CN105473716A - 用于处理包含靶细胞和伴随细胞的生物材料样品以提取靶细胞的核酸的方法和装置 - Google Patents

用于处理包含靶细胞和伴随细胞的生物材料样品以提取靶细胞的核酸的方法和装置 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于处理包含靶细胞和伴随细胞的生物材料样品以提取靶细胞的核酸的方法(100)。该方法(100)包括通过从样品中分离出靶细胞或伴随细胞来积聚样品的靶细胞的步骤(110)。该方法(100)也包括通过化学和/或物理裂解来消化靶细胞以制备包含靶细胞的核酸的靶细胞裂解产物的步骤(120)。该方法(100)还包含由靶细胞的裂解产物提纯核酸以提取靶细胞的核酸的步骤(130)。

Description

用于处理包含靶细胞和伴随细胞的生物材料样品以提取靶细胞的核酸的方法和装置
背景技术
本发明涉及用于处理包含靶细胞和伴随细胞的生物材料样品以提取靶细胞的核酸的方法和用于处理包含靶细胞和伴随细胞的生物材料样品以提取靶细胞的核酸的装置。本发明尤其涉及例如用于所谓的芯片实验室或口袋实验室(Lab-On-A-Chip)的微流体体系。
在分子诊断中，经常需要检测样品中的病原体DNA或RNA。将由病原体，例如病毒或微生物，例如细菌或真菌获得的DNA或RNA称为病原体DNA或RNA。将样品尤其理解为是指血液样品，但原则上也可以是指其它液体或液化的患者样品，例如，尿、粪便、痰、脑脊液、灌洗液（Lavage）、冲洗过的抹片或液化的组织样品，特别是当它们包含血液或血液痕迹时。与此相关的病征例如是尿路感染和败血症。在疑似尿路感染的情况中应从尿中检测病原体。在这种情况下，病原体的浓度可能非常小，例如103 至107每毫升。在疑似败血症的情况中，例如令人感兴趣的是，由血液检测病原体以及任选测定对某些抗生素的耐受性。由于病原体和白血球之间的浓度比，例如10-1000/ml对106-107/ml，在这种情况中，在样品中有很强的人DNA背景。商购可得的例如由血液中选择性提纯病原体的方法使用例如化学试剂，以首先选择性裂解人细胞。随后，酶促消化人核酸。然后例如通过离心分离和滗析上清液分离病原体。这种方法例如公开在DE102005009479A1中。
US 2010/0285578 A1公开了由生物样品制备核酸的装置和方法。
发明内容
在此背景下，根据独立权利要求提供用于处理包含靶细胞和伴随细胞的生物材料样品以提取靶细胞的核酸的改进的方法和用于处理包含靶细胞和伴随细胞的生物材料样品以提取靶细胞的核酸的改进的装置。由各自的从属权利要求和下文中的描述得到有利的实施方案。
根据本发明的实施方式可以实现尤其用于由也包含非病原体核酸的样品例如由血液细胞选择性制备病原体核酸的生物样品的处理，和/或实现由样品积聚病原体并随后将其裂解。本发明的实施方式在这种情况下包括例如用于热预处理样品的方案和/或借助过滤器以及超声波用于样品处理的方案。因此，选择性裂解伴随细胞的热预处理与酶促消化和借助过滤分离的组合尤其具有这样的目的，即由也包含伴随细胞的样品获得提纯的靶细胞-核酸。例如也提供借助超声波在过滤器上进行生物颗粒的裂解，由此可通过超声波破坏过滤器的复合材料，以及微流体体系。
具体地，本发明的实施方式可有利地用于在分子诊断中例如用于诊断感染性疾病的体系或实验室例行程序中，或者用于分子诊断中的微流体芯片实验室体系。
本发明的实施方式可以有利地将含于样品中的靶细胞-核酸，例如病原体DNA，从伴随细胞-核酸，例如人DNA的背景中可靠地分离出来。由此避免伴随细胞核酸干扰随后的扩增-和检测步骤，并因此改善了检测和/或诊断的敏感性。在热预处理样品时可通过尤其是酶促消化可靠地避免例如在温度过高和/或预处理持续时间过长时会出现的样品胶凝化。在此，样品的胶凝也可以考虑与胶凝相关的临界温度和持续时间取决于样品的性质例如红细胞比容来避免。通过例如酶促消化可以避免样品堵塞过滤器。由此甚至可以处理大的样品量。在此情况下，过滤能由相对大的血液体积，例如1-10毫升，积聚仅少量的病原体，例如10-1000个。由此，可以提高靶细胞-核酸的有效浓度并使随后的扩增和检测变得容易或者可提高灵敏度。本发明的实施方式特别好地适用于自动化，特别是在微流体体系中。在这种情况下可容易地施行并且减少污染的风险。
因此，本发明的实施方式能够实现由样品积聚靶细胞并由此提高后续的扩增-和/或检测步骤的效率。在此也可以以有利的方式尤其利用超声波来裂解积聚在过滤器上的靶细胞，由此可导致特别有效的分解。与例如离心分离相反，借助过滤器积聚靶细胞特别好地适合于自动化进行，例如在微流体体系中。这样的自动化进行的优点在于，需要较少的手动操作步骤并减少了污染和/或操作者失误的风险。在将本发明的实施方式转移到微流体体系中时，可在积聚过程中非常精确地控制流速。由此可避免堵塞过滤器或者无意地将靶细胞通过过滤器冲走。
