CN103282121A - 用于核酸提取和分级分离的微流体装置 - Google Patents

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Abstract

本发明的各个实施方案通常涉及用于在单流通装置中从全样品或裂解的样品提取并分级分离DNA分子的分子生物学操作流程、设备和试剂。

Description

用于核酸提取和分级分离的微流体装置
相关申请的交叉参考
按照35U.S.C.§119(e)(1)，本申请要求于2010年11月30日提交的美国临时申请号61/418,305的优先权利益。
发明背景
发明领域
本公开的各个实施方案通常涉及用于在单流通装置中从全样品或裂解的样品提取并分级分离DNA分子的分子生物学操作流程、设备和试剂。
相关技术描述
DNA是由称为核苷酸的单元组成的长聚合物。DNA聚合物是多个单一单元的长链，多个单一单元一起形成称为核酸的分子。核苷酸可以是四种亚单位(腺嘌呤(A)，胞嘧啶(C)，鸟嘌呤(G)和胸腺嘧啶(T))中的一种，并且当以聚合物形式存在时，其可以携带细胞中的遗传信息。DNA包含两条包含四种不同的核苷酸碱基的核苷酸长链(例如，AGTCATCGTAGCT...等)，具有通过酯键连接的糖和磷酸基团的骨架，扭转成双螺旋并且通过互补核苷酸之间的氢键连接(A与相反链中的T之间的氢键，和C与相反链中的G之间的氢键)。沿着骨架的核苷酸碱基的序列可能决定个体遗传特征或者其他获得性疾病，如癌症。
分子生物学的中心法则通常描述生物学信息的正常流程：DNA可以复制成DNA，DNA中的遗传信息可以‘转录’成mRNA，可以从mRNA中的信息在称为翻译的过程翻译成蛋白，在该过程中蛋白亚单位(氨基酸)通过tRNA(每个tRNA按其序列携带一个特定的氨基酸)与mRNA的结合按顺序(如mRNA以及因此所述DNA的序列所指示的顺序)靠得足够近，从而键合。
为了研究或分析来自样品的DNA或RNA的序列和生物学，通常需要提取核酸或将核酸与其余的临床或生物学样品(即，其他的细胞成分，如脂质、碳水化合物、蛋白等)分离。目前这由熟悉本领域的技术人员通过多种方法进行。下文简要描述了这些方法。
标准方法由具有取决于应用和样品类型的具有不同变化形式的操作流程组成，从破坏细胞或裂解细胞从而释放DNA开始。这通常通过机械裂解(诸如碾磨，或在液氮中碾磨组织)、超声处理、酶学(enymatically)或化学方法(诸如向样品中加入离液盐(例如，硫氰酸胍))实现。细胞脂膜和其他脂质通常通过添加去污剂去除，蛋白通常通过添加蛋白酶(诸如蛋白酶K，任选地但是几乎总是这样做)去除。水饱和的苯酚、氯仿允许通过离心水性样品和溶液的混合物进行相分离，产生上层水相和下层有机相(主要是氯仿)。发现核酸存在于水相中，而发现蛋白存在于有机相中。在最后一步，通过用冰冷的2-丙醇或乙醇沉淀而从水相回收RNA。不存在硫氰酸胍时，DNA将存在于水相中。由于DNA不溶于这些醇，其将沉淀并且聚集，在离心时产生沉淀物。这一步骤还去除醇溶性盐。添加螯合剂螯合二价阳离子如Mg2+和Ca2+防止DNA酶降解DNA。与DNA结合的细胞蛋白和组蛋白蛋白可以通过添加蛋白酶或通过用乙酸钠或乙酸铵沉淀这些蛋白、或者在DNA沉淀之前用苯酚-氯仿混合物提取其而去除。
第二种方法是利用在高浓度离液盐存在下DNA结合二氧化硅的能力从裂解物分离DNA(与使用何种裂解方法无关)(Chen和Thomas，1980；Marko等.1982；Boom等.1990)。DNA可以结合任何二氧化硅表面，不管是具有微流体盒的柱、二氧化硅包被的顺磁珠、在离心柱内的二氧化硅滤器，还是其他二氧化硅表面。然后，用基于醇的洗涤去除离液盐，在低离子强度溶液如TE缓冲液(由三羟甲基氨基甲烷(‘Tris’)和乙二胺四乙酸(‘EDTA’)组成的缓冲液)或水中洗脱DNA。由于脱水作用和氢键形成，这与弱的静电排斥相竞争(Melzak等.1996)，DNA与二氧化硅结合。因此，高浓度的盐有助于驱使DNA吸附在二氧化硅上，而低浓度将释放DNA。由于DNA结合在二氧化硅表面，在将与二氧化硅结合的DNA洗脱到H2O或TE缓冲液中之前，用洗脱缓冲液简单地洗掉其余的细胞和其他碎片。
