DE60311244T2

DE60311244T2 - Verfahren und automatische extraktion von nucleinsäuren aus komplexen mischungen

Info

Publication number: DE60311244T2
Application number: DE60311244T
Authority: DE
Inventors: Sylvie Hallier-Soulier; Gaille Leborgne; Nadine Batisse-Debitte; Gabriel Festoc; Xavier Badiche
Original assignee: GeneSystems SA
Current assignee: Pall Genedisc Technologies SAS
Priority date: 2002-04-09
Filing date: 2003-04-09
Publication date: 2007-11-15
Anticipated expiration: 2023-04-10
Also published as: EP1495119A2; PT1495119E; DE60311244D1; EP1495119B1; WO2003085109A2; DK1495119T3; JP2005526509A; FR2838066B1; ES2279960T3; AU2003246804A1; ATE351903T1; WO2003085109A3; FR2838066A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Analyse biologischer Proben, und insbesondere die Analyse des Bakteriengehalts komplexer Mischungen, insbesondere alimentärer Proben.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Extraktion von Nukleinsäuren von Mikroorganismen, die in einer komplexen Mischung enthalten sind. Ein derartiges Verfahren weist wenigstens die folgenden Schritte auf:

(12) das Zurückhalten von in der Mischung enthaltenen Mikroorganismen auf einer Vorrichtung der Art Filterkartusche (40);
(14) die Lyse von Mikroorganismen in situ; und
(16) die Rückgewinnung von Nukleinsäuren von der Filterkartusche (40) auf einem Adapter mit einem Klärungsfilter, wobei die Nukleinsäuren in Form eines gefilterten Lysats rückgewonnen werden.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist weiterhin eine Filterkartusche sowie ein Extraktionsautomat für Nukleinsäuren von Mikroorganismen, die in einer komplexen Mischung oder in Wasser enthalten sind, wobei die Kartusche und der Automat für die Durchführung des Extraktionsverfahrens gemäß der Erfindung verwendet werden.
Die Erfindung betrifft schließlich eine Vorrichtung für die Extraktion und Detektion und/oder Quantifizierung von Nukleinsäuren von Mikroorganismen, die in einer komplexen Mischung enthalten sind, wobei die Vorrichtung einen Extraktionsautomaten für Nukleinsäuren gemäß der Erfindung, der mit einem Amplifikationsautomaten in thermoabhängiger Kette der Nukleinsäuren gekoppelt ist, aufweist.
Das aktuelle Verhalten der Öffentlichkeit, welche potentielle Verbraucher repräsentiert, zeichnet sich durch eine Beschäftigung mit der Gesundheit und allgemeinen Sicherheit aus, und es werden immer mehr Garantien bezüglich Unschädlichkeit, Qualität und Herkunft von auf dem Markt verfügbaren Produkten verlangt. Im Übrigen hat dieses Phänomen in den letzten Jahren zugenommen und steigt weiter an. Somit ist es angemessen, der Öffentlichkeit fundierte Auskünfte zu erteilen, um das Bedürfnis nach Gewissheit und Sicherheit zu erfüllen.
Zu diesem Zweck werden von der Obrigkeit und anderen hinsichtlich öffentlicher Gesundheit und gesundheitlicher Wachsamkeit kompetenter Behörden und Organisationen regelmäßige Kontrollen auferlegt, insbesondere im alimentären Bereich, damit die Normen von Sicherheit und Qualität von den Erzeugern, Herstellern, Verteilern und Gastwirten strikt überwacht werden. Die Qualität der mikrobiologischen Kontrolle ist ein entscheidender Punkt, der entlang der Kette zwischen Erzeuger und Verbraucher eingehalten werden sollte.
Das Prinzip der Kontrollen beruht auf fundierten Analysemethoden gängiger Techniken in der analytischen Chemie oder Biochemie, darunter sind die Chromatographie, die kernmagnetische Resonanz (NMR) und die Massenspektrometrie, sowie auf molekularbiologischen Techniken, welche beispielsweise ermöglichen, spezifische Nukleinsäuren von Organismen, insbesondere Pathogene, durch PCR oder Hybridisierung mittels Sonden zu detektieren.
Die Kontrollen können in großem Maßstab durchgeführt werden, insbesondere auf Ebene eines landwirtschaftlichen Betriebs oder einer verarbeitenden Industrie. Weiterhin werden sie manchmal in Notfällen durchgeführt. In dem Fall, dass die verdächtigen Produkte bereits im Handel erhältlich sind, muss die Unschädlichkeit der Produkte schnellstmöglich beurteilt werden, um gegebenenfalls ihre Rücknahme aus dem Handel vor einer Massenkontaminierung anordnen zu können.
Insbesondere werden die Gesundheitskontrollen im Rahmen der Bewertung auf Ebene der durch Kontaminierung gefährdeter Nahrungsmittel, wie beispielsweise Fleisch, Fisch, Milchprodukte und empfindliche Nahrungsmittel, die durch eventuelle wesentliche Temperaturänderungen beim Durchlaufen der unterschiedlichen Etappen der "Kühlkette" verändert wurden, sowie hinsichtlich Schutz und Überwachung der Umgebung durchgeführt, wobei es sich zum Beispiel um die Kontrolle des Verschmutzungsgrads von städtischen Quellen und Netzen für Trinkwasser handelt.
Bei eher medizinischen Anwendungen ist die Reinheit von Nukleinsäureextrakten aus biologischen Proben von gefährdeten Patienten oder Subjekten ein wesentliches Kriterium für die Durchführung von Diagnosemethoden, und insbesondere die Durch führung von Tests für die Ermittlung von oder Anfälligkeit für genetische(n) Krankheiten.
Auf jeden Fall müssen die in situ durchgeführten Entnahmen schnellstmöglich untersucht werden, wobei optimale Effizienz und Sicherheit gewährleistet sein müssen.
Einer der ersten Behandlungsschritte biologischer Entnahmen kann insbesondere darin bestehen, die Nukleinsäuren zu Zwecken qualitativer und/oder quantitativer Analyse in vitro zu behandeln, und genauer die Nukleinsäuren aus ihrer Zellumgebung zu isolieren.
Die Nukleinsäuren, DNA und RNA, sind Ziel für vielfache Wechselwirkungen in Verbindung mit biologischen Prozessen, bei denen Nukleinsäuren eine elementare Rolle spielen. Zum Beispiel wechselwirken die Letztgenannten direkt mit Enzymen, die für die Expression von Genen verantwortlich sind, sowie mit Proteinfaktoren für die Regulierung der Expression, wobei dies einen elementaren biologischen Prozess bildet, der zu dem Überleben, der Entwicklung und Erneuerung von Zellen beiträgt.
Derartige Komplexe, welche die Nukleinsäuren von Interesse mit Proteinen und/oder anderen Nukleinsäuren verbinden, komplizieren die Isolierung und Reinigung der einzelnen gesuchten Nukleinsäuren beachtlich.
Um diese Schwierigkeit zu überwinden, wird bei den herkömmlichen Methoden zur Extraktion von Nukleinsäuren die Durchführungsdauer zugunsten des Reinheitsgrads der erhaltenen Extrakte aufgegeben. Im Prinzip weisen derartige Methoden wenigstens die folgenden drei Schritte auf: (i) Lyse der Zellmäntel, was das Freisetzen der Nukleinsäuren in dem Medium ermöglicht; (ii) Denaturierung der Komplexe Nukleinsäure-Proteine; und (iii) Trennen der Nukleinsäuren von Interesse von anderen Makromolekülen (Sambrook und Russel. 2001. Molecular cloning; a laboratory manual, 3^rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.).
Diese herkömmlichen Methoden wurden, obwohl sie zumeist das Schema der oben genannten drei Schritte einhalten, empirisch entsprechend den verschiedenen zu erreichenden Zielen modifiziert. Somit unterscheidet sich die Durchführung deutlich je nachdem, ob das verfolgte Ziel darin besteht, (i) DNA und/oder RNA zu isolieren, (ii) aus prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen des Organismus, wobei bekannt ist, dass im Fall prokaryotischer Organismen gegebenenfalls (iii) die DNA nach plasmidischer oder chromosomaler Art unterschieden werden muss.
In dem oben genannten Schema gibt es einen wesentlichen Schritt, der darin besteht, die Nukleinsäuren mittels organischer Lösungsmittel, wie beispielsweise Phenol, Chloroform, Isoamylalkohol oder deren Mischung, zu extrahieren. Die gesuchten Nukleinsäuren, die in der wässrigen Phase enthalten sind, werden dann nach Trennung der organischen und wässrigen Phase durch Zentrifugieren abgefangen.
Die Durchführung eines derartigen Schritts stellt eine, wenn nicht die Hauptbeschränkung der Verfahrensweisen zur Extraktion von Nukleinsäuren gemäß dem Stand der Technik dar. Tatsächlich bildet das für die Trennung der organischen und wässrigen Phase erforderliche Zentrifugieren ein Haupthindernis für die Automatisierung der Methode, indem einerseits das Eingreifen eines Versuchsleiters erforderlich ist, und andererseits die Kosten für die Durchführung aufgrund kostenintensiver und umfangreicher Anlagen hoch sind.
Schließlich ermöglicht die Mehrheit herkömmlicher Methoden der Zelllyse die Extraktion von Nukleinsäuren, nicht nur in ihrer nativen Form, sondern auch in Form von Fragmenten großer Größe (50 kb). Die anschließende Reinigung der Nukleinsäureextrakte mittels organischer Lösungsmittel, wie beispielsweise eine Mischung Phenol-Chloroform, kann eine Scherung der Nukleinsäuren mit sich bringen, wodurch somit Fragmente heterogener Größe von weniger als 50 kb erzeugt werden.
Durch ein derartiges "Versuchsartefakt" kann die Interpretation der Ergebnisse verhindert oder verfälscht werden, insbesondere, wenn der Durchschnittsfachmann die aus der Extraktion hervorgegangenen Produkte einzig auf Basis ihrer Größe beispielsweise mittels Gelelektrophorese unterscheidet, wobei bei der Letztgenannten "Schmier (smear)" genannte Phänomene auftreten, bei denen die Nukleinsäurefragmente nicht als genau einzelne Banden erscheinen, sondern als Flecken, in denen mehrere Banden, die mehreren Nukleinsäurefragmenten entsprechen, neu gruppiert werden. Dieses "Artefakt" kann ebenfalls eine schwerwiegende Minderung der Empfindlichkeit bei der Detektion so extrahierter Nukleinsäuren durch Hybridisierungsmethoden, insbesondere auf Membranen mit sich bringen.
Um diesen Nachteil im Stand der Technik zu beseitigen, wurde in dem Patent EP 0 245 945 ein Automat zur Extraktion und Reinigung von Nukleinsäuren aus Zellen beschrieben. Durch diesen Automat wird ermöglicht, den Extraktionsschritt mittels eines organischen Lösungsmittels auf Basis von Phenol durchzuführen, und das ohne mehrfaches Zentrifugieren, wie es bis dahin erforderlich war. Kurz gesagt wird eine Emulsion durch Hinzufügen eines Lösungsmittels zu dem Zelllysat hergestellt, wobei die Emulsion geheizt wird, um die Trennung der Phasen zu bewirken. Es wird ein letzter Schritt der Extraktion mit Chloroform durchgeführt.
Ungeachtet der möglichen Automatisierung wird mit dieser Methode nicht das Problem im Stand der Technik gelöst, und insbesondere in Verbindung mit der Verwendung organischer Lösungsmittel. Obwohl durch die Extraktion mittels der Lösungsmittel wirksam die Verschmutzungen, nämlich die bei dem Schritt der Lyse der Zellen verwendeten Reinigungsmittel, sowie die Proteine entfernt werden, bleiben diese jedoch stark toxisch. Als Folge erfordert deren Handhabung Aufmerksamkeit und Sparsamkeit und muss auf der Ebene von mit geeigneten Ventilationssystemen versehenen Sicherheitsstationen durchgeführt werden.
Um die oben beschriebenen und mit den Methoden zur Extraktion von Nukleinsäuren verbundenen Nachteile des Standes der Technik zu vermeiden, wobei die Methoden schwer mit den Geboten der Sicherheit, Effizienz und Rentabilität der Industrie und moderner Analyselabore vereinbar sind, wurde in der Internationalen Anmeldung WO93/01312 ein alternativer Ansatz beschrieben.
In dieser Anmeldung wird eine Kartusche zur Herstellung von Nukleinsäuren, insbesondere von genomischer DNA, aus einer Blutprobe, Gewebezellen oder Zellen in Kultur, anders gesagt relativ homogenen Suspensionen eukaryotischer Zellen, in einem biologischen Fluid oder einem Kulturmedium beschrieben.
In der Internationalen Anmeldung WO93/01312 werden des Weiteren eine Vorrichtung und ein Verfahren unter Verwendung dieser Kartusche beschrieben.
Somit umfasst die Kartusche insbesondere eine Dialysekammer, die von den Dialysemembranen abgegrenzt wird. Gegebenenfalls weist die Kartusche weiter einen Filter zum Zurückhalten von Zellkernen auf.
In der Internationalen Anmeldung WO93/01312 wird ein Verfahren zur Herstellung, das heißt, Isolierung und Reinigung, von Nukleinsäuren aus einer Probe, die eukaryotische Zellen enthält, durch Lyse der Kerne, Abbau von Proteinen und Reinigung der Nukleinsäuren durch Dialyse beschrieben.
Die Technologie, auf die sich die Extraktionskartusche bezieht, die in der Internationalen Anmeldung WO93/01312 beschrieben ist, ist jedoch nicht für eine Extraktion von Nukleinsäuren von Prokaryoten geeignet, die gegebenenfalls in heterogenen komplexen Mischungen enthalten sind, wie beispielsweise unbearbeiteten Nahrungsmittelproben, die nicht zuvor beispielsweise durch Trocknung modifiziert wurden, und deren Bestandteile zum Teil fest und zum Teil flüssig sind.
Andere Methoden zur Extraktion von Nukleinsäuren aus Leukozyten, die aber auch auf andere Zellarten wie beispielsweise Bakterien anwendbar sind, werden in den Patentanmeldungen WO 00/21973 und WO 02/16383 beschrieben. Die beiden Anmeldungen offenbaren eine Extraktionsmethode, welche die folgenden Schritte aufweist:

