ITPI20070001A1 - Bioreattore high throughput per l'ingegnerizzazione e lo studio della risposta a stimoli chimico-fisici di condotti vascolari - Google Patents

Description

Descrizione dell'invenzione industriale dal titolo: "BIOREATTORE HIGH THROUGHPUT PER L'INGEGNERIZZAZIONE E LO STUDIO DELLA RISPOSTA A STIMOLI CHIMICO-FISICI DI CONDOTTI VASCOLARI",

DESCRIZIONE

Ambito dell'invenzione.

La presente invenzione riguarda un dispositivo bioreattore high throughput sensorizzato, che può essere posto in serie e/o parallelo a sistemi analoghi, tramite cui sottoporre condotti vascolari di diverse dimensioni a stimoli chimico-fisici, meccanici ed elettromagnetici, simulando condizioni fisiologiche e patologiche presenti all'interno di un organismo.

Le applicazioni di tale dispositivo riguardano vari settori tra cui: l'Ingegneria Tessutale per il "remodelling" guidato di vasi sanguigni e per lo sviluppo di costrutti biologici; l'industria farmaceutica per il "testing" di nuovi medicinali; l'area medica per lo studio, la diagnosi e cura di patologie.

Descrizione della tecnica nota.

È noto che gli stimoli fisici e chimici a cui è sottoposto ogni tessuto o sistema biologico determinano il suo stato patologico e fisiologico.

In particolare numerosi studi hanno mostrato che l'ambiente meccanico influenza profondamente dimensioni, la struttura e 1'ultrastruttura dei vasi sanguigni: variazioni croniche degli sforzi meccanici portano al "remodelling" della parete vasale.

Ad esempio, è noto che un aumento brusco della pressione transmurale porta al cosiddetto "effetto miogenico" (diminuzione del lume delle arteriole}, o che l'aumento dello shear stress alla parete porta alla vasodilatazione. Questi sono alcuni dei meccanismi di controllo periferico della circolazione sanguina e sono il risultato di una serie di complesse cascate di reazioni biochimiche tramite le quali le cellule della parete vasale trasducono un segnale meccanico in uno chimico (con produzione, ad esempio, di sostanze vasoattive), e/o in uno elettromeccanico (ad esempio, le reazioni di eccitazione-contrazioni delle cellule muscolari).

Estremamente complessi e non ancora completamente noti sono i meccanismi di remodelling vascolare (ad esempio l'iperplasia dell'intima) poiché, alla difficoltà di ricostruzione delle reazioni biochimiche, si aggiunge la complicata interdipendenza tra le componenti dell'ambiente meccanico in-vivo che ostacola l'identificazione dello stimolo specifico responsabile di una determinata forma di rimodellamento .

Per riprodurre tali stimoli nelle colture cellulari, sono stati sviluppati i bioreattori, dispositivi in grado di simulare l'ambiente meccano-biologico presente all'interno di un organismo.

Dispositivi come il "Fiat Bed Perfusion System" o il "Bioreattore a flusso laminare" consentono, ad esempio, di sottoporre le cellule endoteliali allo sforzo di taglio dovuto allo shear rate del mezzo di perfusione, ma estrapolare risultati da modelli di coltura cellulare per il rimodellamento vascolare è risultato essere problematico.

Sono stati quindi sviluppati sistemi per la coltura di vasi sanguigni intatti. Pur riproducendo un ben definito ambiente biochimico, inizialmente tali dispositivi portavano ad un rimodellamento patologico della parete vasale (ad esempio, lo sviluppo di una placca ateriosclerotica), poiché i vasi sanguigni non erano soggetti ad alcuno degli sforzi presenti all'interno dell'organismo; i segmenti vascolari erano quindi soggetti ad una coltura "statica". La comprensione dell'importanza dell'ambiente meccanico ha portato allo sviluppo di bioreattori per la coltura di vasi sanguigni che ricostruiscono l'ambiente fisiologico.

