CN117546004A - 检测目标微粒的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种在微流体颗粒分析装置中检测流体中的目标微粒的方法，该微流体颗粒分析装置包括测量通道，该测量通道具有第一电极和第二电极，这两个电极在其间限定操作空间并利用电流源和用于监测来自第一电极和/或第二电极的电信号的装置处于电连接。将怀疑包含暴露标识结合配偶体的目标微粒的样品流体与识别结合配偶体组分混合，以提供该识别结合配偶体与该标识结合配偶体的复合物，并且用导电纳米颗粒标记该复合物；可选地将电导率调节至5,000μS/cm至50,000μS/cm的范围内，然后向微流体颗粒分析装置的测量通道施加悬浮液的流；施加电流以在该操作空间中产生电场，然后监测该第一电极与该第二电极之间的电信号以检测用这些导电纳米颗粒标记的目标微粒。该方法适合检测水或其他流体中的病原细菌。

Description

检测目标微粒的方法
技术领域
本发明涉及一种检测流体中的目标微粒的方法。在该方法中，在微流体装置中通过电阻抗谱(EIS)检测目标微粒。该方法可用于检测和量化作为目标微粒的特定病原体。
背景技术
阻抗谱被充分描述为一种无标记方法，用于检测和定量液体中的细菌和其他微粒。例如，Cheung等人2010(Cytometry Part A[细胞计数A],2010,77A:648-666)的综述文章总结了在微流体系统中使用阻抗流式细胞术的背景知识。
Gawad等人(Lab Chip[实验室芯片],2004,4:241–251)提出了使用EIS分析细胞的微流体流式细胞仪的理论考虑。建议对悬浮在电导率为12,880μS/cm的KCl溶液中的细胞进行表征，但未示出实际实例。
Gawad等人的工作由Cheung等人2005(Cytometry Part A[细胞计数A],2005,65A:124–132)付诸了实践。Cheung等人2005研究了红细胞及衍生组分和具有相当大小的珠(即直径约为5μm)的分化。展现了微流体设备的制造和测试，并示出了如何使用该设备来执行使用两种不同频率的EIS。该设备采用10mm/s的流量，并将细胞悬浮在高电导率的磷酸盐缓冲盐水中。
Houssin等人(IEEE SENSORS2009Conference[2009年IEEE传感器研讨会],396-399)报告了EIS在微型设备中用于分析具有低电导率的水中的寄生虫微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)卵囊的用途。David等人(Biotechnology and Bioengineering[生物技术与生物工程],2011,109:483-492)提供了流式细胞术与微流体EIS之间的比较。
用于检测和定量饮用水和其他液体中的细菌的示例性微流体设备披露于WO2016/116535和WO 2019/025613中。
然而，以上现有技术披露内容均不允许检测颗粒群中的特定颗粒，例如致病菌。Clausen等人(Sensors[传感器]2018,18,3496；doi:10.3390/s18103496)展现了如何能在低电导率盐水溶液(1x PBS，用Milli-Q水稀释至1/20)中区分大肠杆菌(Escherichiacoli)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。在低电导率盐水溶液中，更容易区分细菌与其他颗粒，但此方法的用途仅限于区分大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。
Bertelsen等人(Sensors[传感器]2020,20,6339；doi:10.3390/s20216339)展现了如何能使用阻抗流式细胞术区分灭活和活细菌细胞(也是在低电导率盐水溶液中)。
WO 2016/087460提出了如何用金属纳米颗粒标记目标颗粒，以帮助由微流体系统中的电信号检测目标颗粒。
从现有技术可以看出，需要利用EIS来检测特定细菌，尤其是在细菌混合基质中，并且本发明的目的是提供使用EIS检测特定病原体的方法。
发明内容
本发明涉及一种检测流体中的目标微粒的方法，该方法包括：
-提供微流体颗粒分析装置，该微流体颗粒分析装置包括具有1μm到70μm范围内的截面尺寸的测量通道、以及用于检测颗粒的传感器系统，该测量通道包括第一电极和第二电极，该第一电极和该第二电极限定了该第一电极与该第二电极之间的操作空间，该第一电极和第二电极经由电路处于电连接，该电路包括交流电源、以及用于监测来自该第一电极和/或该第二电极的电信号的装置；
-提供怀疑包含目标微粒的样品流体，该目标微粒暴露标识结合配偶体；
-提供识别结合组分，该识别结合组分包括对该标识结合配偶体具有结合亲和力的识别结合配偶体；
-将该识别结合配偶体组分与该样品流体混合，以提供包括该识别结合配偶体和该标识结合配偶体的复合物的施加悬浮液；
-用导电纳米颗粒标记该识别结合配偶体和该标识结合配偶体的复合物；
-如果该样品流体或该施加悬浮液的电导率低于5,000μS/cm，则将该样品流体或该施加悬浮液的电导率调整为处于5,000μS/cm至50,000μS/cm的范围内；
-向该微流体颗粒分析装置的测量通道施加该施加悬浮液的流；以及
-施加来自该电流源的交流电以在该操作空间中产生电场，并监测该第一电极与该第二电极之间的电信号以根据该电信号的相位并且可选地还根据该电信号的振幅来检测用这些导电纳米颗粒标记的目标微粒。
在本方法中，分析怀疑包含目标微粒的样品流体，以检测并且可选地还量化样品流体中的目标微粒。在该方法中，向微流体颗粒分析装置的测量通道施加可能包含目标微粒的液体，并使用电阻抗谱(EIS)、也称为阻抗流式细胞术(IFC)来检测目标微粒。本方法分析阻抗，并且在本上下文中，电极之间(例如，第一电极与第二电极之间)的阻抗被认为是电极之间的电压的复数表示与流经电极的电流的复数表示的比率。因为在本上下文中施加的电压来自交流电(例如，正弦信号)，由于电压与阻抗之间的线性关系，阻抗具有幅度和相位。使用EIS检测微粒被充分描述为一种无标记技术，并且使用阻抗检测液体中的颗粒传统上可以采用振幅、相位或振幅和相位两者。本发明人现在令人惊奇地发现，如果向测量通道施加包含用导电纳米颗粒标记的目标微粒的液体以使用EIS进行分析，并且该液体具有至少5,000μS/cm(例如在5,000μS/cm至50,000μS/cm范围内)的电导率，则当使用相位时，可以检测到用导电纳米颗粒标记的微粒并将其与其他微粒(即，未用导电纳米颗粒标记的颗粒)区分开，如图4和图8所示。相反，当阻抗分析不包括相位，例如只包括振幅时，用导电纳米颗粒标记的颗粒无法与未标记的颗粒区分开，如图3所示。此外，当电导率低于5,000μS/cm并且阻抗分析包括相位时，用导电纳米颗粒标记的颗粒也无法与未标记的颗粒区分开(见图6)。因此，本发明提供了对如何检测用导电纳米颗粒(例如，金属纳米颗粒)标记的微粒的问题的解决方案。本方法采用相位，但是该方法也可以采用相位和振幅两者。本发明人还令人惊讶地发现，用导电纳米颗粒标记的微粒的检测没有出现由导电纳米颗粒导致的测量伪影引起的问题。因此，EIS在微流体尺度上的快速响应与标记目标微粒的选择性和特异性以及EIS的灵敏度高效地结合，以提供对目标微粒的极其灵敏的检测。
