WO2004101734A1 - 細胞培養用マイクロチャンバー - Google Patents

Abstract

培養中にマイクロチャンバーの形状を可逆に変化させることで、マイクロチャンバー内の泳動細胞を選択的に回収できる流路を開閉することのできる新しいマイクロチャンバーを提供する。　スライドガラス等の光学的に透明な基板１１２上に、光学的に可視領域で透明で、かつ弾性高分子中に形成された細胞培養領域１１０と、その両端に位置する流路１０８，１０９と、この開閉状況を膨張・収縮によって調節する空気溜１０５，１０６と、この空気溜へ加圧、減圧を行うための空気の流路１０３，１０４と、空気圧制御部との接続ジョイント１０１、１０２が配置されており、細胞を含む培養液は流れ１０７の方向に連続的に流れることができる。

Description

明 細 書 細胞培養用マイクロ 技術分野

この発明は、 細胞培養用のマイクロチャンバ一に関し、 より詳細には、 細胞の 状態を顕微鏡観察しながら 1細胞単位で培養することのできる細胞培養用のマイ クロチャンパ一に関する。 従来技術

従来、 細胞の状態の変化や、 細胞の薬物等に対する応答を観察するのに、 細胞 集団の値の平均値をあたかも一細胞の特性であるかの様に観察してきた。し力、し、 実際には細胞は集団の中で細胞周期が同調しているものはまれであり、 各々の細 胞が異なった周期でタンパク質を発現している。

これらの問題を解決するべく、 同調培養等の手法が開発されているが、 培養さ れた細胞の由来が全く同一の一細胞からではないことから、 培養前の由来細胞 各々の遺伝子の違いがタンパク質発現の違いを生み出す可能性があり、 実際に刺 激に対する応答の結果を解析するときに、 そのゆらぎが細胞の反応機構自体が普 遍的に持つ応答のゆらぎに由来するものなのか、 細胞の違い （すなわち遺伝情報 の違い） に由来するゆらぎなのか明らかにすることは難しかった。

また、 同様の理由から、 細胞株についても、 一般には完全に一細胞から培養し たものではないため、 刺激に対する応答の再現性が細胞各々の遺伝子の違いによ つてゆらぐものか明らかにするのは難しかった。

更にまた、 細胞に対する刺激 (シグナル) は、 細胞周辺の溶液に含まれるシグ ナル物質、 栄養、 溶存気体の量によって与えられるものと、 他の細胞との物理的 接触によるものの 2種類があることからも、 ゆらぎにっ 、ての判断が難しいのが 実情であった。

一方、 従来より、 バイオテクノロジ一の研究分野において細胞の観察を行う場 合には、 大型培養器にて培養された細胞群の一部を一時的に培養器から取り出し て顕微鏡にセットし、 観察を行う力 あるいは、 顕微鏡全体をプラスチックの容 器で囲い温度を管理し、 その中に小さい別の容器を用い二酸ィ匕炭素濃度、 及び湿 度を管理しつつ、 顕微鏡観察を行っていた。 このとき、 細胞を培養しながら、 古 くなった培養液と新鮮な培養液を交換することで溶液条件を一定にすることがェ 夫されてきている。

たとえば、 循環ポンプを用いて、 基材表面に対する培地のレベルを基材の上端 縁高さより高いレベルと下端縁高さより低いレベルとの間で上げ ·下げ操作する ことにより、 上記低レベルに下がると培地を供給し、 上記高レベルに上がると培 地を排出する機構によって栄養状態を一定に保つことができる （特開平 1 0— 1 9 1 9 6 1 )。

また、 培養容器内に、 新たな培地を培養容器に導入する導入管と、 培養容器の 培地を外部に排出する排出管と、 培養容器の気体部分とポンプとを連通する気管 の各一端を挿入し、 前記導入管、 排出管及び気管の夫々の管路に培養容内への菌 の侵入を阻止するフィルターを設けることにより、 培養槽の栄養状態を一定に保 つことができる （特開平 8—1 7 2 9 5 6 )。