Il primo, rudimentale, tentativo fu realizzato da Porter (1996} che fissò un segmento venoso sezionato longitudinalmente all'interno di un tubo di silicone perfuso. Sono, quindi, seguiti numerosi passi in avanti (sistemi a flusso pulsatile, a flessione ciclica (Vorpl sistemi per riprodurre la pressione transmurale (Chesley)) fino ad arrivare al sistema sviluppato da Clerin et al. (# patent US 7,011,623 B2). Tale sistema in particolare consente di sottoporre il vaso sanguigno sotto coltura a sforzi di trazione, di pressione transmurale e di shear, e di monitorare in tempo reale i valori di pressione e deformazione tramite sensori. Purtroppo tale sistema, che consente un remodelling guidato dei vasi sanguigni, risulta sia dipendente da un incubatore sia di difficile gestione. Nessuno dei sistemi di condizionamento meccanico risulta controllabile da PC e i programmi di gestione dei sensori sono quelli forniti dalle aziende produttrici. Inoltre i volumi dei terreni di coltura e perfusione sono enormi e incompatibili con analisi in tempo reale mediante sensori chimici e biochimici, peraltro assenti. Infine l'utilizzo di cannule metalliche all'interno della camera di coltura può inficiare i risultati se i tempi sperimentali sono lunghi (maggiori di 20 gg).

In generale, quindi, non esiste un dispositivo per la coltura e la perfusione di segmenti vascolari intatti autonomo, cioè indipendente da un incubatore che garantisce, all'interno della camera, i valori di pH e temperature richiesti. La presenza dell'incubatore non consente, in particolare, la gestione e il monitoraggio tempo reale tramite calcolatore dei parametri sperimentali.

Non esiste, ad oggi, un bioreattore per vasi sanguigni la cui struttura della cella di coltura permetta di osservare l'esperimento in tempo reale mediante microscopio ottico e/o a fluorescenza, e quindi di valutare l'evolversi dei processi delle cellule della parete vasale.

Nessun dispositivo inoltre consente un controllo elettronico degli stimoli meccanici che simulano l'ambiente biologico, né sono previsti dispositivi per stimolazioni elettromagnetiche, né si riscontra, in alcun dispositivo, la presenza, all'interno della camera di coltura e perfusione, di sensori in grado di eseguire analisi precise ed attente dei metaboliti prodotti o consumati dalle cellule, in modo da fornire informazioni precise e puntuali.

Sintesi dell'invenzione

Scopo della presente invenzione è fornire un dispositivo con la funzione di bioreattore per la coltura e la perfusione di segmenti vascolari di vario calibro, autonomo da un incubatore (free-standing), con volumi di terreno di coltura contenuti, le cui camere di coltura sono realizzate con materiale biocompatibile e facilmente sterilizzabile . All'interno di tali camere i vasi<'>, sanguigni perfusi potranno essere sottoposti a diversi ambienti fisiopatologici simulati mediante stimoli fisici, chimici, meccanici ed elettromagnetici . Tali stimoli saranno prodotti da una serie di dispositivi, presenti nella camera di coltura o lungo il circuito di perfusione, controllati da un PC, tramite un software appositamente creato. Inoltre, lo stato dell'esperimento in corso all'interno di guesto nuovo dispositivo bioreattore potrà essere controllato in tempo reale tramite opportuni sensori chimico-fisici presenti all'interno della camera di coltura e nel circuito di perfusione. Questi sensori saranno gestiti dal medesimo software citato sopra.

Le celle di coltura di tale sistema potranno essere collegate tra loro in serie e/o parallelo, o loro combinazioni, riproducendo la fisiologia di un tratto dell'albero vascolare.

