WO2009157212A1 - 培養細胞への作用因子投与方法、マイクロチャンバ、マイクロチャンバアレイ、培養容器および作用因子投与装置 - Google Patents

培養細胞への作用因子投与方法、マイクロチャンバ、マイクロチャンバアレイ、培養容器および作用因子投与装置 Download PDF

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WO2009157212A1
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microchamber
cultured cells
administering
administration
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一木隆範
塩野博文
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国立大学法人東京大学
株式会社ニコン
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    • C12M23/10—Petri dish
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    • C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
    • C12M35/08—Chemical, biochemical or biological means, e.g. plasma jet, co-culture

Definitions

  • the present invention relates to a method of administering an agent such as a drug to a limited cultured cell and its peripheral technology.
  • an object of the present invention is to provide means for selectively administering a drug or the like to a limited cell among a plurality of cells cultured in a culture vessel.
  • the method for administering an agent to cultured cells has a compartment procedure and an administration procedure.
  • a microchamber surrounding target cells is placed in a culture vessel containing a culture solution and cultured cells, and a minute administration space with respect to the volume of the culture vessel is formed inside the microchamber.
  • the agent is administered into the administration space, and the target cell of the cultured cells is selectively sensitized.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a method of administering an agent for cultured cells according to an embodiment.
  • Sectional drawing which shows the structural example of the microchamber which concerns on one embodiment typically The flowchart which shows the example of the agent administration method of one Embodiment Sectional drawing which shows the other structural example of the micro chamber in one Embodiment. Sectional drawing which shows the other structural example of the micro chamber in one Embodiment. Sectional drawing which shows the other structural example of the micro chamber in one Embodiment. Sectional drawing which shows the other structural example of the micro chamber in one Embodiment.
  • FIG. 1 is a view showing an outline of a method for administering an agent for cultured cells according to one embodiment.
  • a microchamber 14 surrounding the target cell 12 is disposed in a culture vessel 13 such as a dish containing the culture cell 12 together with the liquid medium 11 (see FIGS. 1A and 1B).
  • the agent is administered into the microchamber 14 (see FIG. 1C).
  • the agents in the present specification include drugs (for example, amino acids and nitric oxide), candidate drugs, differentiation inducing factors, cell growth factors, gene vectors (circular DNA, viral vectors, liposome vectors, etc.). It is. These agents may take any form of compound, polymer, mixture, solution, nucleic acid or nucleic acid complex.
  • FIG. 2 is a cross-sectional view schematically showing a configuration example of the microchamber 14 according to one embodiment.
  • the overall shape of the microchamber 14 of one embodiment is formed in a bottomed cylindrical cup shape in which the bottom surface side contacting the culture surface of the culture vessel 13 is opened and the top surface side is closed. Therefore, the cells 12 can be accommodated inside the microchamber 14.
  • a sufficiently small administration space with respect to the volume of the culture vessel 13 is constructed inside the microchamber 14.
  • the size of the microchamber 14 is appropriately selected according to the type and number of target cells 12, but as an example, the diameter is set to about 50 ⁇ m to 100 ⁇ m.
  • the microchamber 14 shown in FIG. 2 is made of an elastic material such as an elastomer so that a needle (18) described later can be inserted and removed.
  • a material of the micro chamber 14 for example, silicon rubber (polydimethylsiloxane) or the like can be used.
  • the microchamber 14 in order to improve visibility of cells located inside the microchamber 14, is formed of a light-transmitting material.
  • microchamber 14 in one embodiment may have the following configuration (1) or (2) (or a combination thereof).
  • hydrophilicity may be imparted to the inner surface of the microchamber 14 by forming a hydrophilic film or the like.
  • the micro-chamber 14 is turned upside down so that the liquid medium 11 is filled in the container in advance so that air does not enter, and then the micro-chamber 14 is brought into its original state (opening on the bottom side). Even if it returns, the liquid in a container is hold
  • a film may be formed on the surface of the microchamber 14 with a substance that inhibits protein adsorption (polyethylene glycol (PEG), 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (MPC), etc.).
  • a substance that inhibits protein adsorption polyethylene glycol (PEG), 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (MPC), etc.
  • PEG polyethylene glycol
  • MPC 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine
  • Step S101 The microchamber 14 is placed in the culture vessel 13 so as to surround the target cells 12 from the upper side of the culture vessel 13. Thereby, target cells 12 are accommodated, and a minute administration space with respect to the volume of the culture vessel 13 is formed inside the microchamber 14.
  • the microchamber 14 At this time, it is preferable to keep the microchamber 14 at the same temperature as the culture medium 11 in advance in order to suppress adverse effects on the culture environment due to the transfer of heat.
  • the number of cells 12 accommodated in the administration space may be plural, but in one embodiment, one cell is accommodated in the microchamber 14.
  • Step S102 The agent is administered into the administration space formed by the microchamber 14. Thereby, only the target cells 12 existing in the administration space among the cultured cells cultured in the culture vessel 13 are selectively sensitized to the acting factor.
  • two hollow tubes (needles) 18 each having a needle-like structure and having a sharp tip are pierced into the microchamber 14 from the outside. Thereby, two flow paths communicating with the administration space from the outside are formed.
  • the microchamber 14 is formed of an elastic member, the portion through which the needle 18 is inserted becomes a liquid-tight state due to the elastic deformation of the microchamber 14 and the gap with the needle 18 is closed. Even when the needle 18 is pulled out from the micro chamber 14, the hole through which the needle 18 is inserted is closed by elastic deformation of the micro chamber 14. Therefore, the needle 18 can be repeatedly inserted into and removed from the microchamber 14.
  • the agent is administered from the other of the needles 18 to the administration space.
  • an action factor can be easily administered with respect to the minute volume administration space in the almost sealed state.
  • the culture medium 11 and the action factor sucked from one needle 18 may be recirculated from the other needle 18 to the administration space.
  • Step S103 After allowing the agent to act on the target cells 12 for a certain period of time, the microchamber 14 is removed from the culture vessel 13 to restore the culture environment in the culture vessel 13.
  • the medium 11 may be replaced as necessary.
  • exchanging the culture medium 11 in S103 either of the following methods (A) or (B) is applied.
  • an agent such as a drug can be locally administered to only any cell among a plurality of cells cultured in the culture vessel 13. Therefore, in one embodiment, there is an excellent effect in that administration of a drug or the like can be controlled in individual cell units while culturing cells in the culture vessel 13. Moreover, in one embodiment, since the culture environment of the culture vessel 13 can be restored after administration of the agent, cell culture and administration of drugs and the like can be performed efficiently.
