DE202004006675U1

DE202004006675U1 - Vorrichtung zur Reinigung von Nukleinsäuren

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Publication number: DE202004006675U1
Application number: DE202004006675U
Authority: DE
Original assignee: Roche Diagnostics GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 2004-03-18
Filing date: 2004-03-18
Publication date: 2004-09-16
Anticipated expiration: 2014-03-19

Abstract

Vorrichtung zur Reinigung oder Isolierung von Nukleinsäuren bestehend aus einem ersten Hohlkörpern 100 mit einer Eintrittsöffnung 101 für eine Probe und einer Austrittsöffnung 102 und einem zweiten Hohlkörpern 200 mit einer Eintrittsöffnung 201 und einer Austrittsöffnung 202, wobei die Eintrittsöffnung des zweiten Hohlkörpers 201 mit der Austrittsöffnung des ersten Hohlkörpers 102 funktionell verbunden ist, wobei der erste und der zweite Hohlkörper voneinander gelöst werden können und wobei sich vor der Austrittsöffnung des zweiten Hohlkörpers 202 ein nukleinsäurebindendes Material 203 befindet.

Description

Technisches Gebiet
Gegenstand der Erfindung ist eine Vorrichtung zur Isolierung und Reinigung von Nukleinsäuren aus einer Probe.
Stand der Technik
Mit der Einführung der Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) und nachfolgender alternativer Amplifikationssysteme für Nukleinsäuren ist die Verwendung dieses genetischen Materials als Untersuchungsmaterial für diagnostische Tests möglich geworden. Dadurch sind vor allem bei der Diagnose von Erbkrankheiten, der Prädisposition für gewisse Erkrankungen und von Infektionskrankheiten neue Analysemöglichkeiten, die u. a. eine frühere Erkennung des Zustandes erlauben, gegeben.
Um das genetische Material in eine geeignete Form für die enzymatische Amplifikation zu überführen, ist die Freisetzung aus dem biologischen Probenmaterial erforderlich. Weiterhin muss die Nukleinsäure vor Degradation durch Nukleasen aus dem biologischen Material oder der Umgebung und Abbau durch chemische Reaktionsbedingungen geschützt werden. Die größten Anforderungen werden an die Kontaminationsfreiheit der biologischen Probe und der daraus isolierten Nukleinsäure gestellt. Die Nukleinsäure sollte für die Amplifikation in einer gepufferten, wässerigen, möglichst salzfreien Lösung vorliegen.
Während die PCR grundsätzlich sehr geringe Analytmengen verwendet (pg- ng Bereich), erfordern spezielle Fragestellungen die Aufarbeitung einer größeren Probenmenge. Um etwa zirkulierende Tumorzellen mit einer Sensitivität von einer Tumorzelle in einem Hintergrund von normalen Zellen zu identifizieren, muss z. B. die Nukleinsäure aus 10 – 20 ml einer Blutprobe isoliert werden. So kann dann nach Homogenisierung der Probe ein Aliquot der isolierten RNA auf Expression eines tumorassoziierten Gens untersucht werden.
Neben den klassischen Methoden der Nukleinsäure-Isolierung mittels enzymatischer, mechanischer oder chemischer Lyse des Probenmaterials, nachfolgender Extraktion der Proteine und Lipide durch Phenol und Phenol/CHCl₃ und Präzipitation der Nukleinsäure aus der wässerigen Phase mittels Ethanol oder i-Propanol (Sambrook, J., et al., Molecular Cloning, Cold Spring Habor Laboratory Press, 1989, 2nd Edition, 9.16 – 9.23; Ausubel, F.M., et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 1987, 2.1.1 – 2.4.5) wurden in den letzten Jahren einige kommerzielle Kits speziell für die PCR-Probenvorbereitung entwickelt, welche die seit Ende der siebziger Jahre bekannte Eigenschaft von Nukleinsäuren nutzen, unter chaotropen Salzbedingungen an Glasoberflächen zu binden (Vogelstein, B., et al1., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 (1979) 615–619). Andere Inhaltstoffe biologischen Materials, wie Proteine, Lipide oder Salze, werden nicht gebunden und daher abgetrennt. Zentrifugationsgefäße mit eingelegten Glasvliesen oder Silikagel-Suspensionen, die einen Batchprozeß erlauben, sind bekannt. Weiterhin sind Mehrfachvorrichtungen im Streifen- und 96-well-Mikrotiterplatten- Format mit in den Boden eingelassenen Glasvliesen bekannt, die sowohl mit Hilfe einer darunter angebrachten Vakuumkammer als auch durch Zentrifugation betrieben werden können. Bei diesen Verfahren ist das Volumen der Proben oft begrenzt. Für eine effektive Elution der Nukleinsäuren aus den Glasvliesen sind zudem große Puffermengen nötig, die zu einer verdünnten Lösung der isolierten Moleküle führt und für gewisse Anwendungen zusätzliche Präparationsschritte nötig werden.
Ein modifiziertes Verfahren (Miller et al., Nucl. Acids Res. 16: 1215) verwendet nach der Lyse des Probenmaterials eine konzentrierte Salzlösung zur Ausfällung von Proteinen und anderen Begleitstoffen. Die im Überstand befindlichen Nukleinsäuren werden dann durch Ethanol ausgefällt und durch Zentrifugation gesammelt. Nach Lösen der Nukleinsäuren sind sie für die Amplifikation einsetzbar.
WO 93/11221 offenbart ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Isolation und Reinigung von Nukleinsäuren, das Anionenaustauscher und mineralische Trägerstoffe verwendet. WO 98/32877 offenbart eine Vorrichtung zum Isolieren von Nukleinsäuren, die aus zwei Gefäßen aufgebaut ist, die über ein Verschlusselement verbunden sind, in welchem ein Material zur Bindung der Nukleinsäuren eingebracht ist. US 4,956,298 offenbart eine Separations- oder Reaktionssäule bestehend aus einem Zentrifugiergefäß und einem Aufnahmekörper, wobei das Aufnahmegefäß ein Säulenmaterial enthält und das Zentrifugiergefäß den Ausfluss des Aufnahmekörpers auffängt. DE 19512361 offenbart ein Verfahren zur Isolierung eines biologischen Materials, das eine komprimierbare poröse Matrix zum Binden des biologischen Materials und die Kompression des Materials zur Elution des Materials verwendet. EP 588564 beschreibt eine Vorrichtung zur Affinitätstrennung mit einer in einer Pipettenspitze angeordneten Einfangmembran. WO 96/41810 offenbart die Entnahme von DNA aus einer Zellsuspension mit Hilfe eines hohlen Membranfilters und einem Ionenaustauschschritt. Die Herstellung einer Vorrichtung mit einem Material zur Bindung von Nukleinsäuren ist aus der EP 738733 bekannt. Das deutsche Gebrauchsmuster DE 298 03 712 U1 beschreibt eine Vorrichtung zur Behandlung von Biomolekülen mit einer Trennsäule, die eine Trenneinrichtung aufweist und einem Auffanggefäß für die austretende Flüssigkeit.