Tale invenzione permette inoltre di simulare una batteria di esperimenti in contemporanea (high throghput) Tale caratteristica, come si evince, permette: 1) di ridurre la sperimentazione e la sofferenza animale in quanto dal sacrificio di un solo esemplare posso essere ricavati numerosi segmenti vascolari, 2) di valutare, in maniera precisa, i processi biologici cha avvengono nella parete vasale sottoposta ad opportuni stimoli chimico-fisici che ricreano le condizioni presenti in-vivo, 3) di ridurre costi e tempi sperimentali.

La minimizzazione dei volumi di terreno di coltura, sia di alloggiamento che di perfusione del vaso sanguigno, che caratterizza tale dispositivo consente di eseguire analisi biochimiche senza costose procedure di concentrazione delle soluzioni, garantendo inoltre un vantaggio economico anche in termini di terreno di coltura utilizzato. La presenza di volumi ridotti consente inoltre l'utilizzo di sensori per le molecole di interesse biochimico che solitamente si presentano in concentrazioni bassissime.

Ulteriore scopo della presente invenzione è fornire un bioreattore che produca inoltre un ricircolo del terreno di alloggiamento. Tale ricircolo sarà estremamente lento per non sottoporre gli strati esterni della parete vasale a sforzi non fisiologici, ma al contempo consentirà di ossigenare ed eventualmente cambiare lo stesso evitando la presenza di schiume all'interno delle celle di coltura .

Altro scopo della suddetta invenzione è di guidare il "remodelling" dei segmenti vascolari sottoponendoli a opportuni stimoli (chimici, biochimici, meccanici, elettromagnetici, ecc.). Tale vaso sanguigno si dirà quindi ingegnerizzato e sarà pronto ad una eventuale<'>istallazione in-vivo poiché le sue nuove proprietà meccaniche consentiranno ad esso di sostituire adeguatamente il segmento vascolare malato, anche in un distretto diverso da quello di origine.

Inoltre tale invenzione potrà essere sfruttata come ambiente dinamico ideale in cui poter sviluppare costrutti vascolari a partire da colture cellulari, secondo i principi dell'Ingegneria Tissutale.

Ad oggi tali costrutti, poiché costruiti in ambiente statico, risultano avere proprietà meccaniche insufficienti rispetto ai vasi sanguigni naturali. Importanti sono infine le possibilità offerte da questo nuovo bioreattore per lo studio della fisiologia e della patologia del sistema vascolare grazie alla presenza di biosensori mediante i quali valutare, istante per istante, le concentrazioni delle biomolecole di interesse .

Questi ed altri scopi sono ottenuti da un bioreattore per il monitoraggio dell'attività del tessuto vascolare in presenza di stimoli fisici, chimici e meccanici. Tale bioreattore è caratterizzato dal fatto di prevedere:

- una o più celle di coltura aventi un ingresso e un'uscita per il terreno di perfusione del vaso sanguigno, e un ingresso e un'uscita, distinte dalle precedenti, per un eventuale ricircolo lento e/ o prelievo del terreno di alloggiamento, e che possono prevedere un sistema di sensori integrati o meno per l'analisi in tempo reale della vitalità del tessuto vascolare;

- una camera di premiscelazione, separata dalla/e cella/e di coltura, per la preparazione del terreno di coltura;

- un circuito di perfusione connesso alle suddette porte di ingresso e uscita e comprendente la suddetta camera di premiscelazione;

- mezzi per produrre un flusso controllato di terreno di coltura attraverso il suddetto circuito;

- mezzi per il controllo ed la regolazione della temperatura, del pH, della pressione e di tutti gli stimoli fisico-chimici che si desiderano applicare al vaso sanguigno sotto esame;

- un software appositamente sviluppato che, tramite un'interfaccia grafica facile da gestire da ogni utente, permetta di settare e modificare i parametri dell'esperimento e di visionare in tempo reale il comportamento del segmento vascolare.

In caso di presenza di ricircolo lento del terreno di alloggiamento sarà previsto un apposito circuito dotato sia di un'apposita camera di miscelazione, simile alla camera di miscelazione sopra descritta, sia di mezzi per produrre un flusso controllato di terreno di coltura.

