CN113950523A - 用于类器官培养的系统和方法 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了一种用于培养、监测和/或分析类器官的系统，包括方法和设备。在类器官培养的示例性方法中，该方法可以包括将支架设置于具有开口侧的接受器中。可以将密封构件结合到接受器的开口侧以形成腔室。可以使用支架在腔室中形成类器官。可以将流体和/或至少一种物质从上覆储器引入到腔室中以与类器官接触。

Description

用于类器官培养的系统和方法
相关申请
本申请要求于2019年5月8日提交的美国临时申请no.16/407,026的优先权，该美国临时申请的内容通过引用整体并入本文。
背景技术
类器官(“小器官”)是体外产生的不同类型的细胞的三维团块，并且与器官具有一些相似性，例如表现出器官特异性组织的实际组织学。细胞的团块可通过用少量干细胞接种基质来产生。然后，干细胞在基质内增殖、分化和自组织，同时使用基质作为支架。通过这种方法，迄今为止已经产生了类似于来自脑、心脏、肠、肾、肝和胃等的组织的类器官。这些有希望的结果表明，类器官培养有可能为器官发育和功能提供新的见解，并且有可能重现允许体外药物筛选的疾病模型。类器官可以使如何发现药物和药物的个性化发生彻底改变。
存在许多问题限制了研究人员充分开发类器官的能力。首先，随着类器官尺寸的增加，类器官可能需要从内部和外部两者进料，这提出了挑战。其次，每种不同类型的类器官会需要优化的三维基质支架结构、适合于该结构的培养基交换(进料)，以及甚至可能需要经受机械阻力或受控力的能力，以允许功能类器官的适当生长和发育。第三，不存在用于将大的类器官暴露于不同类型的试剂以允许筛选而优化的容器。第四，不存在通过成像方法为原位监测大类器官而优化的容器。相反，类器官通常在它们被固定和物理切片之后成像。因此，需要用于改进类器官培养的系统和方法，诸如通过提供有效生长、监测和分析大类器官的能力来改进类器官培养。
发明内容
本公开提供了用于培养、监测和/或分析类器官或其它有组织的多细胞结构的系统，包括方法和设备。在类器官培养的示例性方法中，该方法可以包括将支架设置于具有开口侧的接受器中。可以将密封构件结合到接受器的开口侧以形成腔室。可以使用支架在腔室中形成类器官。可以将流体和/或至少一种物质从上覆储器引入到腔室中，以与类器官接触。
附图说明
图1是用于形成、培养、监测和分析类器官的示例性容器的示意性侧视图，其中容器容纳浸没在液体培养基中的类器官，并且容器的前壁和后壁不可见。
图2是图1的容器在容器为空时的分解侧视图。
图3是图2的容器的主体的侧视图，其在如图4至图10中所示的培养、监测和/或分析容器中的类器官的方法执行之前单独绘制并相对于图2倒置。
图4和图5是图3的容器主体的侧视图，其分别在通过3D打印或移液在容器的接受器中形成支架期间和之后绘制。
图6是图5的容器主体的侧视图，其在预制密封构件已结合到容器主体以密封接受器的开口侧从而产生包含支架的腔室之后绘制。
图7是图6的容器主体和密封构件的侧视图，其在容器主体已经被翻转成类器官培养取向、至少一种液体培养基已经被引入包含支架的腔室中并且被引入到与腔室流体连通的上覆储器中、以及容器的盖子已经覆盖储器的开口顶部之后绘制。
图8是在支架中的干细胞增殖和分化以产生类器官之后绘制的图7的容器的侧视图。
图9是通过使类器官发育而对支架进行重塑/替换之后绘制的图8的容器的侧视图。
图10是当通过光片显微术(light-sheet microscopy)对类器官成像时所绘制的图9的容器的侧视图。
图11至图13是图5的容器主体和支架的侧视图，其示出了通过在接受器中原位形成密封构件来密封容器主体的接受器的开口侧以形成腔室的替代方法。