在本方法中，施加交流电以在操作空间中产生电场。在本上下文中，交流电也可以称为AC或AC电压，并且这些术语可以互换使用。一般而言，交流电或AC电压在电极之间具有正弦电压变化，但是也设想电极之间的更复杂的电压变化。因此，在示例中，该方法中采用正弦交流电。然而，还设想可以采用直流电源。所施加的交流电被视为参考信号，并且通过将监测到的电信号与参考信号进行比较来获得或“提取”监测到的电信号的相位。相位通常表示为“相角”，并且在本上下文中，相角以单位rad(或弧度)表示，例如表示为“相位[rad]”。振幅通常以单位dB表示，并且在本上下文中表示为“振幅[dB]”。相关频率也可以用相角和振幅来指示。参考信号与监测到的信号的比较对于本领域技术人员来说是公知的，并且任何相位提取方法都可以用于本方法中。示例性方法包括使用相位检测器或使用同相和正交(I-Q)解调。一般来说，I-Q解调包括两个混合操作：将监测到的信号与参考信号混合，以及将监测到的信号与延迟90度的参考信号混合。在这种情况下，“混合”相当于两个信号相乘。当混合具有相同频率的两个正弦信号时，可以对结果信号进行低通滤波，以去除非线性操作中涉及的谐波。结果，两个所得信号对应于监测到的电信号的同相分量和正交分量，可以从中提取振幅和相位。I-Q解调允许同时提取振幅和相角，而其他方法仅提取相角。当仅提取相角时，可以使用任何补充方法来获得振幅。
目标微粒暴露标识结合配偶体，并且该方法采用对标识结合配偶体具有结合亲和力的识别结合配偶体。因此，该方法中形成标识结合配偶体和识别结合配偶体之间的复合物，并将标识结合配偶体和识别结合配偶体之间的复合物用导电纳米颗粒标记。由此，暴露标识结合配偶体的目标微粒被导电纳米颗粒标记。标识结合配偶体可以被认为与识别结合配偶体互补，并且标识结合配偶体和识别结合配偶体也可以称为结合配偶体对，例如该复合物可以称为结合配偶体对。结合配偶体对可以从感兴趣的目标微粒中自由选择。例如，细菌和其他微生物通常暴露这些微生物特有的一种或多种分子，使得这些分子可用于识别该微生物。例如，可以使用与标识微生物的分子具有互补结合亲和力的结合配偶体来进行识别。标识微生物的分子可以是例如蛋白质分子，例如抗原或糖分子(例如寡糖或多糖)。该分子(即标识结合配偶体)可以对单一微生物物种(例如细菌)具有特异性，或其可能对一组相关微生物(例如相关微生物属)具有特异性。例如，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌可以通过其表面的脂多糖区分，并且识别结合配偶体(例如抗体)可以与革兰氏阴性菌特异性的脂多糖结合，从而提供群组特异性标识结合配偶体。
因此，如本文所用，术语“结合配偶体”是指能够彼此特异性结合的一对分子的两个部分中的任一个，并且因此其可以指抗原-抗体对中的抗原或抗体、碳水化合物-凝集素对中的碳水化合物或凝集素、互补DNA序列的双链分子中的任一条DNA链等。一般而言，结合配偶体对的合适实例包括通过抗原-抗体相互作用、化合物-适配体相互作用、抗体-抗体相互作用、蛋白质-小分子相互作用、酶-底物相互作用、酶-底物类似物相互作用、凝集素-碳水化合物相互作用、药物-受体相互作用、链霉亲和素-生物素相互作用、核酸-核酸相互作用、核酸-蛋白质相互作用等形成的那些。术语“抗体”是指任何合适同种型的抗体以及含有完整抗体的抗原结合特异性的抗体片段。抗体可以是单克隆或多克隆来源的，或者它们可以是重组产生的。
“标识结合配偶体”是指一对结合配偶体中目标微粒暴露的部分，使得当识别结合配偶体与标识结合配偶体结合时，可以通过目标微粒的标识结合配偶体来识别该目标微粒。例如，可以将识别结合配偶体固定在导电纳米颗粒上。标识结合配偶体可以是天然存在于目标微粒上的任何分子，但还预期在该方法中可以采用任何数量的辅助结合配偶体。例如，可以通过使辅助结合配偶体与标识结合配偶体结合并且随后使识别结合配偶体与结合标识结合配偶体的辅助结合配偶体结合来识别目标微粒。因此，在本披露的上下文中，“辅助结合配偶体”是具有主动结合位点和被动结合位点的结合配偶体。辅助结合配偶体的主动结合位点将与识别结合配偶体或另一辅助结合配偶体的被动结合位点特异性结合，并且辅助结合配偶体的被动结合位点将与识别结合配偶体或另一辅助结合配偶体的主动结合位点结合。因此，例如，在本发明方法中，辅助结合配偶体可以与标识结合配偶体和识别结合配偶体结合。特别地，辅助结合配偶体的主动结合位点与标识结合配偶体结合，并且辅助结合配偶体的被动结合位点与识别结合配偶体结合。同样，在本发明方法中，第一辅助结合配偶体可以与标识结合配偶体结合，并且第二辅助结合配偶体可以与第一辅助结合配偶体和识别结合配偶体结合。特别地，第一辅助结合配偶体的主动结合位点与标识结合配偶体结合，第一辅助结合配偶体的被动结合位点与第二辅助结合配偶体的主动结合位点结合，并且第二辅助结合配偶体的被动结合位点与识别结合配偶体结合。
当在该方法中使用辅助结合配偶体时，优选地，辅助结合配偶体具有两个或更多个(例如，多个)被动结合位点，特别地多个相同的被动结合位点。特别地，辅助结合配偶体可以根据被动结合位点的数量与主动结合位点的数量之间的比率来定义。例如，辅助结合配偶体可以具有一个主动结合位点和两个或更多个被动结合位点。当辅助结合配偶体具有两个或更多个(例如多个)被动结合位点，特别地多个相同的被动结合位点，尤其是当被动结合位点的数量与主动结合位点的数量之间的比率为二或更大时，经由辅助结合配偶体结合目标微粒的识别结合配偶体的数量可能增加一个系数，该系数对应于相对于主动结合位点的数量的被动结合位点的数量。因此，当辅助结合配偶体具有多个被动结合位点，特别地多个相同的被动结合位点时，与不使用辅助结合配偶体时(例如当识别结合配偶体直接与标识结合配偶体结合时)相比，本发明方法的灵敏度增加。具有多个被动结合位点的示例性辅助结合配偶体是抗体。例如，辅助结合配偶体可以是针对标识结合配偶体的抗体，并且识别结合配偶体可以是针对用作辅助结合配偶体的抗体的抗体。另外的示例性辅助结合配偶体包含具有主动结合配偶体的分子，该分子与聚合分子(例如寡糖或多糖)连接(例如共价结合)，并且该聚合分子与具有被动结合配偶体的多个分子(例如相同分子)连接(例如共价结合)。