  • the agent is administered to a minute administration space with respect to the volume of the culture vessel 13. Therefore, a high concentration can be achieved in the administration space with a minute amount of drug or the like, and the amount of drug or the like used can be reduced when the target cell 12 is sensitized with the drug or the like.
  • a plurality of microchambers 14 may be disposed in one culture vessel 13 so that the agent is administered to different cells 12 in parallel. At this time, different agents may be administered in each administration space.
  • ⁇ Modification of one embodiment> 4 5, and 6 are cross-sectional views schematically illustrating other configuration examples of the microchamber 14 according to the embodiment. Also with these configurations, it is possible to construct a minute administration space around the target cell 12 and administer the agent in the administration space, and to obtain substantially the same effect as in the example of FIG. 4, 5, and 6, the same components as those in FIG. 2 are denoted by the same reference numerals, and redundant description is omitted.
  • FIG. 4 is an example in which a photodegradable reagent (caged reagent) 19 is fixed as an action factor on the inner surface of a bottomed cylindrical cup-shaped microchamber 14.
  • the caged reagent 19 is a substance inactivated by blocking the active site of the active substance with a nitrobenzyl group or the like, and the active substance is activated by photolysis when irradiated with a cleavage light of a predetermined wavelength.
  • the material of the microchamber 14 in FIG. 4 is formed of a translucent member that transmits at least the wavelength of the cleavage light of the caged reagent 19.
  • the caged reagent 19 in the microchamber 14 may be irradiated with cleavage light having a predetermined wavelength by epi-illumination using, for example, a confocal optical system. Thereby, the caged reagent 19 in the administration space is activated, and only the target cell 12 can sensitize the agent.
  • the microchamber 14 shown in FIG. 5 is composed of a cylindrical member having an open bottom surface and a top surface that are in contact with the culture vessel 13. In the configuration of FIG. 5, it is necessary to set the height of the microchamber 14 so as to prevent the culture medium 11 from flowing in from the upper surface side of the microchamber 14.
  • the agent when an agent is administered to the cells 12 in the administration space, the agent may be injected from the opening on the upper surface side of the microchamber 14 with the needle 18.
  • the upper surface side of the administration space since the upper surface side of the administration space is open, it is also easy to unilaterally inject the agent with one needle 18 into the administration space.
  • FIG. 6 shows an example in which two flow paths 20 respectively communicating with the outside are formed in advance in a bottomed cylindrical cup-shaped micro chamber 14.
  • the medium 11 in the administration space is removed from one of the channels 20 using the two channels 20 formed in the microchamber 14. What is necessary is just to administer an action factor to the administration space from the other channel 20 while sucking.
  • the micro chamber 14 can be configured by a hard member such as plastic or glass. .
  • FIG. 7 is a diagram showing an outline of a method for administering an agent for cultured cells according to another embodiment.
  • the other embodiment is a modification of the embodiment shown in FIG. 1, and an agent is administered to cells for each administration space using a microchamber sheet 21 in which microchambers 14 are arranged.
  • the attachment position of the cultured cells 12 is controlled in accordance with the microchamber sheet 21 by modifying the culture surface on the culture container 13 side.
  • FIG. 8 is a partial cross-sectional view schematically showing a microchamber sheet 21 according to another embodiment.
  • FIG. 9 is a diagram showing a correspondence relationship between the culture surface of the culture vessel 13 used in another embodiment and the microchamber sheet 21.
  • the overall shape of the microchamber sheet 21 according to another embodiment is a disk-shaped member having an outer diameter smaller than the inner diameter of the culture vessel 13, and a plurality of microchambers 14 are provided on one surface (bottom surface side). Is formed.
  • the microchamber 14 is formed of a bottomed cylindrical recess, and is formed by a known fine processing means such as lithography.
  • the microchamber sheet 21 is made of an elastic material such as an elastomer (for example, silicon rubber).
  • the micro chambers 14 of the micro chamber sheet 21 are two-dimensionally arranged at regular intervals.
  • FIGS. 7 and 9 as an example, the micro chamber sheet 21 in which the micro chambers 14 are arranged in 4 ⁇ 4 is illustrated.
  • the first region 22 is a region having relatively high cell adhesion on the culture surface.
  • a plurality of the first regions 22 are formed on the culture surface, and the number thereof corresponds to the number of the micro chambers 14 of the micro chamber sheet 21.
  • the first region 22 on the culture surface has a 4 ⁇ 4 arrangement in accordance with the interval between the microchambers 14.
  • the size of each first region 22 is set to be slightly smaller than the size of the microchamber 14.
  • the second region 23 is a region with relatively low cell adhesion on the culture surface and is formed so as to surround the first region 22. Therefore, in the culture vessel 13, cells are likely to adhere to the first region 22 corresponding to the position of the microchamber 14.
  • examples of the means for forming the first region 22 and the second region 23 include the following (1) to (4). These configurations may be combined as appropriate.
  • Protein adsorption is enhanced by imparting hydrophilicity to the first region 22, and cell adhesion in the first region 22 is relatively increased.
  • region 22 to which hydrophilicity was provided can be formed by irradiating the culture
  • a polymer film having a charge for example, a coating of polylysine, etc.
  • cell adhesion in the second region 23 is relatively lowered.
  • the film material include polyethylene glycol (PEG) and 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (MPC).
  • PEG polyethylene glycol
  • MPC 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine
  • the cell adhesion in the second region 23 may be relatively lowered by forming minute protrusions in the second region 23 by surface processing and reducing the cell adhesion area.
  • the administration method of the agent in another embodiment is performed by inserting a needle 18 into each microchamber 14 and injecting the agent from the outside.
  • the microchamber sheet 21 is arranged in the culture vessel 13 and the point that the needle 18 is inserted into each microchamber 14 to administer the agent, it is almost the same as the one embodiment. Therefore, the description is omitted.
  • the alignment mark is previously provided in the microchamber sheet
  • the administration of the agent in a cell unit can be efficiently performed by arraying.
  • the analysis of optimization of differentiation induction and combinatorial pharmacological studies can be efficiently performed by changing the type of agent to be administered for each microchamber 14, the combination of agents, the order of administration, timing, and the like. Can be done.
  • the complexity of the work of administering the agent is reduced and the work efficiency is further improved.
  • FIG. 10 shows an example in which the caged reagent 19 is fixed to the inside of each microchamber 14 of the microchamber sheet 21.
  • FIG. 11 shows an example in which two flow paths 20 communicating with the outside are formed in each micro chamber 14 of the micro chamber sheet 21. Also by these examples, substantially the same effect as the examples of other embodiments shown in FIGS. 7 and 8 can be obtained.