图14是图13的容器主体、密封构件和支架的侧视图，其在存在成像物镜的情况下并且在容器主体已经被翻转成类器官培养取向、至少一种液体培养基已经被引入到包含支架的腔室中并且被引入到与腔室流体连通的上覆储器中、以及容器的盖子已经覆盖储器的开口顶部之后绘制。
图15是图12的容器主体和支架的侧视图，其示出了相对于图13的改进的方法，该方法通过在接受器中原位形成密封构件来密封容器主体的接受器的开口侧以形成腔室。
图16是用于形成、培养、监测和/或分析类器官阵列的示例性容器条带的示意性侧视图，其中容器条带具有彼此直接连接的一组容器。
图17是图16的容器条带的示意性侧视图，其在类器官培养期间绘制并且示出了在容器条带的每个容器内的储器之间转移液体培养基的示例性泵构造。
图17A和图17B示出了图16的容器条带的示意性侧视图，其在类器官培养过程中绘制并且示出了沿相反旋转方向倾斜容器条带如何能够在每个腔室内驱动沿各自相反方向的流动。
图18是具有容器阵列的示例性容器条带的另一实施例的示意性侧视图，其在类器官培养期间绘制并且示出了用于在容器条带的不同容器的储器之间转移液体培养基的示例性泵构造。
图19是用于图2的容器的容器主体的示例性实施例的视图。
图20是图19的容器主体的正视图。
图21是图19的容器主体的视图，其在容器主体倒置并且从容器主体的接受器分解出来预制密封构件的情况下绘制。
图22是图19的容器主体大致沿图20的线22-22截取的底视图。
图23是图19的容器主体大致沿图20的线23-23截取的顶视图。
图24是图19的容器主体大致沿图23的线24-24截取的截面图。
图25是图19的容器主体大致沿图23的线25-25截取的另一截面图。
图26是容器主体的另一实施例大致如图25那样截取的局部截面图，除了仅示出了容器主体的不同于图25的下部。
图27是图26的容器主体在通过3D打印在容器主体的通道之间形成多孔管之后的局部截面图。
图28是容器主体的再一实施例如图25那样截取的截面图，其中容器主体包括与容器主体的接受器可操作地相连的电磁体。
图29是图28的容器主体与密封构件结合以形成腔室的局部视图，其中支架连接到腔室的顶板，并且细胞位于腔室的底板上，细胞是铁磁性的，并且电磁体被关闭。
图30是图29的容器主体、密封构件、支架和细胞的另一局部视图，其在电磁体被开启使得铁磁标记的细胞通过磁力被拉入支架中的情况下绘制。
图31是在支架形成和类器官形成和培养期间保持作为条带的呈直线状布置的容器组的示例性架子的顶视图，其中每个容器包括与图19的实施例相对应的容器主体。
图32是图31的架子的组装有与图19的实施例相对应的一组容器主体以形成条带的顶视图。
图33是图32的条带的侧视图。
图34是保持与图19的实施例相对应的容器主体的二维阵列以形成条带的另一示例性架子的顶视图。
图35是用于图1和图2的容器的容器主体的又一实施例的大致如图25(用于相关实施例)那样截取的截面图，其中容器主体的开口底端由密封构件密封以形成腔室，其中容器主体限定有进入管，在进入管的底端由可破裂的屏障封闭，并且其中磁体插入到进入管中以将磁体的工作端放置在可破裂的屏障附近(和上方)。
图36是图35的容器主体和密封构件的截面图，其在类器官存在于腔室中并且磁体被具有刺穿可破裂屏障并进入类器官的尖端的针替代的情况下截取。
图37是图35的容器主体和密封构件的截面图，其在类器官存在于腔室中并且磁体被具有刺穿可破裂屏障并且进入类器官的感测/刺激端部区域的传感器/电极替代的情况下截取。
图38至图40是图35的容器主体的局部截面图，其在破裂器械的尖端穿过屏障并从进入管进入腔室之前、期间和之后在可破裂屏障周围截取。
