KR20060009262A - 세포배양용 마이크로 챔버 - Google Patents

세포배양용 마이크로 챔버 Download PDF

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도꾸리쯔교세이호징 가가꾸 기쥬쯔 신꼬 기꼬
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Abstract

Figure 112005059037317-PCT00001
배양중에 마이크로 챔버의 형상을 가역적으로 변화시키므로써, 마이크로 챔버내의 영동세포를 선택적으로 회수할 수 있는 유로를 개폐할 수 있는 새로운 마이크로 챔버를 제공한다. 슬라이드 글래스 등의 광학적으로 투명한 기판(112)상에, 광학적으로 가시영역에서 투명하고 또한 탄성인 고분자중에 형성된 세포배양영역(110)과, 그 양단에 위치하는 유로(108, 109)와, 이 개폐상황을 팽창ㆍ수축에 의해 조절하는 공기저장기(105, 106)와, 이 공기저장기로 가압, 감압을 행하기 위한 공기의 유로(103, 104)와, 공기압 제어부와의 접속 조인트(101, 102)가 배치되어 있고, 세포를 포함하는 배양액은 흐름(107)의 방향으로 연속적으로 흐를 수 있다.

Description

세포배양용 마이크로 챔버{MICRO CHAMBER FOR CELL CULTURE}
본 발명은, 세포배양용 마이크로 챔버에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 세포의 상태를 현미경 관찰하면서 1세포 단위로 배양할 수 있는 세포배양용 마이크로 챔버에 관한 것이다.
종래, 세포의 상태의 변화나, 세포의 약물 등에 대한 응답을 관찰하는데, 세포집단의 값의 평균치를 마치 1세포의 특성인 것처럼 관찰해 왔다. 그러나, 실제로는 세포는 집단 중에서 세포주기가 동조하고 있는 것은 드물어서, 각각의 세포가 다른 주기로 단백질을 발현하고 있다.
이들의 문제를 해결하기 위해서, 동조배양 등의 수법이 개발되어 있지만, 배양된 세포의 유래가 완전히 동일한 1세포로부터가 아닌 것으로부터, 배양전의 유래 세포 각각의 유전자의 차이가 단백질 발현의 차이를 만들어 낼 가능성이 있고, 실제로 자극에 대한 응답의 결과를 해석할 때에, 그 변동이 세포의 반응기구 자체가 보편적으로 갖는 응답의 변동에 유래하는 것인지, 세포의 차이(즉, 유전 정보의 차이)에 유래하는 변동인지 밝히는 것은 어려웠다.
또한, 동일한 이유로부터, 세포주에 관해서도, 일반적으로는 완전히 1세포로부터 배양한 것이 아니기 때문에, 자극에 대한 응답의 재현성이 세포 각각의 유전 자의 차이에 의해 변동되는 것인가 밝히는 것은 어려웠다.
더욱이 또한, 세포에 대한 자극(시그널)은, 세포주변의 용액에 포함되는 시그널 물질, 영양, 용존기체의 양에 의해 주어지는 것과, 다른 세포와의 물리적 접촉에 의한 것의 2종류가 있는 것으로부터도, 변동에 관한 판단이 어려운 것이 실정이었다.
한편, 종래부터, 바이오테크놀로지의 연구분야에 있어서 세포의 관찰을 행하는 경우에는, 대형 배양기에서 배양된 세포군의 일부를 일시적으로 배양기로부터 집어내서 현미경에 세트하고, 관찰을 행하거나, 또는, 현미경 전체를 플라스틱 용기로 둘러싸서 온도를 관리하고, 그 중에 작은 별도의 용기를 이용하여 이산화탄소 농도, 및 습도를 관리하면서, 현미경 관찰을 행하고 있었다. 이 때, 세포를 배양하면서, 오래된 배양액과 신선한 배양액을 교환함으로써 용액조건을 일정하게 하는 것이 연구되어 오고 있다.