处理包含靶细胞和伴随细胞的生物材料样品以提取靶细胞的核酸的方法具有下列步骤：
通过从样品中分离靶细胞或伴随细胞来积聚样品的靶细胞；
通过化学和/或物理裂解来分解靶细胞，以制备含有靶细胞-核酸的靶细胞裂解液；和
由靶细胞-裂解液提纯核酸，以提取靶细胞的核酸。
所述靶细胞可包括具有DNA和/或RNA作为核酸的病原体细胞或病原体，例如病毒或微生物，例如细菌或真菌。为简便起见，在下文中经常称为核酸，在此用其指称DNA和/或RNA。所述伴随细胞可包括人细胞，例如血液细胞等。可将待分析的液体称为样品，通常为液体的或液化的患者样品，例如血液、尿、粪便、痰、脑脊液、灌洗液、冲洗过的抹片或液化的组织样品。在提纯步骤中可提纯含于靶细胞-裂解液中的核酸并供入随后的分析中，通过其可验证某种病原体或基因，例如抗性基因的存在。所述随后的分析例如可通过测序、聚合酶链反应（PCR，聚合酶链式反应），实时PCR和/或在微阵列上的检测或杂交进行。
由样品提纯靶细胞-核酸可在分解或裂解靶细胞之后通过随后将靶细胞-核酸吸附在固相例如二氧化硅（Silika）过滤器或微粒或所谓的微珠上来进行。 除了用于裂解的化学和酶促方法外，还存在机械方法，例如借助超声波或微球或微珠。提纯的目的是给随后的扩增和/或检测提供浓缩形式的靶细胞-核酸。在分离靶细胞-核酸与细胞碎片和蛋白质时也可以有利地使用本发明的实施方式。但是，尤其是人血样品会额外包含大量的带有人DNA的伴随细胞。分离靶细胞和伴随细胞的一种可能性可能在于，首先选择性分解或裂解含于样品中的伴随细胞，例如血细胞并与靶细胞分离。然后，可将靶细胞裂解并可提纯靶细胞-核酸。可能靶细胞仅以很低的浓度存在于样品中。为在提纯前浓缩靶细胞，也可以例如离心分离样品或者经由过滤器冲洗样品。甚至在包含许多伴随细胞的样品的情况中，本发明的实施方式也可以将靶细胞-核酸与样品中存在的伴随细胞-核酸背景分离。否则，伴随细胞-核酸将干扰随后的靶细胞-核酸的扩增和分析，并且可能会使检测靶细胞的存在变得困难至不可能。因此，可防止伴随细胞-核酸在随后的扩增和分析中导致形成不希望的副产物并降低灵敏度。
根据一种实施方式，积聚步骤可具有借助积聚过滤器将靶细胞与样品分离的子步骤。在该分离子步骤中，可借助积聚过滤器截留靶细胞。这样的实施方式提供了能实现有效而可靠地选择靶细胞的优点。
在此，该积聚步骤可具有在分离靶细胞的子步骤之后的净化积聚过滤器的子步骤。为此例如可通过引导水或水性缓冲液通过该积聚过滤器来洗涤积聚过滤器。这样的实施方式提供了这样的优点，即样品中的其它成分，例如蛋白质被冲洗掉，而靶细胞以较大纯度存在。
该积聚步骤也可具有将样品温度调节到用于分解伴随细胞的裂解温度的子步骤和通过化学或酶促裂解来裂解伴随细胞并酶促消化由伴随细胞释放的核酸的子步骤。在此，调节温度的子步骤和裂解并消化的子步骤可在分离子步骤之前进行。也可适当选择裂解温度，以使含于样品中的伴随细胞被破坏或预先破坏，由此完整保留含于样品中的靶细胞。这样的实施方式提供了能实现特别有效而可靠地选择靶细胞的优点。在此，由于不同的细胞壁状况可有针对性地使用热处理。由于裂解，可防止过滤时的堵塞。
在此，裂解和消化子步骤可在调温子步骤之前、之中或之后进行。由此，可在裂解子步骤中降低样品的粘度。在这种情况中，尤其可在裂解和消化子步骤中使用耐温的酶。这样的实施方式提供了这样的优点，即由此在热预处理期间已经可以可靠地避免样品胶凝。
此外，在分解步骤中可借助超声波耦合分解靶细胞。这样的实施方式提供了这样的优点，即由于超声波引起的压力波和空化导致靶细胞的细胞壁特别可靠而快速地被破坏。
在分解步骤中可在过滤器上分解靶细胞，且过滤器的复合材料（Verbund）在此可完全或部分地被破坏或者该过滤器被完全或部分地拆分成其组成部分/成分。所述过滤器可以是已提及的积聚过滤器。
也可以提供借助裂解缓冲液预分解伴随细胞的步骤，且在积聚步骤之前额外或替代地提供超声波耦合。在此这种情况下，在预分解步骤中可导致样品的软裂解，其中选择性裂解含于样品中的伴随细胞，而靶细胞完全保留。这样的实施方式提供了这样的优点，即伴随细胞-核酸在这步中已经被释放而不会被一起积聚。 该预分解步骤中的软裂解例如可以通过温和的酶促或化学裂解来实现。或者，该软裂解也可以通过用低能超声波振荡样品来实现。这具有不必或很少添加另外的试剂的优点。通过用超声波振荡样品也粉碎了由伴随细胞中释放出来的核酸，由此改善了样品的可加工性。因此，可用较低的压力引导样品通过积聚过滤器并能避免积聚过滤器的堵塞。
此外，该积聚步骤可具有稀释样品的子步骤。在此，可用水、水性缓冲液和/或油，例如硅油稀释样品。这样的实施方式具有降低样品粘度，由此改善样品的可加工性的优点。因此，可用较低的压力引导样品通过积聚过滤器并能避免积聚过滤器的堵塞。如果该积聚步骤具有调节样品温度的子步骤，则该稀释子步骤可在调温子步骤之前或之后进行。以此方式，一方面还能可靠地避免热处理期间的胶凝或者另一方面也可通过渗透休克有效地进一步裂解热处理期间被预先破坏的伴随细胞。