  • FIG. 12 is a block diagram showing an example of the configuration of an agent administration apparatus for executing the agent administration method of one embodiment or another embodiment described above.
  • the action factor administration device receives various operations from the temperature-controlled room 41, the robot arm 42, the action factor injection unit 43, the optical observation unit 44, the monitor 45, the storage unit 46, the control unit 47, and the user. And an operation unit 48.
  • the robot arm 42, the action factor injection unit 43, the optical observation unit 44, the monitor 45, the storage unit 46, and the operation unit 48 are connected to the control unit 47, respectively.
  • a culture vessel 13 for culturing cells 12 is stored in the temperature-controlled room 41.
  • the interior of the temperature-controlled room 41 is maintained in an environment suitable for cell culture (for example, an atmosphere having a temperature of 37 ° C. and a humidity of 90%), and is kept at a high degree of cleanliness in order to prevent contamination.
  • the robot arm 42 has a microchamber 14 (or microchamber sheet 21) held at the tip, and moves the microchamber 14 three-dimensionally. Then, according to the instruction from the control unit 47, the robot arm 42 covers the cell 12 at a predetermined position in the culture vessel 13 with the microchamber 14 and performs an operation of removing the microchamber 14 after the administration of the agent is completed.
  • the agent injection unit 43 is disposed near the tip of the robot arm 42.
  • the action factor injection unit 43 pierces the micro chamber 14 with two needles 18 in the form of injection needles to form a flow path, and injects the action factor into the administration space from the outside.
  • the agent injection unit 43 can also be used for exchanging the culture medium 11.
  • the optical observation unit 44 includes an illumination device that illuminates the cultured cells, a microscopic optical system for observing the cultured cells, and an imaging device that captures an image in the culture vessel 13 via the microscopic optical system. .
  • the optical observation unit 44 is used for acquiring position information when the robot arm 42 positions the microchamber 14 in the culture vessel 13.
  • the illumination device of the optical observation unit 44 also functions as a device that irradiates the microchamber 14 with the release light of the caged reagent.
  • the image captured by the optical observation unit 44 can be displayed on the monitor 45 under the control of the control unit 47.
  • the storage unit 46 is composed of a nonvolatile storage medium such as a hard disk or a flash memory.
  • the storage unit 46 stores image information generated by the optical observation unit 44 and a program executed by the control unit 47.
  • the storage unit 46 can also record the administration history of the agent for each cell. In the administration history of the agent, for example, identification information of the target cell, administration date and time, and information on the type and amount of the agent administered are associated with each other.
  • the control unit 47 is a processor that comprehensively controls the operation of each unit of the agent administration device. For example, the control unit 47 controls the robot arm 42 to move the micro chamber 14 and drives the illumination device of the action factor injection unit 43 and the optical observation unit 44 to administer the action factor into the micro chamber 14. .
  • Step S201 The control unit 47 drives the optical observation unit 44 to acquire an observation image obtained by imaging the state in the culture vessel 13. Thereby, the control unit 47 acquires position information when positioning the microchamber 14. As an example, the control unit 47 associates a reference point (for example, the center of the screen) of the image with a position in the culture vessel 13 in advance. Then, the control unit 47 geometrically determines the coordinates of the actual cell in the culture vessel 13 from the positional relationship between the cell and the reference point in the image in consideration of the imaging magnification in the optical observation unit 44 and the lens position. Can be obtained.
  • a reference point for example, the center of the screen
  • control unit 47 displays the observation image on the monitor 45. Thereby, the user can designate the target cell 12 to which the agent is administered from the operation unit 48 based on the observation image.
  • Step S202 Upon receiving designation of the target cell 12 from the user, the control unit 47 drives the robot arm 42 based on the position information (S201), and places the microchamber 14 on the target cell 12. To do. As a result, an administration space is formed in the microchamber 14 around the target cell 12.
  • Step S203 The controller 47 drives the action factor injection unit 43 to administer the action factor to the administration space in the microchamber 14.
  • the controller 47 may activate the caged reagent by irradiating release light with the illumination device of the optical observation unit 44.
  • Step S204 The control unit 47 drives the robot arm 42 to remove the microchamber 14 from the culture vessel 13 after the administration of the action factor, and restores the culture environment in the culture vessel 13.
  • control unit 47 may operate the agent injection unit 43 to exchange the medium. Note that the control unit 47 may remove the microchamber 14 after performing a local medium exchange in the microchamber 14, or remove the microchamber 14 and then exchange the medium in the culture vessel at once. May be.
  • Step S205 The control unit 47 records the administration history of the agent in the storage unit 46.
  • description of the flowchart of FIG. 13 is complete
  • the agent administration method of the above-described embodiment can be efficiently executed. *
  • Example> As an example of the present invention, an exchange experiment of a solution in a microchamber was performed using two microglass pipettes.
  • FIG. 14 is a diagram showing the configuration of the microchamber used in the example.
  • a microchamber was configured by bonding a disc-shaped polydimethylsiloxane (PDMS) sheet to the upper surface of a cylindrical quartz glass ring.
  • the dimensions of the quartz glass ring were an outer diameter of 2.7 mm, an inner diameter of 2.0 mm, and a thickness (t) of 150 ⁇ m.
  • the disk-shaped PDMS sheet had an outer diameter of 2.7 mm and a thickness (t) of 200-300 ⁇ m.
  • the thickness of the micro chamber of the example was about 350 ⁇ m.
  • the outer diameter of the tip of each glass pipette was set to about 50 ⁇ m-100 ⁇ m.
  • the above microchamber was disposed on the PDMS sheet, and two glass pipettes on the introduction side and the collection side were inserted into the microchamber, respectively (see FIG. 15).
  • a micro syringe pump was connected to the glass pipette on the introduction side, and a fluorescent reagent was introduced into the micro chamber from the glass pipette on the introduction side at 10 ⁇ l / min.
  • the glass pipette on the collection side was opened to atmospheric pressure.
  • FIG. 16 is a diagram illustrating a state before the chemical solution is injected into the micro chamber according to the embodiment
  • FIG. 17 is a diagram illustrating a state after the chemical solution is injected into the micro chamber according to the embodiment.
  • the fluorescent reagent was introduced from the glass pipette on the introduction side and the fluorescent reagent was collected from the collection side. Further, it was confirmed that there was no liquid leakage from the hole portion of the PDMS sheet remaining after the glass pipette was pulled out in the micro chamber.

