayo y testigo con 2,5% de paraformaldehído, la reacción se apagó con glicina 0,5 M. Estas muestras (0,5 ml) se cargaron en columnas de sefacrilo pre-giradas. Las columnas se hicieron girar durante 4 minutos a 1.000 rpm. Las muestras se separaron asépticamente de las columnas y se prepararon después diluciones en serie de 10 veces en medio esencial mínimo (MEM) y se adsorbieron en la monocapa de células hospedantes sembradas en placas de cultivo de tejidos durante una hora a 37 \pm 2ºC y 5 \pm 1% de CO_{2}. Post-adsorción, las monocapas se lavaron con EBSS y se sustituyeron con MEM reciente e incubaron durante 5-7 días a 37 \pm 2ºC y 5 \pm 1% de CO_{2}. La presencia de virus infecciosos se determinó como se describe después: post-incubación, las placas se lavaron con 3x con PBS y se fijaron con alcohol calidad TC y colorearon con anticuerpo conjugado anti-BVDV policlonal de porcino directo. La placa coloreada se puntuó usando microscopía UV usando un microscopio Nikon Diaphot, y se puntuaron positivas monocapas que contenían uno o más hepatocitos positivos de antígeno superficial de BVDV. Se inocularon cuatro pocillos por dilución y los resultados se registraron como las FFFUD_{50} calculadas por Reed y Munch (1938).
Como se muestra en la Tabla 11, no se detectaron células infectadas con virus en ninguna de las muestras ensayadas.
TABLA 11 Efecto de paraformaldehído en la inactivación de virus de la diarrea vírica de bovino (BVDV) en suspensión durante 60 minutos a temperatura ambiente (20ºC)
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Referencias
Pugh JC, Summers JW: Infection and uptake of duck hepatitis B virus by duck hepatocytes maintained in the presence of dimethyl sulfoxide. Virology 1989; 172:564-572.
Pugh, J.C., Ijaz, M.K., Suchmann D.B. Use of surrogate models for testing efficacy of disinfectants against Hepatitis B virus. Am J Infect Cont 1999; 27:373-6. Pugh, J.C., Suchmann, F.B., Ijaz, M.K. Hepatitis B virus efficacy testing: Qualification of an avian Hepadavirus in vitro system that uses primary duck hepatocyte cultures. 10º International Symposium on Viral Hepatitis and Liver Diseases. Atlanta, EE.UU., 2000, Abstract B 139.
Berry, M.N., Friend, D.S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells. J. Cell Biology 1969; 43:506-520.
Seglen, P. Preparation of isolated rat liver cells. Methods Cell Biol 1971; 3:29-83.
Pugh, J.C., Di, Q.U., Mason, W.S., Simmons H. Susceptibility to duck hepatitis B virus infection is associated with the presence of cell surface receptor sites that efficiently bind virus particles. J. Virol 1995; 69:4814-22.
Reed, L., Muench, H.A. A simple method of estimating fifty percent end points. Am J of Hyg 1938; 27:493-497.
Debe entenderse que, aunque esta invención se ha descrito aquí con detalle, los ejemplos proporcionados son sólo con fines ilustrativos. Se pretende que otras modificaciones de las realizaciones de la presente invención que son obvias para los de experiencia ordinaria en la técnica estén dentro del alcance de la invención, que se define más extensamente en las reivindicaciones que siguen a continuación.

Claims (57)

1. Un microorganismo purificado que comprende proteínas superficiales y componentes nucleares sustancialmente intactos, en el que una o más proteínas superficiales se han modificado irreversiblemente por un reactivo modificador, de tal modo que el microorganismo se ha hecho por ello no patógeno; y en el que la modificación irreversible se selecciona entre:
(i)
incorporación covalente de un compuesto que comprende uno o más grupos funcionales reactivos a uno o más lugares reactivos en dichas proteínas superficiales; o
(ii)
al menos digestión parcial por una enzima.
2. El microorganismo purificado de la reivindicación 1, en el que el compuesto comprende un grupo funcional reactivo simple.
3. El microorganismo purificado de la reivindicación 2, en el que el compuesto se selecciona de un grupo consistente en formaldehído, acetaldehído, propionaldehído, n-butiraldehído, benzaldehído, p-nitrobenzaldehído, p-tolualdehído, salicilaldehído, fenilacetaldehído, 2-metilpentanal, 3-metilpentanal y 4-metilpentanal.
4. El microorganismo purificado de la reivindicación 1, en el que el compuesto comprende dos o más grupos funcionales reactivos.