Zusammenfassung der Erfindung
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, eine neue Vorrichtung zur Reinigung oder Isolierung von Nukleinsäuren aus größeren Probenvolumina bereitzustellen.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch eine Vorrichtung gelöst, deren einzelne Bestandteile in 1 gezeigt werden. Weiterhin wird ein Verfahren beschrieben, in dem die erfindungsgemäße Vorrichtung verwendet wird und dessen einzelnen Phasen schematisch und beispielhaft ebenfalls in 1 dargestellt sind. Das Verfahren, in dem die Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wird, gewährleistet eine größere Ausbeute der Nukleinsäuren.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Vorrichtung zur Reinigung oder Isolierung von Nukleinsäuren bestehend aus einem ersten Hohlkörpern 100 mit einer Eintrittsöffnung 101 für eine Probe und einer Austrittsöffnung 102 und einem zweiten Hohlkörper 200 mit einer Eintrittsöffnung 201 und einer Austrittsöffnung 202, wobei die Eintrittsöffnung des zweiten Hohlkörpers 201 mit der Austrittsöffnung des ersten Hohlkörpers 102 funktionell verbunden ist, wobei der erste und der zweite Hohlkörper voneinander gelöst werden können und wobei sich vor der Austrittsöffnung des zweiten Hohlkörpers 202 ein nukleinsäurebindendes Material 203 befindet.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Gefäß 400, das eine erfindungsgemäße Vorrichtung enthält.
Ein Verfahren zur Reinigung oder Isolierung von Nukleinsäuren aus einer Probe unter Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung besteht aus den Schritten:

a) Bereitstellen der erfindungsgemäßen Vorrichtung,
b) Überführen der Probe in die Vorrichtung durch die Eintrittsöffnung im ersten Hohlkörper,
c) Durchtritt der Probe vom zweiten Hohlkörper durch das nukleinsäurebindende Material in ein Gefäß, wobei die Nukleinsäuren an das nukleinsäurebindende Material binden
d) optionales Waschen der an das nukleinsäurebindende Material gebundenen Nukleinsäuren,
e) Lösen des zweiten Hohlkörpers vom ersten Hohlkörper und Überführung des zweiten Hohlkörpers in ein Auffanggefäß 900,
f) Waschen der an das nukleinsäurebindende Material gebundenen Nukleinsäuren,
g) Elution der an das nukleinsäurebindende Material gebundene Nukleinsäuren, wodurch die Nukleinsäuren in einem zweiten Auffanggefäß 13 gesammelt und damit gereinigt oder isoliert werden.

Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist ein Kit zur Reinigung oder Isolierung von Nukleinsäuren aus einer Probe, der sich aus einer erfindungsgemäßen Vorrichtung oder eines erfindungsgemäßen Gefäßes und chaotropen Reagenzien zur Bindung der Nukleinsäuren an das nukleinsäurebindende Material zusammensetzt.
Unter einem nukleinsäurebindenden Material wird ein Material verstanden, an dass Nukleinsäuren unter bestimmten Bedingungen nicht-kovalent binden, wobei hingegen andere Stoffe einer Probe unter diesen Bedingungen nicht binden. Diese Bindung der Nukleinsäuren ist reversibel, so dass die Nukleinsäuren anschließend durch Änderung der Bedigungen wieder von dem Material eluiert werden können.
Unter einer Matrix wird im Rahmen dieser Erfindung ein Material verstanden, in das Partikel oder Fasern des nukleinsäurebindenden Materials eingebettet sind. Das Matrixmaterial ist hierbei flüssigkeitsdurchlässig, so dass die Probe die Matrix durchtreten kann, die Nukleinsäuren mit dem nukleinsäurebindenden Material in Kontakt treten können und andere Bestandteile der Probe die Matrix wieder verlassen. Als Partikel bezeichnet der Fachmann feste Materialien mit einem geringen Durchmesser. Bevorzugt haben diese Partikel eine im wesentlichen kugelige Oberfläche. Plättchenförmige und fadenförmige Teilchen aus dem nukleinsäurebindenden Material werden als Fasern bezeichnet.
Ein Hohlkörper ist im Rahmen dieser Erfindung ein hohles Gebilde mit einer Eintrittsöffnung, durch die eine Probe in den Hohlkörper eindringen kann und einer Austrittsöffnung, durch die die Probe den Hohlkörper wieder verlassen kann. Ein Gefäß hingegen ist ein hohles Gebilde mit nur einer Eintrittsöffnung durch die eine Probe in das Gefäß eindringen kann. Es kann also zum Auffangen einer Probe benutzt werden.
Unter der funktionellen Verbindung von Hohlkörpern wird im Rahmen dieser Erfindung verstanden, dass die Verbindung der beiden Hohlkörper so ausgeführt ist, dass die Durchführung des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung möglich ist. Dazu soll die Verbindung bei Bedarf gelöst werden können, undurchlässig für Flüssigkeiten sein und für gewisse Anwendungen auch den Luftaustausch mit der Umgebung verhindern. Außerdem soll ein verlustfreier Durchtritt der Probe von dem ersten Hohlkörper in den zweiten Hohlkörper gewährleistet sein.