在本发明方法中，标识结合配偶体和识别结合配偶体之间的复合物被标记。因此，可以将识别结合配偶体固定在导电纳米颗粒上，并且可以通过将样品流体与含有固定在导电纳米颗粒上的识别结合配偶体的识别结合配偶体组分混合来标记目标微粒。
例如，该方法可以包括以下步骤：
-提供微流体颗粒分析装置，该微流体颗粒分析装置包括具有1μm到70μm范围内的截面尺寸的测量通道、以及用于检测颗粒的传感器系统，该测量通道包括第一电极和第二电极，该第一电极和该第二电极限定了该第一电极与该第二电极之间的操作空间，该第一电极和第二电极经由电路处于电连接，该电路包括交流电源、以及用于监测来自该第一电极和/或该第二电极的电信号的装置，
-提供怀疑包含目标微粒的样品流体，该目标微粒暴露标识结合配偶体，
-提供识别结合组分，该识别结合组分包括固定在导电纳米颗粒上的识别结合配偶体，
-将该识别结合配偶体组分与该样品流体混合，以经由该识别结合配偶体和该标识结合配偶体的复合物提供包括用导电纳米颗粒标记的目标微粒的施加悬浮液；
-如果该样品流体或该施加悬浮液的电导率低于5,000μS/cm，则将该样品流体或该施加悬浮液的电导率调整为处于5,000μS/cm至50,000μS/cm的范围内；
-向该微流体颗粒分析装置的测量通道施加该施加悬浮液的流；以及
-施加来自该电流源的交流电以在该操作空间中产生电场，并监测该第一电极与该第二电极之间的电信号以根据该电信号的相位并且可选地还根据该电信号的振幅来检测用导电纳米颗粒标记的目标微粒。
因此，在该方法的一个实例中，将识别结合配偶体固定在导电纳米颗粒上。在本发明方法的上下文中，术语“固定”是指使用任何期望的方法将识别结合配偶体与导电纳米颗粒结合。例如，识别结合配偶体可以吸附至导电纳米颗粒，识别结合配偶体可以通过离子相互作用与导电纳米颗粒结合，识别结合配偶体可以与导电纳米颗粒共价结合等。结合配偶体至纳米颗粒的固定化是技术人员众所周知的，并且将结合配偶体固定至纳米颗粒的任何方法都可以用于本发明方法中。例如，导电纳米颗粒可以具有金属(例如金或银)外表面，并且基于蛋白质的识别结合配偶体(例如抗体)可以经由相应氨基酸的-SH基团与金属(例如金)结合。因此，当识别结合配偶体和标识结合配偶体的复合物形成时，目标微粒被导电纳米颗粒标记。
导电纳米颗粒包含对标识结合配偶体具有结合亲和力的识别结合配偶体。一般而言，标识结合配偶体和识别结合配偶体参与反应1中的反应，以形成标识结合配偶体和识别结合配偶体之间的复合物。在反应1中，BP标识是标识结合配偶体，BP识别是识别结合配偶体，并且BP复合物是标识结合配偶体和识别结合配偶体之间形成的复合物。
反应1
结合亲和力可以用等式1描述：
等式1
在等式1中，KA是缔合常数，并且[BP复合物]、[BP标识]和[BP识别]分别是平衡时标识结合配偶体和识别结合配偶体之间的复合物的浓度、未结合的标识结合配偶体的浓度和未结合的识别结合配偶体的浓度。优选地，识别结合配偶体和标识结合配偶体之间的亲和力用解离常数表示，KD＝KA -1，范围为10-15M至10-5M。
本发明方法使用微流体颗粒分析设备，该设备使用电阻抗谱(EIS)来检测流体中的目标微粒。在本发明上下文中，微流体颗粒分析设备中的EIS也可以称为阻抗流式细胞术(IFC)，并且被配置为在本发明方法中使用的具有带有电极的测量通道的微流体颗粒分析设备可以称为阻抗流式细胞仪。在本发明上下文中，术语“微流体”旨在覆盖这样的大小范围：其中通道的最小尺寸在约1μm至约1mm，例如约10μm至约200μm范围内，并且一般而言通道将不含有收缩。一般而言可以认为，微流体系统中的流体将在层流条件下流动，并且只要包含在系统中的流体在层流条件下流动，则具有不同于以上定义的通道的流体系统就可以被很好地描述为“微流体”。
该微流体颗粒分析装置包括具有1μm到70μm范围内的截面尺寸的测量通道和用于检测颗粒的传感器系统，该测量通道包括第一电极和第二电极，该第一电极和该第二电极限定了该第一电极与该第二电极之间的操作空间。应当理解，通道不需要被通道壁完全封闭，并且例如通道(例如，测量通道)可以沿着长度轴线通向另一个通道(例如，更大的通道)。WO 2019/025613中披露了对应的装置，其中存在主通道，该主通道沿顶点具有沿主流动方向延伸的开口，该开口通向分析区段，该分析区段对应于在本上下文中的测量通道，但是其中测量通道因此没有被通道壁完全封闭。第一电极和第二电极也可以称为“颗粒检测系统”。因此，颗粒检测系统包括第一电极和第二电极，该第一电极和第二电极限定了该第一电极与第二电极之间的操作空间，该第一电极和第二电极经由电路处于电连接，该电路包括交流电源以及用于监测来自第一和/或第二电极的电信号的装置。
测量通道包括第一电极和第二电极，该第一电极和该第二电极在第一电极和第二电极之间限定了操作空间。容纳电极的测量通道的区段也可以称为分析区段。第一电极和第二电极可以在分析区段的同一表面上，例如第一电极和第二电极可以处于“共面”设定，或者第一电极和第二电极可以被定位在分析区段中的相对表面上，例如第一电极和第二电极可以处于“平行重叠”设置。当第一电极和第二电极定位在分析区段中的相对表面上时，该设置也可以称为“正对”。当两个电极共面时，操作空间平行于分析区段中的流动方向，并且操作空间是电极之间的距离，即从第一电极的边缘到第二电极的边缘。共面电极的操作空间可以在1μm到70μm、例如1μm到50μm或1μm到20μm范围内。
当两个电极处于平行重叠设置时，在适当考虑电极的厚度的情况下，操作空间等于第一表面与第二表面之间的分析距离。一般来说，电极与表面齐平，但是电极可以从表面上升达约1μm，典型地上升达约500nm，例如200nm，这被认为不会影响微流体颗粒分析装置中液体的行为，使得这种电极不会造成影响。第一电极和第二电极通常具有相同的大小，例如表面大小在1μm到100μm范围内，例如5μm到50μm，但是第一电极和第二电极也可以具有不同的大小。电极可以是任何导电材料，但是通常是金属的，例如由钛、金、镍、铜、铱、铂、钯或它们的组合和合金制成。