(Invitrogen)方法研究裂解物中带负电荷的DNA(通过其带负电荷的磷酸骨架)，与在低pH值(＜6.5)下获得正电荷的特定配体结合。通过使用水性洗涤缓冲液从ChargeSwitch-结合的核酸去除蛋白和其他杂质。然后，当周围介质的pH升高(＞8.5)并且正电荷被中和时，核酸可以从
Figure BDA00003268037900031
配体释放。
Nexttec DNA分离系统允许在细胞裂解后四分钟内用单次离心步骤纯化DNA。其比当前所用的DNA分离系统快多至五倍。这可能通过专有吸附剂基质实现，与基于二氧化硅的方法相反，其保留抑制物质如蛋白和低分子量物质，并且允许裂解的样品中的纯DNA通过。这种方法的一个局限是其依赖于在60℃的长时间酶裂解步骤。
本领域技术人员目前所用的方法是在管、离心柱或平板中进行，并且在操作时间和多个步骤上需要大量的手工操作，因此成为DNA分析的瓶颈。使用液体处理机器和在多孔平板中实施上述技术，使用真空汲取样品和反应溶液到用于每种技术的活性基质中，已经用于更高通量应用，然而，这些需要成批的样品才能使其成本有效，并且这仍然产生瓶颈。对于多种应用，诸如在医疗点处对临床相关DNA的分子分析，这正被迅速认为是控制传染病中正在出现的耐药性问题的唯一方法，特别是在发展中和第三世界国家中，这些方法不适用，并且不能容易地在医疗装置点实施。
一些方法，诸如包被微柱或微流体通道中的其他特征和/或结构、或具有二氧化硅表面的顺磁珠，已经在微流体装置中落实和实施，然而，需要多个洗涤步骤和多种缓冲液意味着流体程序设计和微流体装置设计本身是复杂的，因此使得装置昂贵。
发明概述
在一个实施方案中，公开一种用于从裂解物或全样品中同时提取和分级分离DNA的装置，所述装置包括单流通微流体通道，所述通道包括缓冲液和试剂室和吸附剂滤器。
所述吸附剂滤器可以包括至少部分由包含聚苯胺或其衍生物的聚合物涂层覆盖的支持物。
所述装置可以包括玻璃材料。
所述装置可以包括PDMS材料。
在所述装置的一个实施方案中，所述单流通微流体通道包括在其入口处的球根状结构，其中所述球根状结构逐渐变细为在其出口处的较细的结构。
在一些实施方案中，所述吸附剂滤器包括构造在所述微流体通道的壁中的一系列实心或空心的微结构。
在一些实施方案中，所述吸附剂滤器是松散的并且包装在微流体通道内。
在另一个实施方案中，所述吸附剂滤器是设置成结合除核酸之外的细胞样品材料和其他临床/生物样品材料的基质。
按照本发明的一些实施方案，公开用于制造从样品提取和分级分离DNA的微流体装置的方法。所述方法包括：形成至少两个具有通道的坯料层；形成粘合层，其具有被切割穿过该层的端口，所述端口对应于通道的入口和出口端口；以吸附剂材料真空包装一部分通道；并且将所述粘合层排列在所述坯料层之间，并且在压力下将各层粘合在一起。
在另一个实施方案中公开用于从裂解物或全样品中同时提取和分级分离DNA的方法。所述方法包括：提供包括单流通微流体通道的装置，所述通道包括缓冲液和试剂室以及吸附剂滤器；将样品应用到所述单流通微流体通道的入口；用缓冲剂活化所述吸附剂滤器；使样品流入到包含所述吸附剂滤器的通道部分中；使样品通过所述通道流动，并且使其通过包含所述吸附剂滤器的通道部分循环1-10次；并且使提取和分级分离的DNA流出所述装置。
在一个变化方案中，样品流入到包含吸附剂滤器的通道部分，然后在其中温育15秒-15分钟，然后流出所述装置。在另一个变化方案中，样品流入到包含吸附剂滤器的通道部分，然后样品在流出所述装置之前在吸附剂滤器通道内来回振荡。
在一些实施方案中，用缓冲剂活化所述吸附剂滤器，并且将裂解的样品流入到包含所述滤器的通道中，并且使得样品通过通道流到端部，产生纯的或接近纯的DNA溶液。
产生的洗脱物足够纯，并且进行浓缩以在琼脂糖凝胶上检测，并且可以用于PCR、RT-PCR、DNA测序、杂交实验，并且可以在纳米生物传感器如纳米孔、碳纳米管和纳米线生物传感器中检测。
在一些实施方案中，缓冲液和其他试剂储存在盒外，并且通过外部装置的射流技术递送。
附图简述
图1显示用于DNA提取和分级分离的微流体装置的部件分解示意图。
图2显示微流体装置的俯视图。
图3显示微流体装置的仰视图。
图4显示微流体装置的聚碳酸酯插片。
图5显示微流体装置的聚碳酸酯外壳。
图6显示激光切割的双边胶带层，其可以用来将插片(图4)和外壳(图5)粘合在一起，由此形成所述微流体装置的微流体通道。
图7显示层压在盖式流体贮池上的外壳和插片。