Unter chaotropen Reagenzien versteht man Substanzen, die die sekundäre, tertiäre und/oder quartäre Struktur von Proteinen oder Nukleinsäuren verändern, aber zumindest die Primärstruktur nicht beeinflussen. Beispiele sind z.B. Guanidiniumthiocyanat, Guanidinhydrochlorid, Nal, Kl, Natriumthiocyanat oder Kombinationen dieser Substanzen. Im Rahmen dieser Erfindung versteht man unter chaotropen Reagenzien alle chemischen Substanzen, die die geordnete Struktur von flüssigem Wasser stören und somit die Bindung von DNA oder RNA aus dieser wässrigen Lösung an eine Glasoberflächen bewirken. In der Lösung können auch weitere Substanzen wie NaCl, KCl oder CaCl₂ enthalten sein, um die Ionenstärke zu modifizieren. Die Eigenschaft von DNA und RNA unter chaotropen Bedingungen an Glasoberflächen zu binden kann für ihre Isolation aus einer Lösung mit weiteren biologischen Materialien verwendet werden, da die Bindung an die Glasoberfläche reversible ist. Wird die Konzentration der chaotropen Reagenzien beispielsweise reduziert oder werden die chaotropen Reagenzien ganz entfernt, so können die DNA oder RNA wieder eluiert werden.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Vorrichtung zur Reinigung oder Isolierung von Nukleinsäuren bestehend aus einem ersten Hohlkörpern 100 mit einer Eintrittsöffnung 101 für eine Probe und einer Austrittsöffnung 102 und einem zweiten Hohlkörpern 200 mit einer Eintrittsöffnung 201 und einer Austrittsöffnung 202, wobei die Eintrittsöffnung des zweiten Hohlkörpers 201 mit der Austrittsöffnung des ersten Hohlkörpers 102 funktionell verbunden ist, wobei der erste und der zweite Hohlkörper voneinander gelöst werden können und wobei sich vor der Austrittsöffnung des zweiten Hohlkörpers 202 ein nukleinsäurebindendes Material 203 befindet.
Nukleinsäurebindende Materialien sind dem Fachmann bekannt. Das Material kann sowohl partikulär als auch fasrig sein. Für den Fall, dass das Material aus Partikeln besteht, hat es sich als vorteilhaft erwiesen, diese Partikel zu immobilisieren, z. B. durch Einbringen zwischen flüssigkeitsdurchlässigen Plättchen, z. B. Geweben oder Vliesen aus fasrigem Material wie Zellulose oder Kunststoffen, die so enge Poren haben, dass die Partikel zwischen den Plättchen festgehalten werden. Bevorzugt besteht das nukleinsäurebindende Material überwiegend aus Siliziumdioxid oder enthält Siliziumdioxid in Form von Fasern oder Partikeln. Besonders bevorzugt ist das nukleinsäurebindende Material ein Glasvlies oder ein Silicagel oder besteht aus Zeolith. Ebenfalls bevorzugt besteht das nukleinsäurebindende Material aus Metalloxiden oder Metallmischoxiden oder enthält Metalloxide oder Metallmischoxide in Form von Fasern oder Partikeln. Besonders bevorzugt besteht das nukleinsäurebindende Material aus Aluminiumoxid, Hafniumoxid oder Zirkonoxid oder enthält Aluminiumoxid, Hafniumoxid oder Zirkonoxid in Form von Fasern oder Partikeln.
Bevorzugt handelt es sich bei dem nukleinsäurebindenden Material um ein fasriges Material, z. B. in Form von Geweben oder Vliesen. Geeignete Materialien sind z. B. aus Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren mit Hilfe von Zentrifugationsröhrchen ( EP 738733 ) oder Mehrfachvorrichtungen im Streifenformat bekannt ( EP 616638 ). Das nukleinsäurebindende Material muss die Eigenschaft haben, dass die Probenflüssigkeit ohne zusätzliche Krafteinwirkung oder mit Krafteinwirkung, z. B. durch Ausübung von Druck oder Unterdruck, durch das Material durchtreten kann. Da jedoch die Bindung der Nukleinsäuren im vorliegenden Verfahren nicht durch Filtration der Nukleinsäuren aus der Probe geschieht, sondern durch ein Verfahren, bei dem die Affinität von Nukleinsäuren zu Oberflächen ausgenutzt wird, ist es möglich, ein relativ grobporiges Material einzusetzen. Dies erleichtert die Durchströmung auch relativ dickflüssiger Probenflüssigkeiten.
Das flüssigkeitsdurchlässige, nukleinsäurebindende Material ist in der Lage, Nukleinsäuren zu binden, die umgebende Flüssigkeit sowie darin gelöste weitere Bestandteile, wie Proteine etc., jedoch durchzulassen. In einer ersten Möglichkeit können die Nukleinsäuren sequenzspezifisch durch auf der Oberfläche des Materials angebrachte Fangsonden gebunden werden. Die Fangsonden weisen eine Basensequenz auf, die unter Hybridisierungsbedingungen an eine komplementäre Basensequenz in den zu isolierenden Nukleinsäuren binden kann. Die Verwendung sequenzspezifischer Materialien erlaubt die selektive Isolierung von Nukleinsäuren einer bestimmten Sequenz. Ein Verfahren zur Bindung von Nukleinsäuren an Peptidnukleinsäuren auf der Oberfläche von Feststoffen ist beispielsweise in WO 95/14708 beschrieben.
Als nukleinsäurebindendes Material eignet sich z.B. Zirkoniumoxid, Hafniumoxid oder Aluminiumoxid ( EP 897978 ), aber auch Titanoxid. Die hydrierten Oberflächen dieser Materialien haben genügend positive Ladungen, um die negativ geladenen Nukleinsäuren zu binden. Die Hydration der Oberfläche der Oxide kann in basischen Lösungen erreicht werden. Die Elution der Nukleinsäuren kann dann anschließend durch Waschen mit niedermolekularen Alkoholen oder anderen Waschlösungen mit kleinem pH erreicht werden.
In einem bevorzugten Fall weist das flüssigkeitsdurchlässige, nukleinsäurebindende Material eine glashaltige Oberfläche auf. Die Eigenschaft von Glas in partikulärer und fasriger Form Nukleinsäuren zu binden, ist seit langem bekannt. Für die reversible Bindung an die Glasoberfläche sind chaotrope Reagenzien wie z.B. Guanidiniumthiocyanat, Guanidinhydrochlorid, Nal, Kl, Natriumthiocyanat oder Kombinationen dieser Substanzen nötig ( US 5,234,809 ). In DE-A-19512369 ist die Verwendung von Glasvliesen zur Isolierung von Nukleinsäuren beschrieben. In EP-B-0389 063 wird ein Verfahren vorgeschlagen, bei dem die Probe mit einem Gemisch eines chaotropen Guanidiniumsalzes und Silicapartikeln gemischt wird. Unter diesen Bedingungen binden Nukleinsäuren sequenzunabhängig an die Silica-Oberfläche. Die übrigen Probenbestandteile können abgewaschen und die Nukleinsäuren anschließend in wässrigem Puffer eluiert werden.
