JP2014501517A - 核酸抽出及び分画のためのマイクロ流体デバイス - Google Patents
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Abstract
Description
ヒト全血が、小径孔に強制的に通すことによって機械的に溶解され、これは、細胞壁を破壊させ、DNAを遊離させた(他の機械的溶解方法が使用されてもよい)。この溶解物は、DNA抽出マイクロ流体デバイスを通過させられ、溶出液フラクションが収集された。これらの溶出液フラクションは、ヒトゲノム上の短い領域を増幅するPCR反応でのテンプレートとして使用された。最初の2つの溶出されたフラクションは、それぞれ34μl及び32μlであり、次の18フラクションは20μlの容量であった。図14に示すデータは、デバイスが、ポリメラーゼ反応に有害に影響する不純物を含まないDNAを抽出することができることを明らかに示す。
2Xログラダーの40μLが(図1〜12に記載のような)例示的カセットにロードされ、DNA抽出及び分画カラム内にポンプで送り込まれた。次に、10μLフラクションが合計400μL収集された。各溶出液フラクションは、次に、バイオアナライザデバイス(Agilent)でサイズ分布及び存在量について解析された。図15は、これに関する結果を示す。対照実験が、(図1〜12に記載のような)DNA及び抽出カセットを通過した剪断されていないサケ精子DNAによる試料プロトコールで行われた。結果は図13に示され、より小さいログラダーより先に、より大きいサケ精子がデバイスから溶出することを示しており、これは単純な分画能力を示す。
多くの配列決定手法、helicos、FLX(Roche(登録商標))、ゲノムシーケンサー(Illumina(登録商標))、ナノ細孔及びナノワイヤ(QuantuMDx、US61 094,006)は、抽出されたDNAの試料を、配列決定反応が行われる場所に供給するために、マイクロ流体を利用し、細胞を流す。しかしながら、現在までの技術のすべては、デバイスを離れての試料調製を採用し、デバイスを離れての試料調製では、試料は従来のベンチトップ手法(Qiagenのスピンカラム、InvitrogenのCharge Switch(登録商標)、Nexttecの吸着剤フィルタスピンカラム等)を使用して抽出されたそのDNA(又は、RNA/cDNA)を有し、従来のベンチトップ手法は、配列決定プロセスにかなりの時間を追加し、時間通りにかなりのオペレータの人手を要求する。このマイクロ流体解決法は、これらの技術を「前処理する(front−end)」することになり、各技術が試料から結果までの(sample to result)デバイスとなり、配列データを生成するために必要な処理されるもののすべてを自動化することを可能にする。
ショットガン法を使用する標準的な次世代配列決定は、短い読み取り長によって制限される。この重要な制限に対する解決法は、ペアエンドタグ(PET)配列決定戦略であり、ペアエンドタグ(PET)配列決定戦略では、短いタグ及びペアタグが、超高スループット配列決定のために長いDNA断片の末端から抽出される。PET配列は、基準ゲノムに正確にマッピングすることができ、したがって、PETで表現されたDNA断片のゲノム境界を画定し、目標DNA要素の身元を明らかにする。この戦略を成功裏に実施することを可能にするために、このDNAの抽出を行うことに、特定のサイズの断片の選択を続ける。これは時間がかかり、高価である。
多くの分子診断手法、Cepheid(Smart Cycler(登録商標))、Light Cycler(登録商標)(Roche)、BeadXpress(登録商標)及びEco Real−Time PCRシステム(Illumina)、7500リアルタイムPCRシステム(ABI)、GeneChip(登録商標)システム(Affymetrix(登録商標))や、ナノポアデバイス、マイクロ流体デバイス、並びに、ナノワイヤ及びカーボンナノチューブデバイス(QuantuMDx)のような将来のデバイスは、DNA(又は、RNA/cDNA)をそれらの試験基質として利用する。しかしながら、現在までのすべてではないにしてもほとんどの技術は、「デバイスを離れての」試料調製を採用し、デバイスを離れての試料調製では、試料は従来のベンチトップ手法(Qiagenのスピンカラム、InvitrogenのCharge Switch、Nexttecの吸着剤フィルタスピンカラム等)を使用して抽出されたそのDNA(又は、RNA/cDNA)を有し、従来のベンチトップ手法は、分子診断プロセスにかなりの時間を追加し、時間通りにかなりのオペレータの人手を要求する。このマイクロ流体解決法は、これらの技術を「前処理する(front-end)」することになり、各技術が試料から結果までの(sample to result)デバイスとなり、分子診断データを発生するために必要な処理されるもののすべてを自動化することを可能にする。
いくつかの実施形態では、特定の標的DNA配列は、単一フロースルーマイクロ流体カセット内のさらに下流のプロセスに通じるマイクロ流体チャネル内で抽出されてもよい。カセットは、溶解、抽出、試料濃縮、増幅、検出及び廃棄物処理、又は、これらのプロセスの任意の組み合わせを行うことになる。カセットは、完全に取り囲まれてもよく、使い捨てであってもよく、ハンドヘルドデバイス、ベンチトップデバイス、又は高スループットデバイスによって動作されてもよい。
