DE60204735T2 - Verfahren zum Kalibrieren der Probenhöhe in einem Analysegerät - Google Patents

Description

• Gebiet der Erfindung
• Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der quantitativen Mikrospektroskopie und insbesondere ein Verfahren zum Kalibrieren der Höhe einer Probe in einer Probenanalysiervorrichtung.
• Hintergrund der Erfindung
• Die Bestimmung von Blutparametern wie dem Hematocrit ("HCT"), dem Volumen einzelner roter Blutkörperchen ("RCV"), dem mittleren Zellvolumen ("MCV") und der Verteilungsbreite der roten Blutkörperchen ("RDW") ist von eminenter klinischer Wichtigkeit. Üblicherweise werden Systeme verwendet, die auf elektrischer Impedanzmessung (Coulter Counter) oder auf Lichtstreuung (Durchflußzytometer) basieren (siehe beispielsweise J.B. Henry, "Clinical diagnosis and management by laboratory methods", W.B. Saunders Company, Philadelphia, 1996, 5. 548 ff. oder D.H. Tycko, M.H. Metz, E.A. Epstein, A. Grinbaum, "Flow-cytometric light scattering measurement of red blood cell volume and hemoglobin concentration", Applied Optics 24 (1985), 1355–1365). Impedanzzähler sind komplexe und kostspielige Instrumente, die eine sehr sorgfältige Einstellung und Regelung der Instrumenten- und Probenparameter erfordern. Ein Hauptnachteil von Durchflußzytometern ist die Tatsache, daß die Parameter der Lichtstreuung nicht nur vom Zellvolumen, sondern auch von der Form der Zelle abhängen.
• 1983 schlugen Gray, Hoffman und Hansen ein neues optisches Verfahren zum Bestimmen des Volumens von Zellen in einem Durchflußzytometer vor (M.L. Gray, R.A. Hoffman, W.P. Hansen, "A new method for cell volume measurement based on volume exclusion of a fluorescent dye", Cytometry 3 (1983), 428–432). Bei diesem Verfahren sind die Zellen in einem fluoreszenten Farbstoff suspendiert, der die Zellmembranen nicht durchdringen kann. Der Fluoreszenzgrad, der erzeugt wird, wenn ein schmaler Strom der Zellsuspension durch einen fokussierten Laserstrahl erregt wird, bleib konstant, bis eine Zelle in dem beleuchteten Bereich ankommt, wodurch eine Verringerung der Fluoreszenzintensität bewirkt wird, die direkt proportional zum Volumen der Zelle ist. In einem Durchflußzytometer passiert eine einzelne Zelle den durch einen Laser beleuchteten Fleck innerhalb ungefähr 10μs. Aufgrund dieses kurzen Datenerfassungsintervalls muß die elektronische Erkennungsbandbreite relativ groß sein, was zu einem schlechte Signal/Rauschverhältnis und zu einer geringen Genauigkeit der Volumenbestimmung führt.
• Die verfügbare Datenerfassungszeit kann erheblich verlängert werden, indem die Zellen in einer stationären Probe suspendiert werden und Digitalabbildungsfluoreszenzmikroskopie verwendet wird (siehe P.L. Becker, F.S. Fay, "Cell-volume measurement using the digital imaging fluorescence microscope", Biophysical Journal 49 (1986), A465). Bei dem Digitalfluoreszenzmikroskopieansatz ist ein Kalibriervorgang erforderlich, um das Zellvolumen zu bestimmen. Recktenwald und