Unter Nukleinsäuren sind im Sinne der Erfindung Nukleinsäuren jeglichen Ursprungs zu verstehen, z. B. Nukleinsäuren viroiden, viralen, bakteriellen oder zellulären Ursprungs. Sofern die Nukleinsäuren in der Probe nicht frei zugänglich sind, werden sie bevorzugt mit entsprechenden Reagenzien verfügbar gemacht. Hierzu gehören sowohl Veränderungen des pHs (alkalisch), Hitze, Wiederholung extremer Temperaturveränderungen (einfrieren/auftauen), Veränderung der physiologischen Wachstumsbedingungen (osmotischer Druck), Einwirkung von Detergenzien, chaotropen Salzen oder Enzymen (z. B. Proteasen und Lipasen). Probenmaterial, aus dem so Nukleinsäuren freigesetzt werden können, sind insbesondere zellhaltige Medien, Zellabstriche und Gewebeschnitte. Bei den Nukleinsäuren kann es sich sowohl um RNA als auch DNA handeln.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung besteht aus zwei Hohlkörpern 100/200, die über eine funktionelle Verbindung 3 verbunden sind und jeweils eine Eintrittsöffnung 101/201 und eine Austrittsöffnung 102/202 für eine Probe haben. Diese erfindungsgemäße Vorrichtung ist bevorzugt so geformt, dass sie zumindest teilweise in ein Gefäß 400 passt. Funktionell verbunden bedeutet in diesem Zusammenhang, dass die Verbindung der beiden Hohlkörper so ausgeführt ist, dass die Durchführung des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung möglich ist. Dazu soll die Verbindung bei Bedarf gelöst werden können, undurchlässig für Flüssigkeiten sein und für gewisse Anwendungen auch den Luftaustausch mit der Umgebung verhindern. Außerdem soll ein verlustfreier Durchtritt der Probe von dem ersten Hohlkörper in den zweiten Hohlkörper gewährleistet sein. Diese Hohlkörper sind bevorzugt im wesentlichen Zylinder. Bevorzugt sind die Öffnungen im wesentlichen rund. Der erste Hohlkörper hat besonders bevorzugt zusätzlich zu einem zylindrischen Bereich an der Eintrittsöffnung auch einen konischen schmaler werdenden Bereich in Richtung seiner Austrittsöffnung. Der erste Hohlkörper weist bevorzugt ein Volumen von mehr als 5 ml auf. Tritt die Probe 5 durch die Austrittsöffnung 102 des ersten Hohlkörper 100, so gelangt sie durch die funktionelle Verbindung 3 verlustfrei über die bevorzugt runde Eintrittsöffnung 201 in den zweiten Hohlkörper 200.
In dem zweiten Hohlkörper befindet sich das flüssigkeitsdurchlässige, nukleinsäurebindende Material 203. Das nukleinsäurebindende Material ist so an der bevorzugt runden Austrittsöffnung 202 des Hohlkörpers angeordnet, dass die austretende Probenflüssigkeit 5 durch das nukleinsäurebindende Material hindurch treten muss. Hierbei werden die Nukleinsäuren an dem nukleinsäurebindenden Material gebunden.
Der zweite Hohlkörper kann sowohl von seiner Gestalt als auch dem Material her dem ersten Hohlkörper ähneln. Insbesondere sollten die Hohlkörper mindestens das Volumen der Probenflüssigkeit 5 aufnehmen können. Bevorzugt hat der zweite Hohlkörper ein im Vergleich zum ersten Hohlkörper kleineres Volumen. Bevorzugt ist dieser Hohlkörper so geformt, dass dieser zumindest teilweise in ein Auffanggefäß 900 passt. Außerdem besteht der zweite Hohlkörper aus einem Material, dass sich für das Zentrifugieren mit hohen Drehzahlen von bis zu 14.000 Umdrehungen pro Minute eignet.
Beide Hohlkörper weisen Mittel auf, um sie funktionell und reversibel miteinander verbinden zu können. Bevorzugt handelt es sich bei der funktionellen Verbindung 3 des ersten und zweiten Hohlkörpers um eine Verschraubung, also z.B. ein außen- oder innenseitiges Schraubgewinde. Weist der erste Hohlkörper beispielsweise ein Gewinde auf, so ist das Mittel des zweiten Hohlkörpers ein dazu passendes Gegengewinde. In einer anderen bevorzugten Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung sind der erste und der zweite Hohlkörper durch Presskräfte miteinander verbunden, also z.B. über eine Steckverbindung.
Die beiden Hohlkörper weisen bevorzugt zusammen ein Volumen auf, welches die Aufnahme der gesamten Probe und weiterer Reagenzien, z. B. zur Erleichterung der Bindung der Nukleinsäuren an das nukleinsäurebindende Material, erlaubt. Das Volumen beträgt mehr als 500 mikroliter, bevorzugt zwischen 1 und 1000 ml, besonders bevorzugt zwischen 1 und 100 ml, ganz besonders bevorzugt zwischen 5 und 50 ml oder 10 und 30 ml. Besonders bevorzugt ist ein Volumen von 10, 20 oder 30 ml.
Des Weiteren hat der erste Hohlkörper bevorzugt im Bereich nahe seiner Eintrittsöffnung 101 Mittel zur Halterung 103 des Hohlkörpers in einem Gefäß 400, so dass seine Position fixiert ist. Dieses Gefäß hat eine Eintrittsöffnung 401, die bevorzugt rund ist. Bevorzugt hat das Gefäß einen zylindrischen Bereich an der Eintrittsöffnung 401 und einen konischen Bereich an seinem Ende. Das Gefäß dient zur Aufnahme der Flüssigkeit 8, die nach Durchlaufen des nukleinsäurebindenden Materials 203 aus dem zweiten Hohlkörper 200 austritt. Bevorzugt ist das Gefäß verschließbar.
Besonders bevorzugt ist das Gefäß 400 so geformt und mit Verschlussmitteln 6 versehen, dass beide funktionell verbundenen Hohlkörper 100/200 vollständig aufgenommen werden können und das Gefäß 400 mit einem Verschlusselement 7 verschlossen werden kann. Das Verschlusselement ist bevorzugt ein schraubbarer Deckel aus Plastik. Als Mittel zur Halterung 103 des ersten Hohlkörpers im Gefäß 400 ist ein Ringsteg bevorzugt, der über den Rand des Gefäßes ragt, so dass der Hohlkörper auf liegt und nicht weiter in das Gefäß eindringen kann. Besonders bevorzugt ist dieser Ringsteg so geformt, das er durch das Verschlusselement 7 mit dem Gefäß verspannt wird und damit als Dichtung fungiert. Das Verschlusselement ist hierbei bevorzugt ein von oben aufzusetzender Schraubdeckel und das Gefäß hat dann das entsprechende Gegengewinde.