いくつかの実施形態では、特定の標的DNA配列は、DNAが配列決定される(図13)単一フロースルーマイクロ流体カセット内のさらに下流のプロセスに通じるマイクロ流体チャネル内で抽出されてもよい。試料からのDNAの溶解及び抽出に必要なすべての試薬は、マイクロ流体チャネル内に格納されてもよく、各洗浄溶液及び溶解緩衝液は、気泡、若しくは試薬を分離する他の方法によって分離されてもよく、又は、試薬は、ブリスターパック、凍結乾燥、若しくは、マイクロチャネル内に試薬を格納する他の方法で格納されてもよい。
試料を同様の密度のマイクロ流体チャネルからカラムに導入することによって試料を分画することによる問題の1つは、試料のすべてが同時に段階的に導入されるわけではないことである。異なる分子量の断片のDNA断片の混合物は、おそらく、マイクロ流体チャネルの全体に渡って、試料内に均一に分散され、したがって、分画は、ロードされる最初のDNAが最後に入るDNA分子と同調せずに移動するある期間に渡って、抽出及び分画フィルタに入る試料によって妨害されることになる。したがって、混合物は、同時に抽出及び分画カラム内に段階的に導入される必要がある。溶解物成分からのDNAの分離、及び、断片分子量に基づくDNAの分画の両方を行う材料が充填された(チャンバの寸法の点で)テーパ状のカラムが直後に続く、試料の分画に影響することなく試料の拡散を容易にする材料で満たされ、したがって、試料全体が同時に分画カラムに入ることを可能にする球根状の入口から成るマイクロ流体チャンバが、解決法である。DNA抽出及び分画デバイスのためのこのような可能なマイクロ流体設計の非限定的な設計が、図16に示されている。
1b シリンジポンプ3ポート
1c 緩衝液リザーバ
2a 試料(溶解物)充填ポート
2b シリンジポンプ1ポート
2c 試料リザーバ
3a フィルタ空洞1
3b フィルタ空洞2
4 廃棄物チャネル及びポート
5a 収集リザーバ
5b シリンジポンプ4ポート
6 フィルタ
7 フィルタビア
8 シリンジポンプビア(テープ)
9 シリンジポンプビア(シェル)
10 吸着剤が充填されたチャンバ
50 挿入物
60 両面テープ
70 シェル
80 マイクロ流体デバイス
82 アプリケータ
84 真空配管
161 試料入口
162 流体チャネル
163 吸着剤材料
164 フィルタ
165 流体チャネル
181 試料受け
182 試料溶解チャンバ
183 マイクロ流体チャネル
184 チャンバ
185 チャンバ
186 マイクロ流体チャネル
187 解析/センサアレイ
188 電子機器
189 マイクロ流体リザーバ
191 試料受け領域
192 溶解チャンバ
193 核酸試料調製チャンバ
194 サイクラー
195 チャンバ
196 マイクロ流体素子
197 金属コネクタ
198 高感度検出ナノ構造アレイ
199 マイクロ流体チャネル
Claims (12)
- 溶解物又はそのままの試料からDNAを同時に抽出及び分画するためのデバイスであって、前記デバイスは、単一フロースルーマイクロ流体チャネルを備え、前記単一フロースルーマイクロ流体チャネルは、緩衝液チャンバと、試薬チャンバと、吸着剤フィルタと、を備えるデバイス。
- 前記吸着剤フィルタは、ポリアニリン又はその誘導体を含むポリマーコーティングによって少なくとも部分的に覆われた支持体を備える請求項1に記載のデバイス。
- 前記デバイスはガラス材料を含む請求項1に記載のデバイス。
- 前記デバイスはPDMS材料を含む請求項1に記載のデバイス。
- 前記単一フロースルーマイクロ流体チャネルは、その入口に球根状構造を備え、前記球根状構造は、その出口のより細い構造に向かってテーパ状である請求項1に記載のデバイス。
- 前記吸着剤フィルタは、前記単一フロースルーマイクロ流体チャネルの壁内に加工された一連の中実微細構造又は中空微細構造を備えた請求項1に記載のデバイス。
- 前記吸着剤フィルタはゆるく前記単一フロースルーマイクロ流体チャネル内に充填された請求項1に記載のデバイス。
- 前記吸着剤フィルタは、核酸以外の細胞及び他の臨床的/生物学的試料材料を結合するように構成されたマトリックスである請求項1に記載のデバイス。
- 試料からDNAを抽出及び分画するためのマイクロ流体デバイスを製造する方法であって、
チャネルを有する少なくとも2つのブランク層を形成するステップと、
接着層を形成するステップであって、前記チャネルの入口及び出口ポートに対応して、ポートが前記接着層に切り開かれた、前記接着層を形成するステップと、
前記チャネルの一部に吸着材を真空充填するステップと、
前記接着層を間に挟んで前記ブランク層を整列させて前記ブランク層を圧力下で互いに接合するステップと、
を備える方法。 - 溶解物又はそのままの試料からDNAを同時に抽出及び分画するための方法であって、
請求項1に記載のデバイスを設けるステップと、
前記単一フロースルーマイクロ流体チャネルの入口に前記試料を適用するステップと、
前記吸着剤フィルタを緩衝液で活性化するステップと、
前記試料を、前記単一フロースルーマイクロ流体チャネルの前記吸着剤フィルタを含む部分内に流すステップと、
前記単一フロースルーマイクロ流体チャネルを介して前記試料を流し、前記単一フロースルーマイクロ流体チャネルの前記吸着剤フィルタを含む部分を介して1回から10回までの間、ループさせるステップと、
抽出されて分画されたDNAを前記デバイスの外に流すステップと、
を備える方法。 - 前記試料は前記単一フロースルーマイクロ流体チャネルの前記吸着剤フィルタを含む部分内に流され、その後、前記デバイスの外に流される前に、15秒から15分までの間、その中でインキュベートされる請求項10に記載の方法。
- 前記試料は前記単一フロースルーマイクロ流体チャネルの吸着剤フィルタを含む部分内に流され、その後、前記デバイスの外に流される前に、吸着剤フィルタチャネル内で前後に振動させられる請求項10に記載の方法。
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