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Abstract

　培養細胞への作用因子投与方法は、区画手順と投与手順とを有する。区画手順では、培養液および培養細胞を収容した培養容器内にターゲットの細胞を取り囲むマイクロチャンバを配置し、培養容器の容積に対して微少な投与空間をマイクロチャンバの内側に形成する。投与手順では、投与空間内に作用因子を投与して、培養細胞のうちのターゲットの細胞に作用因子を選択的に感作させる。

Description

培養細胞への作用因子投与方法、マイクロチャンバ、マイクロチャンバアレイ、培養容器および作用因子投与装置
　本発明は、限定された培養細胞に対して薬物等の作用因子を投与する方法と、その周辺技術に関する。
　従来から、再生医療などの先端医療分野や創薬分野での基盤技術として、限定された細胞に対して薬物等を投与する手法が研究されている。その一手法として、微量な物質の分析を微細なデバイスで行うマイクロ総合分析システム（Micro Total Analysis Systems：μＴＡＳ）において、μＴＡＳのマイクロ流路内で細胞を培養するとともに、培養した個々の細胞ごとに薬液を投与することも検討されている（例えば、特許文献１参照）。
特開２００５－２０４８３７号公報
　一方、一般的な培養容器（シャーレ、ディッシュ等）の培養環境下で細胞に対して薬剤等を投与する場合、培養容器内に存在する細胞全体に対して同種の薬剤が均一に与えられる。そして、培養容器内において限定された一部の細胞にのみ薬物等を投与する手法は存在しておらず、その点でなお改善の余地があった。
　そこで、本発明の目的は、培養容器で培養されている複数の細胞のうちで限定された細胞に対して選択的に薬物等を投与する手段を提供することにある。
　一の態様に係る培養細胞への作用因子投与方法は、区画手順と投与手順とを有する。区画手順では、培養液および培養細胞を収容した培養容器内にターゲットの細胞を取り囲むマイクロチャンバを配置し、培養容器の容積に対して微少な投与空間をマイクロチャンバの内側に形成する。投与手順では、投与空間内に作用因子を投与して、培養細胞のうちのターゲットの細胞に作用因子を選択的に感作させる。
　なお、上述の培養細胞への作用因子投与方法に適用されるマイクロチャンバ、マイクロチャンバアレイ、培養容器などの消耗品の構成や、上述の培養細胞への作用因子投与方法に適した作用因子投与装置の構成も、本発明の具体的態様として有効である。
一の実施形態に係る培養細胞の作用因子投与方法の概要図 一の実施形態に係るマイクロチャンバの構成例を模式的に示す断面図 一の実施形態の作用因子投与方法の例を示す流れ図 一の実施形態におけるマイクロチャンバの他の構成例を示す断面図 一の実施形態におけるマイクロチャンバの他の構成例を示す断面図 一の実施形態におけるマイクロチャンバの他の構成例を示す断面図 他の実施形態に係る培養細胞の作用因子投与方法の概要図 他の実施形態に係るマイクロチャンバシートを模式的に示す部分断面図 他の実施形態で用いる培養容器の培養面と、マイクロチャンバシートとの対応関係を示す図 他の実施形態に係るマイクロチャンバシートの別例を模式的に示す部分断面図 他の実施形態に係るマイクロチャンバシートの別例を模式的に示す部分断面図 作用因子投与装置の構成例を示すブロック図 作用因子投与装置の動作例を示す流れ図 実施例のマイクロチャンバの構成図 実施例の概要を示す図 実施例のマイクロチャンバの薬液注入前の状態を示す図 実施例のマイクロチャンバの薬液注入後の状態を示す図
　＜一の実施形態の作用因子投与方法の説明＞
　図１は、一の実施形態に係る培養細胞の作用因子投与方法の概要を示す図である。一の実施形態では、液体培地１１とともに培養細胞１２を収容したディッシュなどの培養容器１３に対して、ターゲットの細胞１２を取り囲むマイクロチャンバ１４を配置する（図１（ａ）、（ｂ）参照）とともに、マイクロチャンバ１４内に作用因子を投与する（図１（ｃ）参照）。
  ここで、本明細書の作用因子には、薬剤（例えば、アミノ酸や一酸化窒素など）、候補薬物、分化誘導因子、細胞増殖因子、遺伝子ベクター（環状ＤＮＡ、ウイルスベクター、リポソームベクターなど）が含まれる。なお、これらの作用因子は、化合物、ポリマー、混合物、溶液、核酸または核酸複合体のいずれの形態をとるものであってもよい。
　図２は、一の実施形態に係るマイクロチャンバ１４の構成例を模式的に示す断面図である。一の実施形態のマイクロチャンバ１４の全体形状は、培養容器１３の培養面と接触する底面側が開放されるとともに、上面側が閉塞された有底円筒形のカップ状に構成されている。そのため、マイクロチャンバ１４の内側には細胞１２を収容可能となっている。そして、一の実施形態では、培養容器１３の培養面上にマイクロチャンバ１４を配置することで、培養容器１３の容積に対して十分に微小な投与空間がマイクロチャンバ１４の内側に構築される。なお、マイクロチャンバ１４の大きさは、ターゲットの細胞１２の種類や数などに応じて適宜選択されるが、一例として、その直径が５０μｍから１００μｍ程度に設定される。
　また、図２に示すマイクロチャンバ１４は、後述のニードル（１８）を挿抜可能とするために、エラストマーなどの弾性材料で構成される。このマイクロチャンバ１４の材料としては、例えばシリコンゴム（ポリジメチルシロキサン）などを用いることができる。また、一の実施形態では、マイクロチャンバ１４の内部に位置する細胞の視認性を向上させるために、マイクロチャンバ１４は透光性を有する材料で形成される。
　さらに、一の実施形態でのマイクロチャンバ１４は、以下の（１）または（２）の構成（あるいはこれらの組み合わせ）を有していてもよい。
　（１）投与空間内を液体培地１１で満たすことを容易とするために、マイクロチャンバ１４の内面には、親水性被膜の形成などによって親水性を付与してもよい。この場合には、マイクロチャンバ１４を上下に反転させて空気が入らないように予め液体培地１１を容器内に充填し、その後にマイクロチャンバ１４を本来の状態（底面側に開口がある状態）に戻しても表面張力によって容器内の液体は保持される。したがって、この場合には、予め液体培地１１で満たされている状態のマイクロチャンバ１４を、細胞１２の上に被せることが可能となる。
　（２）マイクロチャンバ１４の表面には、蛋白質の吸着を阻害する物質（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、２－メタクリロイオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）など）で被膜を形成してもよい。この場合には、培養容器１３へのマイクロチャンバ１４の配置によって培養環境に与える影響をより低減させることができる。