图8显示放置在吸附剂填装室的入口处和出口处的筒式插片内的滤器，以确保吸附剂材料保持在适当的位置。
图9显示应用到插片以将盒的两半部分(插片和外壳)保持在一起并且产生微流体通道的双边胶带层。
图10显示在真空下填充的吸附剂室。
图11显示组装的核酸提取微流体装置的俯视图。
图12显示组装的核酸提取微流体装置的仰视图。
图13显示用提取盒和标记有Nexttec清洁柱DNA提取的工作台通过提取实验运行80μl11.0μg/ml鲑鱼精子的结果。
图14显示来自穿过提取微流体装置的裂解的人血液的洗脱物级分的PCR。图14a显示泳道1为质量梯子，泳道2-12为洗脱物1-11。图14b显示泳道1为质量梯子，泳道2-10包含洗脱级分13-21。
图15显示对基于尺寸分离DNA的洗脱物级分进行BioAnalyzer分析的凝胶图像。
图16显示DNA提取和分级分离装置A的备选实施方案。
图17是显示医疗点装置和微流体盒的透视图，其包括在所述盒内的DNA提取和分级分离装置。
图18是显示按照一些实施方案设计用于手持诊断的微流体盒的各部件的示意图。
图19显示在一些实施方案中设计用于手持测序的微流体盒设计。
优选实施方案的详述
在一些实施方案中，公开用于整合来自生物学样品和临床样品的不同分子量核酸分子的核酸(DNA，RNA，cDNA等)提取和分级分离的装置和分子生物学方法，其用于下游应用，诸如，但也不限于，聚合酶链式反应(PCR)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、杂交(诸如southern印迹、微阵列、表达阵列等)、DNA测序(包括用于配对末端测序(paired-end sequencing)的整合的提取和尺寸选择)和其他相关的应用。
本领域中目前所用的分析DNA或RNA的序列和生物学的方法仅收集存在于生物学样品或临床样品中的全部DNA。没有一种方法是基于DNA片段或基因组的尺寸或分子量进行分离。基于分子量分离DNA片段提供了一种用于富集样品以获得特定的目的DNA的方法。例如，用于血源性细菌感染的分子诊断测试将受益于富集样品获得分子量在细菌基因组DNA(gDNA)尺寸范围内的DNA并且弃去较小的DNA片段和较大的人DNA片段。
分级分离被定义为一种分离过程，其中特定量的混合物(在这一情形中，不同分子量的DNA片段)被分成多个较少的量(级分)，其中组成随梯度变化(即，不同的DNA片段按照分子量、尺寸或电荷组织)。基于个体成分的特定性质(诸如分子量)的差异收集级分。还不存在能够在一个单流通装置中既提取又分级分离不同分子量DNA分子的技术。因此，本发明涉及用于在单流通装置中从全样品或裂解的样品进行不同分子量DNA片段(诸如病毒、质粒、gDNA等)的DNA提取和分级分离的技术的制造和应用。
下一代测序方法依赖于称为配对末端测序或配对测序的技术来解析结构元件。这一操作流程要求待测序的模板DNA分子必须在设定的尺寸或分子量范围内。花费大量的工作和资源来制备这些用于配对末端测序的文库。使用多合一的集成装置，如本申请所述的装置既用于提取DNA又选择DNA分子量，将消除这一瓶颈，并且使用本专利所述的装置通过‘前期’测序装置为使样品制备自动化提出了机会。
按照本发明的实施方案公开了制造微流体装置的方法和使用所述微流体装置提取DNA并基于分子量分级分离DNA的方法。所述方法包括提供微流体盒以及使用该盒用于在一个单流通装置中进行核酸提取和分级分离的提议的操作流程和实施例。
基本方面是单流通流体装置，其既从裂解物或全样品提取DNA又基于片段分子量分级分离所述DNA。最简单的装置由下述组成：样品进入通道或端口，提取和分级分离室，通道或柱和洗脱物流出端口或流体通道。通道、室或柱最常见是采用微米-尺寸，但是也可以采用宏观尺寸、纳米-尺寸和皮(pico-)尺寸。本发明的独特方面在于既能从全样品或裂解物提取DNA又能分级分离DNA的单室。
为了检测在单通道/室中进行DNA提取和分级分离的可能性，按照本发明的实施方案制造简单的微流体装置。按下述并且参考图1-12制造并使用所述装置。