Kollegen führten ein Verfahren ein, bei dem das Kalibrieren mittels optisch transparenter und nicht-fluoreszenter Mikrokugeln erfolgt, welche zusammen mit den Zellen suspendiert sind (D. Recktenwald, J. Phi-Wilson, B. Verwer, "Fluorescence quantitation using digital microscopy", Journal Physical Chemistry 97 (1993), 2868 – 2870). Das Volumen einzelner Kugeln wird durch Messen ihrer Projektionsfläche unter dem Mikroskop und durch Umwandeln dieser Zahl in ein Volumen ermittelt, wobei eine ideale Kugelform angenommen wird. Die Verringerung der Fluoreszenzintensität in Folge des Volumens der Kugel, das keine Fluoreszenz ausstrahlt, dient als der erforderliche Kalibrierparameter. Der Vorteil dieses Ansatzes ergibt sich aus der Tatsache, daß die Kalibrierpartikel sich in der Probe selbst befinden. Anders ausgedrückt: eine Kalibrierung erfolgt mit dem selben Probenbehälter und es ist keine eigene Kalibrierprobe erforderlich.
• Die Verwendung von Kalibrierkugeln in einer Zellsuspension ist nicht problemlos. Zunächst stellt das Einbringen der Kugeln einen zusätzlichen Schritt im Arbeitsablaaf dar. Bei Systemen, die für einen hohen Durchsatz ausgelegt sind, stellt dieser zusätzliche Schritt einen Nachteil dar. Zweitens beobachteten Recktenwald und Kollegen eine Neigung der Fluoreszenzfarbstoffmoleküle sich auf der Oberfläche der Kugeln abzulagern, was zu einem Fehler führt. Wenn, drittens, der optische Brechungsindex der Kugeln nicht gut mit dem Index der Flüssigkeit übereinstimmt, treten auf der Brechung basierende Artefakte an den Rändern der Kugeln auf. Schließlich kann die Verwendung von Mikrokugeln ein Problem darstellen, wenn beispielsweise eine geringe Probendicke in der Größenordnung von wenigen Mikrometern oder weniger erforderlich ist.
• Um die Probleme des Standes der Technik zu überwinden, wurde vorgeschlagen (US-Patent 6127184 and Wardlaw), einen küvettenartigen optischen Probenbehälter für eine Zellsuspension zu entwickeln, der in verschiedenen Bereichen unterschiedliche optische Pfadlängen aufweist. In mindestens einem Bereich ist die Dicke der flüssigen Schicht unverdünnten Blutes so dünn (2 bis 7 Mikrometer), daß Mono-Schichten aus isolierten roten Blutkörperchen ("RBC") gebildet werden. In einem anderen Bereich ist die flüssige Schicht dicker (7 bis 40 Mikrometer) und es bilden sich typische kettenartige Aggregate aus RBC (die als "Roleaux" bezeichnet werden). Der dicke Bereich dient der Bestimmung des HCT und der dünne Bereich dient der Bestimmung des RCV. Wie beim Stand der Technik wird das Blutplasma mit einem fluoreszierenden Farbstoff markiert, der nicht in die RBC eindringt.
• Bei einem Verfahren und einer Vorrichtung, die im US-Patent 6127184 beschrieben sind, wird die optische Küvette unter einem Miklroskop angeordnet, mit Erregungslicht beleuchtet und die wieder austretende Fluoreszenz wird mittels eines abbildenden Photodetektors, beispielsweise einer CCD Kamera, gemessen. Das RCV wird unter Anwendung der Gleichung