예컨대, 순환 펌프를 이용하여, 기재 표면에 대한 배지의 레벨을 기재의 상단 테두리 높이보다 높은 레벨과 하단 테두리 높이보다 낮은 레벨과의 사이에서 올리고 내리는 조작을 하는 것에 의해, 상기 낮은 레벨로 내려가면 배지를 공급하고, 상기 높은 레벨로 올라가면 배지를 배출하는 기구에 의해 영양상태를 일정하게 유지할 수 있다(일본국 특개평 10-191961).
또한, 배양용기 내에, 새로운 배지를 배양용기에 도입하는 도입관과, 배양용기의 배지를 외부로 배출하는 배출관과, 배양용기의 기체 부분과 펌프를 연통하는 기관(氣管)의 각 일단을 삽입하고, 상기 도입관, 배출관 및 기관의 각각의 관로에 배양용기내로의 균의 침입을 저지하는 필터를 설치하는 것에 의해, 배양조의 영양상태를 일정하게 유지할 수 있다(일본국 특개평 8-172956).
그러나, 배양세포의 용액환경과, 세포간의 물리적 접촉을 제어하면서 배양 할 수 없었다.
따라서, 본 발명자들은, 이러한 문제점을 해결하고, 새롭게 특정 1세포만을 선택하고, 그 1세포를 세포주로 하여 배양하는 기술, 및 세포를 관찰하는 경우에, 세포의 용액 환경조건을 제어하고, 또한, 용기중에서의 세포 농도를 일정하게 제어하는 기술, 또는 상호작용하는 세포를 특정하면서 배양 관찰하는 기술을 출원했다 (일본국 특개 2002-153260).
발명이 해결하고자 하는 과제
그러나, 상기 문헌(일본국 특개 2002-153260)에서 이용한 광 핀셋 기술은, 포획할 수 있는 힘의 크기가 피코뉴튼(piconewton) 정도이고, 이것은 부유하는 세포를 포획하는 힘으로서는 충분하지만, 스스로 영동하는 세포를 포획하는 데에는 불충분했다. 또한, 배양중의 영동세포를 선택적으로 배양부로부터 회수하는 것은 곤란하였다.
따라서, 본 발명자들은, 상기의 마이크로 챔버에 관해서 검토를 더하고, 배양중에 마이크로 챔버의 형상을 가역적으로 변화시키므로써, 마이크로 챔버내의 영동세포를 선택적으로 회수할 수 있는 유로를 개폐할 수 있는 새로운 마이크로 챔버를 제공한다.
과제를 해결하기 위한 수단
즉, 본 발명은, 세포배양영역, 상기 영역과 외부를 연결하는 적어도 2개의 유로, 상기 유로의 개폐수단, 및 상기 세포배양영역 및 유로의 개폐를 광학적으로 관찰하는 수단으로 이루어지는 세포배양용 마이크로챔버로서, 하나의 유로가 세포배양 영역에 세포를 포함해도 좋은 배양액을 주입할 수 있는 유로이며, 다른 하나의 유로가 세포배양영역으로부터 세포를 포함해도 좋은 배양액을 배출할 수 있는 유로이며, 상기 유로의 적어도 일부가 탄성재료에 의해 둘러싸여 이루어지고, 상기 개폐수단이 상기 유로를 외부로부터 상기 관찰수단의 관찰방향에 대하여 거의 직각방향으로 누르거나 또는 빼는 것에 의해 상기 유로를 개폐 또는 그 폭을 변경하는 것을 특징으로 하는 세포배양용 마이크로 챔버이다.
이 광학적 관찰수단으로서, 광학적 현미경, 비디오 녹화장치, 카메라 등을 들 수 있고, 이들은 PC 등에 연결하여 화상처리를 행하는 것이어도 좋다. 또한, 관찰을 쉽게 하기 위해서, 광조사 장치를 같이 사용해도 좋다.
