ITPI20060121A1 - Bioreattori bi- e tridimensionali hightroughput sensorizzati e/o dotati da sistema di filtrazione e di trasduzione ed attuazione. - Google Patents

Description

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Descrizione dell'invenzione industriale dal titolo:

"BIOREATTORI BI- E TRIDIMENSIONALI HIGHTHROUGHPUT

SENSORIZZATI E/O DOTATI DA SISTEMA DI FILTRAZIONE E DI

5 TRASDUZIONE ED ATTUAZIONE", a nome UNIVERSITÀ DI PISA con sede a PISA.

DESCRIZIONE

Ambito dell'invenzione.

La presente invenzione prende le mosse da un 10 precedente brevetto sviluppato dai medesimi inventori dal titolo ""BIOREATTORE PER LO STUDIO DEGLI EFFETTI SULLE ATTIVITà CELLULARI DI STIMOLI IMPOSTI"" e riguarda un dispositivo bioreattore sensorizzato che può essere posto in serie e/o parallelo a sistemi analoghi per lo studio 15 degli effetti di stimoli fisici chimici, meccanici ed elettromagnetici sulle attività di gruppi cellulari diversi o uguali al fine di simulare un organo, un tessuto o un vero e proprio apparato anatomico per applicazioni in vari settori tra cui: l'Ingegneria Tissutale per lo 20 sviluppo di costrutti biologici; in campo industriale per il "testing" farmacologico, nel campo della cosmesi per lo studio delle reazioni allergologiche ai prodotti sviluppati, nella messa a punto e lo studio di patologie mediche, la loro diagnosi e cura.

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Descrizione della tecnica nota.

È noto che ogni tessuto o sistema biologico durante la

sua evoluzione e la sua normale attività è sottoposto a

stimoli fisici e chimici che sia ne determinano il suo

5 stato patologico e fisiologico sia influenzano la sua

normale funzione. A tal fine si è cercato di realizzare

sistemi in grado di riprodurre uno stimolo fisico e/o

chimico che possono essere collegati in serie e parallelo

ed opportunamente sensori zzati in modo da studiare

IO l'influenza di tali stimoli sulle normali attività

cellulari e nella riproduzione dei processi metabolici di

opportuni sistemi od organi o tessuti biologici.

Allo stato attuale sono noti sistemi che riproducono o

lo stimolo pressorio, per lo studio della sulla influenza

15 sulle cellule gangliari o endoteliali; o il flusso

laminare, turbolento per simulare la permeazione dei

nutrienti attraverso la convenzione come avviene in ogni

t tessuto biologico in seguito al passaggio del flusso

sanguigno.

20 Per quanto riguarda i sistemi di coltura cellulare

isobari si conoscono due sistemi:

1) uno che studia i legami tra l'incremento della

pressione e l'apoptosi nelle cellule gangliari, ed è

costituito da una speciale camera di coltura portata a

25 pressioni elevate e monitorata da un sfigmomanometro a PI 2006 AU u u i *<i>

colonna di mercurio. L'atmosfera all'interno della camera

è costituita da una miscela al 5% di C02e la temperatura

è mantenuta costantemente a 37°C.

2) uno che studia i legami tra la variazione di

pressione ed il rilascio di endotelina 1. Tale sistema è

costituito da una piastra di coltura cellulare a 24

pozzetti, ricoperta da un foglio adesivo con cui si

sigilla il lato superiore della piastra ed in

corrispondenza di ogni pozzetto viene praticato un foro a

cui tramite una valvola presso ria connessa ad uno

sfigmomanometro viene applicata e monitorata la pressione

desiderata.

Esistono anche i cosiddetti bioreattori, che sono

composti da una camera di coltura cellulare in serie con

5 un sistema di flusso dei nutrienti.

Le applicazioni di tali bioreattori sono svariate e

vanno dallo studio di patologie o la rigenerazione di

Λ

tessuti cardio-muscolari, allo sviluppo di sostituti

funzionali epatici, alla rigenerazione ed al testing della

0 cartilagine.

I bioreattori a flusso sono stati studiati per

effettuare delle colture ad alta densità, infatti il

flusso di nutrienti che passa nel bioreattore permette una

più facile perfusione degli stessi ed una più efficace

5 rimozione dei cataboliti cellulari. Questi sistemi PI 2006 AO o 0 1 21

incrementano la velocità di crescita di mono-layer cellulare fino a confluenza da un 100% fino al 200% e ottimizzano la funzione, la morfologia e la differenziazione delle cellule.