　次に、図３の流れ図を参照しつつ、一の実施形態における作用因子投与方法の各手順を具体的に説明する。
　ステップＳ１０１：培養容器１３の上側からターゲットの細胞１２を取り囲むように、培養容器１３にマイクロチャンバ１４を配置する。これにより、ターゲットの細胞１２が収容されるとともに培養容器１３の容積に対して微少な投与空間がマイクロチャンバ１４の内側に形成される。
　このとき、熱の移動による培養環境への悪影響を抑制するために、マイクロチャンバ１４は予め培地１１と同じ温度に保温しておくことが好ましい。なお、投与空間に収容する細胞１２の数は複数であってもよいが、一の実施形態ではマイクロチャンバ１４内に１つの細胞を収容するものとする。
　ステップＳ１０２：マイクロチャンバ１４によって形成された投与空間内に作用因子を投与する。これにより、培養容器１３で培養されている培養細胞のうち、投与空間内に存在するターゲットの細胞１２のみが選択的に作用因子に感作されることとなる。
　具体的には、まず、注射針状の構造を有し、先端が尖った２本の中空管体（ニードル）１８を外側からマイクロチャンバ１４にそれぞれ突き刺す。これにより、外部から投与空間に連通する２本の流路が形成される。
　ここで、マイクロチャンバ１４は弾性部材で形成されているため、ニードル１８が挿通した部分は、マイクロチャンバ１４の弾性変形でニードル１８との隙間が塞がれて液密の状態となる。なお、ニードル１８をマイクロチャンバ１４から引き抜いた場合にも、ニードル１８の挿通した穴は、マイクロチャンバ１４の弾性変形で塞がれる。したがって、マイクロチャンバ１４にはニードル１８を繰り返し挿抜することが可能である。
　次に、ニードル１８の一方から投与空間内の培地１１を吸引しつつ、ニードル１８の他方から投与空間に作用因子を投与する。これにより、ほぼ密閉された状態にある微小な容積の投与空間に対して作用因子を容易に投与できる。なお、一方のニードル１８から吸引した培地１１や作用因子を再び他方のニードル１８から投与空間へ環流させてもよい。
　ステップＳ１０３：ターゲットの細胞１２に作用因子を一定時間作用させた後に、マイクロチャンバ１４を培養容器１３から除去して、培養容器１３内の培養環境を復元する。
　このとき、必要に応じて培地１１の交換を行ってもよい。ここで、Ｓ１０３で培地１１を交換する場合には、以下の（イ）または（ロ）のいずれかの手法が適用される。
　（イ）第１の手法としては、マイクロチャンバ１４を除去した後に、培養容器１３の培地１１をすべて交換する。この場合には、ターゲットの細胞１２の周囲から作用因子を迅速かつ容易に除去できる。
　（ロ）第２の手法としては、ターゲットの細胞１２にマイクロチャンバ１４を被せたままで、一方のニードル１８から新たな培地１１を注入するとともに、作用因子を含んだ古い培地１１を他方のニードル１８から回収する。これにより、マイクロチャンバ１４内の投与空間の培地１１のみを局所的に交換する。そして、培地１１の交換後にマイクロチャンバ１４を除去する。この場合には、マイクロチャンバ１４を除去したときに作用因子が培養容器１３の全体に拡散することが抑制される。したがって、培養容器１３の他の細胞に作用因子の影響が及ぶことをより確実に防止できる。以上で、図３の流れ図の説明を終了する。
　上述した一の実施形態では、培養容器１３で培養された複数の細胞のうち、任意の細胞のみを対象として薬剤などの作用因子を局所的に投与できる。したがって、一の実施形態では、培養容器１３において細胞を培養しつつ、個々の細胞単位で薬剤等の投与を制御できる点で優れた効果を奏する。また、一の実施形態では、作用因子の投与後に培養容器１３の培養環境を復元できるので、細胞の培養と薬剤等の投与とを効率的に行うことができる。
　また、一の実施形態では、培養容器１３の容積に対して微少な投与空間に作用因子を投与する。そのため、投与空間内を微小量の薬剤等で高い濃度にすることができ、ターゲットの細胞１２に薬剤等を感作させる場合に薬剤等の使用量を減少させることができる。
　なお、一の実施形態において、１つの培養容器１３に複数のマイクロチャンバ１４を配置して、異なる細胞１２への作用因子の投与を並行して行うようにしてもよい。このとき、各々の投与空間でそれぞれ異なる作用因子を投与してもよい。
　＜一の実施形態の変形例＞
  図４、図５、図６は、一の実施形態のマイクロチャンバ１４の他の構成例をそれぞれ模式的に示す断面図である。これらの構成によっても、ターゲットの細胞１２の周囲に微小な投与空間を構築して投与空間内に作用因子を投与することができ、図２の例とほぼ同様の効果を得ることができる。なお、図４、図５、図６において図２と共通する構成については、同一符号を付して重複説明は省略する。
　図４は、有底円筒形のカップ状のマイクロチャンバ１４の内面に、作用因子として光分解性試薬（ケージド試薬）１９を固着した例である。ケージド試薬１９は、活性物質の活性部位をニトロベンジル基などでブロックすることで不活性化した物質であって、所定波長の開裂光が照射されると光分解によって活性物質が活性を有するようになる。なお、図４のマイクロチャンバ１４の材質は、少なくともケージド試薬１９の開裂光の波長を透過する透光性の部材で形成される。
  図４の例で投与空間内の細胞に作用因子を投与する場合、マイクロチャンバ１４のケージド試薬１９に対して、例えば共焦点光学系による落射照明によって所定波長の開裂光を照射すればよい。これにより、投与空間内のケージド試薬１９が活性化し、ターゲットの細胞１２のみに作用因子を感作させることができる。
　図５に示すマイクロチャンバ１４は、培養容器１３と接触する底面と、上面とがそれぞれ開口した筒状の部材で構成されている。この図５の構成では、マイクロチャンバ１４の上面側から培地１１が流入することを防ぐように、マイクロチャンバ１４の高さを設定する必要がある。
  図５の例で投与空間内の細胞１２に作用因子を投与する場合、マイクロチャンバ１４の上面側の開口から作用因子をニードル１８で注入すればよい。図５の例では、投与空間の上面側が開放されていることから、投与空間に１本のニードル１８で作用因子を一方的に注入することも容易となる。