图41是图35的容器主体和密封构件大致如图24(用于相关实施例)那样截取的截面图，使得三个进入管可见，其中破裂器械设置在三个进入管中，并且其中仅一个破裂器械延伸到进入管下方的腔室中。
图42至图44是图35的容器主体的变型实施例的局部截面图，其中可破裂屏障被构造成在脆弱网处撕裂，其中这些视图在破裂器械的尖端从进入管穿过可破裂屏障之前、期间和之后在可破裂屏障周围截取。
图45是图35的容器主体和密封构件的截面图，其在类器官存在于腔室中并且磁体被衰减全反射(ATR)光纤探针替代的情况下截取，该光纤探针具有穿过可破裂屏障并进入类器官的尖端。
图46是图35的容器主体和密封构件的截面图，其在类器官存在于腔室中并且磁体被具有前透镜的成像光纤探针替代的情况下截取，该前透镜穿过可破裂屏障并且进入类器官。
图47是图35的容器主体和密封构件的截面图，其在类器官存在于腔室中并且磁体被具有进入类器官的远端的照明探针替代的情况下截取。
图48是图35的容器主体和密封构件的截面图，其在类器官存在于腔室中并且磁体被气动装置替代的情况下截取，该气动装置具有位于类器官内部以产生内部机械应变的可膨胀囊体。
图49是图35的容器主体和密封构件如图24(用于相关实施例)那样截取的截面图，其中类器官存在于腔室中并且磁体被一对气动装置替代，该对气动装置具有位于类器官外部以产生外部机械应变的可膨胀囊体。
图50和图51是图35的容器主体和密封构件分别大致如图25和图24(对于类似的实施例)那样截取的视图，其中一对磁体经由相应的进入管延伸到腔室中，并经由磁吸引将预制的支架结构或生物芯片安装到磁体上。
图52和图53是图35的容器主体和密封构件的截面图，其在下面情况下截取：盖安装在容器主体顶部并密封容器主体顶部，并且设置有柔性构件，该柔性构件通过交替施加在一对储器上的外部压力而变形以驱动液体沿相反方向交替地通过腔室。
具体实施方式
本公开提供了一种用于培养、监测和/或分析类器官或其它有组织的多细胞结构的系统，包括方法和设备，其它有组织的多细胞结构诸如为正在发育或完全发育的多细胞生物体、组织活检体和/或原发性患者材料等。在类器官培养的示例性方法中，该方法可以包括将支架设置于具有开口侧的接受器中。可以将密封构件结合到接受器的开口侧以形成腔室。可以使用支架在腔室中形成类器官。流体和/或至少一种物质可以从上覆储器被引入到腔室中以与类器官接触。
本公开描述了用于形成、培养、监测和/或分析类器官或其它有组织的多细胞结构的容器，其它有组织的多细胞结构诸如为发育中或完全发育的多细胞生物体、组织活检体和/或原发性患者材料等。容器可以是可消耗的(即，在单次使用之后可丢弃的)和/或可以具有标准形状。容器可以包括容器主体，容器主体限定具有开口侧的接受器。密封构件可附接(例如，结合)到容器主体，以由接受器形成腔室。密封构件可以是预先形成的或在接受器中形成，等等。
三维(3D)结构(即，至少一种基质，其可以是支架)可以在接受器的开口侧被密封之前被设置在接受器中。可以通过3D打印机在接受器中形成3D结构。3D打印机可以分配一种或多种可凝固生物墨水，所述一种或多种可凝固生物墨水可以在(一种或多种)墨水被沉积以生成3D结构之前或之时与细胞混合。作为选择，可以将细胞与3D结构分开引入到接受器或腔室中。在其它实施例中，3D结构可以至少部分地或完全地在接受器外部形成，然后设置在接受器中。
在形成基质支架时或在已经形成基质支架之后，可以引入到基质支架中的合适的细胞可以包括未分化的干细胞、已经分化并将继续分化的干细胞、细胞聚集体、小的类器官等。
3D打印机还可以用于将粘合剂和/或密封流体施加到容器主体，以允许在打印过程结束时用透明密封构件密封容器的开口侧。可以适用于分配基质组分的示例性打印技术包括使用生物墨水的基于液滴的生物打印，或基于激光的生物打印(例如，通过使用脉冲激光的激光诱导正向转移(LIFT)对打印细胞、酶等进行基于激光的直写)。