Alternativ kann das Gefäß an seiner Eintrittsöffnung 401 einen konisch schmaler werdenden Bereich haben, so dass der erste Hohlkörper auch ohne zusätzliche Mittel zur Halterung an einer definierten Stelle nicht weiter in das Gefäß eindringen kann. Das Gefäß kann auch in diesem Fall wieder mit einem Verschlusselement verschlossen werden. Auch denkbar ist, dass die beiden funktionell verbundenen Hohlkörper nur teilweise in das Gefäß passen, wobei aber mindestens die Austrittsöffnung des zweiten Hohlkörpers vollständig in das Gefäß ragen muss.
In einer weiteren bevorzugten Variante der erfindungsgemäßen Vorrichtung, die in 2 dargestellt ist, ist das Gefäß 400 mit Mitteln zum Anlegen einer Druckdifferenz versehen. Diese Druckdifferenz kann den Durchtritt der Probe durch das nukleinsäurebindende Material vornehmen oder unterstützen. Hierzu wird das Gefäß mit einem Ansatzstutzen 16 zum Anlegen eines Über- oder Unterdrucks und das Verschlusselement 7 mit einem Druckausgleichsstutzen 17 versehen. Bei dieser Variante der Vorrichtung ist es notwendig, dass die Verbindungsstelle der beiden Hohlkörper auch für Gase undurchlässig ist, da sich sonst keine Druckdifferenz über das nukleinsäurebindende Material aufbauen kann.
Der zweite Hohlkörper 200 ist bevorzugt so geformt, dass er zumindest teilweise in ein Auffanggefäß 900 passt. Dieses Auffanggefäß hat bevorzugt eine im Wesentlichen runde Eintrittsöffnung 901. Das Auffanggefäß 900 ist bevorzugt verschließbar und besteht aus einem zylindrischen Bereich an der Eintrittsöffnung und einen konischen Bereich an seinem Ende. Besonders bevorzugt ist das Auffanggefäß so gestaltet, dass der mit Halterungsmitteln 204 versehene zweite Hohlkörper 200 hinein passt und dass das Gefäß mit einem Verschlusselement 10 verschlossen werden kann. Analog zu dem ersten Hohlkörper 100 hat auch der zweite Hohlkörper als Halterungsmittel 204 bevorzugt einen Ringsteg, der über den Rand des Auffanggefäßes reicht. Bei Verwen dung eines Schraubdeckels 10 mit einem Gewinde 11 wird der Ringsteg mit dem Auffanggefäß verspannt und fungiert als Dichtung. Auch hier ist alternativ wieder eine konische Form des Auffanggefäßes denkbar, um den zweiten Hohlkörper an einer definierten Stelle zu fixieren, wobei der Hohlkörper ganz oder zumindest teilweise in das Auffanggefäß eindringt.
In einer weiteren Variante der vorliegenden Erfindung wird das Auffanggefäß bevorzugt mit Mitteln zum Anlegen einer Druckdifferenz versehen. Diese Druckdifferenz kann die Restflüssigkeit aus dem Vlies entfernen und die Elution der Nukleinsäuren aus dem Material vornehmen oder unterstützen. Hierzu wird das Auffanggefäß mit einem Ansatzstutzen zum Anlegen eines Über- oder Unterdrucks und das Verschlusselement mit einem Druckausgleichsstutzen versehen.
Der erste oder der zweite Hohlkörper, das Gefäß oder das Auffanggefäß der erfindungsgemäßen Vorrichtung sind aus Materialien, die Nukleinsäuren nicht binden. Bevorzugt sind der erste oder der zweite Hohlkörper, das Gefäß oder das Auffanggefäß der erfindungsgemäßen Vorrichtung aus Kunststoff, Metall oder Verbundstoff. Besonders bevorzugt sind Kunststoffe, wie beispielsweise Polypropylen, Polystyrol, Polyethylen oder Luran^®. Diese haben den Vorteil der leichten Herstellbarkeit im Mehrspritzgussverfahren bei gleichzeitiger hoher mechanischer Stabilität unter den Bedingungen des erfindungsgemäßen Isolierungsverfahrens.
Als Material für die Hohlkörper sind spritzgussfähige Kunststoffe besonders bevorzugt, weil dies die Einbringung des nukleinsäurebindenden, flüssigkeitsdurchlässigen Materials schon während der Herstellung des zweiten Hohlkörpers erlaubt. Das Material kann, insbesondere bei Glasfaservliesen, schon während des Spritzgussverfahrens fest in das Verschlusselement eingegossen werden. Es ist jedoch auch möglich, das Material erst nach der Herstellung des zweiten Hohlkörpers im Spritzgussverfahren zu befestigen, z. B. durch Verkleben, Verschweißen oder durch Fixierung mit einem Pressring. Verfahren zur Herstellung eines Hohlkörpers mit nukleinsäurebindendem Material sind in der Patentschrift EP 0 738 733 beschrieben. Solche Trennsäulen mit nukleinsäurebindendem Material sind auch kommerziell erhältlich (High Pure^TM-Säule der Firma Roche Diagnostics GmbH, Mannheim).
Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist ein verschließbares Gefäß, das eine erfindungsgemäße Vorrichtung enthält. Das verschließbare Gefäß ist bevorzugt so geformt, dass es die gesamte erfindungsgemäße Verbindung der beiden Hohlkörper aufzunehmen vermag und über ein Verschlusselement verschließbar ist. Besonders bevorzugt ist das verschließbare Gefäß ein handelsübliches Zentrifugiergefäß, wie z.B. ein Kunststoff-Röhre (Falcon-Röhre), dass ein Füllvolumen von 50 ml hat und über einen Schraubdeckel verschließbar ist.
Ein Verfahren zur Reinigung oder Isolierung von Nukleinsäuren aus einer Probe unter Verwendung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung besteht aus den Schritten:

Eine bevorzugte Verfahrensvariante verwendet eine erfindungsgemäße Vorrichtung mit einem nukleinsäurebindende Material, dass überwiegend aus Siliziumdioxid besteht oder Siliziumdioxid in Form von Partikeln oder Fasern enthält oder dass besonders bevorzugt ein Glasvlies oder Silicagel ist oder aus Zeolith besteht und eine Probe, der noch vor der Überführung in die Vorrichtung durch die Eintrittsöffnung des ersten Hohlkörpers chaotrope Reagenzien zugegeben werden, so dass die Konzentration der chaotropen Reagenzien zwischen 1 M und 8 M liegt.