电极经由电路处于电连接，该电路包括交流电源、以及用于监测电信号的装置。电路可以包括导体，这些导体与微流体颗粒分析装置成一体，例如在微流体颗粒分析装置的基底中。可以适当地选择交流电源，并且交流电源可以提供kHz到MHz范围内(例如从100kHz到100MHz或1MHz到20MHz)的频率。第一电极与第二电极之间的电压将通常在0.1V到20V、例如0.5V到5V范围内。用于监测电信号的装置可以包括用于分析从电极记录的信号的处理装置。用于监测电信号的装置可以进一步包括用于显示或传输来自用于监测电信号的装置的数据的输出装置。用于传输数据的装置可以使用任何无线或有线数据传输协议来操作。
可以以单一频率提供交流电，或者该方法可以采用至少两个频率，例如两个或更多个不同的频率。例如，该方法可以使用100kHz至100MHz(例如1MHz至20MHz)范围内的第一频率、以及100kHz至100MHz(例如1MHz至20MHz)范围内的第二频率，第二频率不同于第一频率。与仅使用单一频率相比，当采用两个不同的频率时，用导电纳米颗粒(例如金属纳米颗粒)标记的颗粒可以更容易与未标记的颗粒区分开。
测量通道包括电极，并且在本上下文中，电极可以称为电极组。每个电极组具有第一电极和第二电极。测量通道可以包括上游电极组和下游电极组。上游电极组也可以称为起始电极组，并且下游电极组也可以称为平衡电极组。在使用中，向第一电极施加电压，并且在第二电极处测量电流。第一电极也可以称为“激励电极”，并且第二电极也可以称为“参比电极”。例如，以预定的采样速率(例如连续地)记录测量的电流。当没有任何颗粒的液体通过电极(例如操作空间)时，参比电极将提供“基信号”，并且当颗粒(比如生物细胞，例如细菌)经过操作空间时，信号将改变。当使用上游电极组和下游电极组两者时，上游电极组和下游电极组经由电路处于电连接。优选地，该电路包括上游电极组和下游电极组两者，使得当向第一电极施加电压时，相同的电压被施加到上游电极组和下游电极组中的第一电极。由此，可以记录上游电极组与下游电极组之间的差分电信号。在示例中，上游电极组和下游电极组共享单个第一电极，即，上游电极组和下游电极组共享激励电极。被共享的激励电极优选地布置在相对于测量通道中的流动方向的上游电极组和下游电极组的第二电极(即，参比电极)之间。在本上下文中，术语“差分信号”或“差分电信号”意指通过从上游电极组的信号中减去下游电极组的信号而获得的信号。当相同的电压被施加到上游电极组和下游电极组并且电极没有检测到颗粒时，除了随机噪声之外，差分信号为零。使用差分电信号允许识别共模噪声，并且可以增大接收器的动态范围，并且对应地，可以以更高的灵敏度检测颗粒。
在特定实施例中，电极以共面设置来布置，并且颗粒检测系统包括位于两个参比电极之间的激励电极。测量电极包括激励电极的上游的第一参比电极和激励电极的下游的第二参比电极。在此实施例中，操作空间被分成第一参比电极与激励电极之间的起始操作空间和激励电极与第二参比电极之间的平衡操作空间。在使用中，向激励电极施加电压，并在两个参比电极处测量电流。穿过操作空间的颗粒将首先遇到起始操作空间，在始操作空间，其存在将通过激励电极与第一参比电极之间的信号的变化来记录。当颗粒处于起始操作空间时，在激励电极与第二参比电极之间将不会记录到信号的变化，但是当颗粒到达平衡操作空间时，其存在将通过激励电极与第二参比电极之间的信号的变化来记录，而在激励电极与第一参比电极之间将不会记录到信号的变化。这允许相同的颗粒通过电极设置被记录两次，并且因而可以估计颗粒的速度。颗粒速度的测量允许估计测量通道中液体的总流动速度，例如线性流动速度。因此，此实施例允许估计通过微流体颗粒分析装置的流量。了解测量通道中的流体速度比仅采用单个参比电极时可以记录的进一步提供对液体中的颗粒浓度的更好的估计，因为信号可能与估计的流体速度相关。当颗粒检测系统包括以平行重叠设置布置的两组或更多组电极时，可以获得这个相同的效果，其中第一(即上游)组电极限定了起始操作空间，并且第二(即下游)组电极限定了平衡操作空间。在两个实施例中，起始操作空间和平衡操作空间的大小可以是相同的，或者大小可以彼此不同。当采用处于平行重叠设置的两组电极时，两组电极之间的距离将通常在5μm到50μm、例如10μm到20μm范围内。
颗粒检测系统位于测量通道中。微流体颗粒分析装置可以不包括除测量通道之外的其他通道，或者微流体颗粒分析装置可以包括任何数量和类型的附加通道。例如，微流体颗粒分析装置可以如WO 2016/116535中披露的那样包括旁路通道，或者测量通道可以如WO2019/025613中披露的那样通向主通道。WO 2016/116535和WO 2019/025613均通过援引并入本文。
在具体示例中，微流体颗粒分析装置包括经由限定主流动方向的主通道与入口歧管流体连通的入口，该入口歧管提供与以下各项的并联流体连通：
-水动力阻力R旁路的旁路通道，和
-水动力阻力R测量的测量通道，该测量通道具有在1μm至50μm范围内的截面尺寸并且进一步具有用于检测颗粒的传感器系统，
其中，流量分布参数X测量＝R测量 -1(R测量 -1+R旁路 -1)-1范围为10-6至0.25，其中，测量通道相对于主流动方向的角度在0°至60°范围内，并且其中，旁路通道相对于主流动方向的角度在0°至60°范围内°，并且
微流体颗粒分析装置进一步包括与旁路通道和测量通道处于流体连通的出口。颗粒检测系统位于测量通道内。
在另一个具体示例中，微流体颗粒分析装置包括通过限定从入口端到出口端的主流动方向的主通道而处于流体连通的入口和出口，
-该主通道由从该入口端延伸到该出口端的主通道壁限定并且具有在20μm到120μm范围内的第一截面尺寸和至少100μm的第二截面尺寸，该主通道的第一顶点与第二顶点相对，这些顶点在该第二截面尺寸上彼此相对，
在该第一顶点和/或该第二顶点处的该主通道壁具有沿着该主流动方向延伸的开口，并且
该主通道壁沿着该开口通向分析区段，该分析区段的第一表面与第二表面相对、相距5μm到50μm范围内或5μm到70μm范围内的分析距离，并且该分析区段具有用于检测颗粒的传感器系统。在该示例中，主通道是测量通道，因此颗粒检测系统位于主通道中。