(a) Ablagerung einer Probe auf einem Filter, der ermöglicht, die in der Probe enthaltenen Zellen zurückzuhalten (Retentat) und Entfernung von Verschmutzungen,
(b) Lyse des Retentats in situ und Bildung eines Zelllysats,
(c) Filtern des Zelllysats und Zurückhalten von Nukleinsäuren auf dem Filter und Entfernung des Rests des Zelllysats,
(d) gegebenenfalls Waschen der in dem Filter enthaltenen Nukleinsäuren und
(e) Elution der Nukleinsäuren, bei welcher die Zusammensetzung und die Abmessungen des Filters so gewählt sind, dass der Filter geeignet ist, die Zellen und die Nukleinsäuren zurückzuhalten.

Weiterhin wird in der Anmeldung WO 94/21780 eine Methode zum Auszählen von in einer Probe enthaltenen Mikroorganismen durch Fixierung der Mikroorganismen auf einem Filter und deren Lyse in situ beschrieben. Bei einer bestimmten Ausführungs form werden nach der Lyse der Mikroorganismen diese durch Amplifizierung mittels PCR direkt auf dem Filter detektiert.
Schließlich wird in einer anderen Patentanmeldung, WO 99/14309, die Detektion unterschiedlicher Mikroorganismen nach dem Filtern auf einem Nitrozellulosefilter mit Poren von 0,45 μm beschrieben.
In diesem Fall sieht die Erfindung ein Verfahren zur Extraktion von Nukleinsäuren von Procaryoten vor, das automatisierbar ist und für die Behandlung eines komplexen Ausgangsmediums angepasst ist.
Folglich entspricht das Verfahren gemäß der Erfindung, das vollständig automatisierbar ist, einem Anspruch der Rationalisierung und der Ökonomie, insofern, dass es: (i) direkt auf die Extraktion von Nukleinsäuren aus unbearbeiteten Entnahmen anwendbar ist, selbst wenn diese hinsichtlich Zusammensetzung und Struktur komplex und heterogen sind; (ii) eine schnelle Extraktion ermöglicht, die in weniger als 3 Stunden durchführbar ist; (iii) reproduzierbare Ergebnisse liefert; (iv) die gleichzeitige Behandlung von bis zu sechs unterschiedlichen Proben ermöglicht, wobei bei jedem Schritt ihre Rückverfolgbarkeit gegeben ist; (v) von nicht qualifiziertem Personal durchgeführt werden kann; (vi) weder das Eingreifen noch das Überwachen durch einen Versuchsleiter erfordert, gegebenenfalls jedoch nur sehr punktuell, wodurch der Versuchsleiter somit verfügbar ist, um parallel andere laufende Extraktionen, andere Vorgänge oder Arbeiten durchzuführen; und (vii) routinemäßig in einem Analyselabor oder einer Industrie durchgeführt werden kann, ohne dass intensive Investitionen in die Ausstattung erforderlich sind.
Die Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Extraktion von Nukleinsäuren von Mikroorganismen, die in einer komplexen, insbesondere alimentären, Mischung enthalten sind, wobei das Verfahren wenigstens die folgenden Schritte aufweist:

(12) das Zurückhalten von in der Mischung enthaltenen Mikroorganismen auf einer Vorrichtung der Art Filterkartusche 40 (s. 3)
(14) die Lyse von Mikroorganismen in situ
(16) die Rückgewinnung von Nukleinsäuren von der Filterkartusche 40 (s. 1).

