WO2015018707A1 - Verfahren und vorrichtung zum aufbereiten einer zielzellen und begleitzellen enthaltenden probe biologischen materials zum extrahieren von nukleinsäuren der zielzellen - Google Patents

Verfahren und vorrichtung zum aufbereiten einer zielzellen und begleitzellen enthaltenden probe biologischen materials zum extrahieren von nukleinsäuren der zielzellen Download PDF

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target cells
cells
filter
nucleic acids
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Bernd Faltin
Franz Laermer
Jochen Rupp
Peter Rothacher
Christian Dorrer
Sebastian Berning
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Robert Bosch Gmbh
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N29/00—Investigating or analysing materials by the use of ultrasonic, sonic or infrasonic waves; Visualisation of the interior of objects by transmitting ultrasonic or sonic waves through the object

Definitions

  • the present invention relates to a method for processing a sample of biological material containing target cells and companion cells
  • the present invention particularly relates to the field of microfluidic systems
  • RNA pathogenic DNA or RNA obtained.
  • a sample of blood is understood to mean the sample, but in principle other liquid or liquefied patient samples, for. Urine, stool, sputum, cerebrospinal fluid, lavage, a flushed swab or a liquefied tissue sample, in particular if these are blood or traces of
  • Urinary tract infections and sepsis In case of a suspected urinary tract infection pathogens are to be detected from urine. A concentration of the pathogens may be very low in this case, z. B. 10 3 to 10 7 per milliliter. In the case of suspected sepsis, for example, it is of interest to detect pathogens from blood and, if appropriate, resistance to certain To determine antibiotics. Due to the concentration ratios between pathogens and leukocytes, for example 10 to 1000 per milliliter compared to 10 6 to 10 7 per milliliter, in this case there is a very strong background of human DNA in the sample. Commercially available methods for the selective purification of pathogenic DNA eg from blood employ, for example, chemical reagents to first achieve selective lysis of human cells.
  • the human nucleic acids are enzymatically digested.
  • Pathogens are subsequently isolated, for example, by centrifugation and decantation of the supernatant. Such a method is disclosed, for example, in DE102005009479A1.
  • US 2010/0285578 A1 discloses devices and methods for recovering nucleic acids from biological samples. Disclosure of the invention
  • an improved method of processing a sample of biological material containing target cells and companion cells to extract nucleic acids of the target cells and an improved apparatus for processing a target cell and companion cell-containing sample of biological material for extracting nucleic acids of the target cells are presented.
  • Advantageous embodiments emerge from the respective subclaims and the following description.
  • a preparation of a biological sample in particular for selectively obtaining pathogenic nucleic acids from a sample which also contains non-pathogenic nucleic acids, for example from blood cells, and / or an accumulation of pathogens from a sample and their subsequent lysis can be realized.
  • embodiments of the present invention include a concept for thermal pretreatment of a sample and / or a concept for
  • Sample preparation by means of a filter and ultrasound is provided with the aim of obtaining target cell nucleic acids purified from a sample also containing accompanying cells.
  • a lysis of bioparticles by means of ultrasound provided on a filter, which can be destroyed by ultrasound, the composite of the filter, and a microfluidic system.
  • embodiments of the present invention are advantageous in
  • Microfluidic lab-on-chip systems can be used for molecular diagnostics.
  • embodiments of the present invention enable target cell nucleic acids contained in a sample, e.g. B. pathogenic DNA, from a background to companion nucleic acids, eg. B. human DNA, reliably separate. This avoids that the companion cell nucleic acids interfere with subsequent amplification and detection steps, and a sensitivity of detection or diagnostics is thus improved.
  • a thermal pretreatment of a sample can by particular
  • the enzymatic digestion can be reliably avoided that the sample gels, which would occur, for example, if a temperature is too high and / or a period of pretreatment is too long.
  • the gelling of the sample can also be avoided in view of a respect to the
  • Gels critical temperature and time also from properties of the sample such. B. depend on the hematocrit. For example, enzymatic digestion can prevent the sample from clogging a filter. This makes it possible to process even large quantities of samples. Filtration allows this, only a few pathogens, eg. B. 10 to 1000, from a relatively large volume of blood, z. B. 1 to 10 milliliters to accumulate. This can increase an effective concentration of target cell nucleic acids and a
  • Sensitivity can be increased.
  • Embodiments of the present invention are particularly well suited for automation, especially in a microfluidic system. This can facilitate a performance and reduce the risk of contamination.
  • embodiments of the present invention enable a
  • a method for processing a sample of biological material containing target cells and companion cells for extracting nucleic acids of the target cells comprises the following steps:
  • the target cells may be pathogenic cells or pathogens, eg. As viruses or microorganisms, such as. As bacteria or fungi, comprising DNA and / or RNA as nucleic acids.
  • pathogenic cells or pathogens eg. As viruses or microorganisms, such as. As bacteria or fungi, comprising DNA and / or RNA as nucleic acids.
  • nucleic acids DNA and / or RNA.
  • the companion cells may include human cells, for example, blood cells or the like.
  • a liquid to be analyzed typically a liquid or liquefied patient sample, e.g. As blood, urine, stool, sputum, cerebrospinal fluid, lavage, a flushed swab or a liquefied tissue sample.
  • the in The nucleic acids contained in the target cell lysate are purified and fed to a subsequent analysis, by the presence of certain pathogens or genes, eg. B. resistance genes, can be checked.
  • This subsequent analysis may, for.
  • sequencing polymerase chain reaction (PCR, polymerase chain reaction), real-time PCR or real-time
  • Purification of the target cell nucleic acids from the sample may be performed after lysing the target cells by subsequent adsorption of the target cell nucleic acids to a solid phase, e.g. B. a silica filter or
  • Microparticles or so-called beads done.
  • mechanical methods eg. B. by means of ultrasound or microspheres or beads.
  • the aim of purification is to concentrate the target cell nucleic acids in a concentrated form
  • human blood samples may additionally contain large amounts of human DNA companion cells.
  • One way to separate the target cells from the companion cells may be to first locate the companion cells, e.g.
  • blood cells contained in the sample can be selectively disrupted or lysed and separated from the target cells. in the
  • target cells can be lysed and the target cell nucleic acids can be purified. It may be that target cells are only present in low concentrations in the sample. To the target cells before the
  • the sample can also z. B. centrifuged or rinsed through a filter.
  • Embodiments of the present invention make it possible, even with samples containing many companion cells, to separate the target cell nucleic acids from the background background of the companion cell nucleic acids. Otherwise, these companion cell nucleic acids would interfere with subsequent amplification and analysis of the target cell nucleic acids, making it difficult, if not impossible, to detect the presence of the target cells. Thus it can be prevented that the companion cell nucleic acids in a subsequent amplification and analysis to form undesired by-products and a
  • the step of accumulating may comprise a substep of separating the target cells from the sample by means of a
  • Target cells are retained by means of an accumulation filter.
  • Selection of the target cells can be achieved.
  • the step of accumulating may include a substep of cleaning the accumulation filter after the substep of separating the target cells.
  • the accumulation filter can be washed, z. By passing water or an aqueous buffer over the accumulation filter.
  • Such an embodiment has the advantage that other components of the sample, for. As proteins are rinsed out and the target cells are present in greater purity.
  • the accumulating step may include a sub-step of tempering the sample to a lysis temperature to open up the companion cells and a substep of lysing the companion cells by chemical or enzymatic lysis and enzymatic digestion of those released from the companion cells
  • the sub-step of tempering and the sub-step of lysing and digestion can be carried out prior to the sub-step of the separation.
  • the lysis temperature may be suitably selected to destroy or damage the companion cells contained in the sample, leaving the target cells contained in the sample intact.
  • Embodiment offers the advantage that a particularly effective and reliable selection of the target cells can be achieved.
  • the thermal treatment can be used selectively due to different cell wall properties. Due to the lysing, clogging in the filtration can be prevented.
  • the sub-step of lysing and digestion before, during or after the sub-step of the tempering can be performed.
  • a viscosity of the sample can be lowered.
  • Enzymes are used. Such an embodiment offers the advantage that thereby already during the thermal pretreatment a gelling of the sample can be reliably avoided.
  • the target cells can be detected by means of
  • Ultrasonic coupling be unlocked.
  • Such an embodiment offers the advantage that ultrasound-induced pressure waves and cavitation cause cell walls of the target cells to be destroyed particularly safely and quickly.
  • the target cells can be placed on a filter
  • the filter may be open-minded and the composite of the filter can be completely or partially destroyed or the filter can be completely or partially decomposed into its components.
  • the filter may be the one already mentioned
  • a step of pre-filtering the companion cells by means of a lysis buffer and additionally or alternatively ultrasonically coupling may be provided prior to the step of accumulating.
  • soft lysis of the sample may be effected, whereby the companion cells contained in the sample are selectively lysed while the target cells remain intact.
  • Soft lysis in the pre-digestion step can be achieved, for example, by mild enzymatic or chemical lysis.
  • soft lysis may also be achieved by sonicating the sample with low energy ultrasound. This has the advantage that no or less additional reagents need to be added.
  • ultrasonically sonicating the nucleic acids released from the companion cells by ultrasonically sonicating the sample, thereby improving the processability of the sample. This allows the sample to be passed through the accumulation filter at a lower pressure and to avoid clogging of the accumulation filter.
  • the accumulating step may include a substep of diluting the sample.
  • the sample may be mixed with water, an aqueous buffer and / or an oil, e.g. a silicone oil, to be diluted.
  • an oil e.g. a silicone oil
  • Embodiment offers the advantage that a viscosity of the sample is reduced which improves processability of the sample. This allows the sample to be passed through the accumulation filter at a lower pressure and to avoid clogging of the accumulation filter.
  • the step of accumulating comprises the sub-step of tempering the sample
  • the sub-step of dilution may be carried out before or after the sub-step of tempering. In this way, on the one hand, gelling during the thermal treatment can be avoided even more reliably, or on the other hand, owing to osmotic shock, it is also possible to effectively further lyse companion cells that have been damaged during the thermal treatment.
  • An apparatus for processing a sample of biological material containing target cells and companion cells for extracting nucleic acids of the target cells comprises: means for accumulating the target cells of the sample by separating the target cells or the companion cells from the sample; means for disrupting the target cells by chemical and / or physical lysis to produce a target cell lysate containing the nucleic acids of the target cells; and means for purifying the nucleic acids from the target cell lysate to extract the nucleic acids of the target cells.
  • the aforesaid apparatus for processing can be advantageously used in connection with an embodiment of the method for processing in order to prepare a sample of biological material containing target cells and companion cells, in order to be able to extract nucleic acids of the target cells.
  • the apparatus is designed to implement or to implement the steps of the method for processing in corresponding devices.
  • the object underlying the invention can be solved quickly and efficiently.
  • the device may be formed as a microfluidic system, in particular for a so-called chip laboratory or
  • the means for accumulating may comprise an accumulation filter for separating the target cells from the sample.
  • an accumulation filter for separating the target cells from the sample.
  • the accumulation filter of the means for accumulating may also be usable by the means for unlocking and additionally or alternatively the means for cleaning.
  • Such an embodiment offers the advantage that a filter is saved when the target cells on the
  • a lysis buffer used for digestion can be set so that target cell nucleic acids released on digestion bind directly to the accumulation filter.
  • Accumulation filter can be given without the lysis buffer from
  • Binding buffer in the accumulation filter can be done diffusively.
  • the binding buffer may be fed through the filter contrary to the initial direction of flow and mixed with the lysis buffer.
  • the means for accumulating may also comprise tempering means for tempering the sample to a lysis temperature for unlocking or pre-damaging the accompanying cells. Further, the accumulating means may comprise a buffer solution storage chamber for lysing the companion cells by chemical lysis.
  • the temperature control means may also be designed to heat and / or to cool. Such an embodiment offers the advantage that a particularly effective and reliable selection of the target cells is achieved.
  • the thermal treatment can be used selectively due to different cell wall properties. Due to the lysis, clogging in the filtration can be prevented.
  • the temperature of the lysis can be adjusted precisely by the temperature control.
  • the temperature control means also have a cooling device, the sample can be adjusted to a second defined temperature level, eg. B. room temperature, are brought so that a duration of the thermal pre-treatment can be adjusted very accurately and gelation of the sample can be avoided particularly reliably.
  • the temperature control means may be thermally coupled to a sample chamber or a sample channel arranged between a sample chamber and a digestion chamber.
  • a sample chamber or a sample channel arranged between a sample chamber and a digestion chamber.
  • the means for unlocking a sample may be thermally coupled to a sample chamber or a sample channel arranged between a sample chamber and a digestion chamber.
  • Comprise ultrasound-coupling means which is arranged adjacent to the means for accumulating.
  • the ultrasonic coupling device can have an ultrasonic sonotrode.
  • Such an embodiment offers the advantage that ultrasound-induced pressure waves and cavitation cause cell walls of the target cells to be destroyed particularly safely and quickly.
  • the accumulation filter may be configured to pass through
  • the accumulation filter may in particular comprise a filter of inorganic fibers or particles, e.g. of alumina or silica, a porous membrane or a membrane with defined holes.
  • the accumulation filter is also designed to retain target cells contained in the sample due to their size. By ultrasound generated pressure waves and shear forces lead to a destruction of the cell walls of the target cells, on the other hand to an, at least partial, destruction of the composite of the accumulation filter.
  • a fiber filter is broken down into individual fibers.