　図６は、有底円筒形のカップ状のマイクロチャンバ１４に、それぞれ外部と連通する２つの流路２０を予め加工して形成した例である。そして、図６の例で投与空間内の細胞１２に作用因子を投与する場合、マイクロチャンバ１４に形成された２つの流路２０を用いて、一方の流路２０から投与空間内の培地１１を吸引しつつ、他方の流路２０から投与空間に作用因子を投与すればよい。
　なお、図４、図５、図６の例において、マイクロチャンバ１４にニードル１８を挿抜する必要がない場合には、プラスチックやガラスなどの硬質の部材でマイクロチャンバ１４を構成することも可能となる。
　＜他の実施形態の作用因子投与方法の説明＞
　図７は、他の実施形態に係る培養細胞の作用因子投与方法の概要を示す図である。他の実施形態は、図１に示す一の実施形態の変形例であって、マイクロチャンバ１４を配列したマイクロチャンバシート２１を用いて各々の投与空間毎に細胞に作用因子を投与する。なお、他の実施形態では培養容器１３側の培養面を修飾することで、培養細胞１２の付着位置がマイクロチャンバシート２１に合わせて制御されている。
　図８は、他の実施形態に係るマイクロチャンバシート２１を模式的に示す部分断面図である。また、図９は、他の実施形態で用いる培養容器１３の培養面と、マイクロチャンバシート２１との対応関係を示す図である。他の実施形態に係るマイクロチャンバシート２１の全体形状は、培養容器１３の内径よりも外径が小さい円板状の部材であって、一方の面（底面側）には複数のマイクロチャンバ１４が形成されている。マイクロチャンバ１４は有底円筒形の凹部で構成されており、例えばリソグラフィなどの公知の微細加工手段で形成される。なお、マイクロチャンバシート２１は、エラストマーなどの弾性材料（例えばシリコンゴム）で形成されている。
　そして、マイクロチャンバシート２１の各々のマイクロチャンバ１４は一定間隔をおいて２次元的に配列されている。なお、図７、図９では、一例として、マイクロチャンバ１４が４×４の配列をなすマイクロチャンバシート２１を図示する。
　一方、培養容器１３の培養面上には、各々で細胞の付着性が異なる第１領域２２と第２領域２３とが形成されている。上記の第１領域２２は、培養面上で相対的に細胞の付着性が高い領域である。この第１領域２２は培養面上に複数形成されており、その数はマイクロチャンバシート２１のマイクロチャンバ１４の数と対応する。培養面上の第１領域２２は、マイクロチャンバ１４の間隔に合わせて４×４の配列をなしている。なお、個々の第１領域２２のサイズは、マイクロチャンバ１４のサイズよりも若干小さくなるように設定されている。
　また、第２領域２３は、培養面上で相対的に細胞の付着性が低い領域であって、第１領域２２を取り囲むように形成されている。そのため、培養容器１３内では、マイクロチャンバ１４の位置に対応する第１領域２２に細胞が付着しやすくなっている。
　ここで、第１領域２２および第２領域２３の形成手段としては、以下の（１）から（４）の例が考えられる。なお、これらの構成は適宜組み合わせてもかまわない。
（１）第１領域２２に対して親水性を付与することで蛋白質の吸着を高め、第１領域２２での細胞の付着性を相対的に高くする。一例として、培養容器１３の培養面にプラズマや紫外線を照射してパターニングを行うことで、親水性が付与された第１領域２２を形成することができる。
（２）電荷を持った高分子被膜（例えばポリリジンのコーティングなど）を第１領域２２に形成することで蛋白質の吸着を高め、第１領域２２での細胞の付着性を相対的に高くする。
（３）第２領域２３に対して蛋白質の吸着を阻害する皮膜を形成することで、第２領域２３での細胞の付着性を相対的に低くする。上記の被膜の材料としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）や、２－メタクリロイオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）などが挙げられる。
（４）第２領域２３に表面加工で微小な突起を形成し、細胞の接着面積を低くすることで第２領域２３での細胞の付着性を相対的に低くしてもよい。
　また、他の実施形態での作用因子の投与の手法は、個々のマイクロチャンバ１４にニードル１８を突き刺して、外部から作用因子を注入することで行われる。この他の実施形態では、マイクロチャンバシート２１を培養容器１３に配置する点と、個々のマイクロチャンバ１４ごとにニードル１８を突き刺して作用因子を投与する点を除いて、一の実施形態とほぼ共通するので説明を省略する。なお、マイクロチャンバシート２１や培養容器１３にアライメントマークを予め設けておけば、マイクロチャンバシート２１を培養容器１３に配置するときの位置決めが容易となる。
　他の実施形態の構成によれば、上記の一の実施形態の効果に加えて、細胞単位での作用因子の投与をアレイ化によって効率よく行うことができる。例えば、各々のマイクロチャンバ１４ごとに投与する作用因子の種類、作用因子の組み合わせ、投与の順番、タイミングなどを変化させることによって、分化誘導の最適化の解析やコンビナトリアルな薬理検討などを効率的に行うことが可能となる。また、他の実施形態では、アレイ化により個々のマイクロチャンバ１４をそれぞれ独立してアライメントする必要がないので、作用因子を投与する作業の煩雑さが低減して作業効率が一層向上する。
　なお、他の実施形態におけるマイクロチャンバシートの変形例を図１０、図１１に示す。
図１０は、マイクロチャンバシート２１の個々のマイクロチャンバ１４の内側にケージド試薬１９をそれぞれ固着した例である。また、図１１は、マイクロチャンバシート２１の個々のマイクロチャンバ１４に、外部と連通する２本の流路２０をそれぞれ形成した例である。これらの例によっても、図７、図８に示す他の実施形態の例とほぼ同様の効果を得ることができる。
　＜作用因子投与装置の構成例＞
　図１２は、上述の一の実施形態または他の実施形態の作用因子投与方法を実行するための作用因子投与装置の構成例を示すブロック図である。
　作用因子投与装置は、恒温室４１と、ロボットアーム４２と、作用因子注入ユニット４３と、光学観察ユニット４４と、モニタ４５と、記憶部４６と、制御部４７と、ユーザーから各種の操作を受け付ける操作部４８とを有している。ここで、ロボットアーム４２、作用因子注入ユニット４３、光学観察ユニット４４、モニタ４５、記憶部４６および操作部４８は、それぞれ制御部４７に接続されている。
　恒温室４１には、細胞１２を培養する培養容器１３が収納される。この恒温室４１の内部は、細胞の培養に適した環境（例えば温度３７℃、湿度９０％の雰囲気）に維持されるとともに、コンタミネーションを防止するために高い清浄度に保たれている。