이 개폐수단을 작동시키고 있지 않을 때의, 상기 유로의 폭이 대상으로 되는 세포 사이즈와 같은 정도인 것이 바람직하다. 따라서, 적당한 유로의 폭은, 대상으로 되는 세포의 사이즈에 따라 다르다. 또한, 개폐수단을 작동시키고 있지 않을 때의, 유로의 폭을, 대상으로 되는 세포의 사이즈보다 약간 좁게 해두면, 세포가 통상 상태에서는 이 유로를 통과하지 않고, 유로를 열었을 때에만 통과하게 되기 때문에, 세포의 분리에 적합하다.
개폐수단은, 유로에 외부로부터 힘을 가하여, 유로를 개폐 또는 그 폭을 변경시키는 것이면 좋다. 기계적으로 힘을 가하는 것이나, 공극을 설치해서 그 체적을 변화시키는 것 등 어떠한 것이어도 좋다.
또한, 상기 개폐수단이 상기 유로에 인접하는 공극을 갖고, 상기 공극이 기체 또는 액체로 채워져서, 그 압력을 변경하는 것에 의해, 상기 공극의 크기를 변경하고, 그 결과 상기 유로개폐 또는 그 폭을 변경하는 것이 바람직하다. 이 공극을 공기로 채우고, 이 공극을 공기저장기로 하여, 그 공기압으로 유로의 개폐를 제어하는 것이 가장 간편하다.
유로는, 그 전부를 탄성재료로 둘러싸여지도록 해도 좋고, 그 개폐수단측만을 탄성재료로 만들어도 좋다. 상기의 공극의 주위와 이 유로의 주위를 같은 재료로 만들고, 그 공극의 크기의 변화가 즉시 유로의 폭에 영향을 주도록 이들을 배치하는 것이 바람직하다.
이 탄성재료는, 어떠한 탄성재료이더라도 좋고, 세포배양에 악영향이 없는 합성 고분자를 이용하는 것이 간편하고, 특히, 실리콘계 수지인 것이 바람직하다.
또한, 이 세포배양용 마이크로 챔버의 세포배양영역과 유로의 개폐를 광학적으로 관찰하기 위해서, 필요한 부분만 투명재료로 만드는 것이 바람직하다. 전체를 투명 탄성재료로 만들어도 좋다.
도 1은, 본 발명의 기본구성의 일례를 나타내는 모식도이다.
도 2는, 유로의 개폐 프로세스의 일례를 설명한 모식도이다.
도 3은, 배양 마이크로 챔버 가공 프로세스의 일례를 설명한 현미경 사진을 나타낸다.
도 4는, 배양 마이크로 챔버 가공 프로세스에서 이용한 주형과 고분자배양 마이크로 챔버의 일례를 설명한 현미경 사진을 나타낸다.
도 5는, 배양 마이크로 챔버의 유로의 개폐상태의 예를 나타내는 현미경 사진을 나타낸다.
도 6은, 배양 마이크로 챔버의 유로가 개폐상태에서 세포가 유로를 통과하는 경우의 현미경 사진을 나타낸다. 화살표는 세포를 나타낸다.
(도면중의 부호의 설명)
101, 102 공기압 제어부와의 접속 조인트
103, 104 공기의 통로
105, 106, 202 공기저장기
107 용액(세포를 포함하는 배양액)의 흐름
108, 109, 111, 201, 204 유로
110 세포배양영역
112, 302, 304 유리기판
113, 303 고분자(실리콘계 수지)
203 세포
301 주형
305 공기압조절부로의 접속 커넥터
발명의 실시형태
이하, 본 발명의 세포배양용 마이크로 챔버를 상세하게 설명하지만, 본 발명의 세포배양용 마이크로 챔버는 이들에 한정되는 것은 아니다.