  • a packed silica filter is accordingly broken down into silica particles.
  • Embodiment offers the advantage that while the target cells remain partially bound to the filter particles, which further improves the Lyseeigenschaften due to particle collisions. As a result, the ultrasound intensity can be reduced, which also has the advantage of less fragmentation of released target cell nucleic acids.
  • the accumulation filter can only be partially decomposed.
  • detached fragments or components of the filter are then collected in the further course of the processing of the still intact areas of the filter or pack in front of the still intact areas of the filter
  • the chemical conditions are also adjustable so that in the digestion of released target cell nucleic acids are adsorbed on this secondary filter and optionally the other filter, while other ingredients, eg. As proteins and cell debris flushed out.
  • the device for cleaning may have a further filter, which is arranged downstream of the accumulation filter.
  • the further filter may be formed to the fragments or particles of the
  • Such an embodiment has the advantage that the dissolved out by the ultrasound components of the
  • Accumulator be retained on the other filter and pack in front of the other filter to a secondary filter.
  • FIG. 1 is a flowchart of a method for rendering according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 to 9 apparatus for processing according to embodiments of the present invention.
  • FIG. 1 shows a flow diagram of a method 100 for processing a sample of biological material containing target cells and companion cells Extracting nucleic acids of the target cells according to an embodiment of the present invention.
  • the method 100 for processing is in
  • the method 100 has a step 105 of pre-digesting the accompanying cells and optionally the digestion of the nucleic acids released from the accompanying cells by means of a lysis buffer and additionally or alternatively ultrasound coupling.
  • the method 100 includes a step of accumulating the target cells of the sample by separating the target cells or companion cells from the sample. Also, that shows
  • Method 100 includes a step 120 of disrupting the target cells by chemical and additionally or alternatively by physical lysis to produce a target cell lysate containing the nucleic acids of the target cells. Furthermore, the method 100 includes a step 130 of cleaning up the
  • Nucleic acids from the target cell lysate to extract the nucleic acids of the target cells.
  • pre-expansion step 105 is optionally executed or skipped.
  • the method 100 comprises the step 1 10 of accumulation, the step 120 of the disruption and the step 130 of the purification.
  • the step 1 10 of accumulating comprises a substep of separating the target cells from the sample by means of an accumulation filter.
  • the step 1 10 of accumulating a sub-step of cleaning the
  • the step 1 10 of accumulating comprises a sub-step of tempering the sample to a lysis temperature for unlocking the companion cells and a substep of lysing the
  • accumulating step 1 10 includes a substep of diluting the sample.
  • the target cells are disrupted by ultrasound injection.
  • FIG. 2 shows a device 200 for processing a target cell
  • the device 200 is designed as a microfluidic system or part of a microfluidic system.
  • the device 200 shows a sample chamber 210, a tempering device in the form of a heater 220, a storage chamber 230 for a first buffer, a filter 240, a waste chamber 250, a lysis buffer storage chamber 260 and a
  • the heater 220 is disposed adjacent to the sample chamber 210. In this case, the heater 220 is thermally coupled to the sample chamber 210.
  • Pantry 230 is connected to sample chamber 210 by fluid communication.
  • the filter 240 is disposed between the sample chamber 210 on the one hand and the waste chamber 250 and the collection chamber 270 on the other hand.
  • the sample chamber 210 is connected by means of a fluid connection via the filter 240 with the waste chamber 250 and the collection chamber 270.
  • the lysis buffer storage chamber 260 is fluidly connected to fluid communication between the sample chamber 210 and the filter 240.
  • the sample chamber 210 has a z. B. by means of plugs, lids or adhesive film resealable opening for introducing the sample.
  • the heater 220 is, for example, a Peltier heater or
  • the waste chamber 250 serves to receive filtrate.
  • the collection chamber 270 serves to receive lysate.
  • FIG. 2 shows a topology of the device 100 and a
  • FIG. 3 shows a device 200 for processing a target cell
  • the device 200 is similar to the device of FIG. Shown here are the device 200, the sample chamber 210, the heater 220, the first buffer storage chamber 230, the filter 240, the waste chamber 250, the lysis buffer storage chamber 260, the collection chamber 270, a microchannel 315, and a cooler 320.
  • the microchannel 315 is arranged.
  • the sample chamber 210 is connected to the storage chamber 230 via a fluid connection via the microchannel 315.
  • the heater 220 and the radiator 320 form the tempering device.
  • the heater 220 and the radiator 320 are disposed adjacent to the microchannel 315.
  • the heater 220 and the radiator 320 are thermally coupled to the microchannel 315.
  • the storage chamber 230 is in this case arranged between the microchannel 315 and the filter 240.
  • the filter 240 is disposed between the storage chamber 230 on the one hand and the waste chamber 250 and the collection chamber 270 on the other hand.
  • the lysis buffer storage chamber 260 is fluidly connected to the
  • FIG. 3 shows a topology of the apparatus 200 for performing a thermal treatment in flow mode.
  • the sample from the sample chamber 210 through the temperature-controllable microchannel 315 in the
  • the temperature-controllable microchannel 315 can be heated by the heater 220 and, if necessary, cooled by the cooler 320, z. B. a Peltier cooler. By means of the cooler 320 as the second thermally active element, the heated sample is in front of a
  • the device 200 is similar to the device of Fig. 3, wherein in Fig. 4, the device 200 in an embodiment as a multi-layer structure in a
  • Section shown with the chambers of the device 200 are omitted in the illustration.
  • the heater 200, the filter 240, the microchannel 315, a further microchannel 415, a first structured polymer layer 481, a polymer film 482, a second structured polymer layer 483 and a polymeric cover film 484 are shown here by the device 200.
  • the structured polymer layers 481 and 483 are made of, for example, thermoplastic polymers, e.g. As PP, PC, PE, PS, COP, COC, etc., formed.
  • the polymer film 482 is formed, for example, from thermoplastic polymers, thermoplastic elastomers, elastomers or the like.
  • the lidding film 484 comprises, for example, a thermoplastic film, adhesive film or the like.
  • the further microchannel 415 extends between the temperature-controllable
  • Microchannel 315 and filter 240 represent the multilayer structure of the device 200 according to the embodiment of the present invention illustrated in FIG.
  • Such a design has the advantage that it is inexpensive to produce and by means of the polymer film 482 also active elements such as valves can be realized.
  • an advantage of this embodiment of the present invention is that the temperature-controllable microchannel 315 is separated from the heater 220 only by the thin cover foil 484. As a result, a temperature in the temperature-controllable microchannel 315 can be set particularly precisely. Operation of the apparatus 200 will be discussed in greater detail below.
  • FIG. 5 shows a device 200 for processing a target cell
  • the device 200 is similar to the device of FIG. Shown are of the device 200 in this case the heater 220, the filter 240, the
  • Microchannel 315 the first patterned polymer layer 481, the polymeric
  • Lid foil 484, another heater 520, a heatable amplification chamber 570 and, for example, two rotary valves 590 are used as a heatable amplification chamber 570 and, for example, two rotary valves 590.
  • first patterned polymer layer 481 and the polymeric lidding film 484 represent the multilayer structure of the device 200 according to the embodiment of the present invention shown in FIG. 5.
  • a first of the rotary valves 590 is disposed between the microchannel 315 and the filter 240 and is configured to release or block fluid communication therebetween.
  • a second of the rotary valves 590 is disposed between the filter 240 and the amplification chamber 570 and configured to be a
  • the further heater 520 is disposed adjacent to the amplification chamber 570 and thermally coupled thereto.
  • the filter 240 is between the two
  • Rotary valves 590 arranged.
  • an embodiment of the device 200 is shown as a multi-layer structure with only two layers. Such an embodiment has the advantage that the device 200 can be produced particularly inexpensively.
  • such an embodiment has the additional amplification chamber 570 which can be heated by means of the further heater 520, in which, after a purification of the target cell nucleic acids, an amplification thereof can be carried out by means of PCR.
  • step 1 10 of accumulating the actual thermal pretreatment of the sample is carried out according to an embodiment in a first sub-step.
  • a heating of the sample for example, to a temperature or Lysetemperatur between 60 and 90 degrees Celsius,
  • the temperature is the same agreed that the accompanying cells contained in the sample, for example, blood cells such as leukocytes, destroyed or pre-damaged and contained in the companion cells nucleic acids, ie human DNA, at least partially released, wherein the target cells contained in the sample, eg. B.
  • Pathogens stay intact. Such selective lysis of the companion cells is possible because the target cells as pathogens have a more robust cell wall and are thus more stable to thermal stresses.
  • the heating of the sample can, for. B. stationary in one of the sample chamber 210 or in
  • the resulting in this sub-step liquid is referred to as the first lysate.
  • step 1 10 of the accumulation is then carried out in a second partial step, a mixing of the first lysate with a first buffer, the enzymes, eg. Proteins, DNAsen and lysozyme, from the storage chamber 230.
  • This first buffer causes digestion or comminution of the resulting in the first sub-step or released damaged cells, cell debris, proteins and nucleic acids of the accompanying cells. This digestion is essential for one
  • the resulting liquid in this step is called digested lysate.
  • step 1 10 of the accumulation is then carried out in a third sub-step filtration, wherein the digested lysate is filtered through the filter 240, z.
  • the filter 240 As a sterile, fiber or silica filter is passed. Still intact cellular components, especially the target cells, are retained on the filter 240 due to their size and thus accumulated.
  • the sample prior to the first substep of step 1 to accumulate, is diluted with an aqueous buffer, e.g. In a ratio between 1: 1 and 1:10. This has the advantage that the viscosity of the sample is reduced and gelling during the thermal
  • osmotic shock triggers be effectively lysed even companion cells, which were only pre-damaged in the first part of the step.
  • additional components are added to accumulate in the second substep of step 1 10, e.g. As detergents, such as. As saponins, SDS or the like, chaotropic salts or basic components, such as. B. NaOH.
  • As detergents such as. As saponins, SDS or the like
  • chaotropic salts or basic components, such as. B. NaOH.
  • the target cells are preceded by the
  • wash down with the lysis buffer from the filter 240 e.g. B. by a buffer, z. B. an aqueous buffer, is flushed in the opposite direction through the filter 240.
  • the filter 240 will retransmit the target cells to the filter 240 in step 120 of digestion.
  • the lysis buffer may be set so that released target cell nucleic acids directly bind to the filter 240 in step 120 of digestion.
  • a binding buffer may be placed on the filter 240 without displacing the lysis buffer from the filter 240. The mixing of lysis buffer and binding buffer in the filter 240 then takes place diffusively.
  • step 120 of FIG. 1 the lysis buffer may be set so that released target cell nucleic acids directly bind to the filter 240 in step 120 of digestion.
  • a binding buffer may be placed on the filter 240 without displacing the lysis buffer from the filter 240. The mixing of lysis buffer and binding buffer in the filter 240 then takes place diffusively.
  • Digesting the digested lysate also heated or sonicated. A thermal load or caused by the ultrasound
  • step 120 of digestion the target cells are lysed. This creates a second lysate.
  • the lysis or digestion is carried out by adding the
  • Lysis buffer from the lysis buffer storage chamber 260 on the filter 240.
  • This lysis buffer can, for. B. contain enzymes, for. As proteinase K, proteases and lysozyme. These enzymes cause destruction of the cell wall of the target cells and thus release of the target cell nucleic acids.
  • the cell wall of the target cells can also be destroyed in other ways, eg. B. by the addition of chemical reagents, eg. As chaotropic salts, detergents such. As saponins, SDS or the like, ß-mercaptoethanol or basic components such. B. NaOH.
  • the target cell nucleic acids are purified from the second lysate, e.g. B. by adsorption on a solid phase.
  • step 130 of purification is followed by analysis of the target cell nucleic acids.
  • the purpose of this analysis may be z. B. be to detect a presence of certain pathogens and resistance genes.
  • the target cell nucleic acids are first selectively amplified, z. B. by means of a PCR.
  • a PCR an exponential amplification of the amount of nucleic acid is achieved by addition of a PCR master mix and repeated start-up of different temperature levels.
  • the PCR master mix typically contains a buffer solution, nucleotides, polymerase, primers, magnesium chloride and optionally bovine serum albumin (BSA).
  • BSA bovine serum albumin
  • z. B. a detection of the amplified target cell nucleic acids by hybridization on a microarray.
  • Advantageous in the realization of the concept for processing in a microfluidic system using a thermal pretreatment of the sample is that the method 100 can be particularly defined and reproducibly performed in a microfluidic system, since the temperatures, the volumes and, when performing the method in
  • the flow rates can be set very precisely. Furthermore, a risk of contamination of the sample from the outside or the environment by the sample can be minimized, since the method 100 is performed in the device 200 as a closed system.
  • FIG. 6 shows a device 200 for processing a target cell
  • the device 200 is designed as a microfluidic system or part of a microfluidic system.
  • the device 200 is the
  • Device 200 in this case the filter 240 or a sieve, the microchannel 315 as an inlet channel, the further microchannel 415 as a connecting channel, a first outlet channel 615a, a second outlet channel 615b, a second filter 620 and an ultrasonic sonotrode 625.
  • the ultrasonic sonotrode 625 is disposed adjacent to the filter 240.
  • the ultrasonic sonotrode 625 is designed to couple ultrasonic waves into a region of the filter 240.
  • the filter 240 is arranged between the microchannel 315 or inlet channel and the further microchannel 415 or connecting channel.