5. El microorganismo purificado de la reivindicación 4, en el que el compuesto es paraformaldehído.
6. El microorganismo purificado de la reivindicación 4, en el que el compuesto es un dialdehído.
7. El microorganismo purificado de la reivindicación 6, en el que el dialdehído se selecciona del grupo constituido por glutaraldehído, glioxal, malondialdehído, succinaldehído, adipaldehído y ftaldehído.
8. El microorganismo purificado de la reivindicación 4, en el que el compuesto comprende al menos un grupo funcional del grupo constituido por imidato de NHS, maleimida, cloroacetilo, fluoroacetilo, yodoacetilo, bromoacetilo, amina e hidrazida.
9. El microorganismo purificado de la reivindicación 1, en el que la enzima se selecciona de un grupo constituido por bromelina, quimiotripsina, clostripaína, colagenasa, elastasa, ficina, kalikreína, metaloendopeptidasa, proteinasa K, aminopeptidasa M, carboxipeptidasa Y, factor Xa, papaína, quimiopapaína, pepsina, staphylococcus aureaus proteasa (cepa V-8), tripsina y mezclas de ellas.
10. Una composición material que comprende:
(a)
un microorganismo purificado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9; y
(b)
un matriz de líquido.
11. La composición de la reivindicación 10, en la que la matriz de líquido se ha modificado para hacerla adecuada para liofilización.
12. El microorganismo purificado de la reivindicación 1, en el que el microorganismo es un virus.
13. El virus purificado de la reivindicación 12, en el que el virus se escoge del grupo constituido por el virus de la inmunodeficiencia humana, el virus de la hepatitis C, el virus de la hepatitis B, citomegalovirus, virus linfotrófico humano, virus de Epstein-Barr, parvovirus, virus de herpes simplex, virus de herpes humano 8 y virus de la hepatitis A.
14. El microorganismo purificado de la reivindicación 1, en el que el microorganismo es un parásito intracelular.
15. El parásito intracelular purificado de la reivindicación 14, en el que el parásito intracelular se escoge del grupo constituido por Chlamydia trachomatis, Chlamydia psittaci, Rickettsia prowazeki, Rickettsia typhi, Rickettsia rickettsi, Rickettsia sibtricus, Rickettsia conori, Rickettsia australis, Rickettsia akari, Rickettsia tsutsugamushi, Coxiella bumeti y Rochalimaea quintana.
16. Un método para producir un microorganismo no patógeno según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y 12 a 15, que comprende:
(a)
proporcionar un microorganismo purificado que comprende proteínas superficiales y componentes nucleares intactos; y
(b)
modificar irreversiblemente una o más proteínas superficiales usando un reactivo modificador mientras se dejan los componentes nucleares sustancialmente intactos, de tal modo que el microorganismo se hace por ello no patógeno;
en el que la etapa (b) comprende:
(i)
incorporar covalentemente un compuesto que comprende uno o más grupos funcionales reactivos a uno o más lugares reactivos en dichas proteínas superficiales; o
(ii)
al menos digestión parcial de una o más proteínas superficiales por una enzima.
17. El método de la reivindicación 16, en el que, en la etapa (b)(i), el compuesto comprende un grupo funcional reactivo simple.
18. El método de la reivindicación 17, en el que el compuesto se selecciona de un grupo consistente en formaldehído, acetaldehído, propionaldehído, n-butiraldehído, benzaldehído, p-nitrobenzaldehído, p-tolualdehído, salicilaldehído, fenilacetaldehído, 2-metilpentanal, 3-metilpentanal y 4-metilpentanal.
19. El método de la reivindicación 17, en el que el compuesto comprende dos o más grupos funcionales reactivos.
20. El método de la reivindicación 19, en el que el compuesto es paraformaldehído.
21. El método de la reivindicación 20, en el que se usa paraformaldehído con una concentración de no más del 5%.
22. El método de la reivindicación 19, en el que el compuesto es un dialdehído.
23. El método de la reivindicación 22, en el que el el dialdehído se selecciona del grupo constituido por glutaraldehído, glioxal, malondialdehído, succinaldehído, adipaldehído y ftaldehído.
24. El método de la reivindicación 16, en el que, en la etapa (b)(i), el compuesto comprende al menos un grupo funcional del grupo constituido por imidato de NHS, maleimida, cloroacetilo, fluoroacetilo, yodoacetilo, bromoacetilo, amina e hidrazida.