　ロボットアーム４２は、マイクロチャンバ１４（またはマイクロチャンバシート２１）が先端に保持されており、マイクロチャンバ１４を三次元的に移動させる。そして、ロボットアーム４２は、制御部４７の指示に応じて、培養容器１３の所定位置の細胞１２にマイクロチャンバ１４を被せるとともに、作用因子の投与終了後にマイクロチャンバ１４を除去する動作を行う。
　作用因子注入ユニット４３は、ロボットアーム４２の先端近傍に配置される。作用因子注入ユニット４３は、マイクロチャンバ１４に注射針状の２本のニードル１８を突き刺して流路を形成し、外部から投与空間内に作用因子を注入する。なお、作用因子注入ユニット４３は、培地１１の交換に用いることもできる。
　光学観察ユニット４４は、培養細胞を照明する照明装置と、培養細胞を観察するための顕微光学系と、顕微光学系を介した培養容器１３内の像を撮像する撮像装置とを有している。この光学観察ユニット４４は、ロボットアーム４２が培養容器１３内にマイクロチャンバ１４を位置決めするときの位置情報の取得などに用いられる。また、光学観察ユニット４４の照明装置は、マイクロチャンバ１４に対してケージド試薬の解除光を照射する装置としても機能する。なお、光学観察ユニット４４で撮像された画像は、制御部４７の制御によってモニタ４５に表示することができる。
　記憶部４６は、ハードディスクやフラッシュメモリ等の不揮発性の記憶媒体で構成される。この記憶部４６には、光学観察ユニット４４が生成した画像情報や、制御部４７によって実行されるプログラムが記憶される。また、記憶部４６には、各々の細胞に対する作用因子の投与履歴を記録することもできる。なお、作用因子の投与履歴は、例えば、ターゲットの細胞の識別情報と、投与日時と、投与された作用因子の種類および量の情報とがそれぞれ対応付けされている。
　制御部４７は、作用因子投与装置の各部の動作を統括的に制御するプロセッサである。例えば、制御部４７は、ロボットアーム４２を制御してマイクロチャンバ１４を移動させるとともに、作用因子注入ユニット４３や光学観察ユニット４４の照明装置を駆動させて、マイクロチャンバ１４内に作用因子を投与する。
　以下、図１３の流れ図を参照しつつ、作用因子投与装置の動作例を説明する。
　ステップＳ２０１：制御部４７は、光学観察ユニット４４を駆動させて培養容器１３内の状態を撮像した観察画像を取得する。これにより、制御部４７は、マイクロチャンバ１４を位置決めするときの位置情報を取得する。一例として、制御部４７は、画像の基準点（例えば画面の中心）と培養容器１３での位置とを予め対応付けておく。そして、制御部４７は、光学観察ユニット４４での撮影倍率やレンズ位置などを考慮して、画像内における細胞と基準点との位置関係から、培養容器１３での実際の細胞の座標を幾何学的に求めることができる。
　その後、制御部４７は、上記の観察画像をモニタ４５に表示する。これにより、ユーザーは観察画像に基づいて、作用因子を投与するターゲットの細胞１２を操作部４８から指定することができる。
　ステップＳ２０２：ユーザーからターゲットの細胞１２の指定を受け付けると、制御部４７は、上記の位置情報（Ｓ２０１）に基づいてロボットアーム４２を駆動させて、ターゲットの細胞１２の上からマイクロチャンバ１４を配置する。これにより、ターゲットの細胞１２の周囲にマイクロチャンバ１４で投与空間が形成される。
　ステップＳ２０３：制御部４７は、作用因子注入ユニット４３を駆動させて、マイクロチャンバ１４内の投与空間に作用因子を投与する。なお、マイクロチャンバ１４内に作用因子としてケージド試薬が固着されている場合、制御部４７は、光学観察ユニット４４の照明装置によって解除光を照射し、ケージド試薬を活性化させてもよい。
　ステップＳ２０４：制御部４７は、作用因子の投与終了後に、ロボットアーム４２を駆動させて培養容器１３からマイクロチャンバ１４を除去し、培養容器１３内の培養環境を復元する。
　このとき、制御部４７は、作用因子注入ユニット４３を動作させて培地交換を行ってもよい。なお、制御部４７は、マイクロチャンバ１４内の局所的な培地交換を行ってからマイクロチャンバ１４を除去してもよく、あるいはマイクロチャンバ１４を除去してから培養容器内の培地を一括して交換してもよい。
　ステップＳ２０５：制御部４７は、作用因子の投与履歴を記憶部４６に記録する。以上で、図１３の流れ図の説明を終了する。上記の作用因子投与装置によれば、上述の実施形態の作用因子投与方法を効率的に実行することが可能となる。　
　＜実施例＞
　本発明の実施例として、２本のマイクロガラスピペットを用いて、マイクロチャンバ内の溶液の交換実験を行った。
　図１４は、実施例で用いたマイクロチャンバの構成を示す図である。実施例では、円筒形の石英ガラスリングの上面に円盤状のポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）シートを接合してマイクロチャンバを構成した。石英ガラスリングの寸法は、外径２．７ｍｍ、内径２．０ｍｍ、厚さ（ｔ）１５０μｍとした。また、円盤状のＰＤＭＳシートの寸法は、外径２．７ｍｍ、厚さ（ｔ）２００－３００μｍとした。なお、実施例のマイクロチャンバの厚さは約３５０μｍとした。また、各ガラスピペットの先端の外径は、５０μｍ－１００μｍ程度とした。
　実施例では、ＰＤＭＳシート上に上記のマイクロチャンバを配置するとともに、導入側および回収側の２本のガラスピペットをそれぞれマイクロチャンバに挿入した（図１５参照）。導入側のガラスピペットにはマイクロシリンジポンプを接続し、導入側のガラスピペットからマイクロチャンバ内に蛍光試薬を１０μｌ／ｍｉｎで導入した。また、回収側のガラスピペットは大気圧開放とした。
　図１６は、実施例のマイクロチャンバの薬液注入前の状態を示す図であり、図１７は、実施例のマイクロチャンバの薬液注入後の状態を示す図である。実施例では、導入側のガラスピペットから蛍光試薬が導入され、回収側から蛍光試薬が回収されたことを確認できた。また、マイクロチャンバにおいて、ガラスピペットを抜いた後に残るＰＤＭＳシートの穴の部分から液漏れがないことを確認できた。
　したがって、実施例では、ガラスピペットを用いることで安定した送液が可能となることが分かった。回収側のガラスピペットには、毛細管現象とデバイス内部の内圧と大気圧のバランスにより液が回収されるため、デバイス内部の圧力が高くなりすぎるのを避けることができた。さらに、マイクロチャンバでは針の貫通の見極めが重要であるが、ガラスピペットを用いて回収する方法では、貫通時に毛細管現象によりピペット内に液が回収されるため貫通の見極めが容易であった。
　＜実施形態の補足事項＞