用于处理包含靶细胞和伴随细胞的生物材料样品以提取靶细胞的核酸的装置具有下列特征：
用于通过从样品中分离靶细胞或伴随细胞来积聚样品的靶细胞的装置；
用于通过化学和/或物理裂解分解靶细胞以制备包含靶细胞的核酸的靶细胞-裂解液的装置；和
用于由靶细胞-裂解液提纯核酸，以提取靶细胞的核酸的装置。
上述处理装置可有利地结合本发明的处理实施方式来使用，以处理包含靶细胞和伴随细胞的生物材料样品，以能够提取出靶细胞的核酸。设计该装置以在合适的装置中或转移到合适的装置中进行该处理方法的步骤。作为本发明的基础的目的也可通过本发明以装置形式的实施方案快速有效地达成。该装置可构成为微流体体系，特别是用于所谓的芯片实验室或口袋实验室或Lab-On-A-Chip。
根据一种实施方式，该用于积聚的装置具有用于将靶细胞与样品分离的积聚过滤器。这样的实施方式提供了这样的优点，即实现靶细胞的有效而可靠的选择。
该用于积聚的装置的积聚过滤器尤其也可为用于分解的装置和额外或替代地用于提纯的装置使用。这样的实施方式提供了这样的优点，即在积聚过滤器上裂解靶细胞且该积聚过滤器也用于DNA提纯时节省了过滤器。为了实现这一方案，可如此调节用于分解的裂解缓冲液，以至于在分解时释放的靶细胞-核酸直接结合在积聚过滤器上。或者，可在分解后在不将裂解缓冲液排挤出积聚过滤器的情况下给积聚过滤器上提供结合缓冲液。在此情况下，积聚过滤器中的裂解缓冲液和结合缓冲液的混合物可以进行扩散。或者，可沿着与最初的流向相反的方向供入结合缓冲液通过该过滤器并使其与裂解缓冲液混合。
该用于积聚的装置也可以具有用于将样品温度调节至裂解温度以分解或预先破坏伴随细胞的调温装置（Temperiermittel）。此外，该用于积聚的装置可具有用于通过化学裂解来裂解伴随细胞的缓冲溶液的储藏室。在此，该调温装置可具有加热装置或加热装置以及冷却装置。也可构成该调温装置以加热和/或冷却。这样的实施方式提供了这样的优点，即实现对靶细胞的特别有效而可靠的选择。在此情况下，由于不同的细胞壁状况，可以有针对性地使用热处理。由于裂解，可避免过滤时的堵塞。特别是可以通过该调温装置精确设定裂解温度。如果该调温装置也具有冷却装置，则可使样品在裂解前到达给定的第二温度水平，例如室温，由此可特别精确地设定热预处理的持续时间并且也能特别可靠地避免样品胶凝。
在此，该调温装置可以与样品室或者布置在样品室和分解室之间的样品通道热耦合。这样的实施方式提供了这样的优点，即样品的热处理可以取决于应用以静止的方式或以流通原则来进行。
根据一种实施方式，该用于分解的装置可以具有超声波耦合装置，其与用于积聚的装置相邻布置。该超声波耦合装置在此可具有超声波振荡单元。这样的实施方式提供了这样的优点，即由超声波引起的压力波和空化导致特别可靠和快速地破坏靶细胞的细胞壁。
尤其可以形成积聚过滤器，以通过超声波耦合完全或部分地破坏成碎片或颗粒或者拆分成其组成部分/成分。这例如可以以所谓的分解步骤来进行。在此，该积聚过滤器尤其可以具有由无机纤维或颗粒例如由氧化铝或二氧化硅制成的过滤器、多孔膜或具有给定孔的薄膜。也形成该积聚过滤器以根据靶细胞的尺寸截留含于样品中的靶细胞。通过超声波产生的压力波和剪切力一方面导致靶细胞的细胞壁的破坏，另一方面导致，至少部分地，积聚过滤器的复合材料的破坏。例如，纤维过滤器被拆分成单根纤维。装填的（gepackt）二氧化硅-过滤器因而被拆分成二氧化硅-颗粒。这样的实施方式提供了这样的优点，即，在此，靶细胞部分结合保留在过滤器颗粒上，由于颗粒碰撞，这又进一步改善了裂解性质。由此可以降低超声波强度，这也具有使所释放的靶细胞-核酸更小碎片化的优点。
在这种情况下该积聚过滤器可以仅部分拆分。然后，由此产生的过滤器的碎片或组成部分/成分在加工的进一步进程中被过滤器仍然完整的部分截留或在积聚过滤器仍然完整的部分之前重新装填成次级过滤器次级过滤器。此外，可通过加入结合缓冲液如此调节化学条件，使得分解时所释放的靶细胞-核酸被吸附在该次级过滤器和任选的其它过滤器上，而其它成分，例如蛋白质和细胞碎片都被冲洗掉。
或者，该用于提纯的装置可具有布置在积聚过滤器下游的另外的过滤器。在此种情况下，形成该另外的过滤器以截留积聚过滤器的碎片或颗粒或者与靶细胞及其裂解产物分离。这样的实施方式提供了这样的优点，即通过超声波溶出的积聚过滤器的组成部分/成分被截留在该另外的过滤器上并且在该另外的过滤器之前装填成次级过滤器。
本发明借助附图示例性地详细说明。其中：
图1示出根据本发明的实施例的处理方法的流程图；和
图2-9示出根据本发明的实施例的处理装置。
在本发明的优选实施例的以下描述中，对于在各图中示出的且起类似作用的元件使用相同或类似的附图标记，其中省略对这些元件的重复描述。