  • the filter 240 is adapted to be replaced by means of the
  • Ultrasonic sonotrode 625 coupled ultrasonic waves wholly or partially to be fragmented into fragments or particles.
  • the further microchannel 415 extends between the filter 240 and the second filter 620 or sieve. From the further microchannel 415, the first outlet channel 615a branches off.
  • the second filter 620 is arranged between the further microchannel 415 and the second outlet channel 615b.
  • the sample is passed through the inlet channel or microchannel 315 via the filter 240 and the connecting channel or further microchannel 415 into the first
  • FIG. 7 shows a device 200 for processing a target cell
  • the device 200 corresponds to the device of FIG. 6, wherein in FIG. 7 the device 200 in an embodiment as a multilayer structure is shown in a sectional view similar to FIG. 4.
  • the filter 200, the filter 240, the microchannel 315 as an inlet channel, the other are shown
  • Microchannel 415 as a connecting channel, the first structured polymer plate 481, the polymer membrane 482, the second structured polymer plate 483, the lid foil 484, the first outlet channel 615a, the second outlet channel 615b, the second filter 620 and the Ultrasonic sonotrode 625.
  • the first patterned polymer layer 481, the polymer film 482, the second patterned polymer layer 483, and the lidding film 484 represent the multilayer structure of the apparatus 200 according to that shown in FIG
  • Embodiment of the present invention Such an embodiment of the device 200 has the advantage that it can be produced inexpensively.
  • the multilayer structure may, for. B. by welding, for. As laser welding, gluing or terminals are connected by rivets.
  • Polymer layers 481 and 483 are made of, for example, thermoplastic
  • Polymers e.g. As PP, PC, PE, PS, COP, COC, etc., formed.
  • Polymer membrane or polymer film 482 is for example made
  • the lidding film 484 comprises, for example, a thermoplastic film, adhesive film or the like.
  • FIG. 8 shows a device 200 for processing a target cell
  • the device 200 corresponds to the device of FIG. 7 with the
  • the inlet channel or microchannel 315 is widened in the region of the filter 240 to the lysis chamber 230, whose typical volume is between 100 microliters and 3 milliliters, and typically at 1 milliliter.
  • This has the advantage that in the lysis chamber 230 a soft lysis can be performed by means of ultrasound, without the need for a further ultrasound sonotrode.
  • the second filter 620 or the sieve is flown over a smaller cross section than the filter 240. In the area in front of the second filter 620 or sieve, the elongated cavity 840 is formed, in which the constituents of the filter 240 collect and the packed secondary filter can form. This has the advantage that to
  • the elongated cavity 840 is structured as a breakthrough through the second according to the embodiment of the present invention shown in FIG.
  • Polymer layer 483 executed.
  • FIG. 9 shows a device 200 for processing a target cell
  • the device 200 corresponds to the device of FIG. 8 with the
  • the ultrasound intensity may be lower than the
  • Cavitation threshold are lowered or the ultrasonic frequency so
  • the sample is passed through the filter 240, in which it is z.
  • a filter of inorganic fibers or particles e.g. made of alumina or silica, a porous membrane or a membrane with defined holes.
  • Target cells contained in the sample are retained on the filter 240 due to their size.
  • the sample is z. B. with a pump, z. As a peristaltic or a diaphragm pump, or by means
  • the filter 240 is subjected to ultrasound, for example with a frequency of 20 to 50
  • the pressure waves and shear forces generated by the ultrasound lead, on the one hand, to the destruction of the cell walls of the target cells and, on the other hand, to a complete or partial destruction of the composite of the filter 240.
  • the filter particles of the filter 240 promote a lysis action. For example, a fabric filter is broken down into individual threads. A packed silica filter is accordingly broken down into silica particles.
  • lysate Digestion of the resulting liquid or suspension is referred to as lysate.
  • cavitation is generated by the ultrasound. This has the advantage that the occurring pressure waves and shear forces are particularly high. Furthermore, it is possible, with a few intensive ultrasound pulses via cavitation effects, first to disassemble the silica filter as a filter 240 and to transfer at least superficial silica particles with target cells bound thereto as a suspension back into the solution, wherein initially only a few target cells need to be lysed. In a next substep of step 120 of the digestion, the actual lysis is carried out with ultrasound of lower intensity below the cavitation threshold, wherein the silica particles from the filter material of the filter 240 have a supporting effect. Such Lysis conditions have proven to be particularly favorable for obtaining the least possible fragmented nucleic acids from the lysed target cells.
  • the filter 240 is filled with liquid in this step. This has the advantage that the ultrasonic energy is coupled particularly well and defined.
  • step 130 of the purification a filtration is performed wherein the lysate is treated with a binding buffer, e.g. B. an ethanol-containing binding buffer, mixed and passed through the second filter 620 and the sieve.
  • a binding buffer e.g. B. an ethanol-containing binding buffer
  • the components of the filter 240 are retained on the second filter 620 and pack before the second filter 620 to a so-called secondary filter.
  • the chemical conditions in this step are adjusted so that lysis of target cell nucleic acids liberated on this secondary filter and optionally the second filter 620 or sieve are adsorbed, while other ingredients, eg. B.
  • the lysate mixed with binding buffer may e.g. B. with a pump, z. B. a peristaltic or a
  • Membrane pump or be passed by centrifugation through the second filter 620 or the sieve.
  • a possible further procedure for processing the target cells and companion cells containing sample of biological material for extracting the nucleic acids of the target cells is described below.
  • the nucleic acids adsorbed on the secondary filter and the second filter 620 are washed and eluted. This has the advantage that the purity and concentration of the nucleic acids are increased.
  • the step 130 of purifying the target cell nucleic acids may be followed by amplification and / or detection, e.g. Example by means of sequencing, polymerase chain reaction (PCR), real-time PCR and / or hybridization on a microarray.
  • a so-called soft lysis is performed in step 105 before step 1 10 of accumulation.
  • Soft lysis is a step in which accompanying cells, in particular blood cells in the presence of a blood sample, contained in the sample are selectively lysed, while the target cells remain intact. This has the advantage that the accompaniment
  • the soft lysis can z. B. be achieved by a mild enzymatic or chemical lysis.
  • the addition of DNAses has the advantage that the nucleic acids released in this first, soft lysis step are digested and thus removed particularly effectively.
  • the soft lysis and the digestion of the nucleic acids released in the soft lysis step can also be achieved by sonicating the sample with ultrasound of reduced energy. This has the advantage of having no or less of additional
  • water or an aqueous buffer is added to the sample prior to step 1 10 of accumulation.
  • This has the advantage that the sample is diluted and therefore lighter, d. H. with lower pressure, can be passed through the pre-filter 620 and clogging of the pre-filter 620 is avoided.
  • the filter 240 is washed after the step 1 10 of accumulating, e.g. By passing water or an aqueous buffer over the filter 240. This has the advantage that other components of the sample, for. As proteins are rinsed out and the target cells are present in greater purity.
  • the addition of a binding buffer is omitted in step 130 of the cleaning.
  • the filtrate formed in the step 130 of purifying which in this case is the
  • a buffer containing proteinase K is added.
  • the second filter 620 is dispensed with. It has been found that the ultrasound parameters can be tuned or the ultrasound energy can be kept so low that the filter 240 is not completely disassembled or comminuted by its sonication due to the sonication. The sonicated filter 240 can thus continue to be used as a filter. The resulting from the sonication particles are collected and retained in subsequent process steps through the intact portions of the filter 240.

Abstract

Es wird ein Verfahren (100) zum Aufbereiten einer Zielzellen und Begleitzellen enthaltenden Probe biologischen Materials zum Extrahieren von Nukleinsäuren der Zielzellen vorgeschlagen. Das Verfahren(100) weist einen Schritt (110) des Akkumulierens der Zielzellen der Probe durch Abtrennen der Zielzellen oder der Begleitzellen aus der Probe auf. Auch weist das Verfahren (100) einen Schritt (120) des Aufschließens der Zielzellen durch chemische und/oder physikalische Lyse auf, um ein die Nukleinsäuren der Zielzellen enthaltendes Zielzellen-Lysat zu erzeugen. Ferner weist das Verfahren (100) einen Schritt (130) des Aufreinigens der Nukleinsäuren aus dem Zielzellen-Lysat auf, um die Nukleinsäuren der Zielzellen zu extrahieren.

Description

Beschreibung
Titel
Verfahren und Vorrichtung zum Aufbereiten einer Zielzellen und Begleitzellen enthaltenden Probe biologischen Materials zum Extrahieren von Nukleinsäuren der Zielzellen
Stand der Technik
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Aufbereiten einer Zielzellen und Begleitzellen enthaltenden Probe biologischen Materials zum
Extrahieren von Nukleinsäuren der Zielzellen und eine Vorrichtung zum
Aufbereiten einer Zielzellen und Begleitzellen enthaltenden Probe biologischen Materials zum Extrahieren von Nukleinsäuren der Zielzellen. Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere das Gebiet mikrofluidischer Systeme,
beispielsweise für sogenannte Chiplabors bzw. Westentaschenlabors (Lab-On-A-
Chip).
In der molekularen Diagnostik besteht oftmals eine Notwendigkeit zum Nachweis von pathogener DNA oder RNA in einer Probe. Als pathogene DNA oder RNA wird die aus einem Pathogen, z. B. einem Virus oder einem Mikroorganismus, z. B. einem Bakterium oder Pilz, gewonnene DNA oder RNA bezeichnet. Unter der Probe wird insbesondere eine Blutprobe verstanden, jedoch können prinzipiell auch andere flüssige oder verflüssigte Patientenproben, z. B. Urin, Stuhl, Sputum, Liquor, Lavage, ein ausgespülter Abstrich oder eine verflüssigte Gewebeprobe, gemeint sein, insbesondere wenn diese Blut oder Spuren von
Blut enthalten. Krankheitsbilder, bei denen dies relevant ist, sind z. B.
Harnwegsinfekte und Sepsis. Bei einem vermuteten Harnwegsinfekt sollen Pathogene aus Urin nachgewiesen werden. Eine Konzentration der Pathogene kann in diesem Fall sehr gering sein, z. B. 103 bis 107 pro Milliliter. Bei einer vermuteten Sepsis besteht beispielsweise Interesse, Pathogene aus Blut nachzuweisen sowie gegebenenfalls Resistenzen gegenüber bestimmten Antibiotika zu bestimmen. Aufgrund der Konzentrationsverhältnisse zwischen Pathogenen und Leukozyten, beispielsweise 10 bis 1000 pro Milliliter gegenüber 106 bis 107 pro Milliliter, befindet sich in diesem Fall ein sehr starker Hintergrund an humaner DNA in der Probe. Kommerziell verfügbare Verfahren zur selektiven Aufreinigung von pathogener DNA z.B. aus Blut setzen beispielsweise chemische Reagenzien ein, um zunächst eine selektive Lyse von humanen Zellen zu erreichen. Anschließend werden die humanen Nukleinsäuren enzymatisch verdaut. Pathogene werden im Anschluss beispielsweise durch Zentrifugation und Dekantieren des Überstands isoliert. Ein derartiges Verfahren wird beispielsweise in der DE102005009479A1 offenbart.
Die US 2010/0285578 A1 offenbart Vorrichtungen und Verfahren zum Gewinnen von Nukleinsäuren aus biologischen Proben. Offenbarung der Erfindung
Vor diesem Hintergrund werden ein verbessertes Verfahren zum Aufbereiten einer Zielzellen und Begleitzellen enthaltenden Probe biologischen Materials zum Extrahieren von Nukleinsäuren der Zielzellen und eine verbesserte Vorrichtung zum Aufbereiten einer Zielzellen und Begleitzellen enthaltenden Probe biologischen Materials zum Extrahieren von Nukleinsäuren der Zielzellen gemäß den Hauptansprüchen vorgestellt. Vorteilhafte Ausgestaltungen ergeben sich aus den jeweiligen Unteransprüchen und der nachfolgenden Beschreibung. Gemäß Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung kann eine Aufbereitung einer biologischen Probe insbesondere zur selektiven Gewinnung pathogener Nukleinsäuren aus einer Probe, die auch nicht-pathogene Nukleinsäuren enthält, beispielsweise aus Blutzellen, und/oder eine Akkumulation von Pathogenen aus einer Probe und deren anschließende Lyse realisiert werden. Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen zum Beispiel hierbei ein Konzept zur thermischen Vorbehandlung einer Probe und/oder ein Konzept zur
Probenaufbereitung mittels eines Filters sowie Ultraschall. So ist insbesondere eine Kombination einer thermischen Vorbehandlung, bei der Begleitzellen selektiv lysiert werden, mit einem enzymatischen Verdau sowie einer Abtrennung mittels Filtration vorgesehen mit dem Ziel, aus einer auch Begleitzellen enthaltenden Probe aufgereinigte Zielzellen-Nukleinsäuren zu erhalten. Auch sind beispielsweise eine Lyse von Biopartikeln mittels Ultraschall auf einem Filter vorgesehen, wobei durch Ultraschall der Verbund des Filters zerstört werden kann, sowie ein mikrofluidisches System. Insbesondere sind Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung vorteilhaft in
Systemen oder Laborroutinen, die in der molekularen Diagnostik beispielsweise zur Diagnose von Infektionskrankheiten verwendet werden, bzw. für
mikrofluidische Lab-on-Chip-Systeme zur molekularen Diagnostik einsetzbar. Vorteilhafterweise ermöglichen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, in einer Probe enthaltene Zielzellen-Nukleinsäuren, z. B. pathogene DNA, von einem Hintergrund an Begleitzellen-Nukleinsäuren, z. B. humaner DNA, zuverlässig abzutrennen. Dadurch wird vermieden, dass die Begleitzellen- Nukleinsäuren nachfolgende Amplifikations- und Detektionsschritte stören, und eine Sensitivität einer Detektion bzw. Diagnostik wird somit verbessert. Bei einer thermischen Vorbehandlung einer Probe kann durch insbesondere
enzymatischen Verdau zuverlässig vermieden werden, dass die Probe geliert, was beispielsweise eintreten würde, wenn eine Temperatur zu hoch ist und/oder eine Zeitdauer der Vorbehandlung zu lang ist. Hierbei kann das Gelieren der Probe auch im Hinblick darauf vermieden werden, dass eine bezüglich des
Gelierens kritische Temperatur und Zeitdauer auch von Eigenschaften der Probe wie z. B. dem Hämatokrit abhängen. Durch einen beispielsweise enzymatischen Verdau kann vermieden werden, dass die Probe einen Filter verstopft. Dadurch ist es möglich, auch große Probenmengen zu verarbeiten. Eine Filtration ermöglicht es hierbei, nur wenige Pathogene, z. B. 10 bis 1000, aus einem relativ großen Blutvolumen, z. B. 1 bis 10 Milliliter, zu akkumulieren. Dadurch kann eine effektive Konzentration von Zielzellen-Nukleinsäuren erhöht und eine
nachfolgende Amplifikation und Detektion erleichtert werden bzw. eine
Sensitivität kann erhöht werden. Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind besonders gut geeignet zur Automatisierung, insbesondere in einem mikrofluidischen System. Hierbei können eine Durchführung erleichtert und eine Gefahr von Kontaminationen herabgesetzt werden.