在本发明方法中，提供怀疑包含目标微粒的样品流体。目标微粒可以是通常与其他微粒一起发现的任何微粒。在本披露的上下文中，可以在本发明方法中分析微粒(可以通过测量通道的任何微粒)。例如，微粒可以是大小在0.5μm至50μm范围的颗粒，尽管微粒也可以小于0.5μm或大于50μm。示例性目标微粒包含其他细菌和微生物群体中的特定细菌(例如致病菌)，并且还可能存在非生物来源的另外的微粒。相应地，样品流体可以是目标微粒可以存在的任何液体。示例性样品流体包括水(例如饮用水、海水或湖水)、体液(比如血液、唾液或精液)、其他生物流体(比如牛奶)、食品应用流体(例如啤酒、葡萄酒、软饮料)或工业液体(比如发酵液)。
还预期目标微粒可以小于0.5μm，并且通过用导电纳米颗粒(例如金或银纳米颗粒)标记目标微粒，单个目标微粒可以通过导电纳米颗粒交联以形成足够大以用于本发明方法中的检测的凝集微粒。例如，具有固定的识别结合配偶体的导电纳米颗粒通常具有多个固定的识别结合配偶体分子，这些分子可以交联具有多个标识结合位点的单个目标微粒。例如，目标微粒可以是病毒颗粒，例如大小在20nm至500nm范围内的病毒颗粒。
根据本发明方法，当将液体流施加至微流体颗粒分析设备的测量通道时，电导率在5,000μS/cm至50,000μS/cm的范围内，例如8,000μS/cm至50,000μS/cm的范围内，例如10,000μS/cm至50,000μS/cm、比如15,000μS/cm至50,000μS/cm的范围内。如果样品流体的电导率低于5,000μS/cm，则通常增加样品流体的电导率以使电导率在5,000μS/cm至50,000μS/cm的范围内。电导率可以根据需要进行调整。特别地，可以将盐(例如NaCl)添加至样品流体中。盐可以以干燥形式或作为溶液(特别地浓缩溶液)添加。无论如何添加盐，都可以监测由于添加盐而导致的样品流体的体积变化。可以针对样品流体或施加悬浮液调节电导率，并且调节时间不影响标记的目标微粒的检测。
在本发明方法中，提供了包含对标识结合配偶体具有结合亲和力的识别结合配偶体的导电纳米颗粒。导电纳米颗粒可以根据需要呈任何形式。优选地，导电纳米颗粒作为水性液体中的悬浮液提供。水性液体中导电纳米颗粒的浓度通常在103ml-1至109ml-1，例如105ml-1至108ml-1的范围内，并且水性液体与样品流体之间的比率通常在1:1至1:1000，例如1:5至1:100的范围内。
在一个实例中，导电纳米颗粒作为水性液体中的悬浮液提供，其具有高电导率，使得通过将含有导电纳米颗粒的水性液体与样品流体混合，来使所得的含有导电纳米颗粒的施加悬浮液达到电导率在5,000μS/cm至50,000μS/cm的范围内。例如，水性液体与样品流体之间的比率通常在1:1至1:1000，例如1:5至1:100的范围内，并且根据样品流体的电导率以及水性液体与样品流体之间的预期体积比来选择相对于样品流体的水性液体的电导率。
向微流体颗粒分析装置的测量通道施加导电纳米颗粒的施加悬浮液。因此，在使用中，液体流被引导通过微流体颗粒分析装置(例如，从入口到出口)，并且流过微流体颗粒分析装置的液体被分析以获得颗粒的含量，例如颗粒被“检测”。微流体颗粒分析装置也可以称为流式系统。施加悬浮液通过微流体颗粒分析装置、特别是测量通道的流速通常不受限制，并且目标微粒的检测不依赖于流速。例如，测量通道中的线性流动速度可以在1mm/s至10m/s、例如10mm/s至100mm/s或100mm/s至1,000mm/s的范围内。测量通道中的流速还可以表示为体积流量，并且微流体颗粒分析装置的体积流量可以在0.1μl/min到10ml/min(例如0.5μl/min到2ml/min)或1μl/min到500ml/min(例如5μl/min到100μl/min)的范围内。
当随时间进行颗粒的检测时，该检测也可以称为“监测”颗粒，例如可以测量液体中的颗粒的含量。流系统可以连续操作或以分批模式操作。在本上下文中，术语“连续”意指在延长的时间段内向测量通道施加流，并且当检测到目标微粒时，用相对于向测量通道施加流的时间点来标记该检测。连续模式中目标微粒的检测还可以相对于流过测量通道的样品流体的体积进行量化(例如，基于流速)。对于某些应用，例如监测液体流，比如饮用水或含有生产细胞的工艺流，连续流动优于分批式分析，因为可以比需要提取和分析样本时更快地获得阳性检测结果，例如采样之间的时间减少到零。在本上下文中，术语“分批模式”意指在本方法中分析一定体积、特别是限定体积的样品流体。对于小样品(例如血液样品)中的病原细菌或微生物的检测，优选以分批模式操作。
微流体颗粒分析装置可以是这样的流式系统：液体流进入入口并经由出口离开微流体颗粒分析装置。因此，入口和出口可以限定微流体颗粒分析装置中的流动方向，并且在这种背景下，微流体颗粒分析装置的元件可以相对于流动方向在彼此“上游”或“下游”。
微流体颗粒分析装置至少包括测量通道，但是微流体颗粒分析装置还可以包括其他通道。在本发明的背景下，通道可以具有任何截面形状，例如，通道可以是正方形、矩形、圆形等。微流体颗粒分析装置不限于具有相同截面形状的通道，并且单个通道的截面形状可以在通道的长度上变化。
微流体颗粒分析装置可以包括泵(例如外部泵)，该泵用于经由入口推动液体通过微流体颗粒分析装置，并且微流体颗粒分析装置还可以包括辅助泵，该辅助泵例如用于经由出口吸入液体。泵可以是任何适合于特定任务的泵，并且示例性泵是活塞泵、注射泵、蠕动泵、膜泵、隔膜泵、齿轮泵、微环形齿轮泵或任何其他合适类型的泵。
在本方法中，采用导电纳米颗粒来标记感兴趣的微粒。在本披露的上下文中，“纳米颗粒”是大小在0.1nm至1000nm范围内的颗粒。然而，优选导电纳米颗粒具有1nm至100nm、或3nm至50nm范围内的大小。
一般而言，导电纳米颗粒的任何部分都可以向导电纳米颗粒提供导电性。具体地，电流在样品流体或导电纳米颗粒的悬浮液中传导并且通过导电纳米颗粒的一个或多个导电部分。例如，导电纳米颗粒可以是导电材料的，或者它们可以包括导电材料的核心或涂层。当导电纳米颗粒包括导电材料的涂层时，导电纳米颗粒通常具有另一种材料(例如非导电材料)的核心，而另一种材料可以被导电材料完全或部分地包被。导电材料通常是金属和贵金属，例如金、银或铂是优选的金属。
导电纳米颗粒通常通过至少具有金属涂层或核心而导电，但也设想可以使用其他导电材料。例如，石墨是导电的并且导电纳米颗粒可以是或包括石墨核心。
在示例中，导电纳米颗粒包括非导电材料的核心和导电金属(例如金或银)的涂层。可以选择核心的非导电材料以向导电纳米颗粒提供特定的功能。例如，非导电材料可以是密度低于包被导电纳米颗粒核心的金属的玻璃或聚合物，使得该导电纳米颗粒与由对应金属制成的导电纳米颗粒相比密度可以降低。