し力 し、 培養細胞の溶液環境と、 細胞間の物理的接触を制御しながら培養する ことができなかった。

そこで、 本発明者らは、 これらの問題点を解決し、 新たに特定の一細胞のみを 選択し、 その一細胞を細胞株として培養する技術、 及び細胞を観察する場合に、 細胞の溶液環境条件を制御し、かつ、容器中での細胞濃度を一定に制御する技術、 あるいは相互作用する細胞を特定しながら培養観察する技術を出願した （特開 2 0 0 2— 1 5 3 2 6 0 )。 発明が解決しょうとする課題

し力 し、 上記文献 （特開 2 0 0 2— 1 5 3 2 6 0 ) で用いた光ピンセット技術 は、 捕獲できる力の大きさがピコニュートン程度であり、 これは浮遊する細胞を 捕獲する力としては十分であるが、 自ら泳動する細胞を捕獲するには不十分であ つた。 また、 培養中の泳動細胞を選択的に培養部から回収することは困難であつ た。 そこで、本発明者らは、 上記のマイクロチャンバ一について更なる検討を加え、 培養中にマイクロチヤンバーの形状を可逆に変化させることで、 マイクロチャン パー内の泳動細胞を選択的に回収できる流路を開閉することのできる新しいマイ クロチャンパ一を提供する。

課題を解決するための手段

即ち、 本発明は、 細胞培養領域、 該領域と外部とを連結する少なくとも 2つの 流路、 該流路の開閉手段、 並びに該細胞培養領域及ぴ流路の開閉を光学的に観察 する手段から成る細胞培養用マイクロチャンバ一であって、 一の流路が細胞培養 領域に細胞を含んでもよい培養液を注入することができる流路であり、 他の一の 流路が細胞培養領域から細胞を含んでもよい培養液を排出することができる流路 であり、 該流路の少なくとも一部が弾性材料により囲まれて成り、 該開閉手段が 該流路を外部から前記観察手段の観察方向に対してほぼ直角方向に押す又は引く ことにより該流路を開閉又はその幅を変更するものであることを特徴とする細胞 培養用マイクロチャンバ一である。

この光学的観察手段として、 光学的顕微鏡、 ビデオ録画装置、 カメラなどが 挙げられ、 これらはパソコン等に繋いで画像処理を行うものであってもよい。 また、 観察を容易にするため、 光照射装置を共に用いてもよい。

この開閉手段を作動させていない時の、 前記流路の幅が対象となる細胞サイ ズと同程度であることが好ましい。 従って、 適当な流路の幅は、 対象となる細 胞のサイズによって異なる。 また、 開閉手段を作動させていない時の、 流路の 幅を、 対象となる細胞のサイズより若干狭くしておくと、 細胞が通常状態では この流路を通過せず、 流路を開けたときのみ通過するようになるため、 細胞の 分離に適する。

開閉手段は、 流路に外部から力を加えて、 流路を開閉又はその幅を変更させる ものであればよい。 機械的に力を加えるものや、 空隙を設けてその体積を変化さ せるもの等いかなるものであってもよい。

また、 前記開閉手段が前記流路に隣接する空隙を有し、 該空隙が気体又は液体 で満たされ、 その圧を変更することにより、 該空隙の大きさを変更し、 その結果 該流路開閉又はその幅を変更するものであることが好ましい。 この空隙を空気で 満たし、 この空隙を空気溜として、 その空気圧で流路の開閉を制御することが最 も簡便である。

流路は、 その全部を弾性材料で囲まれるようにしてもよいし、 その開閉手段側 のみを弾十生材料で作つてもよい。 上記の空隙の周りとこの流路の回りとを同じ材 料で作り、 その空隙の大きさの変化が直ちに流路の幅に影響するようにこれらを 配置することが好ましい。

. この弾性材料は、 いかなる弾性材料であってよく、 細胞培養に悪影響の無い合 成高分子を用いるのが簡便であり、 特に、 シリコーン系樹脂であることが好まし い。

また、 この細胞培養用マイクロチャンバ一の細胞培養領域と流路の開閉を光学 的に観察するため、 必要な部分のみ透明材料で作ることが好ましい。 全体を透明 弾性材料で作ってもよい。 図面の簡単な説明