In particolare, la suddetta cella di coltura, collegabile con altre camere analoghe, disposte in serie o parallelo in configurazioni sia bidimensionali che tridimensionali, è realizzata in materiale siliconico seguendo geometrie opportune che garantiscono tutte le caratteristiche suddette e che possono essere di volta in volta ridisegnate tramite l'utilizzo di software per la progettazione meccanica.

Preferibilmente detta cella è realizzata in almeno due parti sovrapponibili delle quali almeno una presenta una concavità che consente, una volta sovrapposte le due parti, l'alloggiamento del vaso sanguigno. La suddetta cella può presentare nella sua parte superiore un vetrino inglobato all'interno della matrice siliconica che permette di monitorare in tempo reale l'evoluzione dell'esperimento tramite microscopio (ottico a fluorescenza, etc.) o connessione ad un sistema digitale di acquisizione delle immagini.

All'interno della suddetta camera di coltura e perfusione il vaso sanguigno sarà incannulato a connettori in materiale plastico e fissato o con fascette in materiale plastico, opportunamente realizzate, o con del filo chirurgico. I suddetti connettori collegano il segmento vascolare al circuito di perfusione.

In maniera vantaggiosa, almeno una di dette parti sovrapponibili può essere realizzata con materiale trasparente disposto in una zona che operativamente permette l'osservazione, mediante microscopio, delle cellule della parete vasale.

Le suddette due parti sovrapponibili possono essere premute reciprocamente tramite l'azione di due piastre rigide tenute insieme da mezzi di accoppiamento rimovibile.

Preferibilmente, i suddetti mezzi per produrre un flusso controllato di terreno di perfusione attraverso la/le suddetta/e cella/e di coltura comprendono:

- un condotto in ingresso e in uscita dalla cella di coltura suddetta, in modo da formare un circuito chiuso con la camera di premiscelazione separata;

- una pompa peristaltica installata lungo tale condotto; - un sistema di sviluppo di pressione nel circuito di perfusione (elettronico, o anche tramite elevatore graduato);

- uno più punti di immissione di eventuali farmaci o altre sostanze che potenzino o inibiscano le attività delle cellule della parete vasale a monte della cella di coltura;

uno o più punti di prelievo a valle della cella di coltura per effettuarne analisi;

- un sensore di temperatura a monte della cella.

In particolare la suddetta camera di premiscelazione comprende:

- un contenitore in materiale inerte;

- un tappo in materiale inerte;

- mezzi per misurare e variare operativamente i parametri fisiologici del terreno di coltura.

In maniera vantaggiosa, i mezzi per misurare operativamente i parametri fisiologici del terreno di coltura possono comprendere:

- un sensore di pH immerso nel terreno di coltura presente nella suddetta camera di premiscelazione;

- un sensore di pressione per la misurazione all'interno della suddetta camera di premiscelazione;

- sensori per la misura di specie chimiche come 02, C02, NO, etc.

La topologia interna della camera di premiscelazione è progettata in modo che il posizionamento del sensore di pH sia tale da preservarlo dal contatto diretto con le eventuali bolle di gas immesse all'interno della suddetta camera di premiscelazione per equilibrare il terreno di coltura e mantenerlo a pH desiderato.

Preferibilmente, i mezzi per variare operativamente i parametri fisiologici del terreno di coltura possono comprendere:

- un flusso di fluido termostatato in un condotto che avvolge detta camera di premiscelazione, o sistemi di riscaldamento basati su celle Peltier o resistenze in Kapton collegati e controllati da un regolatore elettronico di temperatura, per variarne la temperatura,

- condotti di immissione/fuoriuscita di gas, ad esempio aria e C02, in/da detta camera di premiscelazione per variarne il pH e la pressione.

I maniera vantaggiosa, i suddetti condotti di immissione e fuoriuscita di gas della suddetta camera di premiscelazione possono essere azionati da elettrovalvole comandate da una centralina elettrica di comando.