图1示出根据本发明的实施例的用于处理包含靶细胞和伴随细胞的生物材料样品以提取靶细胞的核酸的方法100 的流程图。该处理方法100可与如图2-9之一的处理装置一样的装置相结合有利地施行。在此，方法100具有借助裂解缓冲液和额外的或替代的超声波耦合预分解伴随细胞和任选消化由伴随细胞释放出的核酸的步骤105。方法100具有通过由样品分离靶细胞或伴随细胞积聚样品的靶细胞的步骤110。方法100还具有通过化学的和额外或替代地通过物理裂解分解靶细胞以制备含有靶细胞的核酸的靶细胞-裂解液的步骤120。方法100还具有由靶细胞-裂解液提纯核酸以提取靶细胞的核酸的步骤130。
根据一个实施例，任选实施或省略预分解步骤105。在此种情况下，方法100具有积聚步骤110、分解步骤120和提纯步骤130。
根据一个实施例，积聚步骤110具有借助积聚过滤器分离样品的靶细胞的子步骤。在此，根据一个实施例，该积聚步骤110具有在分离靶细胞的子步骤之后的纯化积聚过滤器的子步骤。
根据一个实施例，该积聚步骤110具有将样品调温到用于分解伴随细胞的裂解温度的子步骤和通过化学裂解来裂解伴随细胞的子步骤。在此，根据一个实施例，裂解和消化子步骤在调温子步骤之前、之中或之后进行，其中在裂解和消化子步骤中降低样品的粘度。
根据一个实施例，积聚步骤110具有稀释样品的子步骤。
根据一个实施例，在分解步骤120中借助超声波耦合分解靶细胞。
图2示出根据本发明的一个实施例的用于处理包含靶细胞和伴随细胞的生物材料样品以提取靶细胞的核酸的一个装置200。在此，该装置200制成微流体体系或微流体体系的一部分。在此，该装置200中示出样品室 210、加热器220形式的调温装置、用于第一缓冲液的储藏室 230、过滤器240、废料室 250、裂解缓冲液-储藏室 260和收集室270。
加热器220与样品室 210相邻布置。由此，加热器220与样品室 210热耦合。储藏室 230与样品室 210 借助流体连接（Fluidverbindung）相连。过滤器240布置在样品室 210和一方面废料室 250以及另一方面收集室270 之间。由此，样品室 210 借助流体连接经由过滤器240与废料室 250以及收集室270相连。裂解缓冲液-储藏室 260与样品室 210和过滤器240之间的流体连接可传导流体地相连。
样品室 210具有例如可借助塞子、盖子或粘合膜又封闭的用于引入样品的开口 。加热器220例如是珀尔帖加热器或电阻加热器。废料室 250用于接收滤液。收集室270用于接收裂解液。
因此，图2示出装置100或微流体体系的拓扑图，其中以静止的方式在样品室 210中进行样品的热处理。在下面进一步讨论装置200的运行。
图3示出根据本发明的一个实施例的用于处理包含靶细胞和伴随细胞的生物材料样品以提取靶细胞的核酸的一个装置200。该装置200与图2的装置类似。在此，该装置200中示出样品室 210、加热器220、用于第一缓冲液的储藏室 230、过滤器240、废料室 250、裂解缓冲液-储藏室 260、收集室270、微通道315和冷凝器320。
在样品室 210和储藏室 230之间布置有微通道315。样品室 210借助流体连接经由微通道315与储藏室 230相连。加热器220和冷凝器320形成调温装置。 在此，加热器220和冷凝器320与微通道315相邻布置。加热器220和冷凝器320与微通道315热耦合。储藏室 230在此布置在微通道315和过滤器240之间。过滤器240布置在储藏室 230和一方面废料室 250以及另一方面收集室270 之间。裂解缓冲液-储藏室 260借助流体连接与储藏室 230相连。
因此，图3示出用于以流动方式（Durchflussmodus）施行热处理的装置200的拓扑图。在此，样品由样品室 210通过可调温的微通道315泵送到第一缓冲液位于其中的储藏室 230中。可调温的微通道315可通过加热器220加热，并且在需要时可通过冷凝器320例如珀尔帖冷却凝器冷却。借助作为第二热有源元件（aktive Element）的冷凝器320可将加热的样品在与第一缓冲液混合之前调温到给定的温度水平，例如室温。这具有可特别准确地设定热预处理持续时间并因此能特别可靠地避免样品胶凝的优点。在下面进一步详细讨论装置200的运行。
图4示出根据本发明的一个实施例的用于处理包含靶细胞和伴随细胞的生物材料样品以提取靶细胞的核酸的一个装置200。该装置200与图3的装置类似，其中在图4中，该装置200在一个实施方案中作为多层结构示于剖视图中，其中装置200的室在图中略去。在此，该装置200中示出加热器220、过滤器240、微通道315、另外的微通道415、第一结构化聚合物层481、聚合物箔 482、第二结构化聚合物层483和聚合物盖箔 484。
所述结构化聚合物层 481和483例如由热塑性聚合物，例如PP、PC、PE、PS、COP、COC等制成。该聚合物箔 482例如由热塑性聚合物、热塑性弹性体、弹性体等制成。该盖箔 484具有例如热塑性箔、粘合膜等。