È Stato anche messo a punto un sistema microfabbricato su wafer di silicio tramite processo fotolitografico che è in grado di riprodurre il sistema metabolico umano connettendo tra di loro 4 diversi comparti micrometrici con all'interno cellule diverse senza però tener conto sia dei reali cammini metabolici che dei tempi di reazione di un singolo composto con la cellula del comparto al fine di simulare la meglio il reale metabolismo umano,

In commercio, i vari bioreattori si differenziano fondamentalmente per le diverse tipologie delle celle di coltura:

"Rocking Culture System", costituito da una base fissa con un ripiano oscillante e una sacca di coltura in cui Λ fluisce una miscela gassosa attraverso appositi connettori sulla parte superiore della sacca. Il trasferimento di massa, e dei gas, nonché la miscelazione del terreno di coltura vengono raggiunti attraverso l'oscillazione del dispositivo di supporto. L'effetto del moto ondoso genera sulla superficie delle turbolenze, con il risultato di un notevole aumento del coefficiente di trasferimento volumetrico dei nutrienti PI 2006 AO 00 1 21

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rispetto ad una coltura statica.

"Spinner Bioreactor System" avente fiasche con palette girevoli che permettono la perfusione di ossigeno e la distribuzione dei nutrienti. Per controllare il pH e la temperatura è necessario inserire il sistema in un incubatore.

"Spinner-Air Lifted Bioreactor" che adotta un sistema per immobilizzare le cellule costituito da dischetti porosi tenuti tra loro da una parte rigida in acciaio.

- "Rotary Celi Culture System" o a parete rotante, avente

una camera cilindrica rotante che contiene una membrana cilindrica, per lo scambio dei gas, co-rotante e che svolge le funzioni di ossigenazione.

"Airlift Bioreactor", costituito da una camera molto allungata disposta in posizione verticale, nella cui parte bassa viene introdotta la miscela di gas. Il gas introdotto dal basso provoca la riduzione della densità f i •Vi del liquido contenuto all'interno del tubo. Questo

ì determina una circolazione del terreno di coltura attraverso il tubo interno verso la zona più esterna del tubo.

"Hollow-Fiber Bioreactor", avente una rete di capillari artificiali semipermeabili che, bagnati dal terreno di coltura per fenomeni diffusivi, forniscono ossigeno alle cellule, prelevando nutrienti e asportando i

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rifiuti delle vie metaboliche cellulari ed altri inibitori della crescita cellulare.

"Fiat Bed Perfusion System", consistente in una camera piatta contenente co-colture di stroma, ovvero una maglia di fibre connettivali generalmente di natura reticolare. La cella è perfusa dal terreno di coltura. "Stirred Tank". Questo dispositivo presenta un motore elettrico che mette in rotazione alcune palette di varia geometria e disposizione. Essendo molto simili 10 agli "Spinners", valgono le stesse considerazioni fatte per essi, infatti consentono coltivazioni con "microcarriers" o in sospensione. Le palette sono tenute ferme da una parte in acciaio durante la decantazione o l'utilizzo da parte dell'operatore, per 15 evitare di danneggiare le cellule o i "microcarriers".

"Micro-Cell Culture Analog" sviluppato dal gruppo di SHULER costituito da una cella di coltura microfabbricata tramite tecniche standard di litografia ed "etching" e permette di avere più microcamere in serie con colture cellulari diverse in modo da poter testare l'effetto di uno stesso farmaco su diverse cellule per studiare la sua farmacocinetica.

Il principale limite della maggior parte di questi

sterni è rappresentato dal fatto che essi non sono

tonomi, dal momento che necessitano di un incubatore per

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poter garantire all'interno della camera i valori di pH e

temperature richieste. La presenza dell'incubatore non

consente, in particolare, l'utilizzo di un calcolatore che

consentirebbe di seguire in tempo reale l'evolversi dei

parametri per poter intervenire mediante regolazioni nel

corso dell'esperimento.

Inoltre anche quei bioreattori dove non è necessaria

la presenza dell'incubatore, la struttura della cella di

coltura cellulare non permette di osservare l'esperimento

in tempo reale, mediante microscopio ottico e/o a

fluorescenza, e quindi di valutare l'evolversi dei

processi cellulari.