Preferibilmente, i mezzi per monitorare e variare gli stimoli fisico-chimici applicati al condotto vascolare nella camera di coltura comprendono:

- sensore ottico per monitorare lo spessore della parete vasale;

- sensori per la rilevazione di deformazione e sforzi meccanici;

- biosensori integrati e microfabbricati che permettono di monitorare il rilascio o il consumo di biomolecole di interesse;

- sistemi per 1'applicazioni di stimoli elettrici e/o meccanici (ad esempio, trasduttori per la trazione del vaso sanguigno).

Preferibilmente, il bioreattore utilizza una centralina elettronica di amplificazione e filtraggio dei segnali elettrici provenienti dai sensori per misurare detti parametri fisiologici del terreno di coltura, nonché per il comando delle elettrovalvole, e l'applicazione dei vari stimoli elettrici e/o meccanici.

In particolare, il suddetto sistema è interiacciato con un PC, tramite cui è possibile utilizzare un apposito software per il controllo e gestione dei segnali scambiati. Tramite tale software è possibile effettuare la gestione del bioreattore e controllare in tempo reale cosa avviene nella cella di coltura variando i parametri secondo le specifiche volute.

Tali sistemi possono essere anche immessi all'interno di un incubatore, in tal caso il mantenimento dei parametri fisiologici quali pH e temperatura sono svolti dall'incubatore stesso senza controllo da parte dell'operatore.

Breve descrizione dei disegni.

L'invenzione verrà di seguito illustrata con la descrizione di alcune sue forme realizzative, fatte a titolo esemplificativo e non limitativo, con riferimento ai disegni annessi in cui:

- la figura 1 mostra il bioreattore high-throughput completo dei dispositivi ad esso collegati per misurare e variare dall'esterno tutti i parametri biologici e fisici di interesse;

- la figura 2 mostra una cella di coltura montata e inserita tra due piastre di materiale rigido;

- la figura 3 mostra un'esploso di una cella di coltura:

sono messi in evidenza i sensori fisici e chimici e i dispositivi per riprodurre ambienti e condizioni fisiologici e patologici.

Descrizione delle forme realizzative preferite.

Nella figura 1 è mostrato il sistema high-throughput completo dei dispositivi ad esso collegati per misurare e variare dall'esterno tutti i parametri biologici e fisici di interesse.

In particolare, il dispositivo utilizza per ogni camera di coltura 1 una camera di miscelazione 2.

La camera di miscelazione ha il compito di preparare il terreno di coltura che serve per alimentare le cellule del vaso sanguigno in fase di studio, regolandone il pH e la temperatura, misurati tramite opportuni sensori 3, nel range fissato per l'esperimento. La regolazione della temperatura avviene tramite uno scambiatore di calore, mentre la regolazione del pH e della pressione parziale di ossigeno e di anidride carbonica, misurate anch'esse tramite il sistema di sensori 3, viene effettuata grazie. ad un sistema di controllo, tramite elettrovalvole, per l'immissione e la uscita dei gas. I segnali in uscita dai sensori per la misura delle grandezze di interesse sperimentale vengono trasmessi ad una centralina 4 di amplificazione, filtraggio dei segnali. Tale centralina 4 controlla anche i segnali di attivazione delle suddette elettrovalvole e delle applicazioni dei diversi stimoli elettrici e/o meccanici. Il terreno di coltura viene prelevato dalla camera di miscelazione 2 e il suo flusso attraverso i condotti di connessione 5 è regolato tramite una o più pompe peristaltiche 6 a seconda del numero di celle 1 presenti. Il terreno attraversa la cella di coltura 1 e continua il suo percorso tornando nella camera di miscelazione 2. Il sistema di condotti 5 presenta uno o più punti di prelievo 7 che permettono di prelevare campioni di terreno di coltura per effettuarne l'analisi, e un dispositivo 8 per lo sviluppo dello stimolo di pressione transmurale per il condizionamento del vaso sanguigno sotto esame. Tale dispositivo, opportunamente sensorizzato, è collegato alla centralina 4. In assenza di tale dispositivo lo stimolo di pressione transmurale potrà essere generato variando l'altezza relativa tra la pompa peristaltica 6 e la camera di coltura 1, secondo le leggi elementari dell'idrostatica, tramite un opportuno elevatore graduato, non presente in figura.