所述另外的微通道415在可调温的微通道315和过滤器240之间延伸。所述第一结构化聚合物层481、聚合物箔 482、第二结构化聚合物层483和聚合物盖箔 484 代表根据图4中示出的本发明实施例的装置200的多层结构。这种实施方案的优点在于，其可成本有利地制造，并且借助聚合物箔 482也可实现有源元件，如阀门。此外，本发明该实施例的一个优点是，可调温的微通道315仅通过薄的盖箔 484与加热器220分离。由此可特别精确地设定该可调温微通道315中的温度。在下面进一步详细讨论装置200的运行。
图5示出根据本发明的一个实施例的用于处理包含靶细胞和伴随细胞的生物材料样品以提取靶细胞的核酸的一个装置200。该装置200与图4中的装置类似。在此，该装置200中示出加热器220、过滤器240、微通道315、第一结构化聚合物层481、聚合物盖箔 484、另外的加热器520、可加热扩增室 570和示例性的两个旋转阀门 590。
在此，第一结构化聚合物层481和聚合物盖箔 484代表根据图5中示出的本发明实施例的装置200的多层结构。旋转阀门 590中的第一个布置并形成在微通道315和过滤器240之间，以释放或阻塞其间的流体连接。旋转阀门 590中的第二个布置并形成在过滤器240和扩增室 570之间，以释放或阻塞其间的流体连接。所述另外的加热器520与扩增室 570相邻布置，并与其热耦合。因此，过滤器240布置在两个旋转阀门 590之间。
因此，在图5中示出具有仅两层作为多层结构的装置200的实施方案。这种实施方案的优点在于，可以特别成本有利地制造装置200。液体控制在此借助旋转阀门590进行。此外，这种实施方案具有可借助另外的加热器520加热的另外的扩增室 570，在其中在提纯靶细胞-核酸后可借助PCR对它们进行扩增。
在下文中，参考图1-5说明使用根据本发明实施例的方法100和装置200热预处理式样的方案。
在积聚步骤110中，根据一个实施例，在第一子步骤中进行样品的真正的热预处理。在此，将样品加热到例如60℃-90℃，特别是65℃-85℃的温度或裂解温度。在此调节该温度以使含于样品中的伴随细胞，例如血液细胞如白细胞被破坏或被预先破坏，并且含于该伴随细胞中的核酸，即人DNA，至少部分被释放，由此完整保留含于该样品中的靶细胞，例如病原体。伴随细胞的这样的选择性裂解是可行的，因为作为病原体的靶细胞具有更结实的细胞壁并因此对热负荷更稳定。样品的加热例如可以以静止的方式在样品室 210中或以流动方式在毛细管、软管或通道如微通道315中进行。在该子步骤中产生的液体被称作第一裂解液。
然后，在积聚步骤110中，可在第二子步骤中进行第一裂解液与包含酶例如蛋白酶、脱氧核糖核酸酶和溶菌酶的得自储藏室 230的第一缓冲液的混合。该第一缓冲液起到消化或粉碎在第一子步骤中产生或释放的伴随细胞的受损细胞、细胞碎片、蛋白质和核酸的作用。所述消化对于后续的过滤子步骤而言是必需的，因为避免了第一裂解液的胶凝、降低了第一裂解液的粘度并因此避免了过滤器240的堵塞。在过滤时也可以更简单地分离第一裂解液的仍完整的细胞组成/成分。在此子步骤中产生的液体被称作消化裂解液。
然后，在积聚步骤110中，在第三子步骤中进行过滤，其中将消化裂解液引导到过滤器240上，例如无菌-、纤维-或二氧化硅过滤器。仍然完整的细胞组成/成分，特别是靶细胞由于其尺寸被截留在过滤器240上并因此积聚。
根据一个实施例，在用于积聚的步骤110的第一子步骤之前用水性缓冲液稀释样品，例如以1:1-1:10的比例。这具有降低样品粘度并仍可靠地避免热处理期间胶凝的优点。在需要时，用水性缓冲液稀释样品也可在用于积聚的步骤110的第一子步骤之后进行。这具有通过由此引发的渗透休克也有效裂解在第一子步骤中仅被预先破坏的伴随细胞的优点。
根据一个实施例，在用于积聚的步骤110的第二子步骤中加入另外的组分，例如洗涤剂，例如皂甙，SDS等，离液盐或碱性组分例如NaOH。这具有通过也有效裂解在用于积聚的步骤110的第一子步骤中仅被预先破坏的伴随细胞并释放出它们的核酸的优点。
根据一个实施例，用于积聚的步骤110的第一子步骤在用于积聚的步骤110的第二子步骤之后进行。由此在热预处理期间已经可靠地避免了样品的胶凝。在这种情况中，在第一缓冲液中使用耐温的酶。
根据一个实施例，代替在分解步骤120中在过滤器240上裂解靶细胞，在与裂解缓冲液混合之前通过缓冲液，例如水性缓冲液以相反方向经由过滤器240冲洗将靶细胞从过滤器240上冲洗下来。
根据一个实施例，如果靶细胞在分解步骤120中在过滤器240上裂解，则过滤器240也有利地直接用于提纯步骤130中。这具有节省过滤器的优点。为实现这一方案，可如此调节裂解缓冲液以使在分解步骤120中释放的靶细胞-核酸直接结合在过滤器240上。或者可以在分解步骤120之后在不将裂解缓冲液排挤出过滤器240的情况下在过滤器240上添加结合缓冲液。然后，裂解缓冲液和结合缓冲液的混合物在过滤器240中进行扩散。