　（１）図２に示す一の実施形態では、２本のニードル１８を用いて、培地を吸引しつつ投与空間に作用因子を投与する例を説明したが、この場合においても１本のニードル１８で培地を吸引せずに投与空間に作用因子を投与するようにしてもよい。
　（２）なお、上記実施形態のマイクロチャンバ１４、マイクロチャンバシート２１、培養容器１３などの器具は、使い捨て物品として設計することが好ましい。
　以上の詳細な説明により、実施形態の特徴点および利点は明らかになるであろう。これは、特許請求の範囲が、その精神および権利範囲を逸脱しない範囲で前述のような実施形態の特徴点および利点にまで及ぶことを意図する。また、当該技術分野において通常の知識を有する者であれば、あらゆる改良および変更に容易に想到できるはずであり、発明性を有する実施形態の範囲を前述したものに限定する意図はなく、実施形態に開示された範囲に含まれる適当な改良物および均等物によることも可能である。
１１…培地、１２…細胞、１３…培養容器、１４…マイクロチャンバ、１８…ニードル、１９…ケージド試薬、２０…流路、２１…マイクロチャンバシート、２２…第１領域、２３…第２領域、４１…恒温室、４２…ロボットアーム、４３…作用因子注入ユニット、４４…光学観察ユニット、４５…モニタ、４６…記憶部、４７…制御部、４８…操作部

Claims (16)

  1. 　培養液および培養細胞を収容した培養容器内にターゲットの細胞を取り囲むマイクロチャンバを配置し、前記培養容器の容積に対して微少な投与空間を前記マイクロチャンバの内側に形成する区画手順と、
    　前記投与空間内に作用因子を投与して、前記培養細胞のうちの前記ターゲットの細胞に前記作用因子を選択的に感作させる投与手順と、
    　を有することを特徴とする培養細胞への作用因子投与方法。
  2. 　請求項１に記載の培養細胞への作用因子投与方法において、
      前記投与手順では、前記投与空間に連通する流路を介して、前記マイクロチャンバの外部から前記作用因子を投与することを特徴とする培養細胞への作用因子投与方法。
  3. 　請求項２に記載の培養細胞への作用因子投与方法において、
      前記投与手順では、少なくとも前記流路を２つ用いて、前記流路のうちの一方から前記投与空間の充填物を吸引しつつ、前記流路のうちの他方から前記投与空間に前記作用因子を投与することを特徴とする培養細胞への作用因子投与方法。
  4. 　請求項２または請求項３に記載の培養細胞への作用因子投与方法において、
      前記マイクロチャンバを弾性部材で形成するとともに、前記マイクロチャンバに外側から管体を挿通することで前記流路を形成することを特徴とする培養細胞への作用因子投与方法。
  5. 　請求項１に記載の培養細胞への作用因子投与方法において、
    　前記マイクロチャンバを透光性部材で形成するとともに、前記マイクロチャンバの内部には前記作用因子としての光分解性試薬が予め配置され、
    　前記投与手順では、前記光分解性試薬を活性化させる波長の光を前記マイクロチャンバに照射することで、前記作用因子を投与することを特徴とする培養細胞への作用因子投与方法。
  6. 　請求項１に記載の培養細胞への作用因子投与方法において、
      前記投与手順の終了後に前記培養容器から前記マイクロチャンバを除去する除去手順をさらに有することを特徴とする培養細胞への作用因子投与方法。
  7. 　請求項１に記載の培養細胞への作用因子投与方法において、
    　前記投与手順の終了後に、前記培養容器内の少なくとも前記投与空間の前記培養液を交換する培地交換手順を有することを特徴とする培養細胞への作用因子投与方法。
  8. 　請求項１に記載の培養細胞への作用因子投与方法において、
    　前記培養容器に前記マイクロチャンバを複数配置し、前記マイクロチャンバごとに形成された各々の前記投与空間で前記投与手順を並行して実行することを特徴とする培養細胞への作用因子投与方法。
  9. 　請求項８に記載の培養細胞への作用因子投与方法において、
    　各々の前記投与空間でそれぞれ異なる前記作用因子が投与されることを特徴とする培養細胞への作用因子投与方法。
  10. 　請求項８または請求項９に記載の培養細胞への作用因子投与方法において、
    　複数の前記マイクロチャンバは、前記培養容器内で一定間隔をおいて２次元的に配列されることを特徴とする培養細胞への作用因子投与方法。
  11. 　請求項１に記載の培養細胞への作用因子投与方法で用いられるマイクロチャンバであって、
    　細胞を内部に収容可能な弾性部材の容器で、培養容器と接触する底面側が開放されているカップ形状をなすことを特徴とするマイクロチャンバ。
  12. 　請求項１に記載の培養細胞への作用因子投与方法で用いられるマイクロチャンバであって、
    　細胞を内部に収容可能な容器で、培養容器と接触する底面側が開放されているカップ形状をなし、容器の外部から内部へ連通する流路を有することを特徴とするマイクロチャンバ。
  13. 　請求項１に記載の培養細胞への作用因子投与方法で用いられるマイクロチャンバであって、
    　透光性部材で構成されるとともに、細胞を収納する内面部に光分解性試薬が固着されていることを特徴とするマイクロチャンバ。
  14. 　請求項１１から請求項１３のいずれか１項に記載のマイクロチャンバが同一平面上に複数配置された本体部を有し、
    　各々の前記マイクロチャンバは、一定間隔をおいて２次元的に配列されていることを特徴とするマイクロチャンバアレイ。
  15. 　請求項１４のマイクロチャンバアレイを、容器内の培養面上に配置可能な培養容器であって、
    　培養細胞を許容する複数の第１領域と、前記第１領域よりも培養細胞の付着性を低下させた第２領域とが前記培養面上にそれぞれ形成され、
    　各々の前記第１領域の形成位置は、前記マイクロチャンバアレイ上で各々のマイクロチャンバが配列される位置に対応することを特徴とする培養容器。
  16. 　培養容器内に存在するターゲットの細胞の位置を検出する位置情報取得部と、
    　前記ターゲットの細胞を取り囲むマイクロチャンバを前記培養容器内に配置し、前記培養容器の容積に対して微少な投与空間を前記マイクロチャンバの内側に形成するマイクロチャンバ配置部と、
    　前記投与空間内に作用因子を投与するための投与装置と、
    　を備えることを特徴とする培養細胞への作用因子投与装置。
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