Inoltre non esistono bioreattori che possono essere

integrati in serie o parallelo in grado di riprodurre le

medesime funzioni di un apparato o un tessuto biologico o

di più apparati simili in parallelo in modo da riprodurre

una catena di esperimenti simili come vengono normalmente

eseguiti in laboratorio.

Attualmente non esistono bioreattori autonomi che

siano contemporaneamente capaci di mantenere e cambiare in

maniera rapida e controllata la pressione, il pH e la

temperatura all'interno di una camera di coltura, e capaci

di produrre nelle celle un flusso costante di terreno di

coltura, con possibilità di visione in tempo reale di ciò

che avviene all'interno. Inoltre nessuno dei sistemi PI 2006 A 00 0 1 21

finora disponibili prevede l'integrazione all'interno

della camera di coltura cellulare di sensori in grado di

monitorare l'evoluzione dei processi cellulari ed eseguire

analisi precise ed attente dei metaboliti e dei cataboliti

5 prodotti o consumati dalle cellule sia nel sistema globale

che nel singolo distretto, in modo da fornire informazioni

precise e puntuali.

Sintesi dell'invenzione

0 Scopo della presente invenzione è fornire un

dispositivo con la funzione di bioreattore che utilizzi

celle di coltura facilmente modellabili e conformabili in

due o tre dimensioni e che permetta l'utilizzo di

trasduttori, regolatori e sensori intergrati e per

5 monitorare in tempo reale cosa accade all'interno della

cella e/o di ogni singola cella di coltura collegata e

per regolare i parametri e gli stimoli fisico-chimici

simulando sia una condizione fisiologica che patologica e iW / A che possa essere collegato in serie e/o parallelo o loro

0 combinazioni in grado di riprodurre la fisiologia del

tessuto, dell'organo o del sistema fisiologico sotto

esame o di più di essi in parallelo. Tale invenzione

permette in pratica di simulare una batteria di

esperimenti tra di loro contemporanei come accade nei

5 normali test eseguiti su animale, dove più animali sono

sottoposti al medesimo stimolo ed analizzati in parallelo in modo da avere una statistica significativa. Ovviamente tale invenzione come si evince permette: 1) la riduzione della sperimentazione animale e della sofferenza animale in quanto vengono utilizzate solo linee cellulari 2) di poter valutare in maniera precisa cosa avviene ad ogni tipo cellulare una volta sottoposto ad uno opportuno stimolo chimico e/o fisico come accade normalmente nella normale fisiologia di tessuti, sistemi ed apparati fisiologici 3) di poter avere una statistica significativa sui dati ottenuti dagli esperimenti 4) di ridurre i costi ed i tempi sperimentali.

Altro scopo è fornire un dispositivo con la funzione di bioreattore in cui è presente un flusso di terreno di coltura che permette una riduzione dei volumi di terreno di coltura utilizzati per ogni esperimento da 10 a 30 volte rispetto agli altri dispositivi presenti in commercio, con notevole risparmio economico, sia in termini di terreni di coltura utilizzati che nell'analisi delle sostanze in esse contenute.

Ulteriore scopo della presente invenzione è fornire un bioreattore i cui mezzi per produrre un flusso di terreno nelle celle di coltura non danneggiano le cellule e gli aggregati cellulari, non avendo agitatori, gorgogliamenti di gas o altre parti meccaniche in movimento nella cella PI 2006 A0 0 0 1 2 1

di coltura.

Altro scopo della suddetta invenzione è di ricreare i

vari distretti metabolici o funzionali tramite la

connessione in serie e/o parallelo delle diverse camere

di coltura cellulare che inimicano le condizioni del

tessuto o dell'organo in esame. Ad esempio il sistema

renale sarà riprodotto tramite l'utilizzo di cellule

separate dal terreno di coltura da una membrana che

permetta la purificazione del terreno stesso dai

cataboliti prodotti dagli altri tipi cellulari a cui è

connessa la camera di coltura, utilizzando ad esempio

anche un sistema di emodialisi appositamente progettato

per essere incorporato come parte integrante del sistema

stesso .