Im Folgenden wird eine auf der erfindungsgemäßen Vorrichtung beruhende bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens beschrieben. Zunächst werden von 5 bis 30 ml Vollblut, Serum, Plasma oder anderer Körperflüssigkeiten die Zellen lysiert, aufgeschlossen und der Probenflüssigkeit die zusätzlich erforderlichen Reagenzien, z. B. ein chaotropes Salz oder/und Protease, zugesetzt. Außerdem wird die erfindungsgemäße Vorrichtung in einem Gefäß zum Auffangen der nukleinsäurefreien Flüssigkeit platziert (siehe Schritt I und II in 1). Nachdem die Probe 5 durch die Eintrittsöffnung des ersten Hohlkörpers in die Vorrichtung übertragen wurde, wird das Gefäß bevorzugt mit einem Deckel fest verschlossen (Schritt III in 1).
Im nächsten Schritt wird die Probenflüssigkeit zum Durchtritt durch das nukleinsäurebindende Material veranlasst (Schritt IV in 1). Der Durchtritt der Probe kann einerseits bereits durch die Schwerkraft oder aber auch bevorzugt durch Zentrifugieren der Vorrichtung vorgenommen werden. Bevorzugt kann der Durchtritt der Probe durch das nukleinsäurebindende Material auch durch Anlegen einer Druckdifferenz vorgenommen werden. Bei dieser Ausführungsform der Erfindung (siehe 2) ist die Vorrichtung zusätzlich mit Mitteln wie z.B. zwei Ansatzstutzen 16/17 zum Anlegen des Drucks versehen. Bevorzugt befindet sich der eine Ansatzstutzen zum Anlegen des Über- oder Unterdrucks am Gefäß selbst und der zweite Ansatzstutzen befindet sich am Verschlusselement des Gefäßes, um als Druckausgleichsstutzen zu dienen.
Während die Probenflüssigkeit durch das nukleinsäurebindende Material durchtritt, werden die in der Probe vorhandenen Nukleinsäuren an das nukleinsäurebindende Material gebunden, während andere Probenbestandteile zusammen mit der Flüssigkeit 8 in das Gefäß übertreten. Die isolierten Nukleinsäuren befinden sich nun im nukleinsäurebindenden Material des zweiten Hohlkörpers, der bei Bedarf vom ersten Hohlkörper getrennt und auf beliebige Art weiterbearbeitet werden kann.
Da üblicherweise dem flüssigkeitsdurchlässigen Material auch nach Zentrifugation noch gewisse Flüssigkeitsmengen mit Verunreinigungen anhaften, ist es möglich, für die Isolierung besonders reiner Nukleinsäuren noch anhaftende Stoffe durch einen optionalen Waschschritt zu entfernen, noch bevor die Vorrichtung aus dem Gefäß entfernt und die funktionelle Verbindung der Hohlkörper getrennt wird. Hierzu kann beispielsweise die Waschflüssigkeit durch die Eintrittsöffnung des ersten Hohlkörpers zugegeben werden, wodurch sie das Material, an das die Nukleinsäuren gebunden sind beim Durchtritt spült und dann im Gefäß aufgefangen wird. Der Waschschritt kann bevorzugt durch das Anlegen einer Druckdifferenz oder durch das Zentrifugieren der Vorrichtung vorgenommen werden.
Um die Nukleinsäuren wieder von dem flüssigkeitsdurchlässigen, nukleinsäurebindendes Material loszulösen, kann der zweite Hohlkörper von der Vorrichtung entfernt werden (Schritt V in 1). Bevorzugt wird dazu der zweite Hohlkörper nach der Trennung vom ersten Hohlkörper mit einem Auffanggefäß 900 verbunden, um zunächst die im Vlies vorhandene Restflüssigkeit 12 zu entfernen (Schritt VI in 1). Bevorzugt wird dieses Waschen durch Zentrifugieren der Vorrichtung vorgenommen, da der mit dem Auffanggefäß verbundene zweite Hohlkörper auf Grund seiner geringen Ausdehnung mit sehr großen Zentrifugalkräften behandelt werden kann. Anschließend wird der zweite Hohlkörper mit einem zweiten Auffanggefäß 13 verbunden, das das Eluat auffangen soll (Schritt VII in 1). Die Elutionsflüssigkeit 14 ist so zusammengesetzt, dass die Bindung der Nukleinsäuren an das nukleinsäurebindende Material aufgehoben wird. Die Bedingungen, unter denen die Nukleinsäuren wieder gelöst werden können, sind vom verwendeten Material abhängig und der Prozess kann wieder bevorzugt durch Anlegen einer Druckdifferenz oder durch Zentrifugieren unterstützt werden (Schritt VIII in 1).