So ermöglichen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung eine
Akkumulation von Zielzellen aus einer Probe und steigern dadurch eine Effizienz nachfolgender Amplifikations- und/oder Detektionsschritte. Hierbei kann in vorteilhafter Weise auch insbesondere Ultraschall zur Lyse von auf einem Filter akkumulierten Zielzellen genutzt werden, wodurch ein besonders effektiver Aufschluss bewirkt werden kann. Im Gegensatz zu z. B. einer Zentrifugation ist eine Akkumulation von Zielzellen mittels eines Filters sehr gut geeignet zur automatisierten Durchführung, z. B. in einem mikrofluidischen System. Eine solche automatisierte Durchführung hat den Vorteil, dass weniger manuelle Arbeitsschritte benötigt werden und eine Gefahr von Kontaminationen und/oder Benutzerfehlern verringert wird. Bei Umsetzung von Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung in einem mikrofluidischen System lassen sich Flussraten bei der Akkumulation sehr genau kontrollieren. Dadurch kann vermieden werden, dass ein Filter verstopft oder Zielzellen versehentlich durch einen Filter hindurchgeschwemmt werden.
Ein Verfahren zum Aufbereiten einer Zielzellen und Begleitzellen enthaltenden Probe biologischen Materials zum Extrahieren von Nukleinsäuren der Zielzellen weist folgende Schritte auf:
Akkumulieren der Zielzellen der Probe durch Abtrennen der Zielzellen oder der Begleitzellen aus der Probe;
Aufschließen der Zielzellen durch chemische und/oder physikalische Lyse, um ein die Nukleinsäuren der Zielzellen enthaltendes Zielzellen-Lysat zu erzeugen; und
Aufreinigen der Nukleinsäuren aus dem Zielzellen-Lysat, um die Nukleinsäuren der Zielzellen zu extrahieren.
Die Zielzellen können pathogene Zellen bzw. Pathogene, z. B. Viren oder Mikroorganismen, wie z. B. Bakterien oder Pilze, umfassen, die DNA und/oder RNA als Nukleinsäuren aufweisen. Der Einfachheit halber wird im Folgenden häufig von Nukleinsäuren gesprochen, wobei damit DNA und/oder RNA gemeint ist. Die Begleitzellen können menschliche Zellen, beispielsweise Blutzellen oder dergleichen umfassen. Als Probe kann eine zu analysierende Flüssigkeit, typischerweise eine flüssige oder verflüssigte Patientenprobe, z. B. Blut, Urin, Stuhl, Sputum, Liquor, Lavage, ein ausgespülter Abstrich oder eine verflüssigte Gewebeprobe, bezeichnet werden. Im Schritt des Aufreinigens können die in dem Zielzellen-Lysat enthaltenen Nukleinsäuren aufgereinigt und einer nachfolgenden Analyse zugeführt werden, durch die ein Vorhandensein bestimmter Pathogene oder Gene, z. B. Resistenzgene, überprüft werden kann. Diese nachfolgende Analyse kann z. B. durch Sequenzierung, Polymerase- Kettenreaktion (PCR, Polymerase chain reaction), Echtzeit-PCR bzw. Real-Time-
PCR und/oder Detektion bzw. Hybridisierung auf einem Microarray erfolgen.
Das Aufreinigen der Zielzellen-Nukleinsäuren aus der Probe kann nach dem Aufschließen bzw. Lysieren der Zielzellen durch anschließende Adsorption der Zielzellen-Nukleinsäuren an einer festen Phase, z. B. einem Silikafilter oder
Mikropartikeln bzw. sogenannten Beads, erfolgen. Neben chemischen und enzymatischen Methoden zur Lyse gibt es dabei auch mechanische Methoden, z. B. mittels Ultraschall oder Mikrokügelchen bzw. Beads. Ziel des Aufreinigens ist es, die Zielzellen-Nukleinsäuren in aufkonzentrierter Form einer
darauffolgenden Amplifikation und/oder Detektion zur Verfügung zu stellen. Auch bei einem Abtrennen der Zielzellen-Nukleinsäuren von Zelltrümmern und
Proteinen können Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung vorteilhaft zum Einsatz kommen. Insbesondere Humanblutproben können jedoch zusätzlich große Mengen an Begleitzellen mit humaner DNA enthalten. Eine Möglichkeit zur Abtrennung der Zielzellen von den Begleitzellen kann darin bestehen, zunächst die Begleitzellen, z. B. Blutzellen, die in der Probe enthalten sind, selektiv aufzuschließen bzw. zu lysieren und von den Zielzellen abzutrennen. Im
Anschluss können die Zielzellen lysiert werden und können die Zielzellen- Nukleinsäuren aufgereinigt werden. Es kann sein, dass Zielzellen nur in geringer Konzentration in der Probe vorhanden sind. Um die Zielzellen vor dem
Aufreinigen aufzukonzentrieren, kann die Probe auch z. B. zentrifugiert oder über einen Filter gespült werden. Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ermöglichen es, auch bei Proben, die viele Begleitzellen enthalten, die Zielzellen- Nukleinsäuren vom in der Probe vorhandenen Hintergrund an Begleitzellen- Nukleinsäuren abzutrennen. Diese Begleitzellen-Nukleinsäuren würden ansonsten eine nachfolgende Amplifikation und Analyse der Zielzellen- Nukleinsäuren stören und es unter Umständen schwierig bis unmöglich machen, das Vorhandensein der Zielzellen zu detektieren. Somit kann verhindert werden, dass die Begleitzellen-Nukleinsäuren in einer nachfolgenden Amplifikation und Analyse zur Bildung von unerwünschten Nebenprodukten und einer
Herabsetzung der Sensitivität führen. Gemäß einer Ausführungsform kann der Schritt des Akkumulierens einen Teilschritt des Abtrennens der Zielzellen von der Probe mittels eines
Akkumulationsfilters aufweisen. Im Teilschritt des Abtrennens können die
Zielzellen mittels eines Akkumulationsfilters zurückgehalten werden. Eine solche
Ausführungsform bietet den Vorteil, dass eine effektive und zuverlässige
Selektion der Zielzellen erreicht werden kann.
Dabei kann der Schritt des Akkumulierens einen Teilschritt des Reinigens des Akkumulationsfilters nach dem Teilschritt des Abtrennens der Zielzellen aufweisen. Hierbei kann der Akkumulationsfilter gewaschen werden, z. B. indem Wasser oder ein wässriger Puffer über den Akkumulationsfilter geleitet wird. Eine solche Ausführungsform bietet den Vorteil, dass sonstige Bestandteile der Probe, z. B. Proteine, ausgespült werden und die Zielzellen in größerer Reinheit vorliegen.
Auch kann der Schritt des Akkumulierens einen Teilschritt des Temperierens der Probe auf eine Lysetemperatur zum Aufschließen der Begleitzellen und einen Teilschritt des Lysierens der Begleitzellen durch chemische oder enzymatische Lyse und des enzymatischen Verdaus der aus den Begleitzellen freigesetzten
Nukleinsäuren aufweisen. Dabei können der Teilschritt des Temperierens und der Teilschritt des Lysierens und Verdaus vor dem Teilschritt des Abtrennens ausgeführt werden. Auch kann die Lysetemperatur geeignet ausgewählt sein, dass die in der Probe enthaltenen Begleitzellen zerstört oder vorgeschädigt werden, wobei die in der Probe enthaltenen Zielzellen intakt bleiben. Eine solche
Ausführungsform bietet den Vorteil, dass eine besonders effektive und zuverlässige Selektion der Zielzellen erreicht werden kann. Dabei kann die thermische Behandlung aufgrund unterschiedlicher Zellwandbeschaffenheit gezielt eingesetzt werden. Aufgrund des Lysierens kann ein Verstopfen bei der Filtration verhindert werden.
Dabei kann der Teilschritt des Lysierens und Verdaus vor, während oder nach dem Teilschritt des Temperierens ausgeführt werden. Hierbei kann im Teilschritt des Lysierens eine Viskosität der Probe gesenkt werden. Dabei können im Teilschritt des Lysierens und Verdaus insbesondere temperaturbeständige
Enzyme verwendet werden. Eine solche Ausführungsform bietet den Vorteil, dass dadurch bereits während der thermischen Vorbehandlung ein Gelieren der Probe zuverlässig vermieden werden kann.
Ferner können im Schritt des Aufschließens die Zielzellen mittels
Ultraschalleinkopplung aufgeschlossen werden. Eine solche Ausführungsform bietet den Vorteil, dass durch Ultraschall hervorgerufene Druckwellen und Kavitation dazu führen, dass Zellwände der Zielzellen besonders sicher und schnell zerstört werden. Im Schritt des Aufschließens können die Zielzellen auf einem Filter
aufgeschlossen werden und der Verbund des Filters kann dabei ganz oder teilweise zerstört bzw. der Filter ganz oder teilweise in seine Bestandteile zerlegt werden. Bei dem Filter kann es sich um den bereits genannten
Akkumulationsfilter handeln.
Auch kann ein Schritt des Voraufschließens der Begleitzellen mittels eines Lysepuffers und zusätzlich oder alternativ Ultraschalleinkopplung vor dem Schritt des Akkumulierens vorgesehen sein. Dabei kann im Schritt des Voraufschließens eine weiche Lyse der Probe bewirkt werden, bei der in der Probe enthaltene Begleitzellen selektiv lysiert werden, während die Zielzellen intakt bleiben. Eine solche Ausführungsform bietet den Vorteil, dass die Begleitzellen-Nukleinsäuren bereits in diesem Schritt freigesetzt und nicht mit akkumuliert werden. Die weiche Lyse im Schritt des Voraufschließens kann beispielsweise durch eine milde enzymatische oder chemische Lyse erreicht werden. Alternativ kann die weiche Lyse auch durch Beschallen der Probe mit Ultraschall mit niedriger Energie erreicht werden. Dies hat den Vorteil, dass keine oder weniger an zusätzlichen Reagenzien hinzugefügt werden müssen. Auch werden durch das Beschallen der Probe mit Ultraschall die aus den Begleitzellen freigesetzten Nukleinsäuren zerkleinert, wodurch die Verarbeitbarkeit der Probe verbessert wird. So kann die Probe mit niedrigerem Druck über den Akkumulationsfilter geleitet werden und kann ein Verstopfen des Akkumulationsfilters vermieden werden.
Zudem kann der Schritt des Akkumulierens einen Teilschritt des Verdünnens der Probe aufweisen. Hierbei kann die Probe mit Wasser, einem wässrigen Puffer und/oder einem Öl, z.B. einem Silikonöl, verdünnt werden. Eine solche
Ausführungsform bietet den Vorteil, dass eine Viskosität der Probe herabgesetzt wird, womit eine Verarbeitbarkeit der Probe verbessert wird. So kann die Probe mit niedrigerem Druck über den Akkumulationsfilter geleitet werden und kann ein Verstopfen des Akkumulationsfilters vermieden werden. Weist der Schritt des Akkumulierens den Teilschritt des Temperierens der Probe auf, so kann der Teilschritt des Verdünnens vor oder nach dem Teilschritt des Temperierens ausgeführt werden. Auf diese Weise kann einerseits ein Gelieren während der thermischen Behandlung noch zuverlässiger vermieden werden oder können andererseits durch osmotischen Schock auch Begleitzellen, die während der thermischen Behandlung vorgeschädigt wurden, effektiv weiter lysiert werden.