25. El método de la reivindicación 16, en el que, en la etapa (b)(ii), la enzima se selecciona de un grupo constituido por bromelina, quimiotripsina, clostripaína, colagenasa, elastasa, ficina, kalikreína, metaloendopeptidasa, proteinasa K, aminopeptidasa M, carboxipeptidasa Y, factor Xa, papaína, quimiopapaína, pepsina, staphylococcus aureaus proteasa (cepa V-8), tripsina y mezclas de ellas.
26. El método de la reivindicación 16, en el que el microorganismo es un virus.
27. El método de la reivindicación 26, en el que el virus se escoge del grupo constituido por el virus de la inmunodeficiencia humana, el virus de la hepatitis C, el virus de la hepatitis B, citomegalovirus, virus linfotrófico humano, virus de Epstein-Barr, parvovirus, virus de herpes simplex, virus de herpes humano 8 y virus de la hepatitis A.
28. El método de la reivindicación 16ª, en el que el microorganismo es un parásito intracelular.
29. El método de la reivindicación 28, en el que el parásito intracelular se escoge del grupo constituido por
Chlamydia trachomatis, Chlamydia psittaci, Rickettsia prowazeki, Rickettsia typhi, Rickettsia rickettsi, Rickettsia sibtricus, Rickettsia conori, Rickettsia australis, Rickettsia akari, Rickettsia tsutsugamushi, Coxiella bumeti y Rochalimaea quintana.
30. Un método para detectar un microorganismo que comprende proteínas superficiales en una muestra biológica por multiplicación de componentes nucleares de dicho microorganismo, cuyo método comprende la adición de un microorganismo testigo purificado a la muestra biológica, en el que el microorganismo testigo comprende proteínas superficiales y componentes nucleares sustancialmente intactos, y en el que una o más proteínas superficiales de dicho microorganismo testigo se han modificado irreversiblemente por un reactivo modificador, de tal modo que dicho microorganismo testigo se hace por ello no patógeno; en el que la modificación irreversible se selecciona entre:
(a)
incorporar covalentemente un compuesto que comprende uno o más grupos funcionales reactivos a uno o más lugares reactivos en dichas proteínas superficiales; o
(b)
al menos digestión parcial de una o más de dichas proteínas superficiales por una enzima.
31. El método de la reivindicación 30, en el que el compuesto comprende un grupo funcional reactivo simple.
32. El método de la reivindicación 31, en el que el compuesto se selecciona de un grupo consistente en formaldehído, acetaldehído, propionaldehído, n-butiraldehído, benzaldehído, p-nitrobenzaldehído, p-tolualdehído, salicilaldehído, fenilacetaldehído, 2-metilpentanal, 3-metilpentanal y 4-metilpentanal.
33. El método de la reivindicación 30, en el que el compuesto comprende dos o más grupos funcionales reactivos.
34. El método de la reivindicación 33, en el que el compuesto es paraformaldehído.
35. El método de la reivindicación 33, en el que el compuesto es un dialdehído.
36. El método de la reivindicación 35, en el que el el dialdehído se selecciona del grupo constituido por glutaraldehído, glioxal, malondialdehído, succinaldehído, adipaldehído y ftaldehído.
37. El método de la reivindicación 30ª, en el que el compuesto comprende al menos un grupo funcional del grupo constituido por imidato de NHS, maleimida, cloroacetilo, fluoroacetilo, yodoacetilo, bromoacetilo, amina e
hidrazida.
38. El método de la reivindicación 30, en el que la enzima se selecciona de un grupo constituido por bromelina, quimiotripsina, clostripaína, colagenasa, elastasa, ficina, kalikreína, metaloendopeptidasa, proteinasa K, aminopeptidasa M, carboxipeptidasa Y, factor Xa, papaína, quimiopapaína, pepsina, staphylococcus aureaus proteasa (cepa V-8), tripsina y mezclas de ellas.
39. El método de la reivindicación 30, en el que el microorganismo es un virus.
40. El método de la reivindicación 39, en el que el virus se escoge del grupo constituido por el virus de la inmunodeficiencia humana, el virus de la hepatitis C, el virus de la hepatitis B, citomegalovirus, virus linfotrófico humano, virus de Epstein-Barr, parvovirus, virus de herpes simplex, virus de herpes humano 8 y virus de la hepatitis A.