根据一个实施例，在分解步骤120期间，也加热或用超声波加载消化裂解液。热负荷或由超声波引起的压力波和空化导致靶细胞的细胞壁特别可靠快速地破碎。
下面描述另一可能的用于处理包含靶细胞和伴随细胞的生物材料样品以提取靶细胞的核酸的过程。
在分解步骤120中裂解靶细胞。由此产生第二裂解液。该裂解或分解通过从裂解缓冲液-储藏室 260向过滤器240上添加裂解缓冲液来进行。该裂解缓冲液例如可包含酶，例如蛋白酶K、蛋白酶和溶菌酶。这些酶起到破坏靶细胞的细胞壁并因此释放靶细胞-核酸的作用。靶细胞的细胞壁也可以以其它方式来破坏，例如通过添加化学试剂，例如离液盐、清洁剂例如皂甙类、SDS等，ß-巯基乙醇或者碱性组分例如NaOH。
在提纯步骤130中，由第二裂解液纯化出靶细胞-核酸，例如通过吸附在固相上。
通常在提纯步骤130之后分析靶细胞-核酸。该分析的目的例如可以是检测某种病原体和抗性基因的存在。为此通常首先选择性扩增靶细胞-核酸，例如借助PCR。在PCR过程中，通过添加PCR- Mastermix并通过反复运行不同的温度水平来实现核酸量的指数扩增。PCR- Mastermix通常包含缓冲溶液、核苷酸、聚合酶、引物、氯化镁和任选的牛血清白蛋白（BSA）。 然后借助微阵列上的杂交检测扩增的靶细胞 - 核酸。
在使用热预处理样品实现在微流体体系中处理的方案时有利的是，方法100可特别限定在微流体体系中并可再现地施行，因为可以特别精确地设定温度、体积和在以流动方式施行该方法时的流速。此外，可使外界污染样品或样品污染环境的危险最小化，因为方法100在作为封闭体系的装置200中进行。
图6示出根据本发明的一个实施例的用于处理包含靶细胞和伴随细胞的生物材料样品以提取靶细胞的核酸的一个装置200。在此，将装置200制成微流体体系或微流体体系的一部分。该装置200与图2-5中的装置类似。该装置200中示出过滤器240或筛、作为进入通道的微通道315、作为结合通道的另外的微通道415 、第一排出通道 615a、第二排出通道 615b、第二过滤器620和超声波振荡单元 625。
该超声波振荡单元 625与过滤器240相邻布置。在此形成超声波振荡单元 625，以在过滤器240的范围内耦合超声波。过滤器240布置在微通道315 或进入通道与另外的微通道415或结合通道之间。形成该过滤器240以将其通过借助超声波振荡单元 625耦合的超声波完全或部分地粉碎成碎片或颗粒。该另外的微通道415在过滤器240和第二过滤器620 或筛之间延伸。由该另外的微通道415分岔出第一排出通道 615a。第二过滤器620布置在该另外的微通道415 和第二排出通道 615b之间。
试样通过进入通道或微通道315经由过滤器240和结合通道或另外的微通道415 冲进第一排出通道 615a中。然后用超声波加载过滤器240。随后，裂解液经由另外的微通道415和第二过滤器620冲进第二排出通道 615b中。在下面进一步详细讨论装置200的运行。
图7示出根据本发明的一个实施例的用于处理包含靶细胞和伴随细胞的生物材料样品以提取靶细胞的核酸的一个装置200。该装置200相应于图6中的装置，其中在图7中该装置200在一个实施方案中被描绘成类似于图4的剖视图中的多层结构。在此，该装置200中示出过滤器240、作为进入通道的微通道315、作为结合通道的另外的微通道415、第一结构化的聚合物板或聚合物层 481、聚合物膜或聚合物箔 482、第二结构化的聚合物板或聚合物层 483、盖箔 484、第一排出通道 615a、第二排出通道 615b、第二过滤器620和超声波振荡单元 625。
第一结构化聚合物层481、聚合物箔 482、第二结构化聚合物层483和盖箔 484 代表根据图7中示出的本发明实施例的装置200的多层结构。装置200的这种实施方案具有可成本有利地制造的优点。该多层结构例如可通过焊接，例如激光焊接，粘合或借助铆钉夹紧来连接。该结构化的聚合物层481和483例如由热塑性聚合物，例如PP、PC、PE、PS、COP、COC等构成。聚合物膜或聚合物箔 482 例如由热塑性聚合物、热塑性弹性体、弹性体等构成。盖箔 484具有例如热塑性箔、粘合膜等。
图8示出根据本发明的一个实施例的用于处理包含靶细胞和伴随细胞的生物材料样品以提取靶细胞的核酸的一个装置200。该装置200相应于图7的装置，区别在于，进入通道或微通道315在超声波振荡单元 625的范围内拓宽成裂解室 230并且经由比预过滤器620小的截面流向过滤器或筛240，其中在第二过滤器620或筛之前的区域中形成长形的空腔840，在其中可收集过滤器240的组成部分/成分并形成装填的（gepackten）次级过滤器。