Entsprechend der Art der zu analysierenden Probe (festes/flüssiges alimentäres zerkleinertes Gut oder Wasser, beispielsweise Trinkwasser) ist ein erster Schritt erforderlich:

(10) Klärung der Mischung durch Filtration mit einer Vorrichtung der Art Vorfilterkartusche (1, Spalte A), wobei der Schritt (12) dann auf dem Filtrat durchgeführt wird.

Für den Fall, dass die Nukleinsäuren hinsichtlich einer Quantifizierung extrahiert werden, ist ein zusätzlicher Schritt erforderlich:

(18) Konzentration und Reinigung von Nukleinsäuren durch Flüssig-Fest-Adsorptionschromatographie (1, Spalte B).

Bei den Schritten 12, 14 und 16 wird auf eine "Vorrichtung der Art Filterkartusche" 40 (3) Bezug genommen. Dieser Begriff, sowie die äquivalenten Begriffe und Ausdrücke "Kartusche", "Extraktionskartusche" und "Filterkartusche", bezeichnen ein System mit einem Rückhaltefilter 42, der zwischen zwei Gittern eingeklemmt ist oder an ein einzelnes Gitter geklebt ist, wobei das (die) Gitter von jedem Mittel gehalten wird (werden), zum Beispiel von zwei geklebten, geschraubten oder geklipsten Ringen, oder in einen Ring eingesetzt ist (sind).
Die Kartusche kann Lysebehandlungen unterzogen werden (4). In diesem Fall wird das Kunststoffteil, auf welchem die Filterkartusche angeordnet ist, von der Filterstation losgeschraubt, und die Kartusche wird auf ihrer Unterseite – das heißt der Seite, die nicht in Kontakt mit den Bakterien ist – durch eine Abdeckung dicht abgeschlossen. Die Oberseite der Filterkartusche wird dicht abgeschlossen durch eine Vorrichtung, welche einen Trichter, einen Adapter, einen Klärfilter für das Lysat und ein Rohr von 15 ml mit konischem Boden aufweist. Der Adapter wird auf den Trichter geschraubt. Er enthält den Klärfilter für das Lysat, der zuvor in den Trichter eingesetzt wurde. Auf das freie Ende des Adapters wird ein Sammelrohr von 15 ml mit konischem Boden, wie in 4 dargestellt, geschraubt.
Das System weist eigene Spezifikationen aufgrund der charakteristischen Merkmale der Filter, die Bestandteil davon sind, auf. Tatsächlich ist die Auswahl der Filter, wie in der folgenden genauen Beschreibung der Erfindung dargelegt wird, ein wesentlicher Faktor für das Erhalten des erwarteten Ergebnisses. Eine Beschreibung der Filterkartusche 40, die Gegenstand der Erfindung ist, wird unten geliefert.
Im Sinn der vorliegenden Erfindung umfasst die "Extraktion" von Nukleinsäuren zugleich die Isolierung der Nukleinsäuren von ihrer natürlichen biologischen Umgebung, ihre Reinigung und Konzentration. Der Reinheitsgrad und die Konzentration der mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens extrahierten Nukleinsäuren sind derart, dass die Nukleinsäuren Gegenstand einer Detektion sein können mittels Methoden, die genauso sensibel sind wie PCR, und das direkt, ohne einer zusätzlichen Behandlung unterzogen zu werden zur Entfernung von Restverschmutzungen, die in der Lage sind, die Spezifizität und die Empfindlichkeit der Methoden, und insbesondere von PCR-Reaktionen, zu hindern oder zu verändern.
Die "Nukleinsäuren" umfassen gemäß gängiger Bedeutung DNAs und RNAs. Es ist selbstverständlich, dass das Verfahren sowohl im Rahmen der Extraktion einzig von DNA, durch das Hinzufügen von RNAsen in einem Schritt, den der Durchschnittsfachmann ohne Schwierigkeiten auswählen kann, als auch einzig von RNA durch das Hinzufügen von DNAsen und Anti-RNAsen, als auch von DNA und RNA angewendet werden kann.
Unter "Nukleinsäuren von Interesse", "gesuchten" oder "gewünschten" sowie jeder anderen äquivalenten Bezeichnung erkennt der Durchschnittsfachmann mit Leichtigkeit die Ziel-Nukleinsäuren des Extraktionsverfahrens gemäß der Erfindung, wobei die Nukleinsäuren als solche das Ausgangsmaterial für das nachfolgende qualitative und/oder quantitative Analyseverfahren darstellen.
Hier wird unter "Mikroorganismus" jeder prokaryotische Organismus verstanden, wobei die Definition ebenfalls Gram-positive und Gram-negative Bakterien einschließt sowie jene ohne Wand, sowie sporogene Formen von Bakterien.
Mit "komplexe Mischung" wird im Sinn der vorliegenden Erfindung Bezug genommen auf jede Zusammensetzung, welche Zellen von prokaryoten Organismen enthält, wobei die Zusammensetzung heterogener Art sein kann, ein Beispiel ist eine unbearbeitete alimentäre Probe, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie eine mehr oder weniger große Anzahl an unterschiedlichen Elementen aufweist, wovon einige in flüssigem Zustand und andere in festem Zustand vorliegen, oder von eher homogener Art ist und beispielsweise einer mehr oder weniger reinen Bakterienkultur entspricht.
Für das Extraktionsverfahren gemäß der Erfindung werden Techniken zur Trennung mit Membranen oder Filtertechniken angewendet, bei welchen permselektiv genannte poröse Membranen entsprechend ihrer selektiven Eigenschaften verwendet werden und deren Funktionsweise mit einer Barriere mit Siebwirkung vergleichbar ist: die Moleküle oder Partikel, deren ungefähre Größe größer als ein gegebener Schwellenwert ist, welcher der mittleren Porengröße der Membran entspricht, werden zurückgehalten, wohingegen jene, deren Größe kleiner als der Schwellenwert ist, unter Wirkung eines Lösungsmittelstroms, der durch Anwendung eines Druckgradienten erzeugt wird, durch die "Barriere" hindurchgehen.
Zu diesem Zweck ermöglicht das Hindurchgehen durch das Sieb, das durch die poröse Membran gebildet wird, zwei Flüssigkeiten zu trennen, das Permeat oder Filtrat, das durch die Poren der Membran gegangen ist, und das Retentat, das bezogen auf die Anfangsflüssigkeit an Gattungen angereichert ist, die einen größeren Durchmesser als die Poren aufweisen.
Unter den Filtertechniken werden insbesondere die Ultrafiltration und Mikrofiltration hervorgehoben.
Für die Ultrafiltration werden mikroporöse Membranen verwendet, deren Porendurchmesser im Allgemeinen zwischen 1 und 100 nm liegt. Derartige Membranen lassen kleine Moleküle (Wasser, Salze) durch und halten Moleküle mit höherer Molmasse (Polymere, Proteine, Kolloide) zurück. Ungeachtet des Intervalls des oben angegebenen Porendurchmessers ist es geläufig, im Bereich der Ultrafiltration zum Charakterisieren der Membran eher den Begriff der Trenngrenze als der Porengröße zu verwenden. Die Trenngrenze ist definiert als die Masse, ausgedrückt in Dalton, des von der betreffenden Membran zu 90, sogar 95% zurückgehaltenen Moleküls.
Die Mikrofiltration betreffend besteht diese aus einem Trennverfahren fest-flüssig unter Verwendung von Membranen, deren mittlerer Porendurchmesser ungefähr zwischen 0,1 und 10 μm liegt. Mit diesem Verfahren wird folglich ermöglicht, Partikel in Suspension zurückzuhalten.
Die Filterverfahren können in verschiedenen Arten und Anordnungen verwendet werden, wobei Art der Strömung und die Geometrie der Vorrichtung, in welcher die Membran angeordnet ist, eine bestimmende Wirkung auf die Ausbeute der Trennung haben. Beispiele für Arten und Anordnungen werden nachstehend unverbindlich angegeben.
Bei der Frontalfiltration wird die Flüssigkeit, die die zu trennenden Spezies enthält, senkrecht zur Membran getrennt, wohingegen bei der Tangentialfiltration die poröse Membran tangential von der Flüssigkeit überspült wird.