Eine Vorrichtung zum Aufbereiten einer Zielzellen und Begleitzellen enthaltenden Probe biologischen Materials zum Extrahieren von Nukleinsäuren der Zielzellen weist folgende Merkmale auf: eine Einrichtung zum Akkumulieren der Zielzellen der Probe durch Abtrennen der Zielzellen oder der Begleitzellen aus der Probe; eine Einrichtung zum Aufschließen der Zielzellen durch chemische und/oder physikalische Lyse, um ein die Nukleinsäuren der Zielzellen enthaltendes Zielzellen-Lysat zu erzeugen; und eine Einrichtung zum Aufreinigen der Nukleinsäuren aus dem Zielzellen-Lysat, um die Nukleinsäuren der Zielzellen zu extrahieren.
Die vorstehend genannte Vorrichtung zum Aufbereiten kann in Verbindung mit einer Ausführungsform des Verfahrens zum Aufbereiten vorteilhaft eingesetzt bzw. verwendet werden, um eine Zielzellen und Begleitzellen enthaltenden Probe biologischen Materials aufzubereiten, um Nukleinsäuren der Zielzellen extrahieren zu können. Die Vorrichtung ist ausgebildet, um die Schritte des Verfahrens zum Aufbereiten in entsprechenden Einrichtungen durchzuführen bzw. umzusetzen. Auch durch diese Ausführungsvariante der Erfindung in Form einer Vorrichtung kann die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe schnell und effizient gelöst werden. Die Vorrichtung kann als ein mikrofluidisches System ausgeformt sein, insbesondere für ein sogenanntes Chiplabor bzw.
Westentaschenlabor bzw. Lab-On-A-Chip. Gemäß einer Ausführungsform kann die Einrichtung zum Akkumulieren einen Akkumulationsfilter zum Abtrennen der Zielzellen von der Probe aufweisen. Eine solche Ausführungsform bietet den Vorteil, dass eine effektive und zuverlässige Selektion der Zielzellen erreicht wird.
Insbesondere kann der Akkumulationsfilter der Einrichtung zum Akkumulieren auch durch die Einrichtung zum Aufschließen und zusätzlich oder alternativ die Einrichtung zum Aufreinigen nutzbar sein. Eine solche Ausführungsform bietet den Vorteil, dass ein Filter eingespart wird, wenn die Zielzellen auf dem
Akkumulationsfilter lysiert werden und der Akkumulationsfilter auch zur DNA-
Aufreinigung genutzt wird. Um dies zu realisieren, kann ein zum Aufschließen verwendeter Lysepuffer so eingestellt sein, dass beim Aufschluss freigesetzte Zielzellen-Nukleinsäuren direkt an den Akkumulationsfilter binden. Alternativ kann im Anschluss an den Aufschluss ein Bindepuffer auf den
Akkumulationsfilter gegeben werden, ohne den Lysepuffer vom
Akkumulationsfilter zu verdrängen. Eine Mischung von Lysepuffer und
Bindepuffer im Akkumulationsfilter kann hierbei diffusiv erfolgen. Alternativ kann der Bindepuffer entgegen der anfänglichen Flussrichtung durch den Filter zugeführt und mit dem Lysepuffer gemischt werden.
Auch kann die Einrichtung zum Akkumulieren Temperiermittel zum Temperieren der Probe auf eine Lysetemperatur zum Aufschließen oder Vorschädigen der Begleitzellen aufweisen. Ferner kann die Einrichtung zum Akkumulieren eine Vorratskammer für eine Pufferlösung zum Lysieren der Begleitzellen durch chemische Lyse aufweisen. Hierbei können die Temperiermittel eine
Heizeinrichtung oder eine Heizeinrichtung sowie eine Kühleinrichtung aufweisen. Auch können die Temperiermittel ausgebildet sein, um zu heizen und/oder zu kühlen. Eine solche Ausführungsform bietet den Vorteil, dass eine besonders effektive und zuverlässige Selektion der Zielzellen erreicht wird. Dabei kann die thermische Behandlung aufgrund unterschiedlicher Zellwandbeschaffenheit gezielt eingesetzt werden. Aufgrund der Lyse kann ein Verstopfen bei der Filtration verhindert werden. Insbesondere kann durch die Temperiermittel die Lysetemperatur genau eingestellt werden. Wenn die Temperiermittel auch eine Kühleinrichtung aufweisen, kann die Probe vor der Lyse auf ein zweites definiertes Temperaturniveau, z. B. Raumtemperatur, gebracht werden, sodass eine Dauer der thermischen Vorbehandlung besonders genau eingestellt werden kann und auch eine Gelierung der Probe besonders sicher vermieden werden kann.
Dabei können die Temperiermittel mit einer Probenkammer oder einem zwischen einer Probenkammer und einer Aufschlusskammer angeordneten Probenkanal thermisch gekoppelt sein. Eine solche Ausführungsform bietet den Vorteil, dass die thermische Behandlung der Probe anwendungsabhängig auf stationäre Weise oder in einem Durchflussprinzip erfolgen kann. Gemäß einer Ausführungsform kann die Einrichtung zum Aufschließen eine
Ultraschalleinkopplungseinrichtung aufweisen, die benachbart zu der Einrichtung zum Akkumulieren angeordnet ist. Die Ultraschalleinkopplungseinrichtung kann dabei eine Ultraschallsonotrode aufweisen. Eine solche Ausführungsform bietet den Vorteil, dass durch Ultraschall hervorgerufene Druckwellen und Kavitation dazu führen , dass Zellwände der Zielzellen besonders sicher und schnell zerstört werden.
Insbesondere kann der Akkumulationsfilter ausgebildet sein, um durch
Ultraschalleinkopplung ganz oder teilweise zu Fragmenten oder Partikeln zertrümmert bzw. in seine Bestandteile zerlegt zu werden. Dies kann
beispielsweise im genannten Schritt des Aufschließens erfolgen. Hierbei kann der Akkumulationsfilter insbesondere einen Filter aus anorganischen Fasern oder Partikeln, z.B. aus Aluminiumoxid oder Silika, eine poröse Membran oder eine Membran mit definierten Löchern aufweisen. Der Akkumulationsfilter ist auch ausgebildet, um in der Probe enthaltene Zielzellen aufgrund ihrer Größe zurückzuhalten. Durch Ultraschall erzeugte Druckwellen und Scherkräfte führen zum einen zu einer Zerstörung der Zellwände der Zielzellen, zum anderen zu einer , zumindest teilweisen, Zerstörung des Verbunds des Akkumulationsfilters. Beispielsweise wird ein Faserfilter in einzelne Fasern zerlegt. Ein gepackter Silika-Filter wird dementsprechend in Silika-Partikel zerlegt. Eine solche
Ausführungsform bietet den Vorteil, dass dabei die Zielzellen zum Teil an die Filterpartikel gebunden bleiben, was die Lyseeigenschaften aufgrund von Partikelkollisionen noch weiter verbessert. Dadurch kann die Ultraschallintensität reduziert werden, was auch den Vorteil einer geringeren Fragmentierung von freigesetzten Zielzellen-Nukleinsäuren hat. Dabei kann der Akkumulationsfilter nur teilweise zerlegt werden. Die
herausgelösten Fragmente bzw. Bestandteile des Filters werden dann im weiteren Verlauf der Prozessierung von den noch intakten Bereichen des Filters aufgefangen bzw. packen sich vor den noch intakten Bereichen des
Akkumulationsfilters erneut zu einem sekundären Filter zusammen. Durch
Zugabe eines Bindepuffers sind die chemischen Bedingungen dabei zudem so einstellbar, dass bei dem Aufschluss freigesetzte Zielzellen-Nukleinsäuren auf diesem sekundären Filter und gegebenenfalls dem weiteren Filter adsorbiert werden, während sonstige Bestandteile, z. B. Proteine und Zelltrümmer, ausgespült werden.
Alternativ kann die Einrichtung zum Aufreinigen einen weiteren Filter aufweisen, der dem Akkumulationsfilter nachgelagert angeordnet ist. Hierbei kann der weitere Filter ausgebildet sein, um die Fragmente oder Partikeln des
Akkumulationsfilters aufzufangen oder von den Zielzellen bzw. deren
Lyseprodukten abzutrennen. Eine solche Ausführungsform bietet den Vorteil, dass die durch den Ultraschall herausgelösten Bestandteile des
Akkumulationsfilters auf dem weiteren Filter zurückgehalten werden und sich vor dem weiteren Filter zu einem sekundären Filter packen.
Die Erfindung wird anhand der beigefügten Zeichnungen beispielhaft näher erläutert. Es zeigen:
Fig. 1 ein Ablaufdiagramm eines Verfahrens zum Aufbereiten gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung; und
Figuren 2 bis 9 Vorrichtungen zum Aufbereiten gemäß Ausführungsbeispielen der vorliegenden Erfindung.
In der nachfolgenden Beschreibung bevorzugter Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung werden für die in den verschiedenen Figuren
dargestellten und ähnlich wirkenden Elemente gleiche oder ähnliche
Bezugszeichen verwendet, wobei auf eine wiederholte Beschreibung dieser Elemente verzichtet wird.
Fig. 1 zeigt ein Ablaufdiagramm eines Verfahrens 100 zum Aufbereiten einer Zielzellen und Begleitzellen enthaltenden Probe biologischen Materials zum Extrahieren von Nukleinsäuren der Zielzellen gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung. Das Verfahren 100 zum Aufbereiten ist in
Verbindung mit einer Vorrichtung, wie der Vorrichtung zum Aufbereiten aus einer der Figuren 2 bis 9 vorteilhaft ausführbar. Dabei weist das Verfahren 100 einen Schritt 105 des Voraufschließens der Begleitzellen und ggf. des Verdaus der aus den Begleitzellen freigesetzten Nukleinsäuren mittels eines Lysepuffers und zusätzlich oder alternativ Ultraschalleinkopplung auf. Das Verfahren 100 weist einen Schritt 1 10 des Akkumulierens der Zielzellen der Probe durch Abtrennen der Zielzellen oder der Begleitzellen aus der Probe auf. Auch weist das
Verfahren 100 einen Schritt 120 des Aufschließens der Zielzellen durch chemische und zusätzlich oder alternativ durch physikalische Lyse auf, um ein die Nukleinsäuren der Zielzellen enthaltendes Zielzellen-Lysat zu erzeugen. Ferner weist das Verfahren 100 einen Schritt 130 des Aufreinigens der
Nukleinsäuren aus dem Zielzellen-Lysat auf, um die Nukleinsäuren der Zielzellen zu extrahieren.
Gemäß einem Ausführungsbeispiel wird der Schritt 105 des Voraufschließens optional ausgeführt oder übersprungen. Dabei weist das Verfahren 100 den Schritt 1 10 des Akkumulierens, den Schritt 120 des Aufschließens und den Schritt 130 des Aufreinigens auf.
Gemäß einem Ausführungsbeispiel weist der Schritt 1 10 des Akkumulierens einen Teilschritt des Abtrennens der Zielzellen von der Probe mittels eines Akkumulationsfilters auf. Dabei weist gemäß einem Ausführungsbeispiel der Schritt 1 10 des Akkumulierens einen Teilschritt des Reinigens des
Akkumulationsfilters nach dem Teilschritt des Abtrennens der Zielzellen auf.
Gemäß einem Ausführungsbeispiel weist der Schritt 1 10 des Akkumulierens einen Teilschritt des Temperierens der Probe auf eine Lysetemperatur zum Aufschließen der Begleitzellen und einen Teilschritt des Lysierens der
Begleitzellen durch chemische Lyse auf. Dabei wird gemäß einem
Ausführungsbeispiel der Teilschritt des Lysierens und Verdaus vor, während oder nach dem Teilschritt des Temperierens ausgeführt, wobei im Teilschritt des Lysierens und Verdaus eine Viskosität der Probe gesenkt wird. Gemäß einem Ausführungsbeispiel weist der Schritt 1 10 des Akkumulierens einen Teilschritt des Verdünnens der Probe auf.
Gemäß einem Ausführungsbeispiel werden im Schritt des Aufschließens 120 die Zielzellen mittels Ultraschalleinkopplung aufgeschlossen.
Fig. 2 zeigt eine Vorrichtung 200 zum Aufbereiten einer Zielzellen und
Begleitzellen enthaltenden Probe biologischen Materials zum Extrahieren von Nukleinsäuren der Zielzellen gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung. Dabei ist die Vorrichtung 200 als ein mikrofluidisches System oder ein Teil eines mikrofluidischen Systems ausgeführt. Gezeigt sind von der Vorrichtung 200 hierbei eine Probenkammer 210, eine Temperiereinrichtung in Gestalt eines Heizers 220, eine Vorratskammer 230 für einen ersten Puffer, ein Filter 240, eine Abfallkammer 250, eine Lysepuffer-Vorratskammer 260 und eine
Sammelkammer 270.
Der Heizer 220 ist benachbart zu der Probenkammer 210 angeordnet. Dabei ist der Heizer 220 mit der Probenkammer 210 thermisch gekoppelt. Die
Vorratskammer 230 ist mit der Probenkammer 210 mittels einer Fluidverbindung verbunden. Der Filter 240 ist zwischen der Probenkammer 210 einerseits und der Abfallkammer 250 sowie der Sammelkammer 270 andererseits angeordnet. Hierbei ist die Probenkammer 210 mittels einer Fluidverbindung über den Filter 240 mit der Abfallkammer 250 sowie der Sammelkammer 270 verbunden. Die Lysepuffer-Vorratskammer 260 ist mit einer Fluidverbindung zwischen der Probenkammer 210 und dem Filter 240 fluidleitfähig verbunden.