该进入通道或微通道315在过滤器240的范围内拓宽成裂解室 230，其典型的体积为100 微升至3 毫升并且通常为1 毫升。这具有如下优点，即可在裂解室 230中借助超声波进行软裂解，而不需要另外的超声波振荡单元。经由比过滤器240小的截面流向该第二过滤器620或筛。在第二过滤器620或筛的范围内形成长形的空腔840，在其中可收集过滤器240的组成部分/成分并形成装填的次级过滤器。这具有如下优点，即，可使用较小的体积用于洗脱靶细胞-核酸，由此提高洗脱液中的核酸浓度。根据图8中示出的本发明的实施例，该长形的空腔840被制成贯穿第二结构化聚合物层 483的缺口。
图9示出根据本发明的一个实施例的用于处理包含靶细胞和伴随细胞的生物材料样品以提取靶细胞的核酸的一个装置200。该装置200相应于图8的装置，区别在于，根据图9中示出的本发明的实施例，该长形的空腔840被制成在第二结构化聚合物层 483中延伸的通道。
在下文中，参照图1和6-9说明使用根据本发明的实施例的方法100和装置200用过滤器处理样品的方案。由于超声波作用和过滤器240的复合材料的破坏，结合于其中的靶细胞又被转移返回到超声波-裂解特别有效的液相中。在此情况下，靶细胞部分结合保留在过滤器颗粒上，由于颗粒碰撞这还进一步改善裂解性质。由此可降低超声波强度任选低于空化阈值或者提高超声波强频率，例如至数倍，例如增加一倍，以致不再出现空化而不会失去裂解性质。减少的超声波强度和很大程度上的空化自由度具有使所释放的靶细胞-核酸更小碎片化的优点。由此释放的核酸可以直接转移到溶液中。
在积聚步骤110中，引导样品通过过滤器240 ，该过滤器240例如是由无机纤维或颗粒例如由氧化铝或二氧化硅制成的过滤器，多孔膜或具有给定孔的膜。含于样品中的靶细胞由于其尺寸被截留在过滤器240上。例如用泵，例如蠕动泵或隔膜泵，或借助离心分离引导样品通过过滤器240。
在分解或裂解步骤120中，用超声波，例如以20-50KHz的频率加载过滤器240。由超声波产生的压力波和剪切力一方面导致靶细胞细胞壁的破坏，而另一方面导致过滤器240的复合材料的完全或部分破坏。过滤器240的过滤器颗粒促进裂解作用。例如，织物过滤器被分解成单根的线。填充的二氧化硅-过滤器相应地被分解成二氧化硅-颗粒。在分解步骤120中产生的液体或悬浮液被称作裂解液。有利地通过超声波产生空化。这具有如下优点，即出现的压力波和剪切力特别高。也可以，首先用很小强度的超声波脉冲通过空化作用将作为过滤器240的二氧化硅过滤器分解并且至少将表面的在其上粘接有靶细胞的二氧化硅-颗粒作为悬浮液运回到溶液中，由此首先仅需要裂解少量的靶细胞。在分解步骤120的下一子步骤中用在空化阈值以下的更小强度的超声波进行真正的裂解，其中得自过滤器240的过滤器材料的二氧化硅颗粒起促进作用。已证实，这样的裂解条件对于从裂解的靶细胞获得尽可能未碎片化的核酸而言是特别有利的。有利地，在此步骤中用液体填充过滤器240。这具有特别好且确定地耦合超声波能量的优点。
在提纯步骤130中进行过滤，其中使裂解液与结合缓冲液，例如含乙醇的结合缓冲液混合并引导通过第二过滤器620或筛。过滤器240的组成部分/成分被截留在第二过滤器620上并在第二过滤器620之前填充成所谓的次级过滤器。通过添加结合缓冲液调节该步骤中的化学条件，使得裂解时释放的靶细胞-核酸被吸附在该次级过滤器和任选的第二过滤器620或筛上，而其余组成部分/成分，例如蛋白质和细胞碎片被冲洗掉。该与结合缓冲液混合的裂解液例如可以用泵，例如蠕动泵或隔膜泵，或者借助离心分离引导通过第二过滤器620或筛。
下文中描述用于处理包含靶细胞和伴随细胞的生物材料样品以提取靶细胞的核酸的另一可能的过程。洗涤并洗脱吸附在次级过滤器和第二过滤器620上的核酸。这具有提高核酸的纯度和浓度的优点。在提纯靶细胞-核酸的步骤130之后可进行扩增和/或检测，例如借助测序、聚合酶-链反应 (PCR)、实时-PCR和/或微阵列上的杂交。
根据一个实施例，在积聚步骤110之前，在步骤105中进行所谓的软裂解 。将这样的步骤称为软裂解，在其中选择性裂解含于样品中的伴随细胞，特别是存在于血液样品中的血液细胞，而完整保留靶细胞。这具有如下优点，即伴随细胞- 核酸在该步骤中已被释放且不会被一起积聚。该软裂解例如可以通过温和的酶促裂解或化学裂解得以实现。为此，将样品例如与试剂，例如酶，例如蛋白酶、溶菌酶和脱氧核糖核酸酶，碱性成分，例如NaOH, 清洁剂，例如SDS或者离液盐混合。添加脱氧核糖核酸酶尤其具有消化并因此特别有效地除去在该第一软裂解步骤中释放的核酸的优点。替代或补充地，也可通过用降低能量的超声波振荡样品来软裂解并消化在软裂解步骤中释放的核酸。这具有不必或很少额外添加试剂的优点。
根据一个实施例，在积聚步骤110之前向样品中添加水或水性缓冲液。这具有如下优点，即稀释样品并因此更容易地，即用较低的压力引导其通过预过滤器 620并避免预过滤器620堵塞。