筒的坯部件(外壳和插片)是用取决于应用需要用各种聚合物(例如，PP、PE、PC、COP、COC、PMMA等)注塑、铣削或其他制造方法制成的。如果需要，通道被进一步铣削并且加工成所需要的特定深度和宽度的聚合物。筒在组装之前彻底清洁。激光切割粘合剂以与同宏观流体、微流体、纳米流体、皮流体进入和流出相接所需要的端口相对应，并且在筒的部件之间提供流动通道。阻止吸附剂材料溢出的疏水性滤器通过手工冲压、切割或其他方法制成正确的尺寸。吸附剂真空填充到吸附剂室中，并且用疏水性滤器密封。排列多层并且与中间层(诸如PSA)保持在一起。使用基于压力的系统(例如，层压、液压机)将各个筒部件稳固粘合在一起。在所述装置的优选实施方案中，盒由聚碳酸酯或其他生物相容性塑料材料注塑或铣削而成。在其他实施方案中，盒由玻璃模塑或铣削而成。
所述微流体核酸提取盒的一些要点/特征在于可以将DNA与所有其他的细胞成分分离并且还基于分子量分级分离样品中的DNA的室。在该室内是多个滤器和/或多个层析柱，它们分开或在一起地将DNA与裂解物或全样品中的所有其他组分分开，并且还基于尺寸分离DNA片段。在下文所示的多个实施例和在研究这些装置的大量工作中，提取DNA的方法由吸附剂滤器提供(诸如在美国专利号7,018,538中所述；其通过引用完全结合于此)，当以特定密度填装在细长的通道或室中时，该吸附剂滤器还使得DNA基于尺寸分级分离。吸附剂优选是至少部分由包含聚苯胺或其衍生物的聚合物涂层覆盖的支持物。在使滤器变细长的微流体装置设计内组合使用这种处于不同填充密度的吸附剂滤器产生了令人惊讶的分级分离和提取DNA的能力。
通过增加填充密度并且研究不同分子量DNA片段群体在其通过填装有所述吸附剂滤器的通道时的保留，观察到不同分子量的DNA片段在不同的时间洗脱下来。图13显示未剪切的鲑鱼精子基因组DNA在前5个洗脱物级分中洗脱下来，然后，在图14中，0.1-10kb log梯子的较小片段在级分6-10中洗脱下来。较小分子量的DNA片段被拖延而较大的片段先通过。结果清楚地提供了这样的证据：在单个或为增加解析度的多个通道/室内能够既提取又分级分离。
在本发明的其他实施方案中，可以使用备选的滤器或结构或化学性质来从样品提取并分级分离DNA。可以使用其他的滤器或能够结合来自样品裂解物或全血样品的所有其他细胞碎片的宏观结构、微-结构、纳米-结构或皮-结构，分级分离由与这些特征或化学性质整合的其他标准层析柱、或凝胶、或电场提供。
在更多的实施方案中，可以使用多种通道形状、尺寸和路径。图1-12所示的实施例显示通道以微尺寸蜿蜒。然而，通道或室尺寸没有特别的限制，并且可以改变或逐渐变细或按照其他设计，只要所述通道或室足够长，足以促进从裂解物提取DNA和分级分离DNA即可。通道尺寸可以在宏观的、微米的、纳米的、皮米的范围内，只要滤器或层析材料可以填充在其中即可。
在一个实施方案中，微流体室在入口处是球根状结构，逐渐变细成较细小的出口(例如，见图16)。球状末端填充促进通过宏观流体、微-流体、纳米-流体、皮-流体通道上样的样品的扩散的材料。然后，这允许样品同时上样到提取和分级分离滤器中，由此允许更好的分级分离。
在所述装置的一些实施方案中，可以在微流体装置中提供试剂贮池，并且这些可以在筒上提供用于储存活化缓冲液，贮池用于收集洗脱液和废液的样品贮池。
在更多的实施方案中，对单流通通道施加和应用不同的压力和流速，以促进有效的分子量DNA的提取和分级分离。这些压力和流速以及填充密度和通道/室尺寸可以改变以适合不同的应用。
在微流体中使用高面积的一个问题是高的表面积：体积的比率，在这种情形中，这表示DNA非特异性结合到表面上并且不被洗脱下来的可能性。本领域技术人员已知的表面化学性质可以用来防止DNA吸附到盒上。
在一些实施方案中，微流体通道的表面可以进行处理，以防止吸收和吸附到材料内和材料上。这样的表面处理可以包括下述方法，包括但不限于：沿着通道流动牺牲性物质(sacrificial substance)，由此减少材料损失，用生物学物质诸如牛血清、聚合酶或其他此类物质处理表面，或化学处理表面以防止损失。处理可以包括但不限于，放置产生亲水性或疏水性表面的材料以允许更平稳的流动。在一些其他的实施方案中，碳氟化合物和类似的材料(Teflon作为充当疏水性屏障的实例，或聚丙烯酸酯)可以沉积在通道的表面上。本发明还可以包括其他方法，诸如从表面化学生长出来(grown off)的UV涂层和聚合物刷。在另一个实施方案中，可能的是，选择制造筒的材料或修改其设计和材料组成，以防止表面上或表面内的材料损失。