Die Probenkammer 210 weist eine z. B. mittels Stopfen, Deckel oder Klebefolie wieder verschließbare Öffnung zum Einbringen der Probe auf. Bei dem Heizer 220 handelt es sich beispielsweise um einen Peltier-Heizer oder
Widerstandsheizer. Die Abfallkammer 250 dient zur Aufnahme von Filtrat. Die Sammelkammer 270 dient zur Aufnahme von Lysat.
Somit zeigt Fig. 2 eine Topologie der Vorrichtung 100 bzw. eines
mikrofluidischen Systems, bei dem eine thermische Behandlung der Probe stationär in der Probenkammer 210 durchgeführt wird. Auf einen Betrieb der Vorrichtung 200 wird weiter unten eingegangen. Fig. 3 zeigt eine Vorrichtung 200 zum Aufbereiten einer Zielzellen und
Begleitzellen enthaltenden Probe biologischen Materials zum Extrahieren von Nukleinsäuren der Zielzellen gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung. Die Vorrichtung 200 ist der Vorrichtung aus Fig. 2 ähnlich. Gezeigt sind von der Vorrichtung 200 hierbei die Probenkammer 210, der Heizer 220, die Vorratskammer 230 für den ersten Puffer, der Filter 240, die Abfallkammer 250, die Lysepuffer-Vorratskammer 260, die Sammelkammer 270, ein Mikrokanal 315 und ein Kühler 320.
Zwischen der Probenkammer 210 und der Vorratskammer 230 ist der Mikrokanal 315 angeordnet. Die Probenkammer 210 ist mittels einer Fluidverbindung über den Mikrokanal 315 mit der Vorratskammer 230 verbunden. Der Heizer 220 und der Kühler 320 bilden die Temperiereinrichtung. Dabei sind der Heizer 220 und der Kühler 320 benachbart zu dem Mikrokanal 315 angeordnet. Der Heizer 220 und der Kühler 320 sind mit dem Mikrokanal 315 thermisch gekoppelt. Die Vorratskammer 230 ist hierbei zwischen dem Mikrokanal 315 und dem Filter 240 angeordnet. Der Filter 240 ist zwischen der Vorratskammer 230 einerseits und der Abfallkammer 250 sowie der Sammelkammer 270 andererseits angeordnet. Die Lysepuffer-Vorratskammer 260 ist mittels einer Fluidverbindung mit der
Vorratskammer 230 verbunden.
Somit zeigt Fig. 3 eine Topologie der Vorrichtung 200 zur Durchführung einer thermischen Behandlung im Durchflussmodus. Dabei wird die Probe aus der Probenkammer 210 durch den temperierbaren Mikrokanal 315 in die
Vorratskammer 230 gepumpt, in der sich der erste Puffer befindet. Der temperierbare Mikrokanal 315 ist durch den Heizer 220 beheizbar und bei Bedarf durch den Kühler 320 kühlbar, z. B. einen Peltier-Kühler. Mittels des Kühlers 320 als zweitem thermisch aktivem Element ist die erwärmte Probe vor einem
Mischen mit dem ersten Puffer auf ein definiertes Temperaturniveau, z. B.
Raumtemperatur, temperierbar. Dies hat den Vorteil, dass eine Dauer der thermischen Vorbehandlung besonders genau eingestellt werden kann und somit eine Gelierung der Probe besonders sicher vermieden werden kann. Auf einen Betrieb der Vorrichtung 200 wird weiter unten detaillierter eingegangen. Fig. 4 zeigt eine Vorrichtung 200 zum Aufbereiten einer Zielzellen und
Begleitzellen enthaltenden Probe biologischen Materials zum Extrahieren von Nukleinsäuren der Zielzellen gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung. Die Vorrichtung 200 ist der Vorrichtung aus Fig. 3 ähnlich, wobei in Fig. 4 die Vorrichtung 200 in einer Ausführung als Mehrschichtaufbau in einer
Schnittansicht dargestellt ist, wobei die Kammern der Vorrichtung 200 in der Darstellung weggelassen sind. Gezeigt sind von der Vorrichtung 200 hierbei der Heizer 220, der Filter 240, der Mikrokanal 315, ein weiterer Mikrokanal 415, eine erste strukturierte Polymerschicht 481 , eine Polymerfolie 482, eine zweite strukturierte Polymerschicht 483 und eine polymere Deckelfolie 484.
Die strukturierten Polymerschichten 481 und 483 sind beispielsweise aus thermoplastischen Polymeren, z. B. PP, PC, PE, PS, COP, COC etc., ausgeformt. Die Polymerfolie 482 ist beispielsweise aus thermoplastischen Polymeren, thermoplastischen Elastomeren, Elastomeren oder dergleichen ausgeformt. Die Deckelfolie 484 weist beispielsweise eine thermoplastische Folie, Klebefolie oder dergleichen auf.
Der weitere Mikrokanal 415 erstreckt sich zwischen dem temperierbaren
Mikrokanal 315 und dem Filter 240. Die erste strukturierte Polymerschicht 481 , die Polymerfolie 482, die zweite strukturierte Polymerschicht 483 und die polymere Deckelfolie 484 repräsentieren den Mehrschichtaufbau der Vorrichtung 200 gemäß dem in Fig. 4 dargestellten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung. Eine solche Ausführung hat den Vorteil, dass sie kostengünstig herstellbar ist und mittels der Polymerfolie 482 auch aktive Elemente wie Ventile realisiert werden können. Weiterhin ist ein Vorteil dieses Ausführungsbeispiels der vorliegenden Erfindung, dass der temperierbare Mikrokanal 315 lediglich durch die dünne Deckelfolie 484 vom Heizer 220 getrennt ist. Dadurch kann eine Temperatur in dem temperierbaren Mikrokanal 315 besonders genau eingestellt werden. Auf einen Betrieb der Vorrichtung 200 wird weiter unten detaillierter eingegangen.
Fig. 5 zeigt eine Vorrichtung 200 zum Aufbereiten einer Zielzellen und
Begleitzellen enthaltenden Probe biologischen Materials zum Extrahieren von Nukleinsäuren der Zielzellen gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden
Erfindung. Die Vorrichtung 200 ist der Vorrichtung aus Fig. 4 ähnlich. Gezeigt sind von der Vorrichtung 200 hierbei der Heizer 220, der Filter 240, der
Mikrokanal 315, die erste strukturierte Polymerschicht 481 , die polymere
Deckelfolie 484, ein weiterer Heizer 520, eine beheizbare Amplifikationskammer 570 und beispielhaft zwei Drehventile 590.
Dabei repräsentieren die erste strukturierte Polymerschicht 481 und die polymere Deckelfolie 484 den Mehrschichtaufbau der Vorrichtung 200 gemäß dem in Fig. 5 dargestellten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung. Ein erstes der Drehventile 590 ist zwischen dem Mikrokanal 315 und dem Filter 240 angeordnet und ausgebildet, um eine Fluidverbindung zwischen denselben freizugeben oder zu blockieren. Ein zweites der Drehventile 590 ist zwischen dem Filter 240 und der Amplifikationskammer 570 angeordnet und ausgebildet, um eine
Fluidverbindung zwischen denselben freizugeben oder zu blockieren. Der weitere Heizer 520 ist benachbart zu der Amplifikationskammer 570 angeordnet und mit derselben thermisch gekoppelt. Somit ist der Filter 240 zwischen den beiden
Drehventilen 590 angeordnet.
Somit ist in Fig. 5 eine Ausführung der Vorrichtung 200 als Mehrschichtaufbau mit lediglich zwei Schichten gezeigt. Eine solche Ausführung hat den Vorteil, dass die Vorrichtung 200 besonders kostengünstig herstellbar ist. Eine
Steuerung der Flüssigkeiten erfolgt hier mittels der Drehventile 590. Weiterhin weist eine solche Ausführung die zusätzliche, mittels des weiteren Heizers 520 beheizbare Amplifikationskammer 570 auf, in der nach einer Aufreinigung der Zielzellen-Nukleinsäuren eine Amplifikation derselben mittels PCR durchgeführt werden kann.
Im Folgenden wird unter Bezugnahme auf die Figuren 1 bis 5 ein Konzept zur thermischen Vorbehandlung einer Probe unter Verwendung des Verfahrens 100 sowie der Vorrichtung 200 gemäß Ausführungsbeispielen der vorliegenden Erfindung dargelegt.
Im Schritt 1 10 des Akkumulierens wird gemäß einem Ausführungsbeispiel in einem ersten Teilschritt die eigentliche thermischen Vorbehandlung der Probe durchgeführt. Dabei erfolgt ein Erhitzen der Probe beispielsweise auf eine Temperatur bzw. Lysetemperatur zwischen 60 und 90 Grad Celsius,
insbesondere zwischen 65 und 85 Grad Celsius. Die Temperatur ist dabei so abgestimmt, dass die in der Probe enthaltenen Begleitzellen, zum Beispiel Blutzellen wie Leukozyten, zerstört oder vorgeschädigt werden und die in den Begleitzellen enthaltenen Nukleinsäuren, also humane DNA, zumindest zum Teil freigesetzt werden, wobei die in der Probe enthaltenen Zielzellen, z. B.
Pathogene, intakt bleiben. Eine solche selektive Lyse der Begleitzellen ist möglich, da die Zielzellen als Pathogene eine robustere Zellwand besitzen und dadurch gegenüber thermischen Belastungen stabiler sind. Das Erhitzen der Probe kann z. B. stationär in einem der Probenkammer 210 oder im
Durchflussmodus in einer Kapillare, einem Schlauch oder einem Kanal wie dem Mikrokanal 315 erfolgen. Die in diesem Teilschritt entstehende Flüssigkeit wird als erstes Lysat bezeichnet.
Im Schritt 1 10 des Akkumulierens erfolgt dann in einem zweiten Teilschritt ein Mischen des ersten Lysats mit einem ersten Puffer, der Enzyme, z. B. Proteasen, DNAsen und Lysozym, enthält, aus der Vorratskammer 230. Dieser erste Puffer bewirkt einen Verdau bzw. eine Zerkleinerung der im ersten Teilschritt entstandenen bzw. freigesetzten beschädigten Zellen, Zelltrümmer, Proteine und Nukleinsäuren der Begleitzellen. Dieser Verdau ist essentiell für einen
nachfolgenden Teilschritt der Filtration, da eine Gelierung des ersten Lysats vermieden, die Viskosität des ersten Lysats herabgesetzt und somit ein
Verstopfen des Filters 240 verhindert wird. Auch ist in der Filtration eine
Abtrennung von noch intakten zellulären Bestandteilen des ersten Lysats einfacher möglich. Die in diesem Teilschritt entstehende Flüssigkeit wird als verdautes Lysat bezeichnet.
Im Schritt 1 10 des Akkumulierens erfolgt dann in einem dritten Teilschritt die Filtration, wobei das verdaute Lysat wird über den Filter 240, z. B. einen Steril-, Faser- oder Silikafilter, geleitet wird. Noch intakte zelluläre Bestandteile, insbesondere die Zielzellen, werden aufgrund ihrer Größe auf dem Filter 240 zurückgehalten und somit akkumuliert.
Gemäß einem Ausführungsbeispiel wird vor dem ersten Teilschritt des Schrittes 1 10 zum Akkumulieren die Probe mit einem wässrigen Puffer verdünnt, z. B. in einem Verhältnis zwischen 1 :1 und 1 :10. Dies hat den Vorteil, dass die Viskosität der Probe herabgesetzt wird und ein Gelieren während der thermischen
Behandlung noch zuverlässiger vermieden wird. Bei Bedarf kann die Verdünnung mit dem wässrigen Puffer auch nach dem ersten Teilschritt des Schrittes 1 10 zum Akkumulieren erfolgen. Dies hat den Vorteil, durch den hierdurch
ausgelösten osmotischen Schock auch Begleitzellen, die in dem ersten Teilschritt nur vorgeschädigt wurden, effektiv lysiert werden.
Gemäß einem Ausführungsbeispiel werden in dem zweiten Teilschritt des Schrittes 1 10 zum Akkumulieren weitere Komponenten hinzugegeben, z. B. Detergenzien, wie z. B. Saponine, SDS oder dergleichen, chaotrope Salze oder basische Komponenten, wie z. B. NaOH. Dies hat den Vorteil, dass auch
Begleitzellen, die in dem ersten Teilschritt des Schrittes 1 10 zum Akkumulieren nur vorgeschädigt wurden, effizient lysiert werden und deren Nukleinsäuren freigesetzt werden.
Gemäß einem Ausführungsbeispiel wird der erste Teilschritt des Schrittes 1 10 zum Akkumulieren nach dem zweiten Teilschritt des Schrittes 1 10 zum
Akkumulieren ausgeführt. Dadurch wird bereits während der thermischen Vorbehandlung ein Gelieren der Probe zuverlässig vermieden. In diesem Fall werden temperaturbeständige Enzyme im ersten Puffer verwendet.
Gemäß einem Ausführungsbeispiel werden die Zielzellen, anstatt dieselben im Schritt 120 des Aufschließens auf dem Filter 240 zu lysieren, vor dem
Vermischen mit dem Lysepuffer vom Filter 240 heruntergespült, z. B. indem ein Puffer, z. B. ein wässriger Puffer, in Gegenrichtung über den Filter 240 gespült wird.