41. El método de la reivindicación 30, en el que el microorganismo es un parásito intracelular.
42. El método de la reivindicación 41, en el que el parásito intracelular se escoge del grupo constituido por
Chlamydia trachomatis, Chlamydia psittaci, Rickettsia prowazeki, Rickettsia typhi, Rickettsia rickettsi, Rickettsia sibtricus, Rickettsia conori, Rickettsia australis, Rickettsia akari, Rickettsia tsutsugamushi, Coxiella bumeti y Rochalimaea quintana.
43. Un juego para analizar en una muestra biológica la presencia de un microorganismo que tiene proteínas superficiales, en el que el juego comprende una composición de testigo positivo que comprende una muestra purificada de dicho microorganismo que comprende proteínas superficiales y componentes nucleares intactos, en el que una o más proteínas superficiales se han modificado irreversiblemente por un reactivo modificador, de tal modo que el microorganismo se ha hecho por ello no patógeno; en el que la modificación irreversible se selecciona entre:
(a)
incorporación covalente de un compuesto que comprende uno o más grupos funcionales reactivos a uno o más lugares reactivos en dichas proteínas superficiales; o
(b)
al menos digestión parcial de una o más de dichas proteínas superficiales por una enzima.
44. El juego de la reivindicación 43, en el que el compuesto comprende un grupo funcional reactivo simple.
45. El juego de la reivindicación 44, en el que el compuesto se selecciona de un grupo consistente en formaldehído, acetaldehído, propionaldehído, n-butiraldehído, benzaldehído, p-nitrobenzaldehído, p-tolualdehído, salicilaldehído, fenilacetaldehído, 2-metilpentanal, 3-metilpentanal y 4-metilpentanal.
46. El juego de la reivindicación 43, en el que el compuesto comprende dos o más grupos funcionales reactivos.
47. El juego de la reivindicación 46, en el que el compuesto es paraformaldehído.
48. El juego de la reivindicación 46, en el que el compuesto es un dialdehído.
49. El juego de la reivindicación 48, en el que el el dialdehído se selecciona del grupo constituido por glutaraldehído, glioxal, malondialdehído, succinaldehído, adipaldehído y ftaldehído.
50. El juego de la reivindicación 43, en el que el compuesto comprende al menos un grupo funcional del grupo constituido por imidato de NHS, maleimida, cloroacetilo, fluoroacetilo, yodoacetilo, bromoacetilo, amina e hidra-
zida.
51. El juego de la reivindicación 43, en el que la enzima se selecciona de un grupo constituido por bromelina, quimiotripsina, clostripaína, colagenasa, elastasa, ficina, kalikreína, metaloendopeptidasa, proteinasa K, aminopeptidasa M, carboxipeptidasa Y, factor Xa, papaína, quimiopapaína, pepsina, staphylococcus aureaus proteasa (cepa V-8), tripsina y mezclas de ellas.
52. El juego de la reivindicación 43, en el que el microorganismo es un virus.
\newpage
53. El juego de la reivindicación 52, en el que el virus se escoge del grupo constituido por el virus de la inmunodeficiencia humana, el virus de la hepatitis C, el virus de la hepatitis B, citomegalovirus, virus linfotrófico humano, virus de Epstein-Barr, parvovirus, virus de herpes simplex, virus de herpes humano 8 y virus de la hepatitis A.
54. El juego de la reivindicación 43, en el que el microorganismo es un parásito intracelular.
55. El juego de la reivindicación 54, en el que el parásito intracelular se escoge del grupo constituido por
Chlamydia trachomatis, Chlamydia psittaci, Rickettsia prowazeki, Rickettsia typhi, Rickettsia rickettsi, Rickettsia sibtricus, Rickettsia conori, Rickettsia australis, Rickettsia akari, Rickettsia tsutsugamushi, Coxiella bumeti y Rochalimaea quintana.
56. Un método para detectar un microorganismo que comprende proteínas superficiales en una muestra biológica por técnicas de multiplicación de ácidos nucleicos, cuyo método comprende comultiplicación de un testigo interno positivo en la muestra biológica, en el que el testigo interno positivo comprende el microorganismo purificado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y 12 a 15.
57. Un método para detectar un microorganismo que comprende proteínas superficiales en una muestra biológica por multiplicación de componentes nucleares de dicho microorganismo, que comprende:
(a)
añadir el microorganismo purificado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y 12 a 15 a una muestra biológica en la que ensayar la presencia de un microorganismo correspondiente;
(b)
extraer el ácido nucleico objetivo a multiplicar;
(c)
multiplicar el ácido nucleico objetivo; y
(d)
detectar el ácido nucleico objetivo multiplicado.
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