根据一个实施例，在积聚步骤110 之后洗涤过滤器240，例如通过引导水或水性缓冲液通过过滤器240。这具有使样品的其余成分例如蛋白质被冲洗掉而靶细胞以较高纯度存在的优点。
根据一个实施例，在提纯步骤130 中省略结合缓冲液的添加。在这种情况中，将进一步处理在提纯步骤130 中产生的在这种情况中包含靶细胞-核酸的滤液。这具有如下优点，即该进一步处理可使用其它任意方法进行。
根据一个实施例，在提纯步骤130中，在添加结合缓冲液之前还添加包含蛋白酶K的缓冲液。这具有能使细胞碎片变得更小并因此特别好地被冲洗掉的优点。
根据另一实施例，省略第二过滤器620。已经表明，可如此调节超声波参数或者可如此小地保持超声波能量，以使过滤器240并非完全，而是仅表面被振荡分解或粉碎成其组成部分/成分。该被振荡过的过滤器240因此能够继续被用作过滤器。通过振荡产生的颗粒在随后的工艺步骤中被过滤器240尚完整的子部分收集并截留。
所描述的和在附图中示出的实施例仅为示例性选择。不同的实施例可完全地或针对各个特征彼此组合。也可以将一个实施例的特征补充到另一个实施例中。此外可以重复工艺步骤以及以不同于所描述的顺序施行工艺步骤。

Claims (16)

1.用于处理包含靶细胞和伴随细胞的生物材料样品以提取靶细胞的核酸的方法(100)，其中所述方法(100)具有下述步骤：
通过从样品中分离靶细胞或伴随细胞积聚(110)样品的靶细胞；
通过化学和/或物理裂解分解(120)靶细胞，以制备含有靶细胞的核酸的靶细胞-裂解液；和
由所述靶细胞-裂解液提纯(130)核酸，以提取靶细胞的核酸。
2.根据权利要求1的方法(100)，其中积聚步骤(110)具有借助积聚过滤器 (240; 620)从样品中分离靶细胞的子步骤。
3.根据权利要求2的方法(100)，其中积聚步骤(110)具有在分离靶细胞的子步骤之后的纯化积聚过滤器(240; 620)的子步骤。
4.根据前述权利要求之一的方法(100)，其中积聚步骤(110)具有将样品温度调节到裂解温度以分解和预先破坏伴随细胞的子步骤和通过化学裂解和酶促消化由伴随细胞释放的核酸裂解伴随细胞的子步骤。
5.根据权利要求4的方法(100)，其中所述裂解和消化子步骤在调温子步骤之前、之中或之后进行，其中在裂解和消化子步骤中降低样品的粘度。
6.根据前述权利要求之一的方法(100)，其中在分解步骤(120)中借助超声波耦合分解靶细胞。
7.根据前述权利要求之一的方法(100)，其中在分解步骤(120)中在过滤器(240)上分解靶细胞并且过滤器(240)在此完全或部分地被拆分成其组成部分/成分。
8.根据前述权利要求之一的方法(100)，在积聚步骤(110)之前具有借助裂解缓冲液和/或超声波耦合的伴随细胞的预分解步骤(105)。
9.根据前述权利要求之一的方法(100)，其中积聚步骤(110)具有稀释样品的子步骤。
10.用于处理包含靶细胞和伴随细胞的生物材料样品以提取靶细胞的核酸的装置(200)，其中所述装置(200)具有下述特征：
通过由样品分离靶细胞或伴随细胞以积聚样品的靶细胞的装置(210, 220, 230, 240; 315, 320; 620)；
通过化学和/或物理裂解来分解靶细胞以制备含有靶细胞的核酸的靶细胞-裂解液的装置(240, 260; 620, 625)；和
用于由靶细胞-裂解液提纯核酸以提取靶细胞-核酸的装置(240, 250, 270; 520, 570)。
11.根据权利要求10的装置(200)，其中用于积聚的装置(210, 220, 230, 240; 315, 320; 620)具有用于从样品中分离靶细胞的积聚过滤器 (240; )。
12.根据权利要求10-11之一的装置(200)，其中用于积聚的装置(210, 220, 230, 240; 315, 320; 620)具有用于将样品温度调节至用于分解或预先破坏伴随细胞的裂解温度的调温装置 (220; 315)。
13.根据权利要求11的装置(200)，其中调温装置 (220; 315)与样品室(210)或布置于样品室 (210)和分解室 (230)之间的样品通道 (315)热耦合。
14.根据权利要求10或11的装置(200)，其中用于分解的装置(240, 260; 620, 625)具有超声波耦合装置 (625)，其与用于积聚的装置(620)相邻布置。
15.根据权利要求11的装置(200)，其中形成积聚过滤器 (620)，以通过用于分解靶细胞的超声波耦合将其完全或部分地拆分成其组成部分/成分。
16.根据权利要求15的装置(200)，其中用于提纯的装置(240, 250, 270; 520, 570)具有另外的过滤器(620)，其布置在积聚过滤器 (240)的下游，其中形成该另外的过滤器(620)以将积聚过滤器(620)的碎片或颗粒与靶细胞或其裂解产物分离。
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