在另一个示例中，非导电材料的核心是超顺磁性纳米颗粒。超顺磁性颗粒对于本领域技术人员来说是公知的，并且可以选择任何超顺磁性材料用于核心。例如，超顺磁性纳米颗粒可以是代表单磁畴的纳米颗粒，例如磁性氧化铁(例如磁铁矿)纳米颗粒，其大小在3nm至50nm范围内。超顺磁性纳米颗粒还可以是几个单磁畴纳米颗粒的簇。
当导电纳米颗粒包括超顺磁性核心时，导电纳米颗粒的超顺磁性性质允许使用磁场来操纵导电纳米颗粒。例如，微流体颗粒分析装置可以包括具有磁性捕获区域的区段，样品流体中包含的超顺磁性纳米颗粒可以被固定在该磁性捕获区域中。固定在磁性捕获区域中的超顺磁性纳米颗粒可以在被固定的同时经受进一步的分析，或者可以将超顺磁性纳米颗粒从磁性捕获区域转移到另一个地点(例如，转移到微流控颗粒分析之外的地点)以用于分析。磁性捕获区域可以包括具有在10μm至1000μm范围内的最小截面尺寸的通道以及一个或多个销，例如销的直径在1μm至1000μm范围内，具有高磁导率，例如为80％镍和20％铁的合金(“坡莫合金”)等，布置在第一磁极与跨通道相对的第二磁极之间，例如销可以与第一磁极和第二磁极之间的线成45°至135°范围内的角度。
本发明的任何实施例可以用于本发明的任何方面，并且当实施例用于特定方面时，特定实施例的任何优点同样适用。
附图说明
在下文，将在示例的帮助下并参考示意图更详细地说明本发明，在附图中：
图1展示了用于本方法的装置中的测量通道中的平行重叠电极布局；
图2示出了用于本方法的装置中的测量通道中的共面电极布局；
图3示出了在16,000μS/cm下革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、聚苯乙烯颗粒、硼硅酸盐珠和银包硼硅酸盐珠的计数与振幅的图；
图4示出了在16,000μS/cm下革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、聚苯乙烯颗粒、硼硅酸盐珠和银包硼硅酸盐珠的计数与相角的图；
图5示出了在800μS/cm下革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和聚苯乙烯颗粒的群体图；
图6示出了在800μS/cm下革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和银包硼硅酸盐珠的群体图；
图7示出了在16,000μS/cm下革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和聚苯乙烯颗粒的群体图；
图8示出了在16,000μS/cm下革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、聚苯乙烯颗粒、硼硅酸盐珠和银包硼硅酸盐珠的群体图；
图9示出了在4,000μS/cm下革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、硼硅酸盐珠和银包硼硅酸盐珠的群体图；
图10示出了在8,000μS/cm下革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、聚苯乙烯颗粒和银包硼硅酸盐珠的群体图；
图11示出了在12,000μS/cm下革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、聚苯乙烯颗粒和银包硼硅酸盐珠的群体图。
本发明不限于附图中展示的实施例。因此，应理解当所附权利要求中提及的特征后面是附图标记时，此类标记仅出于提高权利要求的可理解性的目的而被包括并且决不限制权利要求的范围。
具体实施方式
本发明涉及一种在微流体颗粒分析装置1中检测流体中的目标微粒5的方法，该微流体颗粒分析装置包括测量通道2，该测量通道具有第一电极4和第二电极4，这两个电极在其间限定操作空间3并利用电流源和用于监测来自第一电极和/或第二电极4的电信号的装置处于电连接。合适的微流体颗粒分析装置是称为BactoBox(来自丹麦赫尔雷夫的SBTInstruments A/S)的微流体颗粒分析装置1，但是WO 2016/116535和WO 2019/025613中披露的微流体颗粒分析装置同样是合适的。
图1展示了用于该方法的微流体颗粒分析装置1的区段，其中电极4处于平行重叠设置。图1示出了测量通道的操作空间3，其中电极4位于该操作空间中。电极4形成在基板12上。在图1中，电极4被指定为具有附加标签“A”到“D”。在该示例中，微流体颗粒分析装置1包括面向相对的第一参比电极B的第一激励电极A。此外，与第二参比电极D相对的第二激励电极C位于第一激励电极A和第一参比电极B的下游。电压(例如交流电)被施加到激励电极A、C，并且在两个参比电极B、D处测量电流。减去来自两个参比电极B、D的信号(Idiff＝IAB-ICD)，以便获得图1所示的特征转变信号。当电极A-B或C-D之间不存在颗粒5时，测量的电流在电极A和B处相等(IAB＝ICD)，并且因此差分信号为零(Idiff＝0)。随着颗粒5移动到上游激励电极A与其参比电极B之间的体积，即操作空间3中，在上游参比电极B上测量的信号发生变化。然而，下游参比电极D上的信号将不会改变，并且差分电流将不同于零(Idiff≠0)。当颗粒5恰好被定位在上游激励电极A与其参比电极B之间时，测量到最大差分电流。当颗粒在流动流方向上恰好在A和B电极以及C和D电极之间时，测量的信号将再次相等(Idiff＝0)。当颗粒定位在激励电极C与其参比电极D之间时，测量到最小差分电流。
用于该方法的另一个微流体颗粒分析装置1的区段如图2所示。图2示出了测量通道的操作空间3，电极4位于该操作空间中。电极4形成在基板12上。在图2中，电极4以共面设置来布置，并且微流体颗粒分析装置1包括位于两个参比电极A、C之间的激励电极B。向激励电极B施加电压，并且在两个参比电极A、C处测量电流。减去来自两个参比电极A、C的信号(Idiff＝IBA-IBC)，以便获得特征转变信号，如图2所示。当电极4之间不存在颗粒5时，在电极A和电极C处测量的电流相等(IBA＝IBC)，并且因此差分信号为零(Idiff＝0)。随着颗粒5移动到上游参比电极A与激励电极B之间的体积，即操作空间3中，在上游参比电极A上测量的信号发生变化。然而，下游参比电极C上的信号将不会改变，并且差分电流将不同于零(Idiff≠0)。当颗粒5恰好定位在上游参比电极A与激励电极B之间时，测量到最大差分电流。当颗粒5在激励电极B的中心正上方时，测量的信号将再次相等(Idiff＝0)。当颗粒恰好被定位在激励电极B与下游参比电极C之间时，测量到最小差分电流。