参考图1，显示1a，缓冲液填充端口-移液管头，或其他用来用缓冲液填充装置的装置，插入到端口中，以用制备缓冲液填充筒。1b，注射器泵3端口-端口盖连接缓冲液端口(1a)与缓冲液端口(1b)。该通路(via)沿筒的厚度延伸以与用于产生流动或压力的外部注射器泵或其他装置相接。1c，缓冲液贮池-在这一贮池中包含或储存缓冲液，并且在使用时用来活化或湿润滤器。2a，样品(裂解物)填充端口-移液管头，或用来填充样品/裂解物的其他装置，插入到端口中，以用样品/裂解物填充微流体装置。2b，注射泵1端口-端口盖连接样品端口(2a)与注射器端口(2b)，该通路沿筒的厚度延伸以与外部注射器泵相接。2c，样品贮池-样品(裂解物)在使用之前包含在该贮池中。3a，滤器腔1-容纳在吸附剂填装室的入口处的滤器。备选地，可以使用微结构和其他用于从裂解物分离DNA的材料。3b，滤器腔2-容纳在吸附剂填装室的出口处的滤器。4，废液通道和端口-用于从吸附剂室流出的和通过注射器泵2从筒中流出的过量的制备缓冲液的废液路径。5a，收集贮池-在该贮池中收集来自吸附剂室的洗脱物，用于后续用移液管吸出。5b，注射器泵4端口-提供抽吸以通过吸附剂填装室汲取洗脱物并且进入到收集贮池中。6，滤器-
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亲水性滤器。7，滤器通路-通过这些通路缓冲液/样品裂解物或其他样品从筒插片层流到外壳层。8，注射器泵通路(胶带)-在胶带的这一端部处的通路形成从筒的插片层到外壳层的通道，在此处它们与外部注射器泵相接。9，注射器泵通路(外壳)-与外部注射器泵相接。10，吸附剂填装室，其包含吸附剂粉末，例如，Nexttec吸附剂粉末。
参考图2，显示组装的微流体装置的俯视图。参考图3，显示组装的微流体装置的仰视图。
图4所示的微流体装置的插片可以通过铣削、平版印刷制造或其他制作工艺产生。其可以由塑料如聚碳酸酯或其他材料制成。
图5所示的外壳可以通过铣削、平版印刷制造或其他制作工艺产生。其可以由塑料如聚碳酸酯或其他材料制成。
参考图6，显示激光切割的双边胶带层。双边胶带60，或本领域已知的任意其他粘合剂，可以用来将插片(图4；附图标记50)和外壳(图5；附图标记70)粘合在一起，由此形成微流体装置80的微流体通道。
参考图7，显示外壳70被层压以盖住流体贮池。在其他实施方案中可以使用其他给流体贮池加盖的方式。
参考图8，滤器6已被放置在吸附剂填装室的入口和出口处插片50的滤器腔(3a和3b)内，以确保吸附剂材料保持在适当的位置。在其他实施方案中，可以不使用这些滤器，因为盒设计(组装的插片和外壳部件)可以在结构上进行改进以防止吸附剂材料溢出，例如，通过减少在入口和出口处的吸附剂填充室的管腔横截面面积。
参考图9，显示双边胶带层被应用到插片上，以保持盒的两半部分(插片和外壳)在一起并且产生微流体通道。当然，可以使用任何其他本领域已知的粘合胶带、粘合剂、聚合物层等替代所述双边胶带。
参考图10，显示组装的盒80的吸附剂室在真空下的填充。通过敷料器82(例如，移液管)在吸附剂室的一端供应吸附剂。在示例的实施方案中，通过对吸附剂室的另一端施加真空而促进吸附剂填充。真空通过真空管84(与真空源连接)施加。真空管84的远端可以进行改进，如所示，通过包括弹性体抽吸杯或与弹性体抽吸杯相接而对吸附剂室的开口提供足够的负压施加。
参考图11，显示组装的核酸提取微流体装置的俯视图。
参考图12，显示组装的核酸提取微流体装置的仰视图。
参考图13，显示用提取盒和工作台通过提取实验运行80μl11.0μg/ml鲑鱼精子的结果，所述工作台标记有Nexttec清洁柱DNA提取。作为从盒洗脱下来的洗脱物，使用Quant IT系统评估每个级分的DNA浓度。将来自清洁柱的提取的结果和来自盒的每个洗脱物级分的结果制成表格，并且挨着该表格绘图显示级分浓度。与清洁柱上的0.46μg和0.58μg相比，最终提取的总DNA是0.043μg。这些结果证明使用所述微流体盒既能提取又能分级分离DNA。尽管来自提取盒的DNA的量和浓度显著低于来自清洁柱的，但是提取盒不与热循环仪集成，而是进行单次扩增反应。预计扩增能够大量增加DNA产率。
参考图14，对来自通过提取微流体装置的裂解的人血液的洗脱物级分进行PCR。图14a显示泳道1为质量梯子，泳道2-12为洗脱物1-11。最强的强度条带是在前两个级分中，如预测一样，原因在于这些将包含gDNA。图14b显示泳道1为质量梯子，泳道2-10包含洗脱级分13-21。泳道11包含来自水的PCR(空白)，泳道12包含来自用已知浓度的DNA(21μl/mL)提取的DNA样品的PCR。