Questi ed altri scopi sono ottenuti da un bioreattore

per il monitoraggio di attività cellulari in presenza di

stimoli fisici, chimici e meccanici, caratterizzato dal

fatto di prevedere:

una o piu celle di coltura avente un ingresso e

un'uscita e che può prevedere un sistema di sensori

integrati o meno per l'analisi in tempo reale della

vitalità e delle funzioni cellulari,-una camera di premiscelazione, separata dalla cella o

dalle celle di coltura, per la preparazione del

terreno di coltura;

- un circuito connesso a detto ingresso e detta uscita e

comprendente detta camera di premiscelazione;

mezzi per produrre un flusso controllato di terreno di

coltura attraverso detto circuito;

mezzi per produrre un controllo ed una regolazione sia

della temperatura, che del pH, della pressione e di

tutti gli stimoli fisico-chimici che si desideri

applicare alle cellule sotto esame;

- un software appositamente sviluppato, che tramite

un'interfaccia grafica facile da gestire da ogni

utente permetta di settare sia i parametri

dell'esperimento che di visionare in tempo reale ciò

che accade alle cellule.

In tal modo è permessa un'analisi in tempo reale di ciò

che avviene all'interno di una o più celle di coltura

senza aver bisogno di utilizzare in incubatore in cui

allocare la cella di coltura.

In particolare, detta cella di coltura con uno o più

\ camere disposte in serie o parallelo o loro combinazioni

sia bidimensionali che tridimensionali è realizzata in

materiale siliconico con forme che producono un flusso

laminare del terreno di coltura a seconda degli scopi

previsti e può essere di volta in volta ridisegnata

tramite l'utilizzo di software per la progettazione

meccanica

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Preferibilmente detta cella è realizzata in almeno due parti sovrapponibili delle quali almeno una presenta una concavità in modo tale che una volta sovrapposte fornisca un passaggio per il terreno di coltura.

Vantaggiosamente, lungo detto passaggio per il terreno di coltura, almeno una di dette parti sovrapponibili può essere realizzata con materiale trasparente disposto in una zona che operativamente permette l'osservazione mediante microscopio delle cellule impiantate su di esso.

Vantaggiosamente dette due parti sovrapponibili possono essere premute reciprocamente per l'azione di due piastre rigide tenute insieme da mezzi di accoppiamento rimovibile .

Preferibilmente, detti mezzi per produrre un flusso controllato di terreno di coltura attraverso detta cella di coltura comprendono:

un condotto in ingresso e in uscita da detta cella di coltura, a formare un circuito chiuso con la camera di premiscelazione separata;

una pompa peristaltica installata lungo tale condotto;

uno più punti di immissione di eventuali farmaci o altre sostanze che potenzino o inibiscano le attività cellulari a monte della cella di coltura;

uno o più punti di prelievo a valle della cella di coltura per effettuarne analisi;

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un sensore di temperatura a monte della cella.

In particolare detta camera di premiscelazione comprende:

- un contenitore in materiale inerte;

- un tappo in materiale inerte;

- mezzi per misurare operativamente i parametri fisiologici del terreno di coltura.

Vantaggiosamente i mezzi per misurare operativamente i parametri fisiologici del terreno di coltura possono comprendere :

un sensore di pH immerso nel terreno di coltura presente in detta camera di premiscelazione;

un sensore di pressione per la misurazione all'interno di detta camera di premiscelazione;

- sensori per la misura di specie chimiche come 02, C02, NO, etc.

Vantaggiosamente la topologia interna della camera di premiscelazione è progettata in modo che il posizionamento del sensore di pH sia tale da preservarlo dal contatto diretto con le eventuali bolle di gas immesse all'interno di detta camera di premiscelazione per equilibrare il terreno di coltura e mantenerlo a pH desiderato

Preferibilmente, i mezzi per variare operativamente i parametri fisiologici del terreno di coltura possono comprendere :

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condotti di immissione/fuoriuscita di gas, ad esempio aria e C02, in/da detta camera di premiscelazione per variarne il pH e la pressione;

flusso di fluido termostatato in un condotto che avvolge detta camera di premiscelazione, per variarne la temperatura.

Preferibilmente, i mezzi per monitorare e controllare gli stimoli fisico-chimici applicati alle cellule nella camera di coltura comprendono:

-sensore ottico per la rilevazione di bolle all'interno della camera di coltura cellulare;

-sensori per la rilevazione di deformazione e sforzi meccanici;

-biosensori integrati e microfabbricati che permettono di monitorare il rilascio o il consumo di biomolecole di interesse;

-sistemi per 1'applicazioni di stimoli elettrici e/o meccanici .