Bevorzugt wird die Elution durch Zentrifugieren vorgenommen, da es dadurch möglich ist, die Nukleinsäuren in sehr kleinen Volumina an Elutionsflüssigkeit zu lösen und auch die in den nukleinsäurebindenden Material verbleibende Menge an Nukleinsäuren zu minimieren. Bevorzugt wird das Zentrifugieren bei der Elution und beim Waschen mit größeren Zentrifugalkräften durchgeführt als das Zentrifugieren beim Durchtritt der Probe und dem optionalen Waschen. Das Zentrifugieren bei der Elution und beim Waschen wird bevorzugt mit mehr als 5000 g und das Zentrifugieren beim Durchtritt der Probe und dem optionalen Waschen bei weniger als 5000 g durchgeführt. Besonders bevorzugt sind der zweite Hohlkörper und das Auffanggefäß so geformt, dass sie zusammen z.B. in einer Eppendorf-Zentrifuge (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) bei mehr als 10000 g zentrifugiert werden können. Dies ist möglich, da das Auffanggefäß ein deutlich geringeres Volumen zu haben braucht als das erste Gefäß, welches nur mit einer deutlich geringeren Zentrifugalkraft (z.B. in einer Beckman – Tischzentrifuge, (Beckman Coulter, Inc., USA) mit etwa 3000 g) behandelt werden darf und somit mehr Elutionsflüssigkeit benötigen würde. Somit ist die erfindungsgemäße Vorrichtung nicht nur für die Isolierung der Nukleinsäuren sondern auch für die Überführung von Nukleinsäuren aus einem größeren 5 in ein kleineres Volumen 15 geeignet.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Kit zur Reinigung oder Isolierung von Nukleinsäuren aus einer Probe, der sich aus einer erfindungsgemäßen Vorrichtung oder einem erfindungsgemäßen Gefäß und chaotropen Reagenzien zur Bindung der Nukleinsäuren an das nukleinsäurebindende Material zusammensetzt. Der Kit kann außerdem weitere Plastikteile beinhalten, die für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens notwendig sind, wie z.B. Mikrotiterplatten oder einfache Reaktionsgefäße wie Eppendorf-Reaktionsgefäß (Eppendorf Hamburg, Deutschland). Zusätzlich kann der Kit weitere Reagenzien enthalten, die für das erfindungsgemäßen Verfahrens notwendig sind, z.B. Lysis-Puffer mit chaotropen Reagenzien, Detergenz, Alkohol oder Mischungen dieser Stoffe, die die Lyse von Zellen bewirken, Waschpuffer mit chaotropen Reagenzien und/oder Alkohol oder Puffer mit saurem pH-Wert zum Waschen des nukleinsäurebindende Materials an das Nukleinsäuren gebunden sind oder Elutionspuffer, die das Loslösen der Nukleinsäuren von dem nukleinsäurebindende Material ermöglichen. Diese Komponenten des Kits können erfindungsgemäß einzeln oder in Aufbewahrungsbehältern zur Verfügung gestellt werden. Die Reagenzien werden meistens gebrauchsfertig angeboten, können aber auch in Form von Stocklösungen verkauft werden, die vor der Verwendung noch verdünnt werden müssen.
Die folgenden Beispiele, Publikationen und die Abbildungen erläutern die Erfindung, deren Schutzumfang sich aus den Patentansprüchen ergibt, weiter. Die beschriebenen Verfahren sind als Beispiele zu verstehen, die auch noch nach Modifikationen den Gegenstand der Erfindung beschreiben.
Beschreibun der Figuren
1: Beispielhafte und schematische Darstellung des erfindungsgemäßen Verfahrens unter Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung.
2: Alternative Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Vorrichtung, wobei Mittel vorgesehen sind, die es ermöglichen eine Druckdifferenz zu erzeugen und damit den Durchtritt der Probe durch das nukleinsäurebindende Material zu gewährleisten.
Beispiele
Beispiel 1
Das folgende Beispiel einer DNA-Isolierung aus 5 ml Serum soll die vorliegende Erfindung näher erläutern. Das so genannte „UpScale HighPure"-Verfahren benutzt den so genannte „UpScale HighPure"-Kit, der aus einer kommerziell erhältlichen High PureTM-Säule (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland), einem aufsteckbarem Volumenaufsatz und Reagenzien, die mit den Reagenzien des „MagNA Pure^® LC Total Nucleic Acid Isolation Kit – Large Volume" (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland) identisch sind. Der Volumenaufsatz (aus Polypropylen) hat in diesem Beispiel die Form eines Zylinders (Innendurchmesser 2.5 cm, Länge 5 cm) mit einem Füllvolumen von etwa 25 ml, einer runden Einflussöffnung und einer Ausflussöffnung, in der eine HighPure-Säule (Volumen etwa 1.5 ml) befestigt werden kann. Bei der Durchführung der DNA-Isolierung mittels dem „UpScale HighPure"-Verfahren kommen außerdem eine Eppendorf-Zentrifuge (Eppendorf, Hamburg, Deutschland), eine Beckman-Zentrifuge (Beckman Coulter, Inc., USA) mit 50 ml Falcon-Röhrchen, ein handelsüblicher Vortexer und Eppendorf-Reaktionsgefäße (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) zum Einsatz.
Durchführung der DNA-Isolierung
250 μl einer 40 mg/ml Proteinase K-Lösung werden in einem 50 ml Falcon-Tube vorgelegt. Dazu werden 5 ml Probe (Serum bzw. Plasma) zugegeben, gevortext und dann 10 min bei Raum-temperatur inkubiert. Im nächsten Schritt werden 6,25 ml Lyse/Binding-Puffer zugegeben, gevortext und die Lösung für 10 min bei 70 °C inkubiert. Daran anschließend erfolgt eine Zentrifugation bei 1900 g (Entfernen von Schaum). Als nächstes werden 3,125 ml Isopropanol zugegeben, gemischt und 1 min bei 1900 g zentrifugiert, dann wird das Gemisch für 10 min bei Raumtemperatur stehen gelassen. Im nächsten Schritt wird das Gemisch in 1 Portion (ca. 15 ml) in den Volumenaufsatz der Vorrichtung eingebracht, die verbleibende Restflüssigkeit wird mittels Pipette ebenfalls auf die Säule gegeben. Zunächst wird 2 min bei 1900 g (einschließlich hochdrehen), danach 1 min bei 3300 g zentrifugiert. Im nächsten Schritt wird der Durchlauf verworfen.
Als nächstes folgen diverse Waschschritte (die verwendeten Waschpuffer sind in dem kommerziell erhältlichen „MagNA Pure^® LC Total Nucleic Acid Isolation Kit – Large Volume", Cat.-Nr. 3264793, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland enthalten): Zunächst wird die Vorrichtung in neues 50 ml Falcon-Tube gestellt, 2 ml Waschpuffer 1 zugegeben und 2 min bei 3300 g zentrifugiert. Danach werden 2 ml Waschpuffer 2 zugegeben und 2 min bei 3300 g zentrifugiert. Im nächsten Waschschritt werden 2 ml Waschpuffer 3 zugegeben und 2 min bei 3300 g zentrifugiert (Die 3 Waschschritte können ohne Wechsel des Falcon-Tubes erfolgen).
Der Volumenaufsatz wird nun von der High Pure-Säule entfernt und die High Pure-Säule in ein Eppendorf-Cup gestellt, mit einem Deckel verschlossen und in der Eppendorf-Zentrifuge für 1 min bei 20000 g zentrifugiert. Hierbei wird die Restflüssigkeit aus dem Vlies entfernt.
Der nächste Schritt beinhaltet die Elution der DNA. 50 – 100 μl Elutionspuffer werden auf das Vlies gegeben und die High Pure-Säule wird mit einem Deckel verschlossen. Danach wird 3 min bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend für 1 min bei 20000 g in der Eppendorf-Zentrifuge zentrifugiert. Das Eppendorf-Reaktionsgefäß enthält das Eluat und die High Pure^TM-Säule kann verworfen werden.