参考图15，显示来自对基于尺寸分离DNA的洗脱物级分进行的BioAnalyzer分析的凝胶图像。BioAnalyzer试剂盒中包含的尺寸梯子在泳道L和12运行。泳道1-10表示在上样20μl‘Quick-Load2-log DNA梯子’(#N0469S，New England BioLabs)并通过所述装置运行后，从图1-12所示的微流体装置洗脱下来的前10μl洗脱物级分。
参考图16，显示关于DNA提取和分级分离装置的结构的一种备选的微流体设计的非限制性设计。显示样品进入(161)。流体通道(162)可以是宏观尺度的、微尺度的、纳米尺度的或皮尺度的流体通道。显示吸附剂材料(163)，其促进通过流体通道上样的样品的扩散，以使样品上样到滤器(164)上。优选地，吸附剂材料(163)不结合或者分级分离DNA，尽管其可以设计成结合并且阻碍某些其他裂解物组分。滤器(164)将DNA与其他裂解物组分分离并且基于分子量分级分离所述DNA。室/通道逐渐变细，并且滤器的填装密度是这样的，以使分级分离增加级分的解析度。宏观尺度的、微尺度的、纳米尺度的或皮尺度的流体通道(165)是流出洗脱物级分的地方。
图17是显示医疗点装置和微流体盒的透视图，其包括在所述盒内的DNA提取和分级分离装置。
图18是显示按照一些实施方案设计用于手持诊断的微流体盒的各部件的示意图。一次性盒包括样品接收区181和样品裂解室182。特定的裂解缓冲液/条件在本领域中是已知的。样品制备发生在微流体通道183中，优选具有吸附剂，例如，Nexttec’s吸附剂材料。在一些实施方案中，可以在室184中进行DNA浓缩，然后进行DNA提取。在室184中还可以进行冻干试剂(如果使用干的试剂)和/或PCR试剂的重构(或湿试剂的混合)。如果使用热循环，例如，用于PCR扩增，其将在室185中进行。加工过的(任选地扩增的)DNA将通过微流体通道186传送到分析/传感器阵列187，其包括，例如，在本发明之后或之内阵列排列的纳米线或其他生物传感器。电子器件188用来连接来自纳米线/生物传感器的信号与读取装置(未显示)。废液仅在空的微流体贮池189。
图19显示在一些实施方案中设计用于手持测序的微流体盒。样品接收区191可以充当样品溢出的屏障，并且还能够接纳样品，例如，更像在血液真空采血管(vacutainer)上的橡胶盖。裂解室192可以是简单的微型反应器室，其包括裂解试剂以分解细胞并释放基因组DNA。如果靶核苷酸聚合物可能游离在血清中，该部分还可以类似于滤器，以去除血细胞。核酸样品制备室193可以用来将样品的核苷酸聚合物级分与其余的样品组分(蛋白、碳水化合物、脂质等)分离并且提取样品的核苷酸聚合物级分。这可以通过本领域技术人员公知的一些方法实现。例如，该宏观流体室可以包含Nexttec’s过滤技术。靶核苷酸聚合物的扩增可以在配置用于PCR扩增所述靶核苷酸聚合物的循环仪194中进行。循环仪194可以利用加热元件或其他公知的经过PCR所需要的不同温度循环反应混合物的策略，来进行所需要的热循环，或者等温扩增法(诸如LAMB，RPA，等)，其可以不需要加热样品。样品加工，如果应用的话，在一些实施方案中可能是合乎需要的，至少用来浓缩核酸，或者在测序之前去除可能引起背景信号的‘突出’的核苷酸链。这样的加工在室195中进行。一般的微流体196包括多个变量，诸如在一些实施方案中所用的通道的尺寸，流体流动，阀门和控制，材料和阀门。在一些实施方案中，金属连接器197连接灵敏检测纳米结构(在优选的实施方案中，为纳米线)与检测器装置(未显示)。灵敏检测纳米结构阵列198可以接触一个或多个微流体通道，并且可以是紧密排列的灵敏检测纳米结构(诸如纳米线或碳纳米管)。将DNA放置在通道中的方法可以包括，例如，紧密通道，其允许长DNA片段沿着所述通道解开、迁移和伸展，如果需要，这可以允许长的读码长度，并且叠加探针/引物可以点样在纳米线簇上，并且通过所述通道进行短暂的多个平行的测序反应。蜿蜒的微流体通道199可以填充试剂，在一些实施方案中，试剂由气泡分开。由于该微流体通道可以泵入，或者微小致动器推动试剂前行，在所述微流体通道中的试剂的顺序可以通过合成反应来运行测序，例如在2011-0165572A1，2011-0165563A1和PCT/IB2009/005008中所公开的，这些通过引用完全结合于此。备选地，这种试剂储存方法可以用贮池或泡罩包装替换，并且还可以是通过反应液自身重构的冻干的试剂。