Se presente, il circuito di ricircolo lento del terreno di alloggiamento prevede una pompa peristaltica 9, una camera di miscelazione 2 con il sistema di sensori 3. Il collegamento di tali sensori alla centralina 4 non è presente in figura per chiarezza espositiva. Anche in questo circuito è presente un sistema di prelievo 7.

Il sistema può anche non essere dotato di centralina e sistema di riscaldamento se posto all'interno dell'incubatore.

La gestione dell'intero sistema, se posto fuori dall'incubatore, può essere effettuata tramite PC 8, collegato alla centralina 4.

In accordo con la figura 2 cella di coltura 1 può essere inserita tra due piastre di materiale rigido 11. Nella stessa figura sono visibili le porte 12 di ingresso/uscita per il circuito di perfusione e le porte 13 di ingresso/uscita per il circuito di ricircolo lento del terreno di alloggiamento.

La figura 3 mostra le due parti sovrapponibili 14 15 di una cella sensorizzata 1 dove sono presenti sia sensori fisici 16, 17, 18 che sensori chimici 19 che possono essere ottenuti tramite tecniche di macro-, micro o nanofabbricazione . I sensori suddetti possono anche svolgere di trasduttori di stimoli fisici o chimici. Tali sensori tramite opportuni cavi 20 sono connessi centralina 4, che è interfacciata ad un computer 10 per l'acquisizione e 1'eleborazione dei dati da loro forniti. Sulla base di tali dati potranno essere impostate ed eseguite delle azioni di controllo sui trasduttori, anche automatizzate, tramite computer 10 e la centralina 4.

La descrizione di cui sopra di una forma esecutiva specifica è in grado di mostrare l'invenzione dal punto di vista concettuale in modo che altri, utilizzando la tecnica nota, potranno modificare e/o adattare in varie applicazioni tale forma esecutiva specifica senza ulteriori ricerche e senza allontanarsi dal concetto inventivo, e, quindi, si intende che tali adattamenti e modifiche saranno considerabili come equivalenti della forma esecutiva esemplificata. I mezzi e i materiali per realizzare le varie funzioni descritte potranno essere di varia natura senza per questo uscire dall'ambito dell'invenzione. Si intende che le espressioni o la terminologia utilizzate hanno scopo puramente descrittivo e per questo non limitativo.

Claims (6)