Gemäß einem Ausführungsbeispiel wird der Filter 240, falls die Zielzellen im Schritt 120 des Aufschließens auf dem Filter 240 lysiert werden,
vorteilhafterweise auch direkt im Schritt 130 des Aufreinigens genutzt. Dies hat den Vorteil, dass ein Filter eingespart wird. Um dies zu realisieren, kann der Lysepuffer so eingestellt sein, dass im Schritt 120 des Aufschließens freigesetzte Zielzellen-Nukleinsäuren direkt an den Filter 240 binden. Alternativ kann im Anschluss an den Schritt 120 des Aufschließens ein Bindepuffer auf den Filter 240 gegeben werden, ohne den Lysepuffer vom Filter 240 zu verdrängen. Das Mischen von Lysepuffer und Bindepuffer im Filter 240 erfolgt dann diffusiv. Gemäß einem Ausführungsbeispiel wird während des Schrittes 120 des
Aufschließens das verdaute Lysat auch erhitzt oder mit Ultraschall beaufschlagt. Eine thermische Belastung bzw. durch den Ultraschall hervorgerufene
Druckwellen und Kavitation führen dazu, dass die Zellwände der Zielzellen besonders sicher und schnell zerstört werden.
Ein möglicher weiterer Ablauf zum Aufbereiten der Zielzellen und Begleitzellen enthaltenden Probe biologischen Materials zum Extrahieren der Nukleinsäuren der Zielzellen wird im Folgenden beschrieben.
Im Schritt 120 des Aufschließens werden die Zielzellen lysiert. Dabei entsteht ein zweites Lysat. Die Lyse bzw. der Aufschluss erfolgt durch Zugabe des
Lysepuffers aus der Lysepuffer-Vorratskammer 260 auf den Filter 240. Dieser Lysepuffer kann z. B. Enzyme enthalten, z. B. Proteinase K, Proteasen und Lysozym. Diese Enzyme bewirken eine Zerstörung der Zellwand der Zielzellen und somit eine Freisetzung der Zielzellen-Nukleinsäuren. Die Zellwand der Zielzellen kann auch auf andere Art und Weise zerstört werden, z. B. durch Zugabe von chemischen Reagenzien, z. B. chaotropen Salzen, Detergenzien wie z. B. Saponinen, SDS oder dergleichen, ß-Mercaptoethanol oder basischen Komponenten wie z. B. NaOH.
Im Schritt 130 des Aufreinigens werden die Zielzellen-Nukleinsäuren aus dem zweiten Lysat heraus aufgereinigt, z. B. durch Adsorption an einer festen Phase.
Typischerweise schließt sich an den Schritt 130 des Aufreinigens eine Analyse der Zielzellen-Nukleinsäuren an. Ziel dieser Analyse kann es z. B. sein, ein Vorhandensein bestimmter Pathogene und Resistenzgene nachzuweisen.
Typischerweise werden hierzu zunächst die Zielzellen-Nukleinsäuren selektiv amplifiziert, z. B. mittels einer PCR. Bei der PCR wird durch Zugabe eines PCR- Mastermix und durch wiederholtes Anfahren verschiedener Temperaturniveaus eine exponentielle Verstärkung der Nukleinsäuremenge erreicht. Der PCR- Mastermix enthält typischerweise eine Pufferlösung, Nukleotide, Polymerase, Primer, Magnesiumchlorid sowie gegebenenfalls Bovine Serum Albumin (BSA). Danach erfolgt z. B. eine Detektion der amplifizierten Zielzellen-Nukleinsäuren mittels Hybridisierung auf einem Microarray. Vorteilhaft bei der Realisierung des Konzepts zum Aufbereiten in einem mikrofluidischen System unter Verwendung einer thermischen Vorbehandlung der Probe ist, dass das Verfahren 100 in einem mikrofluidischen System besonders definiert und reproduzierbar durchgeführt werden kann, da die Temperaturen, die Volumina und, bei Durchführung des Verfahrens im
Durchflussmodus, die Flussraten besonders genau eingestellt werden können. Ferner kann eine Gefahr einer Kontamination der Probe von außen bzw. der Umgebung durch die Probe minimiert werden, da das Verfahren 100 in der Vorrichtung 200 als einem abgeschlossenen System durchgeführt wird.
Fig. 6 zeigt eine Vorrichtung 200 zum Aufbereiten einer Zielzellen und
Begleitzellen enthaltenden Probe biologischen Materials zum Extrahieren von Nukleinsäuren der Zielzellen gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung. Dabei ist die Vorrichtung 200 als ein mikrofluidisches System oder ein Teil eines mikrofluidischen Systems ausgeführt. Die Vorrichtung 200 ist der
Vorrichtung aus einer der Figuren 2 bis 5 ähnlich. Gezeigt sind von der
Vorrichtung 200 hierbei der Filter 240 bzw. ein Sieb, der Mikrokanal 315 als Einlasskanal, der weitere Mikrokanal 415 als Verbindungskanal, ein erster Auslasskanal 615a, ein zweiter Auslasskanal 615b, ein zweiter Filter 620 und eine Ultraschallsonotrode 625.
Die Ultraschallsonotrode 625 ist benachbart zum Filter 240 angeordnet. Dabei ist die Ultraschallsonotrode 625 ausgebildet, um Ultraschallwellen in einen Bereich des Filters 240 einzukoppeln. Der Filter 240 ist zwischen dem Mikrokanal 315 bzw. Einlasskanal und dem weiteren Mikrokanal 415 bzw. Verbindungskanal angeordnet. Der Filter 240 ist ausgebildet, um durch die mittels der
Ultraschallsonotrode 625 eingekoppelten Ultraschallwellen ganz oder teilweise zu Fragmenten bzw. Partikeln zerkleinert zu werden. Der weitere Mikrokanal 415 erstreckt sich zwischen dem Filter 240 und dem zweiten Filter 620 bzw. Sieb. Von dem weiteren Mikrokanal 415 zweigt der erste Auslasskanal 615a ab. Der zweite Filter 620 ist zwischen dem weiteren Mikrokanal 415 und dem zweiten Auslasskanal 615b angeordnet.
Die Probe wird durch den Einlasskanal bzw. Mikrokanal 315 über den Filter 240 und den Verbindungskanal bzw. weiteren Mikrokanal 415 in den ersten
Auslasskanal 615a gespült. Dann wird Filter 240 mit Ultraschall beaufschlagt. Im Anschluss wird das Lysat über den weiteren Mikrokanal 415 und den zweiten Filter 620 in den zweiten Auslasskanal 615b gespült. Auf einen Betrieb der Vorrichtung 200 wird weiter unten detaillierter eingegangen. Fig. 7 zeigt eine Vorrichtung 200 zum Aufbereiten einer Zielzellen und
Begleitzellen enthaltenden Probe biologischen Materials zum Extrahieren von Nukleinsäuren der Zielzellen gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung. Die Vorrichtung 200 entspricht der Vorrichtung aus Fig. 6, wobei in Fig. 7 die Vorrichtung 200 in einer Ausführung als Mehrschichtaufbau in einer Schnittansicht ähnlich Fig. 4 dargestellt ist. Gezeigt sind von der Vorrichtung 200 hierbei der Filter 240, der Mikrokanal 315 als Einlasskanal, der weitere
Mikrokanal 415 als Verbindungskanal, die erste strukturierte Polymerplatte bzw. Polymerschicht 481 , die Polymermembran bzw. Polymerfolie 482, die zweite strukturierte Polymerplatte bzw. Polymerschicht 483, die Deckelfolie 484, der erste Auslasskanal 615a, der zweite Auslasskanal 615b, der zweite Filter 620 und die Ultraschallsonotrode 625.
Die erste strukturierte Polymerschicht 481 , die Polymerfolie 482, die zweite strukturierte Polymerschicht 483 und die Deckelfolie 484 repräsentieren den Mehrschichtaufbau der Vorrichtung 200 gemäß dem in Fig. 7 dargestellten
Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung. Eine solche Ausführung der Vorrichtung 200 hat den Vorteil, dass sie kostengünstig herstellbar ist. Der Mehrschichtaufbau kann z. B. durch Schweißen, z. B. Laserschweißen, Kleben oder Klemmen mittels Nieten verbunden werden. Die strukturierten
Polymerschichten 481 und 483 sind beispielsweise aus thermoplastischen
Polymeren, z. B. PP, PC, PE, PS, COP, COC etc., ausgeformt. Die
Polymermembran bzw. Polymerfolie 482 ist beispielsweise aus
thermoplastischen Polymeren, thermoplastischen Elastomeren, Elastomeren oder dergleichen ausgeformt. Die Deckelfolie 484 weist beispielsweise eine thermoplastische Folie, Klebefolie oder dergleichen auf.
Fig. 8 zeigt eine Vorrichtung 200 zum Aufbereiten einer Zielzellen und
Begleitzellen enthaltenden Probe biologischen Materials zum Extrahieren von Nukleinsäuren der Zielzellen gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung. Die Vorrichtung 200 entspricht der Vorrichtung aus Fig. 7 mit der
Ausnahme, dass der Einlasskanal bzw. Mikrokanal 315 im Bereich der Ultraschallsonotrode 625 zu der Lysekammer 230 erweitert ist und dass der Filter bzw. das Sieb 240 über einen kleineren Querschnitt angeströmt wird als der Vorfilter 620, wobei in einem Bereich vor dem zweiten Filter 620 bzw. Sieb eine längliche Kavität 840 ausgeformt ist, in der sich die Bestandteile des Filters 240 sammeln und einen gepackten sekundären Filter bilden können.
Der Einlasskanal bzw. Mikrokanal 315 ist im Bereich des Filters 240 zu der Lysekammer 230 erweitert, deren typisches Volumen zwischen 100 Mikroliter und 3 Milliliter und typischerweise bei 1 Milliliter liegt. Dies hat den Vorteil, dass in der Lysekammer 230 eine weiche Lyse mittels Ultraschall durchgeführt werden kann, ohne dass eine weitere Ultraschallsonotrode benötigt wird. Der zweite Filter 620 bzw. das Sieb wird über einen kleineren Querschnitt angeströmt als der Filter 240. Im Bereich vor dem zweiten Filter 620 bzw. Sieb ist die längliche Kavität 840 ausgebildet, in der sich die Bestandteile des Filters 240 sammeln und den gepackten sekundären Filter bilden können. Dies hat den Vorteil, dass zur
Elution der Zielzellen-Nukleinsäuren ein kleineres Volumen verwendet werden kann, so dass die Nukleinsäurenkonzentration im Eluat erhöht wird. Die längliche Kavität 840 ist gemäß dem in Fig. 8 dargestellten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung als ein Durchbruch durch die zweite strukturierte
Polymerschicht 483 ausgeführt.
Fig. 9 zeigt eine Vorrichtung 200 zum Aufbereiten einer Zielzellen und
Begleitzellen enthaltenden Probe biologischen Materials zum Extrahieren von Nukleinsäuren der Zielzellen gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung. Die Vorrichtung 200 entspricht der Vorrichtung aus Fig. 8 mit der
Ausnahme, dass die längliche Kavität 840 gemäß dem in Fig. 9 dargestellten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung als ein in der zweiten
strukturierten Polymerschicht 483 verlaufender Kanal ausgeführt ist. Im Folgenden wird unter Bezugnahme auf die Figuren 1 und 6 bis 9 ein Konzept zur Probenaufbereitung mit einem Filter unter Verwendung des Verfahrens 100 sowie der Vorrichtung 200 gemäß Ausführungsbeispielen der vorliegenden Erfindung dargelegt. Durch Ultraschalleinwirkung und Zerstörung des Verbunds des Filters 240 werden die darin gebundenen Zielzellen wieder in die flüssige Phase zurück überführt, wo eine Ultraschall-Lyse besonders effektiv ist. Dabei bleiben die Zielzellen zum Teil an Filterpartikel gebunden, was die Lyseeigenschaften aufgrund von Partikelkollisionen noch weiter verbessert.
Dadurch kann die Ultraschallintensität gegebenenfalls unter die
Kavitationsschwelle erniedrigt werden bzw. die Ultraschallfrequenz so
angehoben, z.B. auf ein Vielfaches, z.B. verdoppelt, werden, dass keine
Kavitation mehr auftritt, ohne die Lyseeigenschaften zu verlieren. Die reduzierte
Ultraschallintensität und weitgehende Kavitationsfreiheit hat den Vorteil einer geringeren Fragmentierung von freigesetzten Zielzellen-Nukleinsäuren. Die dabei freigesetzten Nukleinsäuren können unmittelbar in die Lösung übergehen. In dem Schritt 1 10 des Akkumulierens wird die Probe über den Filter 240 geleitet, bei dem es sich z. B. um einen Filter aus anorganischen Fasern oder Partikeln, z.B. aus Aluminiumoxid oder Silika, eine poröse Membran oder eine Membran mit definierten Löchern handelt. In der Probe enthaltene Zielzellen werden aufgrund ihrer Größe auf dem Filter 240 zurückgehalten. Die Probe wird z. B. mit einer Pumpe, z. B. einer peristaltischen oder einer Membranpumpe, oder mittels
Zentrifugation über den Filter 240 geleitet.