우선, 본 발명의 세포배양 마이크로 챔버의 기본구성의 일례를 도 1에 나타낸다. 도 1a의 (B-B) 수평단면도 및, 도 1b의 (A-A) 종단면도에 예시한 바와 같이, 본 발명의 세포배양 마이크로 챔버(100)는, 슬라이드 글래스 등의 광학적으로 투명한 기판(112)상에, 광학적으로 가시영역에서 투명하고 또한 탄성인 고분자중에 형성된 세포배양영역(110)과, 그 양단에 위치하는 유로(108, 109, 111)의 개폐상황을 팽창 또는 수축에 의해 조절하는 공기저장기(105, 106)와, 이 공기저장기로 가압 또는 감압을 행하기 위한 공기의 통로(103, 104)와, 공기압 제어부와의 접속 조인트(101, 102)가 배치되어 있어, 용액(세포를 포함하는 배양액)은 흐름(107)의 방향으로 연속적으로 흐를 수 있다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 배양영역(110)은, 2개의 유로(108, 109)의 개방 또는 폐쇄상황에 따라, 그 중에서 배양하고 있는 세포를 포획하는 것도, 배출하는 것도 가능하다. 여기에서, 유로의 개폐는, 공기저장기의 공기의 압력을 제어하므로써 유로를 둘러싸는 고분자 벽면을 팽창 또는 수축시켜, 유로(111)의 폭을 조절한다. 이 때, 유로의 폭을 광학적 계측수단에 의해 계측할 수 있도록, 유로를, 광학현미경의 광축과는 수직인, 수평면상에 평면적으로 배치하고 있다. 이것에 의해, 예컨대 광학현미경을 이용하므로써, 유로의 폭, 즉 개방상황을 실제로 시료를 흘리지 않아도 관찰하는 것 만으로 확인할 수 있다. 따라서, 이 개방상황을 눈으로 확인하면서, 공기저장기(105, 106)의 공기압을 조정할 수 있다. 또한, 이 개방상태를 화상처리에 의해 자동적으로 계측함으로써, 미리 예정한 개방상태로 피드백 제어할 수도 있다.
다음에, 도 2를 이용하여, 유로의 개폐에 관해서 설명한다. 도 2의 a, b는 각각, 유로를 적절한 정도로 닫아서, 용액만은 유로(201)를 통과하지만, 세포(203)는 통과시키지 않은 상태에서의, 수평단면과 수직단면도이다. 공기저장기(202)에 공기를 도입해서 가압하므로써, 유로(204)는 닫히고, 그 가압의 정도에 따라 통과하는 세포의 사이즈를 조절할 수 있다.
다른 한편, 도 2의 c, d는 각각, 유로를 개방하여, 용액 뿐만 아니라 세포도 유로(201)를 통과하는 상태에서의, 수평단면과 수직단면이다. 공기저장기(202)로부터 공기를 배출하므로써, 유로(204)는 열리고, 그 감압의 정도에 의해 세포를 전부 통과시킬 수 있다.
도 3은, 실제로 세포배양 마이크로 챔버를 제작하는 프로세스의 일례를 나타내는 것이다. 우선, 포토리소그래프기술 등의 미세가공기술에 의해 주형을 형성한다(도 3의 1). 예컨대, 광경화성의 두꺼운 레지스트재 SU-8을 이용하므로써, 유리기판(302)상에 광학적으로 SU-8을 경화시킨 주형(301)을 작성할 수 있다. 다음에, 주형 위에, 광학적으로 투명하고 또한 탄성인 고분자를 흘려 넣어 경화시키므로써, 주형의 형상을 고분자로 전사할 수 있다(도 3의 2). 여기에서, 예컨대 광학적으로 가시영역에서 투명하고 또한 탄력성을 갖는 소재로서는, 실리콘 수지(폴리디메틸실록산 등)가 있다. 고분자가 경화한 후에, 공기나 용액을 흘리기 위한 관통구멍을 천공기를 이용해서 작성하고, 주형으로부터 고분자를 벗긴다(도 3의 3). 최후에, 이 미세구조를 전사한 고분자를 유리기판(304)상에 접착시키고, 공기압 조절부로의 접속 커넥터나 용액의 도입, 배출부를 설치하므로써 세포배양 마이크로 챔버로서 이용할 수 있다.
도 4는, 실제로 도 3의 프로세스에서 작성한 광경화성 수지 SU-8을 이용해서 작성한 세포배양 마이크로 챔버의 주형(도 4a)과, 이 주형을 전사해서 작성한 고분자 미세구조(도 4b)의 일례이다. 이 광학현미경 사진으로부터, 주형의 미세구조를 정확하게 고분자로 전사할 수 있다는 것을 알 수 있다.