Die ebene Anordnung erleichtert den Aufbau-/Abbauvorgang und kann mit viskosen Flüssigkeiten verwendet werden. Jedoch muss die Gefahr einschränkender Phänomene wie unten angegeben, davon insbesondere Verstopfen, bei der Durchführung des Filterverfahrens in ebener Anordnung berücksichtigt werden.
Die spiralförmige Anordnung besteht aus einer in sich zusammengerollten flachen Membran. Das Filtrat wird somit in dem Mittelkanal gesammelt. Diese Anordnung ist vorteilhaft hinsichtlich der Kompaktheit, das Reinigen der Membran ist jedoch schwierig und der Abbau des Filtersystems unmöglich. Weiterhin werden nicht zu vernachlässigende Verstopfungen erzeugt.
Bei der rohrförmigen Anordnung wird die Membran im Innern einer zylindrischen Matrix aus porösem Stahl oder aus Glasfaser ausgelegt. Das Zuführen der zu filternden Lösung wird im Innern der Matrix durchgeführt, wobei die Lösung dann die Membran unter Wirkung von Druck durchquert und das Filtrat anschließend auf dem Äußeren der Matrix rückgewonnen wird. Dieses System weist den Vorteil einer bequemen Reinigung durch einfache Umkehr des Filterflusses auf, es sind jedoch bedeutende Abmessungen der Anlage erforderlich.
Die Wahl der Betriebsbedingungen für das Filterverfahren richtet sich im Allgemeinen danach, einschränkende Phänomene, und darunter das Zusetzen der Membran oder Verstopfen, und die Konzentrationspolarisation, zu reduzieren.
Das Verstopfen beruht auf physikalischen, chemischen und biologischen Problemen, die an der Grenzfläche Membran-Lösung auftreten. Sie sind durch eine Modifikation der Filtereigenschaften der Membran bei ihrer Verwendung insbesondere aufgrund von Problemen wie Ablagerung und/oder Adsorption, die eine Ansammlung des Materials in den Poren, anschließend an der Membranoberfläche, hervorrufen, gekennzeichnet. Folge des Verstopfens ist das sofortige Zusetzen der Poren, was zugleich Änderungen der Permeabilität und der Selektivität zur Folge hat, wodurch die Wirksamkeit der Trennung beeinträchtigt wird, manchmal schwerwiegend.
Bei den verwendeten Membranen mit der Eigenschaft, Trennungen im Molekular- oder Partikelbereich zu bewirken, ist das Ansammeln von Spezies (Moleküle oder Partikel), immer langsamer werdend und schließlich zum Stopp führend, auf der Oberfläche der Membranen ein unvermeidliches, dem Filtervorgang ureigenes Phänomen. Dieses Phänomen, Konzentrationspolarisation genannt, erzeugt einen Diffusionsfluss von der Membran ins Innere der zu behandelnden Lösung, das heißt in umgekehrter Richtung zum Filtrationsfluss, den der Versuchsleiter bei der Lösung zu erhalten wünscht. Folge der Konzentrationspolarisation ist eine Reduzierung des Filtrationsflusses, eine Änderung der Selektivität, wobei die mit der Ansammlung verbundene Ablagerung eventuell die Rolle einer "zweiten Membran" übernimmt, sowie eines Verstopfens der Poren der Membran aufgrund von Niederschlägen oder Gelbildung an der Oberfläche, wobei die gesammelten Arten ein Netz mit quasifestem Aussehen bilden.
Im Laufe des Schritts 10 des Extraktionsverfahrens gemäß der Erfindung (der nicht notwendig ist, wenn das zu analysierende Material Wasser ist), wird das Ausgangsmaterial, nämlich die komplexe Mischung, gefiltert, um die Partikel zurückzuhalten, deren mittlerer Porendurchmesser größer als ungefähr 5 μm, und vorzugsweise größer als ungefähr 8 μm, ist.
Unter "Membran" oder "Filter" wird im Sinn der vorliegenden Erfindung jede Vorrichtung verstanden, die der Definition "permselektive Membran" wie oben angegeben entspricht.
Das in Schritt 10 verwendete Filterverfahren ist eine Frontal-Mikrofiltration, wobei die Mikrofiltration in ebener Weise unter Vakuum durchgeführt wird.
Die Parameter zur Durchführung des Schritts der Mikrofiltration werden durch das zu erreichende Doppelziel auferlegt, nämlich einerseits mittels der Größe die in der komplexen Mischung enthaltenen Trümmer, welche gegebenenfalls eukaryotische Zellen umfassen, die entfernt werden müssen, sowie die prokaryotischen Zellen, bei welchen der tolerierte Verlustgrad minimal sein muss, zu unterscheiden und andererseits jedes einschränkende Phänomen, wie beispielsweise Verstopfen und Konzentrationspolarisation, zu vermeiden.
Zu diesem Zweck wird Schritt 10 mittels eines Filters durchgeführt, der aus einem Material besteht, das für die Behandlung der stark mit Partikeln geladenen viskosen Flüssigkeiten geeignet ist, wie beispielsweise Polycarbonat und Cellulosenitrat, wobei der Filter ein Einwegfilter ist, um jede Gefahr von Verschmutzung zwischen den unterschiedlichen Proben, die gleichzeitig behandelt werden können, zu vermeiden. Der mittlere Porendurchmesser des Filters liegt zwischen 1,2 und 12 μm, und vorzugsweise etwa gleich 5 μm.
Schritt 12 des Extraktionsverfahrens, welches Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, besteht in einer ebenen, Tangential-Mikrofiltration unter Vakuum.
Der bei diesem Schritt verwendete Rückhaltefilter 42, der in die Filterkartusche 40 eingesetzt ist, wurde so gewählt, dass selektiv die in dem aus Schritt 10 hervorgegangenen Filtrat enthaltenen Spezies getrennt werden und mit Mikroorganismen angereichert werden, wobei so viel wie möglich unerwünschte Trümmer und Spezies durchgelassen werden.
Die Kriterien zur Auswahl des Filters, nämlich ein minimaler Verlust in Prozent an Mikroorganismen in dem Filtrat und keine Nebeneffekte, die die Effzienz der Filtration einschränken könnten, haben die Erfinder dazu gebracht, einen Filter aus Polycarbonat oder aus Cellulosenitrat aufgrund der Gleichförmigkeit der Struktur der Poren sowie des hohen, nicht spezifischen Adsorptionsvermögens zu wählen. Der so gewählte Filter 42 weist einen mittleren Porendurchmesser zwischen 0,22 und 0,55 μm, bevorzugt ungefähr 0,45 μm, auf.
Schritt 14 des Extraktionsverfahrens gemäß der Erfindung betrifft die chemische und/oder mechanische Lyse von in dem aus Schritt 12 des Verfahrens hervorgegangenen Retentat enthaltenen Mikroorganismen. Wie zuvor angegeben, wird dieser Schritt in situ durchgeführt, das heißt auf gleicher Ebene mit der Filterkartusche 40.
Von den Erfindern gewünschtes Ziel war es, ein Lyseverfahren zu entwickeln, das zugleich: (i) wirksam ist; (ii) für die Biodiversität der komplexen Ausgangsmischungen geeignet ist, welche gegebenenfalls Gram-positive Bakterien und Sporen enthalten, deren Lyse, wenn herkömmliche Methoden angewendet werden, langwierig und schwierig ist; und schließlich (iii) für eine Automatisierung des gesamten Verfahrens passend ist.
Unter chemischer Lyse wird die Wirkung eines Reinigungsmittels an den prokaryotischen Zellen verstanden, wobei das Reinigungsmittel beispielsweise in einem Lysepuffer enthalten ist, der insbesondere aufweist:

– Tris-HCl (pH zwischen 7 und 9, vorzugsweise gleich ungefähr 8; und Konzentration zwischen ungefähr 25 und 400 mM, vorzugsweise gleich ungefähr 100 mM);
– gegebenenfalls die Gruppe der folgenden drei Bestandteile:
– EDTA (pH zwischen 7 und 9, vorzugsweise gleich ungefähr 8; und Konzentration zwischen ungefähr 10 und 100 mM, vorzugsweise gleich ungefähr 40 mM);
– NaCl (ungefähr 50 bis 800 mM, vorzugsweise ungefähr 200 mM);
– SDS (ungefähr zwischen 0,5 und 8%, vorzugsweise ungefähr 2%).
wobei die Mischung der oben genannten vier Bestandteile einen TENS genannten Puffer bildet (Kuske et al. 1998. Appl. Environ. Microbiol. 64: 2463-2472); und
– Chelex-100 (ungefähr zwischen 3 und 60%, vorzugsweise ungefähr 15%);