  

  bestimmt, wobei B_P die aus einem Bereich bekannter Größe, A, innerhalb eines von Zellen freien Plasmabereichs austretende Fluoreszenzintensität bezeichnet. B_RBC bezeichnet die Fluoreszenzintensität, die aus einem anderen Bereich gleicher Größe, jedoch mit einem einzelnen RBC, austritt. I der Praxis wird B_P durch Messen der Fluoreszenzintensität in einem von Zellen freien Bereich nahe einem bestimmten RBC und durch Extrapolieren der vollen Größe A ermittelt. Im Gegensatz zur HCT-Bestimmung müssen die absolute Fläche A und die absolute Höhe der flüssigen Schicht d bekannt sein. Anders ausgedrückt muß das absolute Volumen V = A·din welchem das einzelne RBC eingebettet ist bekannt sein. Die Fläche A kann unter dem Mikroskop leicht bestimmt werden. Die Bestimmung der Höhe d nahe dem RBC ist ein komplizierteres Problem und wird als "Kalibrierung" bezeichnet.
• Das US-Patent 6127184 offenbart einige Verfahren zum "Kalibrieren" der optischen Küvette, d.h. zum Bestimmen der Höhe d. Nach einem Verfahren wird ein quadratisches Kapillar mit bekanntem Volumen in der Küvette integriert. Durch Messen der Fluoreszenzintensität, die aus diesem Kapillar austritt, kann ein Kalibrierparameter C = Intensität/Volumen erhalten werden. Da die Fluoreszenzintensität pro Flächeneinheit als proportional zur Höhe der Küvette gilt, kann die Höhe an jeder Stelle durch die wieder austretende Fluoreszenzintensität bestimmt werden. In der Praxis kann das Integrieren eines kleinen Teils, wie eines vorgefertigten Kapillars in einen Wegwerfartikel aus Kunststoff, jedoch schwierig und kostspielig sein.
• Andere im US-Patent 6127184 offenbarte Verfahren umfassen die Verwendung einer stufenartigen Veränderung in der Küvettendicke als ein Mittel zum Kalibrieren und das Verwenden eines geformten Kalibrierstandards, beispielsweise ein Aufnahme von genau kontrollierter Höhe. Diese Verfahren weisen jedoch einige Nachteile dahingehend auf, daß sie den zusätzlichen Schritt des Präzisionsformens erfordern, was schwierig und kostspielig sein kann.
• Es hat sich infolgedessen gezeigt, daß ein Bedarf an einem Verfahren zum Kalibrieren der Höhe einer Probe in einer Probenanalysiervorrichtung besteht, das keine geformten Kalibrierwerkzeuge von extremer Genauigkeit erfordert.
• Überblick über die Erfindung
• Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Kalibrieren der Probenhöhe in einer Probenanalysiervorrichtung und insbesondere ein Kalibrierverfahren zu schaffen, das genau ist, jedoch keine geformten Kalibrierwerkzeuge von extremer Genauigkeit innerhalb der Probenanalysiervorrichtung erfordert.
• Erfindungsgemäß wird die genannte Aufgabe gelöst, indem eine Probe eines biologischen Fluids, und vorzugsweise Vollblut, in eine Kammer, beispielsweise eine optische Küvette, gegeben wird, wobei das Blutplasma einen Farbstoff, und vorzugsweise einen fluoreszierenden Farbstoff aufweist, der nicht in die roten Blutkörperchen hinein diffundiert. Die Probe wird mit Erregungslicht beleuchtet, so daß das Plasma Fluoreszenzstrahlung abgibt, welche beispielsweise durch einen abbildenden Photodetektor eines Mikroskops erkannt wird. Der fluoreszierende Farbstoff ist derart gewählt, daß weder das Erregungslicht, noch das emittierte Fluoreszenzlicht wesentlich von den roten Blutkörperchen absorbiert werden.
• Der Höhenwert im Einzelzellbereich wird sodann durch das Ausführen der folgenden Verfahrensschritte bestimmt: (a) Messen der Fluoreszenzintensitätswerte an zellfreien Stellen innerhalb des Einzelzellbereichs als Funktion der Brennebenenposition, (b) Bestimmen der Halbwertsbreite (der vollen Breite bei der Hälfte des Maximums "FWHM") der Fluoreszenzintensität/Brennebenenposition-Kurve und (c) Berechnen der Höhe d im Einzelzellbe reich aus der Größe der FWHM unter Berücksichtigung des Brechungsindex des Blutplasmas.
• Kurzbeschreibung der Zeichnungen
• 1 zeigt (als das mittlere glockenförmige Profil) die Erregungsintensität auf der Achse innerhalb der flüssigen Probe als Funktion der Z-Position bei einer typischen EPI-Konfiguration, wobei die Probe durch die Objektivlinse mit einer Erregungswellenlänge λ_ex = 500 nm beleuchtet wird, wobei von einer idealen Linse mit gleichmäßiger Beleuchtung der Eintrittspupille und einer numerischen Apertur von NA = 0,4 ausgegangen wird. Die Küvettenhöhe beträgt 32 Mikrometer (–16....+16). Die äußere glockenförmige Kurve gibt die Photonensammeleffizienz bei einer Emissionswellenlänge von λ_em = 600 nm an. Die innere glockenförmige Kurve gibt den kombinierten Effekt der Erregung und des Photonensammelns an.