Vantaggiosamente, più celle di coltura possono essere collegate reciprocamente tramite condotti più o meno lunghi, in serie o in parallelo, a simulare il comportamento di organi biologici anche complessi, in modo che le cellule contenute nelle celle a monte producano metaboliti che, trasportati dal terreno di coltura, fungono da alimento per le cellule contenute nelle celle a

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valle . v Vantaggiosamente più celle collegate reciprocamente possono essere integrate su un unico supporto miniaturizzato, realizzato ad esempio in materiale rigido, formando un circuito per il flusso di terreno di coltura

che alimenta, in modo e in sequenza predeterminati, tutte

le celle di coltura.

Vantaggiosamente, detto supporto in materiale rigido è ottenuto tramite un processo di microformatura, per esempio per fotolitografia e/o elettroerosione.

Vantaggiosamente detto supporto chiude le celle e i condotti con almeno un vetrino in materiale trasparente, permettendo l'osservazione, tramite microscopio, dello sviluppo delle cellule contenute nelle celle.

Vantaggiosamente, detti condotti di immissione e fuoriuscita di gas in/da detta camera di premiscelazione, possono essere azionati da elettrovalvole comandate da una

Λ/V centralina elettrica di comando. j j<J>l Preferibilmente, il bioreattore utilizza una centralina elettronica di amplificazione e filtraggio dei segnali elettrici provenienti dai sensori per misurare detti parametri fisiologici del terreno di coltura, nonché per il comando delle elettrovalvole.

In particolare, il bioreattore utilizza un software per il controllo e gestione dei segnali scambiati che

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permettono di visionare in tempo reale cosa avviene

cella di coltura e variare i parametri a seconda delle specifiche volute.

Tali sistemi possono essere anche immessi all'interno di un incubatore, in tal caso il mantenimento dei parametri fisiologici quali pH e temperatura sono svolti dall 'incubatore stesso senza controllo da parte dell 'operatore.

Breve descrizione dei disegni.

L'invenzione verrà di seguito illustrata con la descrizione di alcune sue forme realizzative, fatte a titolo esemplificativo e non limitativo, con riferimento ai disegni annessi in cui:

la figura 1 mostra il bioreattore High-throughput completo dei dispositivi ad esso collegati per misurare e variare dall'esterno tutti i parametri,ΛΛ biologici e fisici di interesse;

la figura 2 mostra una cella di coltura con sensori integrati al suo interno;

la figura 3 mostra una cella di coltura tridimensionale;

la figura 4 mostra una cella di coltura che simula il sistema di emodialisi appositamente progettata per essere integrata con altre celle di coltura collegate PI2006 A 0 0 0 1 21

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ad essa in serie o parallelo;

Descrizione delle forme realizzative preferite.

Nella figura 1 è mostrato il sistema High-throughput completo dei dispositivi ad esso collegati per misurare e variare dall'esterno tutti i parametri biologici e fisici

di interesse.

In particolare, il dispositivo utilizza tante camere

di premiscelamento 1 sensorizzate quante sono le celle di coltura 2 connesse al sistema.

La camera di miscelazione ha il compito di preparare

il terreno di coltura che serve per alimentare le cellule

in fase di studio, regolandone il pH e la temperatura nel range fissato per l'esperimento. I segnali in uscita dai sensori vengono trasmessi ad una centralina 3 di amplificazione, filtraggio dei segnali ed attivazione delle elettrovalvole che regolano l'immissione di ossigeno

e anidride carbonica nella camera di premiscelamento.

Il terreno di coltura viene prelevato dalla camera di

y premiscelamento e il suo flusso è regolato tramite una pompa peristaltica 4. Il terreno attraversa poi la cella

di coltura 2 e continua il suo percorso nel condotto 5, tornando nella cella di premiscelamento. In uscita da ogni cella o in più punti di essa il condotto presenta un punto

di prelievo 6 che permette di prelevare una quantità di terreno di coltura per effettuarne l'analisi.

riscaldamento per mantenere la temperatura nel range fisiologico dell'esperimento.