实施例
下述是本公开内容的一些实施方案的一些示例性和非限制性实施例。
实施例1-从机械裂解的全血提取DNA用于PCR
通过迫使人全血通过小直径的孔而将人全血机械裂解，这使得细胞壁破裂并且释放DNA(也可以使用其他机械裂解方法)。将该裂解物通过所述DNA提取微流体装置并且收集洗脱物级分。这些洗脱物级分在PCR反应中用作模板，所述PCR反应扩增人基因组上的短区域。前两个洗脱的级分分别为34μl和32μl，接下来的18个级分体积为20μl。图14显示的数据清楚地证明该装置能够提取DNA，其不包含不利地影响聚合酶反应的杂质。
实施例2-DNA片段分级分离
40μL2X log梯子上样到实例盒(如图1-12所述)上，并且泵入到DNA提取和分级分离柱上。然后，收集10μL级分，共收集400μL。然后在BioAnalyzer装置(Agilent)上分析每个洗脱物级分的尺寸分布和丰度。图15显示这一分析的结果。用通过DNA提取盒(如图1-12所述)的未剪切的鲑鱼精子DNA利用相同的操作流程进行对照实验。结果显示在图13中，并且表明较大的鲑鱼精子比较小的log梯子更早从所述装置上洗脱下来，这证明简单的分级分离能力。
实施例3-DNA测序
多种测序方法，helicos，FLX(Roche)，基因组测序仪(Illumina)，纳米孔和纳米线(QuantuMDx，US61094,006)利用微流体和流动单元将提取的DNA的样品递送至进行测序反应的位置。然而，迄今为止的所有技术使用‘装置外’的样品制备，其中样品的DNA(或RNA/cDNA)用传统的工作台方法(Qiagen的离心柱，Invitrogen的电荷转换，Nexttec的吸附剂滤器离心柱等)提取，这对测序过程增加了大量的时间，并且时间上需要大量的操作者手工操作。这种微流体方案将使这些技术成为‘前沿的’，允许每种技术成为样品到结果装置，并且使产生序列数据所需要的所有过程自动化。
实施例4-自动化和集成的DNA提取和尺寸选择，用于配对末端测序
标准的下一代测序法，使用短枪法受到短的读码长度的限制。对于该关键的限制的解决方案是配对末端标签(paired-end tag，PET)测序策略，其中从长DNA片段的末端提取短的和配对的标签用于超高通量的测序。PET序列可以准确地绘制在参照基因组上，由此划分PET-表示的DNA片段的基因组边界并且揭示靶DNA元件的身份。为了做到此，提取DNA之后选择特定尺寸的片段，以允许成功实施这一策略。这是耗费时间且昂贵的。
例如，Illumina HiSeq和MiSeq操作流程包括一个Zymo清除步骤(在“标签化(tagmentation)”之后)和一个Ampure XP尺寸选择步骤(在有限循环PCR之后)。最终的文库具有～250-300的中值插入尺寸，以支持在MiSeq系统上的长配对末端2x150读码长度。
使用多合一的集成装置既用于提取DNA又选择尺寸，将消除这一样品制备瓶颈，并且使用本专利中提出的装置通过‘前期’测序装置为使样品制备自动化提出了机会。
实施例4-诊断
多种分子诊断方法，Cepheid(Smart Cycler)、Light Cycler(Roche)、BeadXpress和Eco实时PCR系统(Illumina)、7500实时PCR系统(ABI)、GeneChip系统(Affymetrix)，和将来的装置，诸如纳米孔装置、微流体装置和纳米线&碳纳米管装置(QuantuMDx)，利用DNA(或RNA/cDNA)作为其检测底物。然而，如果不是迄今为止的所有技术，则大部分技术应用‘装置外’样品制备，其中样品的DNA(或RNA/cDNA)使用传统工作台方法(Qiagen的离心柱，Invitrogen的电荷转换，Nexttec的吸附剂滤器离心柱等)提取，这对分子诊断过程增加了大量的时间，并且时间上需要大量的操作者手工操作。这种微流体方案将使这些技术成为‘前沿的’，允许每种技术成为样品到结果装置，并且使产生分子诊断数据所需要的所有过程自动化。
实施例5-单装置分子分析
在一些实施方案中，可以在微流体通道中提取特定的靶DNA序列，其通往在单流通微流体盒中的进一步的下游过程。该盒将进行裂解、提取、样品浓缩、扩增、检测和废液处理，或者这些过程的任意组合。该盒可以是完全封闭的，一次性的并且可以手持操作，或者是台式设备或高通量装置。