• 2 zeigt ähnliche Kurven wie 1, jedoch bei einer numerischen Apertur von 0,8.
• 3 zeigt die erwartete Fluoreszenzintensität als Funktion der Brennebenenposition bei Küvettenhöhen von 3 Mikrometer (durchgezogene Kurve) und 6 Mikrometer (gestrichelte Kurve), ausgehend von einer numerischen Apertur von 0,4.
• 4 zeigt ähnliche Kurven wie 3, jedoch bei einer numerischen Apertur von 0,8.
• 5 zeigt berechnete Küvettenhöhenwerte als Funktion der verwendeten numerischen Apertur bei tatsächlichen Höhenwerten von 3, 5 und 7 Mikrometer.
• 6 zeigt die erwartete Fluoreszenzintensität als Funktion der Brennebenenposition bei Küvettenhöhen von 20 Mikrometer (durchgezogene Kurve) und 22 Mikrometer (gestrichelte Kurve), ausgehend von einer numerischen Apertur von 0,4.
• 7 zeigt ähnliche Kurven wie 6, jedoch bei einer numerischen Apertur von 0,8.
• 8 zeigt ähnliche Kurven wie 3, jedoch unter der Annahme, daß die Probe nicht durch die Objektivlinse beleuchtet wird. Die numerische Apertur beträgt 0,4.
• 9 zeigt ähnliche Kurven wie 8, jedoch bei einer numerischen Apertur von 0,8.
• 10 zeigt ähnliche Kurven wie 6, jedoch unter der Annahme, daß die Probe nicht durch die Objektivlinse beleuchtet wird. Die numerische Apertur beträgt 0,4.
• 11 zeigt ähnliche Kurven wie 10, jedoch für eine numerische Apertur von 0,8.
• Detaillierte Erfindungsbeschreibung
• Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird eine Probe eines biologischen Fluids wie vorzugsweise Blut und höchst vorzugsweise unverdünntes Blut, das RBC in Suspension enthält, in eine Kammer, beispielsweise eine optische Küvette gegeben, deren Dicke die Bildung einer Mono-Schicht isolierter RBC unterstützt. Bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel ist die Küvette relativ dünn und zum Anordnen auf der Probenauflage eines Fluoreszenzmikroskops geeignet. Der flüssigen Probe wird ein fluoreszierender Farbstoff hinzugegeben und darin verteilt. Der Farbstoff ist derart gewählt, daß er nicht in die RCB eintritt. Anders ausgedrückt: nur das Blutplasma wird mit einem fluoreszierenden Farbstoff markiert. Der Farbstoff sollte Erregungslicht innerhalb eines Spektralbereichs absorbieren, in dem die Absorption innerhalb der RCB nur gering ist. Da Hämoglobin der dominante Absorbent in RCB ist, sollte die Erregungswellenlänge vorzugsweise länger als 600 nm sein. Ein gut geeigneter Farbstoff ist TO-PRO-3 (vertrieben von beispielsweise Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregon), der innerhalb eines Wellenlängenbereichs um 640 nm erregt werden kann. Ein anderer möglicher Farbstoff ist TO-PRO-5 (ebenfalls von Molecular Probes, Inc. vertrieben), der ebenfalls nicht in die RCB eindringt und um 750 nm erregt werden kann.
• Das erfindungsgemäße Verfahren zum Kalibrieren einer Probenanalysiervorrichtung, bei der es sich vorzugsweise um eine Einweg-Probenanalysiervorrichtung und bei einem stärker bevorzugten Ausführungsbeispiel um eine Blutprobenanalysiervorrichtung handelt, kann in den folgenden drei Schritten zusammengefaßt werden:
• Schritt 1
• Messen von Fluoreszenzintensitätswerten an zellfreien Stellen innerhalb des Einzelzellbereichs als Funktion der Brennebenenposition.
• Schritt 2
• Bestimmen der Halbwertsbreite oder FWHM der Fluoreszenzintensität/Brennebenenposition-Kurve.
• Schritt 3
• Berechnen der Höhe d im Einzelzellbereich aus der Größe von FWHM unter Berücksichtigung des Brechungsindex des Blutplasmas.
• Die erfindungsgemäßen Schritte 1 bis 3 werden im folgenden näher beschrieben.
• 1 zeigt (als das mittlere glockenförmige Profil) die Erregungsintensität auf der Achse innerhalb der flüssigen Probe als Funktion der Z-Position bei einer typischen EPI-Konfiguration, wobei die Probe durch die Objektivlinse mit einer Erregungswellenlänge λ_ex = 500 nm beleuchtet wird, wobei von einer idealen Linse mit gleichmäßiger Beleuchtung der Eintrittspupille und einer numerischen Apertur von NA = 0,4 ausgegangen wird. Die Erregungsintensität als Funktion der Z-Position E(z) kann unter Verwendung der Gleichung