La camera di premiscelamento presenta anche un sistema di sensori 7 per la rilevazione del pH, della temperatura, della pressione, ed un sistema di controllo per l'immissione e la uscita del gas, anch'esso controllato dalla stessa centralina 3, che permette di mantenere i parametri all'interno del bioreattore costante pari a quelli impostati via software.

Per ogni cella di coltura 2 esiste una corrispondente camera di miscelazione 1.

Il sistema può anche non essere dotato di centralina e sistema di riscaldamento allorquando viene posto all'interno dell'incubatore.

Il sistema può essere controllato tramite PC 8 se /ΥΛ posto fuori da incubatore o no.

La figura 2 mostra una cella sensorizzata 2 dove al suo interno sono presenti sia sensori fisici 9 che sensori chimici 10 che possono essere ottenuti tramite tecniche di macro-, micro o nanofabbricazione. Tali sensori tramite opportuni cavi 11 sono connessi alla centralina 3 interfacciata con un computer 8 per l'acquisizione, l'elaborazione dei dati da loro forniti ed eventualmente l'impostazione delle azioni di controllo tramite la centralina 3 suddetta o l'immissione di particolari stimoli fisici o chimici all'interno della camera di coltura 1. I sensori suddetti possono anche svolgere funzione di trasduttori di stimoli fisici o chimici.

La figura 3 mostra un esempio di bioreattore tridimensionale 12 dove ogni cella del bioreattore 13 è assemblata secondo un percorso ben definito dai tubi di collegamento 14 attraverso cui fluisce il terreno di coltura. Tale percorso è ottimizzato in modo da riprodurre i tempi fisiologici tipici dei flussi di nutrienti tra i diversi tessuti in esame.

La figura 4 mostra una cella di coltura 2 che è interfacciata con una camera 15 per la filtrazione del terreno di coltura al fine di estrarre da questo sia metaboliti o cataboliti importanti per l'analisi delle cellule poste in coltura sia per replicare la funzione filtrante del sistema renale al fine di simulare il più fedelmente possibile il sistema metabolico naturale.

La descrizione di cui sopra di una forma esecutiva specifica è in grado di mostrare l'invenzione dal punto di vista concettuale in modo che altri, utilizzando la tecnica nota, potranno modificare e/o adattare in varie applicazioni tale forma esecutiva specifica senza ulteriori ricerche e senza allontanarsi dal concetto inventivo, e, quindi, si intende che tali adattamenti e PI2006 A0 0 0 1 21

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modifiche saranno considerabili come equivalenti

forma esecutiva esemplificata. I mezzi e i materiali per realizzare le varie funzioni descritte potranno essere di varia natura senza per questo uscire dall'ambito dell'invenzione. Si intende che le espressioni o la terminologia utilizzate hanno scopo puramente descrittivo e per questo non limitativo.

RIVENDICAZIONI

1. Sistema di bioreattori dalle diverse forme e topologie connessi in serie e/o in parallelo per il monitoraggio di attività cellulari in presenza di stimoli fisici, chimici e meccanici, in grado di simulare uno o più esperimenti in-vivo e con la possibilità di acquisire informazioni su diversi parametri fisiologici in tempo reale.

La caratteristica di tale invenzione è di prevedere:

una o più cella di coltura collegate in serie e/o parallelo avente un ingresso e un'uscita;

una camera di premiscelazione per ogni cella di coltura presente, per la preparazione del terreno di coltura;

un circuito connesso agli ingressi ed alle uscite e comprendente le camere di miscelazione;

Claims (1)

1. PI2006 A0 0 0 1 21 21

   modifiche saranno considerabili come equivalenti forma esecutiva esemplificata. I mezzi e i materiali per realizzare le varie funzioni descritte potranno essere di varia natura senza per questo uscire dall'ambito dell'invenzione. Si intende che le espressioni o la terminologia utilizzate hanno scopo puramente descrittivo e per questo non limitativo. RIVENDICAZIONI 1. Sistema di bioreattori dalle diverse forme e topologie connessi in serie e/o in parallelo per il monitoraggio di attività cellulari in presenza di stimoli fisici, chimici e meccanici, in grado di simulare uno o più esperimenti in-vivo e con la possibilità di acquisire informazioni su diversi parametri fisiologici in tempo reale. La caratteristica di tale invenzione è di prevedere: una o più cella di coltura collegate in serie e/o parallelo avente un ingresso e un'uscita; una camera di premiscelazione per ogni cella di coltura presente, per la preparazione del terreno di coltura; un circuito connesso agli ingressi ed alle uscite e comprendente le camere di miscelazione; I 2006 A 0 00 1 21 22