处于几个频率下的转变信号的大小和形状被用来表征颗粒特性和样本特征，因此确定样本中的颗粒5的类型。此外，通过考虑颗粒已经移动的长度和转变的时间(ttr)，转变信号可以用于确定颗粒5移动穿过电极4的速度。通过评估从最大峰值到最小峰值的时间，可以直接根据转变信号确定时间。转变的时间(ttr)在图1和图2中指示。通过考虑两件事来评估颗粒5行进的距离。首先，电极4的宽度及它们之间的距离是在微流体颗粒分析装置1的设计期间选择的特定尺寸并且被明确限定。其次，由于测量通道2的微尺寸，测量通道2中的流动是层状的。这意味着在转变期间，颗粒5将停留在测量通道2中的相同位置，例如分析区段3，并将在电极4上沿直线移动。因此，通过确定最大和最小差分电流之间的时间以及颗粒5已经行进的物理距离，可以计算颗粒5的精确速度(参见图1和图2)。通过评估颗粒5的流动速度并使用明确限定的通道尺寸，人们可以容易地确定分析区段3中的流量，因为颗粒5在任何给定的所施加的条件下将会跟随分析区段3中的流动。
微流体颗粒分析装置1可以使用任何合适的技术制造，但是由于通道的较小的临界尺寸，优选的是使用洁净室设施来制造微流体颗粒分析装置1。制造过程因此可以包括标准制造程序，比如电极剥离过程、光刻法和直接结合，这是本领域技术人员公知的。
在作为示例性微流体颗粒分析设备1的BactoBox设备中进行电阻抗谱(EIS)实验以说明本发明方法，但这些实验可以容易地在WO 2016/116535和WO 2019/025613中披露的设备中进行。对于以下实施例，用BactoBox在800μS/cm、4,000μS/cm、8,000μS/cm、12,000μS/cm和16,000μS/cm的电导率下(通过在注射用水(超纯水)中稀释磷酸盐缓冲盐水(PBS)来实现)测试不同的电导率场景。使用以下颗粒：1μm聚苯乙烯微球(聚合科学公司(Polysciences)，目录号：07310-15)、2μm聚苯乙烯微球(聚合科学公司，目录号：19814-15)、具有85nm银涂层的2μm硼硅酸盐微球(Cospheric公司，目录号：SiO2MS-AG-4.1)、大肠杆菌ATCC 8739ATCC和枯草芽孢杆菌斯氏亚种(Bacillus subtilis subsp.spizizenii)ATCC 6633。从平板中挑取单菌落的大肠杆菌和枯草芽孢杆菌，将其接种至8ml脑心浸液肉汤中，并在35℃，300rpm下生长过夜。在测量前，将培养物和微球在不同的电导率液体中分别稀释至500,000至1,000；000个细胞/ml和个微球/ml之间。使用单一频率(7MHz)进行测量，或在大约2MHz和7MHz的两个频率下进行测量，并且在所有情况下，输入信号在高电导率样品的3V峰峰值(peak-to-peak)至低电导率样品的15V峰峰值之间变化。使用定制的软件程序对结果进行分析和绘制。特别地，I-Q解调和事件检测在现场可编程门阵列(FPGA)中实现，FPGA是一种允许同时进行软件和硬件开发的嵌入式系统。每个事件都被检测为“计数”，并且事件的事后数据分析在Python中进行，但MATLAB(迈斯沃克公司(MathWorks Inc.)，内蒂克，马萨诸塞州，美国)也可以用于数据处理。因此，结果绘制为相对于振幅(表示为“HF振幅(dB)”)的计数数量(图3)、相对于相位角(表示为“HF相位[rad]”)的计数数量(图4)，或者结果以X轴上2MHz(其中LF相位表示2MHz的“低”频相位)和Y轴上7MHz(其中HF相位表示7MHz的“高”频相位)绘制(图5至图11)。可以使用单一频率来区分金属标记颗粒与未标记的颗粒，但通过使用两个频率并绘制高频相对于低频，可视化了信号的差异，从而表明某些颗粒类型可以彼此区分开。
实施例1
将革兰氏阴性大肠杆菌细菌、革兰氏阳性枯草芽孢杆菌细菌、分别为2μm和1μm的聚苯乙烯颗粒、2μm硼硅酸盐珠和银包被的2μm硼硅酸盐珠的样品悬浮在PBS中，以提供约16,000μS/cm的电导率，并将样品分别施加至BactoBox微流体颗粒分析。从数据中提取振幅和相位角，并相对于振幅绘制记录的计数(图3)，并针对相位角绘制记录的计数(图4)。数据叠加示于图3和图4中。
从图3可以看出，银包颗粒确实显示出与其他颗粒类型的计数峰略有不同的计数峰，但颗粒曲线的重叠表明仅使用振幅无法区分颗粒。然而，当绘图包括相位数据时(图4)，银包颗粒明显从其他颗粒类型中脱颖而出，并且使用相位角允许将银包颗粒与未标记的颗粒类型明显区分开。
实施例2
将革兰氏阴性大肠杆菌细菌、革兰氏阳性枯草芽孢杆菌细菌和分别为2μm和1μm的聚苯乙烯颗粒的样品悬浮在5％ PBS中，以提供约800μS/cm的电导率，并将样品分别施加至微流体颗粒分析设备。将样品分别施加至微流体颗粒分析设备，记录电信号并绘制在图5中。在图5中，大肠杆菌显示为黑点，枯草芽孢杆菌显示为灰色正方形，并且2μm和1μm聚苯乙烯颗粒分别显示为黑色叉形和灰点。从图5可以清楚地看出，细菌的位置与聚苯乙烯颗粒不同，并且彼此之间也不同，因此可以区分革兰氏阴性大肠杆菌细菌、革兰氏阳性枯草芽孢杆菌细菌和聚苯乙烯颗粒。
将银包被的2μm硼硅酸盐珠样品悬浮在5％ PBS中，并分别施加至微流体颗粒分析设备，并记录电信号。在图6中，显示银包硼硅酸盐珠的信号叠加在大肠杆菌细菌和枯草芽孢杆菌细菌的信号上。在图6中，黑点表示带有银涂层的硅酸盐颗粒，黑色正方形表示大肠杆菌，并且灰色叉形表示枯草芽孢杆菌。图6显示银包硼硅酸盐珠的信号与枯草芽孢杆菌细菌的信号重叠，并且这些信号无法彼此区分。
将2μm聚苯乙烯颗粒、大肠杆菌细菌和枯草芽孢杆菌细菌的样品悬浮在电导率约16,000μS/cm的100％ PBS中，并将悬浮液分别施加至微流体颗粒分析设备，并记录电信号。图7中重叠显示了信号的总体图。在图7中，黑点表示大肠杆菌，灰色正方形表示枯草芽孢杆菌，黑色叉形表示2μm聚苯乙烯颗粒，并且灰点表示1μm聚苯乙烯颗粒。图7表明，在PBS的电导率下，颗粒(即2μm聚苯乙烯颗粒、大肠杆菌细菌和枯草芽孢杆菌细菌)都无法区分，因为它们在总体图中的位置相同。