  

  berechnet werden, wobei

  

  wobei λ_ex die mittlere Erregungswellenlänge ist. Die äußere glockenförmige Kurve in 1 gibt die Photonensammeleffizienz D(z) wieder, welche beschrieben werden kann durch

  

  wobei λ_em die mittlere Emissionswellenlänge ist. Die innere glockenförmige Kurve in 1 stellt den kombinierten Effekt von E(z) und D(z) dar.
• "EPI-Konfiguration" ist ein in der Fluoreszenzmikroskopie allgemein verwendeter Begriff. Er bedeutet, daß nahezu paralleles Erregungslicht (üblicherweise nach unten) auf die Objektivlinse gerichtet wird. Das einfallende Erregungslicht wird von der Objektivlinse auf die Probe fokussiert, wodurch ein kleiner Bereich hoher Beleuchtungsintensität gebildet wird. Flureszenzlicht, das in diesem Bereich der Probe erzeugt wird, wird von der selben Objektivlinse gesammelt und bildet einen aufwärts gerichteten parallelen Fluoreszenzstrahl. Ein paralleler Strahl wird gebildet, da die Probe nahezu genau in der Brennebene der Objektivlinse angeordnet sein sollte. Es existieren sodann zwei einander überlappende Strahlen über der Objektivlinse (der abwärts gerichtete Erregungsstrahl und der aufwärts gerichtete Fluoreszenzstrahl). Durch Einfügen beispielsweise eines dichroitischen Strahlteilers wird einer der Strahlen unter einem Winkel von 90° abgeteilt. Dies ist möglich, da die Fluoreszenzstrahlung eine längere Wellenlänge hat, als das Erregungslicht. In zahlreichen Mikroskopen wird der Erregungsstrahl abgeteilt. Anders ausgedrückt: ein nahezu paralleler Erregungsstrahl erreicht einen dichroitischen Block und wird in Richtung der Objektivlinse gerichtet. An der Probe erzeugtes Fluoreszenzlicht geht gerade durch den dichroitischen Block und erreicht den abbildenden Photodetektor oder das Auge des Betrachters.
• Wie aus der 1 ersichtlich, beleuchtet das Erregungslicht nicht die gesamte Höhe einer 32 Mikrometer dicken Küvette und das erzeugte Fluoreszenzlicht wird auch nicht vollständig gesammelt. Dieser Effekt ist bei einer größeren NA noch ausgeprägter, wie in 2 für NA = 0,8 dargestellt.
• Die erwartete Fluoreszenzintensität I(z₀) als Funktion der Z-Position der Brennebene des Mikroskops in bezug auf die Mitte der Küvette z₀ bei einer gegebenen Küvettenhöhe d kann unter Verwendung der Gleichung