1. RIVENDICAZIONI 1. Sistema bioreattore, con celle di diverse forme e topologie, connesse in serie e/o in parallelo, per il monitoraggio, studio, e 1'ingegnerizzazione di condotti vascolari grazie alla presenza di stimoli fisici, chimici e meccanici, in grado di simulare condizioni fisiologiche e patologiche presenti in-vivo e di effettuare più esperimenti contemporaneamente, con la possibilità di acquisire informazioni su diversi parametri fisiologici in tempo reale. La caratteristica di tale invenzione è di prevedere: una o più cella di coltura collegate in serie e/o parallelo aventi un ingresso e un'uscita per il terreno di perfusione, ed un ingresso e una uscita per il terreno di alloggiamento; una camera di miscelazione per ogni cella di coltura presente, per la preparazione del terreno di coltura; un circuito di perfusione connesso porte di ingresso e uscita per la perfusione delle celle di coltura e comprendente le camere di miscelazione; - mezzi per produrre un flusso controllato di terreno di coltura attraverso detto circuito; un circuito di ricircolo lento del terreno di alloggiamento, connesso alle porte di ingresso e uscita per tale terreno, e comprendente un mezzo per produrre un flusso lento e controllato, e una camera di miscelazione. mezzi per produrre almeno uno o anche combinazioni di più stimoli fisici-chimici che si desideri applicare al vaso sanguigno sotto esame; mezzi di controllo di suddetti mezzi per la produzione di almeno uno o combinazione di più stimoli fisici-chimici, affinché ciascuno stimolo assuma valori predeterminati; - mezzi per la sensorizzazione della cella di coltura, della camera di miscelazione e il circuito di perfusione e di ricircolo.
2. 2. Sistema bioreattore per il monitoraggio, studio, e 1'ingegnerizzazione di condotti vascolari, secondo la rivendicazione 1, in cui la suddetta cella di coltura è realizzata in materiale siliconico o similare con forme tali da poter alloggiare vasi sanguigni di diverso calibro e il sistema di dispositivi e sensori per la simulazione di varie condizioni fisio-patologiche.
3. 3. Sistema bioreattore per il monitoraggio, studio, e 1'ingegnerizzazione di condotti vascolari, secondo la rivendicazione 1, in cui la suddetta cella di coltura è realizzata in materiale siliconico in almeno due parti sovrapponibili delle quali almeno una presenta una concavità che consente, una volta sovrapposte le due parti, l'alloggiamento del vaso sanguigno. La suddetta cella può presentare nella sua parte superiore un vetrino inglobato all'interno della matrice siliconica che permette di monitorare in tempo reale l'evoluzione dell'esperimento tramite microscopio (ottico, a fluorescenza, etc.) o connessione ad un sistema digitale di acquisizione delle immagini.
4. 4. Sistema bioreattore per il monitoraggio, studio, e 1'ingegnerizzazione di condotti vascolari, secondo la rivendicazione 3, in cui le suddette due parti sovrapponibili possono essere premute reciprocamente per l'azione di due piastre rigide tenute insieme da mezzi di accoppiamento rimovibile.
5. 5. Sistema bioreattore per il monitoraggio, studio, e 1'ingegnerizzazione di condotti vascolari, secondo la rivendicazione 1, in cui i suddetti mezzi per produrre un flusso controllato di terreno di coltura attraverso ogni singola cella comprendono: - un condotto in ingresso e in uscita da detta cella di coltura, a formare un circuito chiuso con la camera di miscelazione separata; - una pompa peristaltica installata lungo tale condotto; - un sistema di sviluppo di pressione nel circuito di perfusione {elettronico, o anche tramite elevatore graduato); un punto di immissione di eventuali farmaci o altre sostanze che potenzino o inibiscano le attività cellulari a monte di ogni cella di coltura; - un punto di prelievo a valle della cella di coltura per effettuarne analisi; - una camera di miscelazione per il condizionamento dell terreno di coltura e per la misura ed il controllo di parametri fisiologici quali pH, pressione, temperatura, etc.
6. 6. Sistema bioreattore per il monitoraggio, studio, e 1'ingegnerizzazione di condotti vascolari, secondo la rivendicazione 1, in cui detta cella di coltura può inoltre prevedere: - un sistema di sensori fisici e/o chimici realizzati con tecniche di macro-, micro- e nanofabbricazione integrati in detta camera per il monitoraggio di parametri fisiologici e/o metabolici; e/o un sistema di trasduttori fisici e/o chimici realizzati con tecniche di macro-, micro- e nanofabbricazione integrati in detta camera per l'applicazione di stimoli fisici e/o chimici; 9. Sistema bioreattore per il monitoraggio, studio, e 1'ingegnerizzazione di condotti vascolari, secondo la rivendicazione 1, in cui detta cella di coltura può svolgere la sua attività sia in un incubatore che all'esterno di esso tramite un'opportuna centralina di controllo, o una scheda elettronica, o un PC che possono controllare il sistema e mantenere i parametri fisiologici nel range desiderato.