将银包被的2μm硼硅酸盐珠、2μm硼硅酸盐珠、聚苯乙烯颗粒、大肠杆菌细菌和枯草芽孢杆菌细菌的样品悬浮在电导率约16,000μS/cm的100％ PBS中，并将悬浮液分别施加至微流体颗粒分析设备，并记录电信号。图8中重叠显示了信号的总体图。在图8中，黑点表示具有银涂层的2μm硅酸盐颗粒，灰色正方形表示大肠杆菌，黑色叉形表示枯草芽孢杆菌，灰点表示2μm聚苯乙烯颗粒，黑色正方形表示1μm聚苯乙烯颗粒，并且灰色叉形表示2μm硅酸盐珠。图8表明，在银包被硼硅酸盐珠并分析与未包被的聚苯乙烯颗粒、未包被的硼硅酸盐珠和细菌相比的银包珠时，银包珠与其他颗粒明显区分开来，这些颗粒在图中聚集在一起。
因此，在约800μS/cm的低电导率下，革兰氏阴性大肠杆菌细菌、革兰氏阳性枯草芽孢杆菌细菌和聚苯乙烯颗粒可以使用EIS很容易地彼此区分。然而，在约16,000μS/cm的高电导率下，革兰氏阴性大肠杆菌细菌、革兰氏阳性枯草芽孢杆菌细菌和聚苯乙烯颗粒在图中聚集在一起，并且无法区分颗粒类型。当使用银涂层来标记颗粒时(在这种情况下由硼硅酸盐制成玻璃珠)，银涂层使得银包玻璃珠在高电导率下与其他颗粒类型明显区分开来，尽管银包玻璃珠在低电导率不能与枯草芽孢杆菌细菌区分开。因此，本发明人出人意料地发现，当在高电导率下以EIS分析银包颗粒时，与未包被的颗粒相比，银涂层允许检测银包颗粒。因此，银涂层可用于选择性标记目标微粒，以用于EIS检测。
实施例3
为了分析电导率的影响，进行了实验，其中将银包被的2μm硼硅酸盐珠、聚苯乙烯颗粒、大肠杆菌细菌和枯草芽孢杆菌细菌悬浮在不同浓度的PBS中，并将这些电导率调整样品分别施加至BactoBox微流体颗粒分析。特别地，将样品分别悬浮在25％、50％和75％PBS中，以提供分别为约4,000μS/cm、8,000μS/cm和12,000μS/cm的电导率。图9中示出了在4,000μS/cm下获得的测量结果的总体图，图10中示出了在8,000μS/cm下获得的测量结果的总体图，图11中示出了在12,000μS/cm下获得的测量结果的总体图。在图9至图11中，黑点表示具有银涂层的2μm硅酸盐颗粒，灰色正方形表示大肠杆菌，黑色叉形表示枯草芽孢杆菌，灰点表示2μm聚苯乙烯颗粒，并且黑色正方形表示1μm聚苯乙烯颗粒。
图9显示，在4,000μS/cm下，枯草芽孢杆菌细菌和银包玻璃珠之间仍有一些重叠，但随着电导率增加，银包玻璃珠的信号与其他类型颗粒的信号之间的区别越来越明显(图10和图11)。因此，在电导率为5,000μS/cm时，银包颗粒可以与没有银涂层的颗粒(特别地细菌)区分开来。
附图标记清单
1 微流体颗粒分析装置
12 基板
2 测量通道
3 操作空间
4 电极
A 第一激励电极
B 第一参比电极
C 第二激励电极
D 第二参比电极
5 颗粒。

Claims (12)

1.一种检测流体中的目标微粒的方法，该方法包括：
-提供微流体颗粒分析装置(1)，该微流体颗粒分析装置包括具有1μm到70μm范围内的截面尺寸的测量通道(2)、以及用于检测颗粒的传感器系统，该测量通道包括第一电极(4)和第二电极(4)，该第一电极和该第二电极限定了该第一电极(4)与该第二电极(4)之间的操作空间(3)，该第一电极和第二电极(4)经由电路处于电连接，该电路包括交流电源、以及用于监测来自该第一电极和/或该第二电极(4)的电信号的装置；
-提供怀疑包含目标微粒(5)的样品流体，该目标微粒(5)暴露标识结合配偶体；
-提供识别结合组分，该识别结合组分包括对该标识结合配偶体具有结合亲和力的识别结合配偶体；
-将该识别结合配偶体组分与该样品流体混合，以提供包括该识别结合配偶体和该标识结合配偶体的复合物的施加悬浮液；
-用导电纳米颗粒标记该识别结合配偶体和该标识结合配偶体的复合物；
-如果该样品流体或该施加悬浮液的电导率低于5,000μS/cm，则将该样品流体或该施加悬浮液的电导率调整为处于5,000μS/cm至50,000μS/cm的范围内；
-向该微流体颗粒分析装置(1)的测量通道(2)施加该施加悬浮液的流；以及
-施加来自该电流源的交流电以在该操作空间(3)中产生电场，并监测该第一电极与该第二电极(4)之间的电信号以根据该电信号的相位来检测用这些导电纳米颗粒标记的目标微粒(5)。
2.根据权利要求1所述的检测流体中的目标微粒(5)的方法，其中，该识别结合组分包括固定在导电纳米颗粒上的该识别结合配偶体。
3.根据权利要求1或2所述的检测流体中的目标微粒(5)的方法，其中，该导电纳米颗粒是银或金纳米颗粒。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的检测流体中的目标微粒(5)的方法，其中，该导电纳米颗粒包括非导电材料的核心和导电金属的涂层。
5.根据权利要求4所述的检测流体中的目标微粒(5)的方法，其中，该不导电的核心是超顺磁性纳米颗粒。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的检测流体中的目标微粒(5)的方法，其中，该识别结合配偶体与该标识结合配偶体之间的解离常数在10-15M至10-5M范围内。
7.根据权利要求6所述的检测流体中的目标微粒(5)的方法，其中，该识别结合配偶体选自由以下各项组成的组：抗原、蛋白质、多肽、寡肽、多糖、寡糖、糖、多核苷酸和生物素。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的检测流体中的目标微粒(5)的方法，其中，该目标微粒(5)是病原微生物。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的检测流体中的目标微粒(5)的方法，其中，该方法进一步包括检测未用这些导电纳米颗粒标记的微粒(5)。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的检测流体中的目标微粒(5)的方法，其中，用于检测颗粒的该传感器系统包括上游电极组(4)和下游电极组(4)，其中，每个电极组(4)具有第一电极(4)和第二电极(4)，并且该第一电极与该第二电极(4)之间的电信号是差分电信号。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的检测流体中的目标微粒(5)的方法，其中，以两个或更多个不同频率施加该交流电。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的检测流体中的目标微粒(5)的方法，其中，连续地或以分批模式向该测量通道(2)施加该施加悬浮液的流。
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