  

  berechnet werden.
• 3 zeigt I(z₀) gemäß dieser Gleichung für zwei Küvetten mit Höhen von 3 Mikrometer (durchgezogene Kurve) und 6 Mikrometer (gestrichelte Kurve), ausgehend von einer numerischen Apertur von 0,4. In 3 und in sämtlichen nachfolgenden Figuren wurde ein Normalisierungsvorgang angewandt, dahingehend, daß die tatsächliche Fluoreszenzintensität durch die maximale Fluoreszenzintensität normalisiert ist, die für z₀ = 0 erhalten wird. Es sei darauf hingewiesen, daß die Normalisierung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens nicht erforderlich ist, jedoch verbessert sie das Darstellungsvermögen der Figuren.
• Aus der 3 ist ersichtlich, daß im Falle von NA = 0,4 die beobachteten FWHM-Werte nicht mit der tatsächlichen Küvettenhöhe übereinstimmen. Die gemessene FWHM ist der tatsächlichen Höhe wesentlich näher, wenn die numerische Apertur der Objektivlinse auf NA = 0,8 erhöht wird, wie in 4 dargestellt.
• 5 zeigt, wie weit die beobachtete FWHM von der tatsächlichen Höhe als Funktion der numerischen Apertur der Objektivlinse abweicht, ausgehend von tatsächlichen Höhenwerten von 3,5 bzw. 7 Mikrometer. Wie ersichtlich, wäre eine numerische Apertur NA ≥ 0,7 erforderlich, um die Höhe eines Einwegartikels mit einer tatsächlichen Höhe von ungefähr 3 Mikrometer zu bestimmen. Kleinere NA-Werte sind für dickere Küvetten erforderlich. Aus der 5 ist ersichtlich, daß eine Höhe von ungefähr 5 Mikrometer mit einer NA ≥ 0,6 und eine Höhe von ungefähr 7 Mikrometer mit NA ≥ 0,5 bestimmt werden kann. Noch geringere NA-Zahlen können bei noch dickeren Küvetten angewendet werden.
• Der Fall einer dickeren Küvette ist in 6 dargestellt, in der von zwei Höhenwerten von 20 und 22 Mikrometer und einer numerischer Apertur NA = 0,4 ausgegangen wird. Es ist ersichtlich, daß die beobachtete FWHM der Fluoreszenzintensitätskurve sehr gut mit den tatsächlichen Höhenwerten koinzidiert. Ein noch genaueres Intensitätsprofil wird bei NA = 0,8 erhalten, wie in 7 dargestellt.
• 8 zeigt ähnliche Kurven wie 3, wobei jedoch angenommen wird, daß die Probe nicht durch die Objektivlinse beleuchtet wird. Die numerische Apertur beträgt 0,4. Wie in 3 koinzidieren die beobachteten FWHM nicht mit den tatsächlichen Höhenwerten von 3 bzw. 6 Mikrometer.
• 9 zeigt ähnliche Kurven wie 8, jedoch für eine numerische Apertur von 0,8. Hier koinzidieren die beobachteten FWHM gut mit den tatsächlichen Höhenwerten.
• 10 zeigt ähnliche Kurven wie 6, jedoch davon ausgehend, daß die Probe nicht durch die Objektivlinse beleuchtet wird. Die numerische Apertur beträgt 0,4. 11 zeigt ähnliche Kurven wie 10, jedoch bei einer numerischen Apertur von 0,8. In beiden Fällen fallen die beobachteten FWHM gut mit den tatsächlichen Höhenwerten von 20 und 22 Mikrometer zusammen.
• Bisher wurde noch nicht berücksichtigt, daß bei einer Verschiebung der Brennebene des Mikroskops durch die Küvette das Licht sich aufgrund des Brechungsindex n, der von 1 verschieden ist, innerhalb der Küvette mit einer anderen Geschwindigkeit ausbreitet. Die numerische Apertur NA = n·sinα verändert sich innerhalb der flüssigen Probe nicht, jedoch ist die effektive Weglänge länger als in der Luft. Infolgedessen muß die beobachtete FWHM korrigiert werden, um die tatsächliche Küvettenhöhe zu erhalten. Erfindungsgemäß wird die tatsächliche Küvettenhöhe aus dem Wert der beobachteten FWHM über die Gleichung