Die mechanische Behandlung besteht aus einer Ultrabeschallung der auf dem Rückhaltefilter fixierten prokaryotischen Zellen, wobei die Ultrabeschallung unter den gleichen Pufferbedingungen wie die chemische Lyse in einem Ultraschallwäscher und bei Temperaturen zwischen 60 und 100°C, und vorzugsweise angrenzend an 70°C, durchgeführt wird. Alternativ kann die mechanische Behandlung bei Umgebungstemperatur und trocken, das heißt durch direkte Fixierung des Behälters, der die zu lysierende Lösung enthält, auf dem Ultraschallgerät ohne Zwischenbad, durchgeführt werden, wobei jede Lysekartusche direkt auf eine unabhängige Sonotrode gesetzt wird.
Die chemische Behandlung, die alternativ zur mechanischen Lyse oder im Anschluss daran durchgeführt wird, wird unter Wärme durchgeführt. Der Ausdruck "unter Wärme" deckt im Sinn der vorliegenden Erfindung Temperaturen zwischen 80 und 120°C, und vorzugsweise angrenzend an 100°C, ab.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsweise der vorliegenden Erfindung weist Schritt 14 des Extraktionsverfahrens eine mechanische Behandlung bei Umgebungstemperatur und trocken auf, an die sich eine chemische Behandlung anschließt, wobei die Behandlungen wie oben beschrieben sind.
In hohem Maße denaturierende chaotrope Mittel können gegebenenfalls zu dem Lysepuffer hinzugefügt werden, um DNAse- und RNAse-Aktivitäten zu hemmen, die in der Lage sind, die Extraktionsausbeute der Nukleinsäuren zu mindern. Die für eine Verwendung im Rahmen des Verfahrens gemäß der Erfindung geeigneten chaotropen Mittel umfassen, ohne beschränkend zu sein, Guanidiumthiocyanat, Guanidiumchlorid, Harnstoff, Perchlorsäure, Trichloressigsäure, Natriumthiocyanat, Natriumjodid, Guanidiumisothiocyanat, Hexadecyltrimethylammoniumbromid (CTAB).
Gemäß einer Durchführungsweise des Extraktionsverfahrens, welches Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist (1, Spalte A), wird im Laufe des Schritts 16 die Lösung, welche die Nukleinsäuren von Interesse enthält, durch Ansaugen von der Kartusche 40 rückgewonnen. Vorteilhafterweise wird wenigstens eine Waschung der Kartusche 40 mit dem Puffer TE 1X durchgeführt, um den Verlust an Nukleinsäuren zu minimieren.
Dann wird mit Schritt 18 vorgesehen, die Nukleinsäuren auf einer Kieselerde-Kolonne zu konzentrieren und zu reinigen. Es wird hier auf die Flüssig-Fest-Adsorptionschromatographie Bezug genommen, eine Trennungsart, die auf der Verteilung der gelösten Stoffe zwischen dem fixierten Adsorptionsmittel und der beweglichen liquiden Phase basiert. In diesem Fall ist die Kieselerde ein dipolares Adsorptionsmittel. Die Fixierung durch Adsorption beruht auf dem Aufbau von sekundären Oberflächenbindungen, oder Dipol-Ion-Bindungen, zwischen dem Adsorptionsmittel und dem adsorbierten Molekül.
Schritt 18 besteht also aus wenigstens vier Unterschritten:

(181) der Verdünnung des Nukleinsäureextrakts, insbesondere in Gegenwart von absolutem Ethanol, um die Bindungen der Nukleinsäuren mit der Kieselerde zu optimieren;
(182) der Ablagerung der Mischung auf der Kieselerde-Kolonne;
(183) einer oder mehreren Waschungen der Kolonne gefolgt von deren Trocknen; und
(184) der Elution der in der Kieselerde-Kolonne zurückgehaltenen Nukleinsäuren.

Bei dem Unterschritt 182 werden die Nukleinsäuren auf der Kieselerde in Gegenwart von hohen Konzentrationen chaotroper Salze adsorbiert, welche das Wasser der hydratisierten Moleküle der gelösten Stoffe entfernen.
Die Polysaccharide sowie die Proteine werden nicht adsorbiert und im Laufe des Unterschritts 183 entfernt.
Im Rahmen des Unterschritts 184 wird die Elution der gereinigten Nukleinsäuren bei geringer Salinität durchgeführt.
Vorzugsweise werden die Unterschritte 181 bis 184 unter Vakuum durchgeführt, um jeden Rücklauf zu eventuellen Zentrifugiervorgängen zu verhindern, insbesondere, um den Waschpuffer sowie die Lösung aus Nukleinsäuren zu eluieren.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsweise weist das Extraktionsverfahren, das Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, weitere vorbereitende Schritte auf, deren Ziel es ist, die anschließende Handhabung der komplexen Mischung, die beispielsweise durch eine alimentäre Probe, wie ein Fleischprodukt der Art Hackfleisch oder ein Milchprodukt der Art Käse, dargestellt ist, zu erleichtern.
Die vorbereitenden Schritte bestehen aus:

(26) dem Zerkleinern der komplexen, insbesondere alimentären, Probe; und
(28) der enzymatischen und chemischen Vorbehandlung des so erhaltenen zerkleinerten Guts.