Beispiel 2
Das folgende Beispiel zeigt den Vergleich einer DNA-Isolierung nach dem erfindungsgemäßen Verfahren und einer Isolierung nach dem Stand der Technik. Eine Serum-Probe wurde analog zu Beispiel 1 vorbereitet und gleichmäßig auf 2 HighPure^TM-Säulen mit Volumenaufsatz verteilt. Die Experimentführung für beide Säulen ist hierbei bis zum Schritt der Restflüssigkeitsentfernung identisch. Bei einem der Säulen wird im folgenden erfindungsgemäß der Volumenaufsatz von der HighPure-Säule getrennt, die Restflüssigkeit im Vlies mit Hilfe einer Eppendorf-Zentrifuge abzentrifugiert (etwa 15 μl) und die gebundene Nukleinsäure anschließend wieder mit Hilfe der Eppendorf-Zentrifuge in 50 μl eluiert.
Im Gegensatz dazu wurde bei der zweiten Säule die Verbindung zwischen HighPure-Säule und Volumenaufsatz beibehalten, die ganze Vorrichtung in ein Falcon-Tube gesteckt und die Elution mit 50 μl Lösung in einer Beckmann-Zentrifuge durchgeführt (2 min 3300 g), ohne die Restflüssigkeit aus dem Vlies vorher zu entfernen.
Im Ergebnis zeigte sich, dass im Mittel über 10 Versuche die DNA-Ausbeute ohne Trennung der Vorrichtung und ohne die Eppendorf-Zentrifuge um etwa 30 % geringer war.
Referenzliste

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Miller, S.A., et al., Nucleic Acids Res. 16 (1988) 1215 Sambrook, J., et al., Molecular Cloning, Cold Spring Habor Laboratory Press, 1989, 2nd Edition, 9.16 – 9.23 US 4,956,298 US 5,234,809
Vogelstein, B., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 (1979) 615–619 WO 93/11221 WO 95/14708 WO 96/41810 WO 98/32877

Claims

Vorrichtung zur Reinigung oder Isolierung von Nukleinsäuren bestehend aus einem ersten Hohlkörpern 100 mit einer Eintrittsöffnung 101 für eine Probe und einer Austrittsöffnung 102 und einem zweiten Hohlkörpern 200 mit einer Eintrittsöffnung 201 und einer Austrittsöffnung 202, wobei die Eintrittsöffnung des zweiten Hohlkörpers 201 mit der Austrittsöffnung des ersten Hohlkörpers 102 funktionell verbunden ist, wobei der erste und der zweite Hohlkörper voneinander gelöst werden können und wobei sich vor der Austrittsöffnung des zweiten Hohlkörpers 202 ein nukleinsäurebindendes Material 203 befindet.
Vorrichtung gemäß Anspruch 1, wobei der zweite Hohlkörper ein im Vergleich zum ersten Hohlkörper kleineres Volumen hat.
Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei die Vorrichtung so geformt ist, dass diese zumindest teilweise in ein Gefäß 400 passt.
Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der zweite Hohlkörper so geformt ist, dass dieser zumindest teilweise in ein Auffanggefäß 900 passt.
Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der erste und der zweite Hohlkörper durch Verschraubung miteinander verbunden sind.
Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der erste und der zweite Hohlkörper durch Presskräfte miteinander verbunden sind.
Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der erste und/oder der zweite Hohlkörper im wesentlichen Zylinder sind.
Vorrichtung gemäß Anspruch 7, wobei der erste Hohlkörper zusätzlich zu seinem zylindrischen Bereich an der Eintrittsöffnung einen konisch schmaler werdenden Bereich in Richtung seiner Austrittsöffnung hat.
Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Öffnungen des ersten und/oder des zweiten Hohlkörpers im Wesentlichen rund sind.
Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Hohlkörper ein Volumen von mehr als 5 ml aufweist.
Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 3 bis 10, wobei das Gefäß verschließbar ist.
Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 3 bis 11, wobei das Gefäß aus einem zylindrischen Bereich an der Eintrittsöffnung und einem konischen Bereich an seinem Ende besteht.
Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 3 bis 12, wobei das Gefäß Mittel zum Anlegen einer Druckdifferenz hat.
Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 4 bis 13, wobei das Auffanggefäß verschließbar ist.
Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 4 bis 14, wobei das Auffanggefäß verschließbar ist und aus einem zylindrischen Bereich an der Eintrittsöffnung 401 und einem konischen Bereich an seinem Ende besteht.
Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 4 bis 15, wobei das Auffanggefäß Mittel zum Anlegen einer Druckdifferenz hat.
Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 4 bis 16, wobei die Eintrittsöffnungen des Gefäßes 401 und/oder des Auffanggefäßes 901 im wesentlichen rund sind.
Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass das nukleinsäurebindende Material überwiegend aus Siliziumdioxid besteht oder Siliziumdioxid in Form von Fasern oder Partikeln enthält.
Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass das nukleinsäurebindende Material ein Glasvlies oder ein Silicagel ist oder aus Zeolith besteht.
Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass das nukleinsäurebindende Material aus Metalloxiden oder Metallmischoxiden besteht oder Metalloxide oder Metallmischoxide in Form von Fasern oder Partikeln enthält.
Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass das nukleinsäurebindende Material aus Aluminiumoxid, Hafniumoxid oder Zirkonoxid besteht oder Aluminiumoxid, Hafniumoxid oder Zirkonoxid in Form von Fasern oder Partikeln enthält.
Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass der erste oder der zweite Hohlkörper, das Gefäß oder das Auffanggefäß aus einem Material sind, dass Nukleinsäuren nicht bindet.
Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass der erste oder der zweite Hohlkörper, das Gefäß oder das Auffanggefäß aus Kunststoff, Metal oder einem Verbundstoff sind.
Vorrichtung gemäß Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass der zweite Hohlkörper aus Polypropylen ist.
Verschließbares Gefäß 400, das eine Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 24 enthält.
Kit zur Reinigung oder Isolierung von Nukleinsäuren aus einer Probe zusammengesetzt aus a) einer Vorrichtung gemäß einem der Punkte 1 bis 24 oder eines Gefäß gemäß Punkt 25, b) chaotrope Reagenzien zur Bindung der Nukleinsäuren an das nukleinsäurebindende Material.