도 5는, 이 세포배양 마이크로 챔버중의 유로의 기능을 나타내는 일련의 현미경 사진이다. 도 5a에서는, 공기저장기에 공기를 가압하므로써 유로를 닫고, 세포도 용액도 흐르지 않도록 한 것이다. 도 5b에서는, 공기저장기를 음압에서 흡인하므로써, 유로를 세포가 흐르지 않을 정도로 개방한 것이다. 이 현미경 사진으로부터도 알 수 있는 바와 같이, 용액의 흐름에 의해 세포는 유로까지 가까이 당길 수 있지만, 유로를 통과할 수는 없다. 또한, 유로의 개방량은 광학현미경에 의해 눈으로 확인할 수 있다. 따라서, 세포를 실제로 흘리지 않아도, 유로의 개방값을 눈으로 보는 것 만으로 조절할 수 있다. 도 5c는, 유로를 더 개방하므로써 세포를 흘린 것이다.
도 6에는, 더욱이 실제로 세포가 유로를 통과하는 과정이 현미경 사진으로 나타나 있다. 유로의 좌측에 있는 세포(화살표)는(도 6의 1), 유로를 통과해서(도 6의 2), 유로의 오른쪽으로 통과한다(도 6의 3).
본 발명의 세포배양용 마이크로 챔버는 이하와 같은 특징을 갖는다 :
-세포 배양영역과 외부가 유로에 의해서만 연결되기 때문에, 세포가 개폐장치등에 접하는 일이 없어, 세포에 여분의 부하가 걸리지 않는다.
-개폐수단이, 유로의 개폐의 관찰방향과 거의 직각이기 때문에, 관찰이 유로의 개폐에 영향을 주는 일이 없고, 또한 유로를 통과 또는 통과하지 않는 세포와, 유로의 개폐상태를 동시에 관찰할 수 있다.
이러한 특징에 의해, 세포의 배양액으로부터 단일세포를 분리하는 것이 가능하게 된다.
그 때문에, 종래 불가능했던, 영동하는 생물세포 등을 용기내의 세포수를 제어하면서 배양하는 것이 가능하게 된다. 또한, 용기의 내부의 세포를 선택적으로 회수하는 것이 가능하게 된다.

Claims (4)

  1. 세포배양영역, 상기 영역과 외부를 연결하는 적어도 2개의 유로, 상기 유로의 개폐수단, 및 상기 세포배양영역 및 유로의 개폐를 광학적으로 관찰하는 수단으로 이루어지는 세포배양용 마이크로 챔버로서, 하나의 유로가 세포배양영역에 세포를 포함해도 좋은 배양액을 주입할 수 있는 유로이며, 다른 하나의 유로가 세포배양영역으로부터 세포를 포함해도 좋은 배양액을 배출할 수 있는 유로이며, 상기 유로의 적어도 일부가 탄성재료에 의해 둘러싸여 이루어지고, 상기 개폐수단이 상기 유로를 외부로부터 상기 관찰수단의 관찰방향에 대하여 거의 직각방향으로 누르거나 또는 빼는 것에 의해 상기 유로를 개폐 또는 그 폭을 변경하는 것임을 특징으로 하는 세포배양용 마이크로 챔버.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 개폐수단을 작동시키고 있지 않을 때의, 상기 유로의 폭이 대상으로 되는 세포 사이즈와 같은 정도인 세포배양용 마이크로 챔버.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 개폐수단이 상기 유로에 인접하는 공극을 갖고, 상기 공극이 기체 또는 액체로 채워지고, 그 압력을 변경하는 것에 의해, 상기 공극의 크기를 변경하고, 그 결과, 상기 유로를 개폐 또는 그 폭을 변경하는 것인 세포배양용 마이크로 챔버.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탄성재료가 실리콘계 수지인 세포배양용 마이크로 챔버.
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