Die Erfindung betrifft gleichermaßen eine Filterkartusche 40, die für die Durchführung der Schritte 12 und 14 (1, Spalte A) des Extraktionsverfahrens für Nukleinsäuren von Mikroorganismen verwendbar ist.
Wenn der Schritt der Konzentrierung und Reinigung mittels Chromatographie (Schritt 18) durchgeführt wird, weist die Kartusche 40 einen Rückhaltefilter 42 aus Polycarbonat auf, dessen mittlerer Porendurchmesser vorzugsweise 0,45 μm beträgt, der zwischen zwei Filterstützen (Gitter) eingesetzt ist, wobei das Ganze von zwei Ringen aus Polymer gehalten wird, wie in 3 dargestellt ist. Diese Kartusche kann dicht verschlossen sein, um den Lysebehandlungen unterzogen zu werden (4), oder alternativ ist der Rückhaltefilter in einen Ring aus verspritztem Polymer eingepasst. In diesem Fall ist der Teil, auf dem die Filterkartusche angeordnet ist, von der Filterstation abgeschraubt und die Kartusche wird an ihrer Unterseite – das heißt der Seite, die nicht mit den Bakterien in Kontakt ist – mittels einer Abdeckung dicht abgeschlossen. Die Oberseite der Filterkartusche ist dicht verschlossen mittels einer Vorrichtung, die einen Trichter, einen Adapter, einen Filter zur Klärung des Lysats und ein Rohr von 15 ml mit konischem Boden aufweist. Der Adapter ist auf den Trichter geschraubt. Er enthält den Filter zur Klärung des Lysats, der zuvor in den Adapter eingesetzt wurde. Auf das freie Ende des Adapters ist ein Sammelrohr von 15 ml mit konischem Boden geschraubt, wie in 4 dargestellt ist.
Gegenstand der Erfindung ist weiter ein Extraktionsautomat für Nukleinsäuren von Mikroorganismen, die in einer komplexen, insbesondere alimentären, Mischung oder in Wasser enthalten sind, wobei der Automat für die Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung verwendbar ist.
Mit "Automat" wird jede Vorrichtung oder jedes Gerät bezeichnet, das für die Durchführung eines Verfahrens geeignet ist, dessen wesentliche Schritte automatisch durchgeführt werden, ohne dass die Bedienung, das Eingreifen oder die Überwachung durch einen Bediener erforderlich ist, außer gegebenenfalls auf Ebene einzelner Schritte und nicht grundsätzlich, zum Beispiel wenn der Anschluss zwischen zwei wesentlichen Schritten sichergestellt werden muss.
Die Erfindung sieht gleichermaßen eine Vorrichtung zur Extraktion und Detektion sowie gegebenenfalls Quantifizierung von Nukleinsäuren von Mikroorganismen, die in einer komplexen, insbesondere alimentären, Mischung enthalten sind, vor, welche einen Extraktionsautomaten für Nukleinsäuren gemäß der vorliegenden Erfindung aufweist, in Verbindung mit einem Amplifikationsautomaten in thermoabhängiger Kette der Nukleinsäuren.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Amplifikationsautomat in thermoabhängiger Kette, der in der Vorrichtung gemäß der Erfindung enthalten ist, der drehenden Art.
Ein Amplifikationsautomat in thermoabhängiger Kette für Nukleinsäuresequenzen, der im Rahmen der Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung verwendbar ist, wurde in dem Patent US 6,821,771 , das am 23. November 2004 erteilt wurde und die Priorität aus dem französischen Patent 2812306, erteilt am 14. Januar 2005, in Anspruch nimmt, beschrieben. Ein Beispiel für eine derartige Vorrichtung weist insbesondere auf: (i) eine Kartusche mit einer Mehrzahl an Reaktionskammern, welche die Starterpaare für die Amplifikation der spezifischen Nukleotidsequenzen enthält, mit welcher ein Behälter zum Zuführen von Extrakt von gereinigten Nukleinsäuren verbunden ist, die bei der Amplifikation als Matrix dienen; (ii) eine Heizplatte, bei der wenigstens zwei unterschiedliche Zonen auf wenigstens zwei verschiedene Temperaturen gebracht und konstant gehalten werden können, wobei jede Temperatur einem gegebenen Schritt in einem Amplifikationskreislauf entspricht, nämlich dem Schritt der Denaturierung, Hybridisierung oder Elongation; (iii) Mittel zum betreffenden Versetzen zwischen der Kartusche und der Platte, wobei durch das Versetzen sichergestellt wird, dass die Reaktionskammern zyklisch der Temperatur jeder Zone der Platte ausgesetzt werden, wodurch ermöglicht wird, automatisch die Zyklen der Amplifikationsreaktion aneinanderzureihen, die im Innern der Kammern ablaufen.
Die Erfindung wird, ohne dadurch eingeschränkt zu werden, durch die folgenden Zeichnungsfiguren dargestellt:
1: Schema des Extraktionsverfahrens für Nukleinsäuren.
2: Schema des Extraktionsautomaten für Nukleinsäuren. Es sind darin drei Stationen dargestellt, nämlich die Station 80, in welcher die Schritte 10 (optional), 12, 16 und 18 des Extraktionsverfahrens durchgeführt werden, und die Stationen 82 und 84, in denen Schritt 14 durchgeführt wird.
3: Schema einer Filterkartusche.
4: Schema des Aufbaus zur Durchführung von Schritt 14 des Extraktionsverfahrens.
5: Schema des Aufbaus zur Durchführung von Schritt 16 des Extraktionsverfahrens.
BEISPIELE
Das Extraktionsverfahren für Nukleinsäuren, das Gegenstand der Erfindung ist, wurde an zwei komplexen alimentären Mischungen, nämlich einem Fleischprodukt der Art Hacksteak und einem Käse mit weichem Teig, der unter der Marke Babybel^® vermarktet wird, sowie einer Trinkwasserprobe getestet. Die beiden komplexen alimentären Mischungen werden gemäß Spalte A aus 1 der vorliegenden Erfindung bearbeitet, wohingegen die Trinkwasserprobe gemäß Spalte B der 1 der vorliegenden Erfindung bearbeitet wird.
Die beiden komplexen Mischungen wurden mit bekannten Mengen von zwei verschiedenen Mikroorganismen geimpft (Listeria monocytogenes und Salmonella ser. Enteritidis), wobei die Mikroorganismen gewählt wurden, um die Wirksamkeit der Extraktion mittels des Verfahrens gemäß der Erfindung von Nukleinsäuren von Grampositiven und Gram-negativen Bakterien zu verifizieren. Die Trinkwasserprobe wurde mit bekannten Mengen eines Stamms von Legionella pneumophila, Serogruppe 1, geimpft.
I – Zerkleinern der alimentären Probe
Gemäß den von der AFNOR (Association Française de Normalisation) und dem FIL (Federation Internationale de Laiterie (Internationaler Milchwirtschaftsverband; IMV)) herausgegebenen und verbreiteten Normen, die zurzeit in Kraft sind, wurde die alimentäre Probe mittels eines Stomachers zerkleinert, um eine Ausgangssuspension herzustellen.
Die eingewogene Menge der alimentären Probe, 25 g, wurde zu 1/10tel in einem Verdünnungsmittel gemäß den Normen NF V 08-010 (März 1996, Verlag AFNOR, Paris, Frankreich), NF V 04-501 (April 1998, Verlag AFNOR) und FIL 122C:1996 (Dezember 1996, Verlag FIL, Brüssel, Belgien) suspendiert. Gemäß den Normen hängt die Zusammensetzung des Verdünnungsmittels von der Art des Nahrungsmittels ab. Im vorliegenden Fall wurden das Hacksteak und der Käse jeweils in Pepton-Wasser gepuffert und in Natriumcitrat zu 20 g/l suspendiert.
Die so erhaltenen Suspensionen wurden für 3 Minuten zerkleinert.
Aliquote zu 10 ml des zerkleinerten Guts, was 1 g des Nahrungsmittels vom Anfang darstellt, wurden am Ende der Extraktion von Nukleinsäuren entnommen.
Die alimentären Matrizen können gleichermaßen nach einer Anreicherung mit Ziel-Mikroorganismen in dem beschriebenen Kulturmedium entsprechend dem gesuchten Mikroorganismus, durch die gültigen AFNOR-Normen, angereichert werden. In diesem Fall wird die enzymatische Vorbehandlung direkt mit 10 ml des angereicherten Mediums durchgeführt.
II – Enzymatische und chemische Vorbehandlung der alimentären Probe
Dieser Schritt ermöglicht, die Fettkügelchen und die Proteinmicellen zu hydrolysieren, um Phänomene wie Verstopfen zu vermeiden, die geeignet sind, die Ausbeute der späteren Filterschritte zu mindern.
Die Zusammensetzungen der Lösungen zur Vorbehandlung wurden auf empirische Weise in Anbetracht einer bibliographischen Studie (Driehuis und Teernstra 1992. Neth. Milk Dairy J. 46: 209-215; Starbuck et al. 1992. Lett. Appl. Microbiol. 15: 248-252; Yang und Lundahl 1994. Anal. Biochem. 218: 210-221; Rijpens et al. 1996. Appl. Environ. Microbiol. 62: 1683-1688) bestimmt.
Die zu jedem Aliquot von 10 ml hinzugefügten Adjuvantien setzten sich zusammen aus 0,2 g Trypsin für das zerkleinerte Gut des Hacksteaks und 0,2 g Pankreatin, 10 mM EDTA, 5% Triton und 4% Cholsäure für das zerkleinerte Gut des Käses.
Die Proben wurden bei 25°C für 1 Stunde für das zerkleinerte Gut des Hacksteaks und bei 30°C für 1 Stunde 30 Minuten für das zerkleinerte Gut des Käses inkubiert. Dieser Inkubationsschritt ermöglicht weder das Wachstum bedeutsamer Bakterien noch eine "vorzeitige" Lyse der prokaryotischen Zellen, zwei Phänomene, die in der Lage sind, der Ausbeute des Verfahrens zu schaden.
III – Mikrofiltration des alimentären zerkleinerten Guts (Schritt 10)
III-1- Abstimmung des Protokolls
Unter Berücksichtigung der relativen Auflagen zur Vermeidung von Verstopfungen wurden Filter aus Cellulosenitrat mit einem mittleren Porendurchmesser von 8 μm gewählt.
Die Mikrofiltration wurde auf ebene Weise unter Vakuum durchgeführt.
Jede 10 ml des vorbehandelten alimentären zerkleinerten Guts wurden gefiltert. Je nachdem, ob es sich um Hacksteak oder Käse handelt, wurde die Mikrofiltervorrichtung mit 40 ml des Puffers TE 1X (Tris-HCl 10 mM pH 8,0 und EDTA 1 mM pH 8,0) oder 10 ml Triton 0,5% (mit sterilem destilliertem Wasser verdünnt), jeweils vorgeheizt auf 50°C, gewaschen. Durch diesen Schritt des Waschens wird beabsichtigt, den Materialverlust einzuschränken, insbesondere der Bakterien von Interesse, und die Proben zu verdünnen, um Verstopfungen zu vermeiden, insbesondere beim nachfolgenden Schritt des Zurückhaltens auf dem Filter.