In dem Schritt 120 des Aufschließens bzw. Lysierens wird der Filter 240 mit Ultraschall beaufschlagt, beispielsweise mit einer Frequenz von 20 bis 50
Kilohertz. Die durch den Ultraschall erzeugten Druckwellen und Scherkräfte führen zum einen zur Zerstörung der Zellwände der Zielzellen und zum anderen zu einer ganzen oder teilweisen Zerstörung des Verbunds des Filters 240. Die Filterpartikel des Filters 240 unterstützen eine Lysewirkung. Beispielsweise wird ein Gewebefilter in einzelne Fäden zerlegt. Ein gepackter Silika-Filter wird dementsprechend in Silika-Partikel zerlegt. Die in dem Schritt 120 des
Aufschließens entstehende Flüssigkeit bzw. Suspension wird als Lysat bezeichnet. Vorteilhafterweise wird durch den Ultraschall Kavitation erzeugt. Dies hat den Vorteil, dass die auftretenden Druckwellen und Scherkräfte besonders hoch sind. Weiter ist es möglich, mit wenigen intensiven Ultraschallpulsen über Kavitationseffekte den Silikafilter als Filter 240 zunächst zu zerlegen und zumindest oberflächliche Silika-Partikel mit daran gebundenen Zielzellen als Suspension in die Lösung zurück zu überführen, wobei zunächst nur wenige Zielzellen lysiert werden brauchen. In einem nächsten Teilschritt des Schrittes 120 des Aufschließens wird mit Ultraschall niedrigerer Intensität unterhalb der Kavitationsschwelle die eigentliche Lyse durchgeführt, wobei die Silikapartikel aus dem Filtermaterial des Filters 240 unterstützend wirken. Solche Lysebedingungen haben sich als besonders günstig erwiesen für den Erhalt möglichst unfragmentierter Nukleinsäuren aus den lysierten Zielzellen.
Vorteilhafterweise ist der Filter 240 in diesem Schritt mit Flüssigkeit befüllt. Dies hat den Vorteil, dass die Ultraschallenergie besonders gut und definiert eingekoppelt wird.
In dem Schritt 130 des Aufreinigens wird eine Filtration durchgeführt, wobei das Lysat mit einem Bindepuffer, z. B. einem Ethanol enthaltenden Bindepuffer, vermischt und über den zweiten Filter 620 bzw. das Sieb geleitet wird. Die Bestandteile des Filters 240 werden auf dem zweiten Filter 620 zurückgehalten und packen sich vor dem zweiten Filter 620 zu einem sogenannten sekundären Filter. Durch die Zugabe des Bindepuffers sind die chemischen Bedingungen in diesem Schritt so eingestellt, dass bei der Lyse freigesetzte Zielzellen- Nukleinsäuren auf diesem sekundären Filter und gegebenenfalls dem zweiten Filter 620 bzw. Sieb adsorbiert werden, während sonstige Bestandteile, z. B.
Proteine und Zelltrümmer, ausgespült werden. Das mit Bindepuffer vermischte Lysat kann z. B. mit einer Pumpe, z. B. einer peristaltischen oder einer
Membranpumpe, oder mittels Zentrifugation über den zweiten Filter 620 bzw. das Sieb geleitet werden.
Ein möglicher weiterer Ablauf zum Aufbereiten der Zielzellen und Begleitzellen enthaltenden Probe biologischen Materials zum Extrahieren der Nukleinsäuren der Zielzellen wird im Folgenden beschrieben. Die auf dem sekundären Filter und dem zweiten Filter 620 adsorbierten Nukleinsäuren werden gewaschen und eluiert. Dies hat den Vorteil, dass Reinheit und Konzentration der Nukleinsäuren gesteigert werden. An den Schritt 130 des Aufreinigens der Zielzellen- Nukleinsäuren kann sich eine Amplifikation und/oder Detektion anschließen, z. B. mittels Sequenzierung, Polymerase-Kettenreaktion (PCR), Real-Time-PCR und/oder Hybridisierung auf einem Microarray.
Gemäß einem Ausführungsbeispiel wird vor dem Schritt 1 10 des Akkumulierens in dem Schritt 105 eine sogenannte weiche Lyse durchgeführt. Als weiche Lyse wird ein Schritt bezeichnet, bei dem in der Probe enthaltene Begleitzellen, insbesondere Blutzellen bei Vorliegen einer Blutprobe, selektiv lysiert werden, während die Zielzellen intakt bleiben. Dies hat den Vorteil, dass die Begleitzellen-
Nukleinsäuren bereits in diesem Schritt freigesetzt und nicht mit akkumuliert werden. Die weiche Lyse kann z. B. durch eine milde enzymatische oder chemische Lyse erreicht werden. Hierfür werden der Probe z. B. Reagenzien beigemischt, z. B. Enzyme, z. B. Proteasen, Lysozym und DNAsen, basische Komponenten, z. B. NaOH, Detergenzien, z. B. SDS, oder chaotrope Salze. Insbesondere hat die Zugabe von DNAsen den Vorteil, dass die in diesem ersten, weichen Lysesch ritt freigesetzten Nukleinsäuren verdaut und somit besonders effektiv entfernt werden. Alternativ oder ergänzend kann die weiche Lyse und der Verdau der im weichen Lyseschritt freigesetzten Nukleinsäuren auch durch Beschallen der Probe mit Ultraschall verringerter Energie erreicht werden. Dies hat den Vorteil, dass keine oder weniger an zusätzlichen
Reagenzien hinzugefügt werden müssen.
Gemäß einem Ausführungsbeispiel wird der Probe vor dem Schritt 1 10 des Akkumulierens Wasser oder ein wässriger Puffer hinzugefügt. Dies hat den Vorteil, dass die Probe verdünnt wird und deshalb leichter, d. h. mit niedrigerem Druck, über den Vorfilter 620 geleitet werden kann und ein Verstopfen des Vorfilters 620 vermieden wird.
Gemäß einem Ausführungsbeispiel wird der Filter 240 nach dem Schritt 1 10 des Akkumulierens gewaschen, z. B. indem Wasser oder ein wässriger Puffer über den Filter 240 geleitet wird. Dies hat den Vorteil, dass sonstige Bestandteile der Probe, z. B. Proteine, ausgespült werden und die Zielzellen in größerer Reinheit vorliegen.
Gemäß einem Ausführungsbeispiel wird auf das Hinzufügen eines Bindepuffers in dem Schritt 130 des Aufreinigens verzichtet. In diesem Fall wird das in dem Schritt 130 des Aufreinigens entstehende Filtrat, das in diesem Fall die
Zielzellen-Nukleinsäuren enthält, weiterprozessiert. Dies hat den Vorteil, dass für die weitere Prozessierung beliebige andere Verfahren verwendet werden können.
Gemäß einem Ausführungsbeispiel wird in dem Schritt 130 des Aufreinigens vor Hinzufügen des Bindepuffers noch ein Puffer hinzugefügt, der Proteinase K enthält. Dies hat den Vorteil, dass Zelltrümmer zerkleinert werden und deshalb besonders gut ausgespült werden können. Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel wird auf den zweiten Filter 620 verzichtet. Es hat sich gezeigt, dass die Ultraschallparameter so abgestimmt werden können bzw. die Ultraschallenergie so gering gehalten werden kann, dass der Filter 240 durch die Beschallung nicht vollständig, sondern nur oberflächlich in seine Bestandteile zerlegt bzw. zerkleinert wird. Der beschallte Filter 240 kann somit weiter als Filter genutzt werden. Die durch die Beschallung entstandenen Partikel werden in darauffolgenden Prozessschritten durch die noch intakten Teilbereiche des Filters 240 aufgefangen und zurückgehalten.
Die beschriebenen und in den Figuren gezeigten Ausführungsbeispiele sind nur beispielhaft gewählt. Unterschiedliche Ausführungsbeispiele können vollständig oder in Bezug auf einzelne Merkmale miteinander kombiniert werden. Auch kann ein Ausführungsbeispiel durch Merkmale eines weiteren Ausführungsbeispiels ergänzt werden. Ferner können Verfahrensschritte wiederholt sowie in einer anderen als in der beschriebenen Reihenfolge ausgeführt werden.

Claims

Ansprüche
1 . Verfahren (100) zum Aufbereiten einer Zielzellen und Begleitzellen
enthaltenden Probe biologischen Materials zum Extrahieren von
Nukleinsäuren der Zielzellen, wobei das Verfahren (100) folgende Schritte aufweist:
Akkumulieren (1 10) der Zielzellen der Probe durch Abtrennen der Zielzellen oder der Begleitzellen aus der Probe;
Aufschließen (120) der Zielzellen durch chemische und/oder physikalische Lyse, um ein die Nukleinsäuren der Zielzellen enthaltendes Zielzellen-Lysat zu erzeugen; und
Aufreinigen (130) der Nukleinsäuren aus dem Zielzellen-Lysat, um die Nukleinsäuren der Zielzellen zu extrahieren.
2. Verfahren (100) gemäß Anspruch 1 , bei dem der Schritt (1 10) des
Akkumulierens einen Teilschritt des Abtrennens der Zielzellen von der Probe mittels eines Akkumulationsfilters (240; 620) aufweist.
3. Verfahren (100) gemäß Anspruch 2, bei dem der Schritt (1 10) des
Akkumulierens einen Teilschritt des Reinigens des Akkumulationsfilters (240; 620) nach dem Teilschritt des Abtrennens der Zielzellen aufweist.
4. Verfahren (100) gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, bei dem der Schritt (1 10) des Akkumulierens einen Teilschritt des Temperierens der Probe auf eine Lysetemperatur zum Aufschließen und Vorschädigen der Begleitzellen und einen Teilschritt des Lysierens der Begleitzellen durch chemische Lyse und des enzymatischen Verdaus der aus den Begleitzellen freigesetzten Nukleinsäuren aufweist
5. Verfahren (100) gemäß Anspruch 4, bei dem der Teilschritt des Lysierens und Verdaus vor, während oder nach dem Teilschritt des Temperierens ausgeführt wird, wobei im Teilschritt des Lysierens und Verdaus eine Viskosität der Probe gesenkt wird.
6. Verfahren (100) gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, bei dem im Schritt (120) des Aufschließens die Zielzellen mittels Ultraschalleinkopplung aufgeschlossen werden.
7. Verfahren (100) gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, bei dem im
Schritt (120) des Aufschließens die Zielzellen auf einem Filter (240) aufgeschlossen werden und der Filter (240) dabei ganz oder teilweise in seine Bestandteile zerlegt wird.
8. Verfahren (100) gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, mit einem
Schritt (105) des Voraufschließens der Begleitzellen mittels eines
Lysepuffers und/oder Ultraschalleinkopplung vor dem Schritt (1 10) des Akkumulierens.
9. Verfahren (100) gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, bei dem der Schritt (1 10) des Akkumulierens einen Teilschritt des Verdünnens der Probe aufweist.
10. Vorrichtung (200) zum Aufbereiten einer Zielzellen und Begleitzellen
enthaltenden Probe biologischen Materials zum Extrahieren von
Nukleinsäuren der Zielzellen, wobei die Vorrichtung (200) folgende
Merkmale aufweist: eine Einrichtung (210, 220, 230, 240; 315, 320; 620) zum Akkumulieren der Zielzellen der Probe durch Abtrennen der Zielzellen oder der Begleitzellen aus der Probe; eine Einrichtung (240, 260; 620, 625) zum Aufschließen der Zielzellen durch chemische und/oder physikalische Lyse, um ein die Nukleinsäuren der Zielzellen enthaltendes Zielzellen-Lysat zu erzeugen; und eine Einrichtung (240, 250, 270; 520, 570) zum Aufreinigen der
Nukleinsäuren aus dem Zielzellen-Lysat, um die Nukleinsäuren der
Zielzellen zu extrahieren.
1 1 . Vorrichtung (200) gemäß Anspruch 10, bei der die Einrichtung (210, 220,
230, 240; 315, 320; 620) zum Akkumulieren einen Akkumulationsfilter (240; ) zum Abtrennen der Zielzellen von der Probe aufweist.
12. Vorrichtung (200) gemäß einem der Ansprüche 10 bis 1 1 , bei der die
Einrichtung (210, 220, 230, 240; 315, 320; 620) zum Akkumulieren
Temperiermittel (220; 315) zum Temperieren der Probe auf eine
Lysetemperatur zum Aufschließen oder Vorschädigen der Begleitzellen aufweist.
13. Vorrichtung (200) gemäß Anspruch 1 1 , bei der die Temperiermittel (220;
315) mit einer Probenkammer (210) oder einem zwischen einer
Probenkammer (210) und einer Aufschlusskammer (230) angeordneten Probenkanal (315) thermisch gekoppelt sind.
14. Vorrichtung (200) gemäß einem der Ansprüche 10 oder 1 1 , bei der die
Einrichtung (240, 260; 620, 625) zum Aufschließen eine
Ultraschalleinkopplungseinrichtung (625) aufweist, die benachbart zu der Einrichtung zum Akkumulieren (620) angeordnet ist.
15. Vorrichtung (200) gemäß Anspruch 1 1 , bei der der Akkumulationsfilter (620) ausgebildet ist, um durch Ultraschalleinkopplung zum Aufschließen der Zielzellen ganz oder teilweise in seine Bestandteile zerlegt zu werden.
16. Vorrichtung (200) gemäß Anspruch 15, bei der die Einrichtung zum
Aufreinigen (240, 250, 270; 520, 570) einen weiteren Filter (620) aufweist, der dem Akkumulationsfilter (240) nachgelagert angeordnet ist, wobei der weitere Filter (620) ausgebildet ist, um die Fragmente oder Partikeln des Akkumulationsfilters (620) von den Zielzellen bzw. deren Lyseprodukten abzutrennen.
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