第 1図は、 本発明の基本構成の一例を示す模式図である。

第 2図は、 流路の開閉プロセスの一例を説明した模式図である。

第 3図は、 培養マイク口チャンパ一加工プロセスの一例を説明した顕微鏡写真 を示す。

第 4図は、 培養マイクロチャンバ一加工プロセスで用いた铸型と高分子培養マ イクロチャンバーの一例を説明した顕微鏡写真を示す。

第 5図は、 培養マイクロチヤンバーの流路の開閉状態の例を示す顕微鏡写真を 示す。

第 6図は、 培養マイクロチャンバ一の流路が開状態で細胞が流路を通過する場 合の顕微鏡写真を示す。 矢印は細胞を示す。

図中の符号の説明

1 0 1、 1 0 2 空気圧制御部との接続ジョイント

1 0 3、 1 0 4 空気の通路

1 0 5、 1 0 6、 2 0 2 空気溜 107 溶液 （細胞を含む培養液） の流れ

108、 109、 111、 201、 204 流路

1 10 細胞培養領域

1 12、 302、 304 ガラス基板

1 13, 303 高分子 （シリコーン系樹脂）

203 細胞

301 醒

305 空気圧調節部への接続コネクタ 発明の実施の形態

以下、 本発明の細胞培養用マイクロチャンバ一を詳細に説明するが、 本発明の 細胞培養用マイクロチャンバ一はこれらに限定されるものではない。

まず、本発明の細胞培養マイクロチヤンバーの基本構成の一例を第 1図に示す。 第 1図 aの （B— B) 水平断面図及ぴ、 第 1図 bの （A— A) 縦斬面図に例示す ように、 本発明の細胞培養マイクロチャンバ一 100は、 スライドガラス等の光 学的に透明な基板 112上に、 光学的に可視領域で透明かつ弾性の高分子中に形 成された細胞培養領域 110と、 その両端に位置する流路 108, 109、 1 1 1の開閉状況を膨張又は収縮によって調節する空気溜 105, 106と、 この空 気溜へ加圧又は減圧を行うための空気の通路 103， 104と、 空気圧制御部と の接続ジョイント 101、 102が配置されており、溶液 （細胞を含む培養液） は流れ 107の方向に連続的に流れることができる。

第 1図に示すように、 培養領域 1 10は、 2つの流路 108、 109の開放又 は閉鎖状況によって、 その中で培養している細胞を捕獲することも、 排出するこ とも可能である。ここで、流路の開閉は、空気溜の空気の圧力を制御することで、 流路を囲む高分子壁面を膨張又は収縮させ、 流路 1 11の幅を調節する。 このと き、 流路の幅を光学的計測手段によって計測できるよう、 流路を、 光学顕微鏡の 光軸とは垂直な、 水平面上に平面的に配置している。 これによつて、 たとえば光 学顕微鏡を用いることで、 流路の幅、 すなわち開放状況を実際に試料を流さなく ても観察するだけで確認することができる。 従って、 この開放状況を目視で確認 しながら、 空気溜 1 0 5、 1 0 6の空気圧を調整することが可能である。 また、 この開放状態を画像処理によって自動的に計測することによって、 あらかじめ予 定した開放状態にフィードパック制御することもできる。

次に、 第 2図を用いて、 流路の開閉について説明する。 第 2図 a、 bはそれぞ れ、 流路を適度に閉じて、 溶液だけは流路 2 0 1を通過するが、 細胞 2 0 3は通 過させない状態での、 水平断面と垂直断面図である。 空気溜 2 0 2に空気を導入 して加圧することで、 流路 2 0 4は閉じ、 その加圧の程度によって通過する細胞 のサイズを調節することができる。

他方、 第 2図 c、 dはそれぞれ、 流路を開放して、 溶液だけでなく細胞も流路 2 0 1を通過する状態での、 水平断面と垂直断面である。 空気溜 2 0 2から空気 を排出することで、 流路 2 0 4は開き、 その減圧の程度によって細胞をすベて通 過させることができる。