Am Ende des Schritts der Mikrofiltration wurden für jede 10 ml des zerkleinerten Guts vom Anfang entsprechend aus Käse oder Hacksteak 20 und 50 ml des Filtrats, welches die Ziel-Bakterien enthält, erhalten.
III-2-Bedingungen für die Durchführung mittels Automat
Dieser Schritt wird auf der mit der Pumpe verbundenen Filterstation mittels eines Aufbaus durchgeführt, der von oben nach unten einen Einweg-Trichter, eine Einweg-Vorfilterkartusche, einen Zylinder aus Kunststoff und eine Einweg-Rückhaltekartusche aufweist. Dieser Aufbau ist mit der Filterstation 80 mittels eines Kunststoffteils (2) verbunden.
Die Mikrofiltration wurde auf ebene Weise durchgeführt.
Die Flüssigkeiten (alimentäre zerkleinerte Güter, hinzugefügt zum Waschpuffer) wurden manuell verteilt.
IV – Zurückhalten von Mikroorganismen (Schritt 12)
IV-1-Abstimmung des Protokolls
Nach einer Anzahl von Tests des Rückhaltefilters unter Berücksichtigung der betreffenden Auflagen zur Vermeidung von Verstopfen wurde die besten Ergebnisse mit Polycarbonat-Filtern mit einem mittleren Porendurchmesser von 0,45 μm beobachtet.
Das Filtrat zu 40 ml wurde auf dem so ausgewählten Rückhaltefilter 42 gefiltert.
Das Filtrat wurde entfernt und der Rückhaltefilter 42 in einem Rohr aus Polypropylen angeordnet.
Bezüglich der Trinkwasserproben sind die Schritte des Zerkleinerns der Probe sowie die enzymatische und chemische Vorbehandlung der Probe nicht erforderlich (1, Spalte B). Gemäß den von der AFNOR (Association Française de Normalisation) herausgegebenen und verbreiteten Normen, die zurzeit in Kraft sind, beträgt die eingewogene Menge der Trinkwasserprobe zwischen 250 ml und 2 l, und vorzugsweise 1 l. Die eingewogene Menge wird direkt auf dem Polycarbonat-Filter mit einem mittleren Porendurchmesser von 0,45 μm gefiltert, um die Bakterien der Art Legionella zurückzuhalten.
IV-2-Bedingungen für die Durchführung mittels Automat
Das Vorfiltern und das Zurückhalten wurden direkt in Reihe durchgeführt, das Filtrat von 40 ml wird direkt vom Ausgang des Vorfilterns mittels eines Zylinders in die am Eingang des Moduls 80 des Extraktionsgeräts angeordnete Rückhaltekartusche 40 gebracht (2).
Ein Müllbeutel ist vorgesehen, um das Filtrat entfernen zu können.
V – Lyse der Ziel-Mikroorganismen (Schritt 14)
V-1-Abstimmung des Protokolls
Am Ausgang des vorausgegangenen Schritts wurde der Rückhaltefilter 42 in einem Rohr aus Polypropylen abgelagert, da dieses Material dem zur Herstellung der Filterkartusche 40 erforderlichen Polymer sehr ähnlich ist.
Das auf dem Rückhaltefilter 42 fixierte Retentat wurde in 1 ml Lysepuffer Tris-HCl 100 mM pH 8,0 – Chelex-100 25% suspendiert.
Das Rohr aus Polypropylen, welches den Rückhaltefilter 42 enthält, und der Lysepuffer wurden in einem Ultraschallbad von 120 W angeordnet. Die Ultrabeschallung wurde bei 70°C für 40 min und bei 80% der maximalen Leistung des Ultraschallgeräts, also einer Leistung zwischen 80 und 120 W, und vorzugsweise 100 W, durchgeführt.
Das Rohr wurde dann im Wasserbad für 10 min bei 100°C inkubiert.
V-2-Bedingungen für die Durchführung mittels Automat
Das auf der Filterstation positionierte Kunststoffteil der Pumpe, mit dem die Filterkartusche verbunden ist, wurde abgeschraubt. Die Filterkartusche wurde auf ihrer Unterseite mit einer Abdeckung verschlossen. 2 ml Lysepuffer Tris-HCl 100 mM pH 8,0 – Chelex-100 25% wurden auf der Filterkartusche abgelagert. Die Letztgenannte ist an ihrer oberen Seite durch einen Trichter verschlossen, auf welchen ein Adapter mit einer Kolonne zur Klärung des Lysats und ein Rohr zu 15 ml (4) geschraubt ist.
Der Aufbau zur Durchführung der Lyse wird dann von dem Versuchsleiter auf einer Sonotrode auf dem Modul 82 für 40 min bei einer Frequenz von 35 KHz angeordnet.
Die Kartusche wird dann von dem Versuchsleiter in einem Wasserbad zum Trocknen auf dem Modul 84 für 10 min bei 100°C angeordnet.
VI – Rückgewinnung der Nukleinsäuren (Spalten A und B, Schritt 16)
VI-1-Abstimmung des Protokolls
Das in dem Rohr aus Polypropylen enthaltene Bakterienlysat wird mit Hilfe einer Pipette zu 1 ml entnommen und in einem mit einer "Filter"kolonne ausgestatteten neuen Rohr angeordnet. Das Lyserohr wird dann mit 1 ml TE 1X gespült, welches gleichermaßen entnommen und auf der "Filter"kolonne angeordnet wird. Das Lysat wird dann auf der "Filter"kolonne durch einfache Schwerkraft gefiltert. Das gefilterte Lysat wird entnommen und direkt mittels PCR analysiert oder gemäß Schritt 18 aus Spalte B (1) konzentriert und gereinigt.
VI-2-Bedingungen für die Durchführung mittels Automat
Der für die Durchführung der Lyse erforderliche Aufbau, welche die Filterkartusche 40 enthält, wird von dem Versuchsleiter auf der Filterstation auf dem Modul 80 angeordnet. Nachdem die Abdeckung durch einen kleinen Behälter (5) ersetzt wurde, wird die Pumpe angeschlossen, um das Lysat durch die "Filter"kolonne zu filtern. Der Versuchsleiter lagert dann 1 ml TE 1X auf der Filterkartusche ab, das TE ermöglicht das Spülen des Rückhaltefilters 42. Das Rohr aus Polypropylen, welches das gefilterte Lysat enthält, wird entnommen und die DNA direkt mittels PCR analysiert oder gemäß Schritt 18 aus Spalte B (1) konzentriert und gereinigt.
VII – Konzentrierung und Reinigung der Nukleinsäuren durch Fest-Flüssig-Chromatographie (Spalte B, Schritt 18)
VII-1-Abstimmung des Protokolls
Die Nukleinsäuren wurden mittels einer Kieselerde-Kolonne, wie sie in dem System "Nucleospin Plant L" (Macherey-Nagel, Düren, Deutschland) erhältlich ist, konzentriert und gereinigt.
Eine Kieselerde-Kolonne wurde in einer Vakuumkammer angeordnet, welche es ermöglicht, mehrere Proben gleichzeitig zu behandeln. Die Kammer war gebildet aus einer Glasküvette, die mit einem Manometer und einer Abdeckung aus Polypropylen ausgestattet ist, wobei die Abdeckung auf ihrer Außenseite die Kolonnen aufnehmen kann und auf ihrer Innenseite Einweg-Kanülen, die die Übertragung der Flüssigkeit gewährleisten.
Gegebenenfalls konnte das Vakuum jeder Kolonne mittels eines entfernbaren Hahns geregelt werden.
In dem Glasbehälter befand sich ein Träger, der es ermöglicht, die Rohre unterhalb jeder Kanüle anzuordnen, um die unterschiedlichen Flüssigkeiten (Bindungspuffer und Ethanol, Waschlösungen, Eluat) rückzugewinnen.
Die Nukleinsäuren (1 Volumen) wurden mit 1 Volumen Bindungspuffer (Puffer "C4" des oben genannten vermarkteten Systems) und 1 Volumen absolutem Ethanol gemischt. Die Mischung wurde kräftig für 30 Sekunden gerührt, dann auf einer Kolonne wie oben beschrieben abgelagert.
Die Kieselerde-Kolonne wurde zuerst mit 1 ml Waschpuffer "CQW", dann mit 2 ml des Puffers "C5" gewaschen, wobei die Puffer mit dem System "Nucleospin Plant L" geliefert wurden.
Das in der Glasküvette angeordnete Rohr, welches die aus den Waschschritten hervorgegangenen Abfälle enthält, wurde evakuiert.
Das Vakuum wurde dann für 12 Minuten zum Zweck des Trocknens der Kolonne angewendet.
200 μl des auf 70°C vorgeheizten Puffers "CE" wurden auf der Kolonne für 5 Minuten inkubiert.
Nach Elution unter Vakuum in einem neuen Rohr wurde der vorausgegangene Schritt einmal wiederholt. Die Nukleinsäuren wurden dann unter Vakuum für 5 Minuten eluiert.
Die so gereinigte Menge an Nukleinsäuren liegt zwischen 15 und 250 μl, und beträgt vorzugsweise 200 μl.
VII-2-Bedingungen für die Durchführung mittels Automat
Der Adapter, welcher ein Rohr aus Polypropylen enthält und dazu bestimmt ist, das gefilterte Lysat zu sammeln, und die "Filter"kolonne werden von der Filterstation abgeschraubt. Die "Filter"kolonne wird entfernt und durch eine Kieselsäure-Kolonne ersetzt, die erforderlich ist, um die DNA zu konzentrieren und zu reinigen. Hierbei ist die Kolonne nicht in einem Rohr enthalten, um die Entfernung des Lysats (welches keine DNA mehr enthält, da diese auf der Kieselerde zurückgehalten worden sein sollte) und von Waschflüssigkeiten, die direkt in einem Abfallbehälter gesammelt werden, zu ermöglichen.
Das in dem Rohr aus Polypropylen enthaltene gefilterte Lysat (1 Volumen) wird mit 1 Volumen des Bindungspuffers (Puffer "C4" des von Macherey-Nagel vermarkteten Systems) und 1 Volumen absolutem Ethanol gemischt. Diese Mischung wird für 30 Sekunden kräftig gerührt, dann auf der Filterstation auf der erneut angeordneten Kieselerde-Kolonne abgelagert. Nach Anschluss der Pumpe, um sicherzustellen, dass das Lysat auf der Kieselerde-Kolonne gefiltert wird, wird die auf der Kieselerde rückgehaltene DNA mit 1 ml Waschpuffer "CQW", dann mit 2 ml Puffer "C5" gewaschen, wobei die Puffer mit dem System "Nucleospin Plant L" geliefert wurden und vom Versuchsleiter manuell verteilt werden.
Das Vakuum wird dann für 15 Minuten zur Trocknung der Kolonne angewendet.
Ein neues Rohr für die Rückgewinnung der konzentrierten und gereinigten DNA wird auf das freie Ende des Adapters geschraubt.
200 μl des auf 70°C vorgeheizten Puffers TE 1X werden für 5 Minuten auf der Kolonne inkubiert. Nach Elution unter Vakuum für 1 Minute in dem neuen Rohr wird der vorausgegangegene Schritt erneut einmal durchgeführt.
Die so gereinigte Menge an Nukleinsäuren liegt zwischen 100 und 300 μl, und beträgt vorzugsweise 200 μl.