实施例6-手持测序装置
在一些实施方案中，可以在微流体通道中提取特定的靶DNA序列，其通往在单流通微流体盒中的进一步的下游过程，其中DNA被测序(图13)。从样品裂解和提取DNA所需要的所有试剂可以储存在微流体通道中，每种洗涤溶液和裂解缓冲液可以通过气泡分开，或通过分开所述试剂的另外的方法分开，或者所述试剂可以储存在泡罩包装中、冻干储存或通过其他在微通道中储存试剂的方法储存。
在一些实施方案中，可以提取靶病毒、细菌或基因组DNA的小的特定区域以进行测序，并由此诊断特定的病毒、细菌或遗传序列(诸如SNP)的存在或不存在，以及提供关于遗传类型、突变(已知的或未知的)、耐药状态等的增值信息。
与本公开内容结合使用的多个实施方案使其自身用于手持测序，因为其可以不需要在测序反应之前提取DNA所需要的体积大的设备。
在一个实施方案中，探针序列可以固定化在灵敏检测纳米结构(在这种情形中为纳米线)上，待测序的模板ssDNA分子可以与所述探针序列杂交，并且探针序列可以作为用于通过合成反应测序的引物。在另一个实施方案中，模板ssDNA分子可以固定化在灵敏检测纳米结构上，并且可以用游离的引物寡核苷酸引发用于测序。
实施例7-设计高解析度的微流体DNA提取和分级分离装置
通过将样品引入至来自相似密度的微流体通道的柱而分级分离样品的一个问题在于不是所有的样品在相同的时间分相。不同分子量片段的DNA片段的混合物最可能在整个微流体通道中均匀散布在样品中，因此在一段时间段内进入提取和分级分离滤器的样品将妨碍分级分离，其中最先上样的DNA与最后进入的DNA分子的运行不同相。因此，混合物需要同时分相到提取柱和分级分离柱中。由球状入口组成的微流体室，其填充促使样品展开而不影响样品分级分离的材料，因此其允许整个样品同时进入到分级分离柱中，然后紧接着是逐渐变细(关于室尺寸而言)的柱，该柱填装有既能将DNA与裂解物组分分离又能基于片段分子量分级分离DNA的材料，这是一种方案。图16显示了关于DNA提取和分级分离装置的结构的这样一种可能的微流体设计的非限制性设计。

Claims (12)

1.一种用于从裂解物或全样品同时提取DNA并分级分离DNA的装置，所述装置包括单流通微流体通道，所述通道包括缓冲液和试剂室以及吸附剂滤器。
2.权利要求1的装置，其中所述吸附剂滤器包括至少部分由包含聚苯胺或其衍生物的聚合物涂层覆盖的支持物。
3.权利要求1的装置，其中所述装置包括玻璃材料。
4.权利要求1的装置，其中所述装置包括PDMS材料。
5.权利要求1的装置，其中所述单流通微流体通道包括在其入口处的球根状结构，并且其中所述球根状结构逐渐变细为在其出口处的较细的结构。
6.权利要求1的装置，其中所述吸附剂滤器包括构造到所述微流体通道的壁中的一系列实心或空心的微结构。
7.权利要求1的装置，其中所述吸附剂滤器是松散的并且包装在微流体通道内。
8.权利要求1的装置，其中所述吸附剂滤器是设置成结合除核酸之外的细胞样品材料和其他临床/生物样品材料的基质。
9.一种制造从样品提取和分级分离DNA的微流体装置的方法，所述方法包括：
形成至少两个具有通道的坯料层；
形成粘合层，所述粘合层具有被切割成穿过所述粘合层的端口，所述端口对应于所述通道的入口和出口端口；
用吸附剂材料真空包装一部分通道；并且
将所述粘合层排列在所述坯料层之间，并且在压力下将各层粘合在一起。
10.一种用于从裂解物或全样品同时提取并分级分离DNA的方法，所述方法包括：
提供权利要求1的装置；
将所述样品应用到所述单流通微流体通道的入口；
用缓冲剂活化所述吸附剂滤器；
使所述样品流入到包含所述吸附剂滤器的通道部分中；
使所述样品通过所述通道流动，并且使其通过所述包含所述吸附剂滤器的通道部分循环1-10次；并且
使提取和分级分离的DNA流出所述装置。
11.权利要求10的方法，其中所述样品流入到所述包含吸附剂滤器的通道部分，然后在其中温育15秒-15分钟，然后流出所述装置。
12.权利要求10的方法，其中所述样品流入到所述包含吸附剂滤器的通道部分，然后所述样品在流出所述装置之前在吸附剂滤器通道内来回振荡。
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