第 3図は、 実際に細胞培養マイクロチャンバ一を製作するプロセスの一例を示 すものである。 まず、 フォトリソグラフ技術等の微細加工技術によって錄型を形 成する （第 3図の 1 )。 たとえば、光硬ィ匕性肉厚レジスト材、 S U— 8を用いるこ とで、 ガラス基板 3 0 2上に光学的に S U— 8を硬化させた鎵型 3 0 1を作成す ることができる。 次に、 铸型の上に、 光学的に透明で、 かつ、 弾性高分子を流し 込に硬化させることで、 錶型の形状を高分子に転写することができる（第 3図の 2 )。 ここで、 たとえば光学的に可視領域で透明でかつ弾力性を持つ素材として は、 シリコーン樹脂 （ポリジメチルシロキサン等） がある。 高分子が硬化した後 に、 空気や溶液を流すための貫通穴を穿孔機を用いて作成し、 錶型から高分子を はがす（第 3図の 3 )。最後に、 この微細構造を転写した高分子をガラス基板 3 0 4上に接着させ、 空気圧調節部への接続コネクタや溶液の導入、 排出部を取り付 けることで細胞培養マイクロチャンバとして用いることができる。

第 4図は、 実際に第 3図のプロセスで作成した光硬ィ匕 '生樹脂 S U— 8を用いて 作成した細胞培養マイクロチャンバ一の錶型 （第 4図 a ) と、 この鑄型を転写し て作成した高分子微細構造（第 4図 b )の一例である。 この光学顕微鏡写真から、 錶型の微細構造を正確に高分子に転写することができることがわかる。

第 5図は、 この細胞培養マイクロチヤンバ中の流路の機能を示す一連の顕微鏡 写真である。 第 5図 aでは、 空気溜に空気を加圧することで、 流路を閉じ、 細胞 も溶液も流れないようにしたところである。 第 5図 bでは、 空気溜を陰圧で吸引 することで、 流路を細胞が流れない程度に開放したところである。 この顕微鏡写 真からもわかるように、 溶液の流れによって細胞は流路まで引き寄せられるが、 流路を通過することはできない。 また、 流路の開放量は光学顕微鏡によって目視 で確認することができる。 従って、 細胞を実際に流さなくても、 流路の開放値を 目視のみで調節することができる。 第 5図 cは、 更に流路を開放することで、 細 胞を流したところである。

第 6図には、 更に実際に細胞が流路を通過する過程が顕微鏡写真で示されてい る。 流路の左側にあった細胞 （矢印） は （第 6図の 1 )、 流路を通過して （第 6図 の 2 )、 流路の右側に通過する （第 6図の 3 )。 発明の効果

本発明の細胞培養用マイクロチヤンバ一は以下のような特徴を持つ： —細胞培養領域と外部とが流路によつてのみ連結されるため、 細胞が開閉装置な どに接することがなく、 細胞に余分な負荷がかからない。

一開閉手段が、 流路の開閉の観察方向とほぼ直角であるため、 観察が流路の開閉 に影響されることが無く、 また流路を通過又は通過しない細胞と、 流路の開閉状 態とを同時に観察することができる。

これらの特徴により、細胞の培養液から単一細胞を分離することが可能になる。 そのため、 従来不可能であった、 泳動する生物細胞等を容器内の細胞数を制御 しながら培養することが可能となる。 また、 容器の内部の細胞を選択的に回収す ることが可能となる。

Claims

請 求 の 範 囲

1 . 細胞培養領域、 該領域と外部とを連結する少なくとも 2つの流路、 該流路 の開閉手段、 並びに該細胞培養領域及ぴ流路の開閉を光学的に観察する手段から 成る細胞培養用マイクロチャンバ一であって、 一の流路が細胞培養領域に細胞を 含んでもよい培養液を注入することができる流路であり、 他の一の流路が細胞培 養領域から細胞を含んでもよい培養液を排出することができる流路であり、 該流 路の少なくとも一部が弾性材料により囲まれて成り、 該開閉手段が該流路を外部 力 ら前記観察手段の観察方向に対してほぼ直角方向に押す又は引くことにより該 流路を開閉又はその幅を変更するものであることを特徴とする細胞培養用マイク 口チャンパ一。

2 . 前記開閉手段を作動させていない時の、 前記流路の幅が対象となる細胞サ ィズと同程度である請求項 1に記載の細胞培養用マイクロチヤンバー。

3 . 前記開閉手段が前記流路に隣接する空隙を有し、 該空隙が気体又は液体で 満たされ、 その圧を変更することにより、 該空隙の大きさを変更し、 その結果、 該流路を開閉又はその幅を変更するものである請求項 1又は 2に記載の細胞培養 用マイクロチャンバ一。 ·

4 . 前記弾性材料がシリコーン系樹脂である請求項 1〜 3のいずれか一項に記 載の細胞培養用マイクロ；