   mezzi per produrre un flusso controllato di terreno di coltura attraverso detto circuito; mezzi per produrre almeno uno o anche combinazioni di più stimoli fisici-chimici che si desideri applicare alle cellule sotto esame; mezzi di controllo di detti mezzi per produrre almeno uno o combinazione di più stimoli fisici-chimici,affinché detto o ciascuno stimolo assuma valori prederteminati; mezzi per la sensorizzazione della cella di coltura; mezzi per la riproduzione del sistema filtrante del sistema fisiologico naturale; almeno una cella che presenti un allocazione tridimensionale delle cellule in coltura in uno o più compartimenti collegati in serie e/o in parallelo al fine di riprodurre la topologia del sistema metabolico naturale ; 2. Sistema di Bioreattori per il monitoraggio di attività \ cellulari, secondo la rivendicazione 1, in cui detta cella di coltura è realizzata in materiale siliconico o similare con forme tali da riprodurre la fluidodinamica del distretto fisiologico o dell'apparato sotto esame col terreno di coltura. 3. Sistema di Bioreattori per il monitoraggio di attività cellulari, secondo al rivendicazione 1, in cui detta cella di coltura è realizzata in almeno due parti sovrapponibili PI2006 AO 00 1 21 23

   delle quali almeno una presenta una concavità in modo tale che una volta sovrapposte fornisca un passaggio per il terreno di coltura. 4. Sistema di Bioreattori per il monitoraggio di attività cellulari, secondo la rivendicazione 3, in cui dette due parti sovrapponibili possono essere premute reciprocamente per l'azione di due piastre rigide tenute insieme da mezzi di accoppiamento rimovibile. 5. Sistema di Bioreattori per il monitoraggio di attività cellulari, secondo la rivendicazione 1, in cui detti mezzi per produrre un flusso controllato di terreno di coltura attraverso ogni singola cella comprendono: - un condotto in ingresso e in uscita da detta cella di coltura, a formare un circuito chiuso con la camera di premiscelazione separata; - una pompa peristaltica installata lungo tale condotto; - un punto di immissione di eventuali farmaci o altre sostanze che potenzino o inibiscano le attività cellulari a monte di ogni cella di coltura; - un punto di prelievo a valle della cella di coltura per effettuarne analisi; - una camera di premiscelazione per il condizionamento del terreno di coltura e per la misura ed il controllo di parametri fisiologici quali pH, pressione, temperatura, etc. PI 2006 A0 0 0 1 21

   6. Sistema di Bioreattori per il monitoraggio di attività cellulari, secondo la rivendicazione 1, in cui detta cella di coltura può inoltre prevedere: - un sistema di sensori fisici e/o chimici realizzati con tecniche di macro-, micro- e nanofabbricazione integrati in detta camera per il monitoraggio di parametri fisiologici e/o metabolici; e/o un sistema di trasduttori fisici e/o chimici realizzati con tecniche di macro-, micro- e nanofabbricazione integrati in detta camera per l'applicazione di stimoli fisici e/o chimici; 7. Sistema di Bioreattori per il monitoraggio di attività cellulari, secondo la rivendicazione 1, in cui detta cella di coltura può inoltre presentare geometria tridimensionale al fine di riprodurre la topologia del distretto fisiologico sotto esame o della specie animale di cui si vuole mimare la fisiologia,con alloggiamenti interni connessi tra loro in serie o in parallelo per l'alloggiamento dei diversi tipi cellulari e con la presenza di punti di prelievo del terreno per la sua analisi. 8. Sistema di Bioreattori per il monitoraggio di attività cellulari, secondo la rivendicazione 1, in cui detta cella di coltura può essere collegata in serie a detta cella di coltura per svolgere funzione di filtraggio del terreno di PI2006 AO 00 1 21 25 coltura come avviene nel normale sistema fisiolog

   renale. 9. Sistema di Bioreattori per il monitoraggio di attività cellulari, secondo la rivendicazione 1, in cui detta cella di coltura può svolgere la sua attività sia in un incubatore che all'esterno di esso tramite un'opportuna centralina di controllo o una scheda elettronica che può controllare il sistema e mantenere i parametri fisiologici nel range desiderato.