  

  berechnet, wobei n den Brechungsindex des Blutplasma angibt.
• Es sei darauf hingewiesen, daß das erfindungsgemäße Verfahren nicht auf die Verwendung des FWHM Werts beschränkt ist. Es fiele in den Rahmen der Er findung, eine beliebige andere charakteristische Breite der Fluoreszenzintensität/Brennebenenposition-Kurve zu bestimmen und diesen Wert zum Kalibrieren der Probenhöhe zu verwenden. In diesem Fall muß das Verhältnis zwischen der verwendeten charakteristischen Breite und der FWHM bekannt sein.

Claims (10)

1. Verfahren zum Kalibrieren der Probenhöhe einer Probe in einer Kammer einer Probenanalysiervorrichtung, die in einem bildgebenden optischen Abtastinstrument gehalten ist, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt: a) Bereitstellen der zum Aufnehmen einer Probe vorgesehenen Kammer in der Probenanalysiervorrichtung; b) Anordnen einer Probe in der Kammer, wobei die Probe einen fluoreszierenden Farbstoff enthält; c) Beleuchten der Probe mit Erregungslicht; d) Abtasten der Probe mit dem Instrument, um die von der Probe kommende Fluoreszenz zu erfassen; e) Messen von Fluoreszenzintensitätswerten als Funktion der Brennebenenposition des Instruments in bezug auf die Probe; f) Bestimmen einer charakteristischen Breite der Kurve der Fluoreszenzintensität über der Brennebenenposition; g) Berechnen einer ungefähren Probenhöhe aus der charakteristischen Breite; h) Berechnen eines korrigierten Probenhöhenwerts unter Berücksichtigung des Brechungsindex der Probe; und i) Erhalten der kalibrierten Probenhöhe.
2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die charakteristische Breite der Kurve der Fluoreszenzintensität gegenüber der Brennebenenposition die Halbwertsbreite FWHM ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das bildgebende optische Abtastinstrument ein Fluoreszenzmikroskop ist.
4. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Kammer eine optische Küvette ist.
5. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Probe eine Flüssigkeit ist, die Partikel in Suspension enthält.
6. Verfahren nach Anspruch 5, bei dem die Messung von Fluoreszenzintensitätswerten als Funktion der Brennebenenposition des Instruments in Bezug auf die Probe an partikelfreien Stellen in der Probe durchgeführt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem der fluoreszierende Farbstoff in der Probe derart gewählt ist, daß er nicht in die Partikel eindringt.
8. Verfahren nach Anspruch 7, bei dem der fluoreszierende Farbstoff derart gewählt ist, daß er Erregungslicht absorbiert und Fluoreszenzlicht in Spektralbereichen emittiert, in denen die Partikel nur gering absorbierend sind.
9. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Probe ein biologisches Fluid ist, bei dem es sich um Blut oder eine Zellsuspension handelt.
10. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem die kalibrierte Probenhöhe d aus dem FXHM-Wert FWHM unter Verwendung der Gleichung

    

    berechnet wird, wobei n der Brechungsindex der Probe und NA die numerische Apertur des bildgebenden optischen Abtastinstruments ist.