Claims

Verfahren zur Extraktion von Nukleinsäuren von Mikroorganismen, die in einer komplexen, insbesondere alimentären, Mischung oder in Wasser enthalten sind, welches wenigstens die folgenden Schritte aufweist: (12) das Zurückhalten von in der Mischung enthaltenen Mikroorganismen auf einer Vorrichtung der Art Filterkartusche (40); (14) die Lyse von Mikroorganismen in situ; und (16) die Rückgewinnung von Nukleinsäuren von der Filterkartusche (40) auf einem Adapter mit einem Klärungsfilter, wobei die Nukleinsäuren in Form eines gefilterten Lysats rückgewonnen werden.
Verfahren gemäß Anspruch 1, bei welchem dem Schritt (12) ein Schritt (10) zur Klärung der komplexen Mischung durch Filtration vorausgeht, wobei der Schritt (12) dann auf dem aus Schritt (10) hervorgegangenen Substrat durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, bei welchem der Schritt (10) zur Klärung der komplexen Mischung mittels eines Filters zur einmaligen Benutzung aus Polycarbonat oder aus Cellulosenitrat durchgeführt wird, dessen Poren einen mittleren Durchmesser zwischen 1,2 und 12 μm, vorzugsweise 5 μm, aufweisen.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, bei welchem dem Schritt (16) ein Schritt (18) der Konzentration und Reinigung von Nukleinsäuren durch Flüssig-Fest-Adsorptionschromatographie folgt.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, bei welchem die bei den Schritten (12) und (14) verwendete Kartusche (40) einen Rückhaltefilter (42) aufweist.
Verfahren gemäß Anspruch 4, bei welchem der Schritt (18) auf einer Kieselerde-Kolonne durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 6, bei welchem der Schritt (18) wenigstens die folgenden Unterschritte aufweist: (181) die Verdünnung des Nukleinsäureextrakts; (182) die Ablagerung der Mischung auf der Kieselerde-Kolonne; (183) wenigstens eine Waschung gefolgt von Trocknen der Kolonne; und (184) die Elution der in der Kieselerde-Kolonne zurückgehaltenen Nukleinsäuren.
Verfahren gemäß Anspruch 7, bei welchem die Unterschritte (181) bis (184) unter Vakuum durchgeführt werden.
Verfahren gemäß Anspruch 1, bei welchem der Schritt (12) aus einer tangentialen Mikrofiltration besteht, die mittels eines in der Kartusche (40) enthaltenen Rückhaltefilters (42) durchgeführt wird, wobei der Filter (42) aus Cellulosenitrat oder aus Polycarbonat ist und einen mittleren Porendurchmesser von 0,22 bis 0,55 μm und vorzugsweise 0,45 μm aufweist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, bei welchem der Schritt (14) eine chemische Lysebehandlung aufweist, die in der Wärmewirkung, insbesondere bei 70°C, des Reinigungsmittels besteht, das in dem Lysepuffer enthalten ist, welcher aufweist: – Tris-HCl (pH zwischen 7 und 9, vorzugsweise gleich ungefähr 8; und Konzentration zwischen ungefähr 25 und 400 mM, vorzugsweise gleich ungefähr 100 mM); – Chelex-100 (ungefähr zwischen 3 und 60%, vorzugsweise ungefähr 15%); – und gegebenenfalls die Gruppe der folgenden drei Bestandteile: – EDTA (pH zwischen 7 und 9, vorzugsweise gleich ungefähr 8; und Konzentration zwischen ungefähr 10 und 100 mM, vorzugsweise gleich ungefähr 40 mM); – NaCl (ungefähr 50 bis 800 mM, vorzugsweise ungefähr 200 mM); – SDS (ungefähr zwischen 0,5 und 8%, vorzugsweise ungefähr 2%).
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, bei welchem der Schritt (14) eine mechanische Lysebehandlung aufweist, die aus der Ultrabeschallung von Mikroorganismen in dem Puffer, der TENS und Chelex-100, vorzugsweise TENS 2X und Chelex-100 15% aufweist, besteht.
Verfahren gemäß Anspruch 11, bei welchem die Ultrabeschallung bei Wärme, ungefähr bei 70°C, durchgeführt wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, bei welchem der Schritt (14) eine mechanische Lysebehandlung aufweist, die aus der Trockenbeschallung von Mikroorganismen besteht.
Verfahren gemäß Anspruch 1, bei welchem der Schritt (14) eine mechanische Lysebehandlung gemäß einem der Ansprüche 11 bis 13 und eine chemische Lysebehandlung gemäß Anspruch 10 aufweist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, welches des Weiteren die folgenden vorbereitenden Schritte aufweist: (26) das Zerkleinern der komplexen, insbesondere alimentären, Probe; und (28) die enzymatische und chemische Vorbehandlung des erhaltenen zerkleinerten Guts.
Extraktionsautomat für Nukleinsäuren von Mikroorganismen, die in einer komplexen, insbesondere alimentären, Mischung oder in Wasser enthalten sind, für die Durchführung des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass dieser wenigstens drei Module (80, 82, 84) aufweist, wobei das erste der Module die Schritte (12), (16) und (18) durchführt, das zweite und dritte Modul (82) und (84) den Schritt (14) des Extraktionsverfahrens durchführen.
Automat gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass das erste Modul (80) gleichermaßen in der Lage ist, den Schritt (10) des Extraktionsverfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15 durchzuführen.
Vorrichtung für die Extraktion, Detektion und gegebenenfalls Quantifizierung von Nukleinsäuren von Mikroorganismen, die in einer komplexen, insbesondere alimentären, Mischung oder in Wasser enthalten sind, welche einen Extraktionsautomaten für Nukleinsäuren gemäß einem der Ansprüche 16 und 17 aufweist, in Verbindung mit einem Amplifikationsautomaten in thermoabhängiger Kette der Nukleinsäuren.
Vorrichtung gemäß Anspruch 18, bei welcher der Amplifikationsautomat in thermoabhängiger Kette der drehenden Art ist.