支架和/或其它基质可以由一种或多种水凝胶提供。每种水凝胶可以包括一种或多种热塑性结构组分，诸如基质胶、藻酸盐、纳米原纤维纤维素(nanofibrillarcellulose)、胶原、纤维蛋白和/或聚乙二醇等，这些一种或多种热塑性结构组分以温度依赖性方式协同形成基质。
在一些实施例中，可以将两种或更多种不同的水凝胶/基质设置在接受器中。水凝胶/基质可以因任何合适的参数而不同，这些参数诸如为熔融温度、对酶降解的抵抗力、溶解度、细胞吸引和/或细胞排斥特性等。
每种水凝胶/基质可以包括任何合适的组分。示例性的组分包括一种或多种多糖(例如糖胺聚糖(GAG，诸如硫酸软骨素、硫酸皮肤素、肝素、硫酸乙酰肝素、透明质酸、硫酸角质素等)、蛋白聚糖(例如与核心蛋白(诸如通过其丝氨酸)连接以形成如下物质的GAG：聚集蛋白聚糖、聚集蛋白、短纤蛋白聚糖、XVIII型胶原蛋白、皮屑蛋白、神经蛋白聚糖、基底膜蛋白聚糖、富含亮氨酸的小蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖等)、纤维蛋白(例如胶原蛋白、弹性蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白等)和/或类似物。蛋白酶识别位点(例如，用于支架金属蛋白酶(MMP))可以结合在水凝胶/基质中，以允许通过细胞降解/重塑。可以选择这些位点的频率以及每个位点的顺序，以允许适当量的降解/重塑。
一种或多种生长因子可以在形成基质时包含在基质中，或者可以在形成液体培养基后引入液体培养基中。合适的示例性生长因子包括血管生成素、骨形态发生蛋白(BMP)、睫状神经营养因子、群落刺激因子、肝配蛋白(ephrins)、表皮生长因子、红细胞生成素、成纤维细胞生长因子、神经胶质衍生的神经营养因子、肝细胞生长因子、胰岛素、胰岛素样生长因子、白介素、白血病抑制因子、角质形成细胞生长因子、神经调节蛋白、神经营养蛋白、血小板衍生的生长因子、转化生长因子、肿瘤坏死因子(α)、容器内皮生长因子等。
任何合适的细胞最初可以在支架上繁殖。这些细胞可以包括干细胞(例如多能干细胞)、支持细胞等。可通过任何合适的技术将细胞沉积在支架中，所述技术包括生物墨水液滴打印、微接触打印、光刻、蘸笔纳米光刻和/或移液等。
容器可以设置多个储器，所述储器经由通道而与腔室处于流体连通，所述通道可以形成在储器和腔室之间的共用壁中。这种构造可以被描述为标准进料接口。在一些实施例中，3D打印提供容器内部的标准进料接口与任何合适的打印结构的连接，以使得能够生长不同类型的类器官。
打印的3D结构能够在适当类型的细胞发育成类器官时为它们提供临时支架。这些细胞可以自组织并产生它们自己的细胞外基质，这可以替代一些或全部支架。对于内部进料也是如此：容器可以提供通用接口，该通用接口可以可选地通过3D打印来修改，并且这些细胞可以组织以最佳地使用该修改的接口。
在倒置容器的同时，可以将支架(带有或不带有细胞)设置在容器主体的接受器中，并且可以通过接受器形成腔室。一旦这些过程完成，就可以将容器转为正面朝上(转至其类器官培养取向)，并且置于腔室上的至少一个储器可以填充有进料液体。如果在支架内还没有任何细胞，则可以将合适的细胞放置于进料液体中，并将这些合适的细胞与进料液体一起从上覆储器引入支架中(或者可以经由进入管引入细胞(例如，参见示例7))。
在可以开始特定的进料方案之前，形成类器官可能需要初始培养时间。进料方案可以包括根据预定的计划和/或基于类器官的发育阶段或状况，用合适的培养基装载储器以及从储器移除培养基。进料方案可以取决于支架的形状以及待形成的类器官的类型。
容器可被构造成使得能够经由腔室的可由密封构件提供的底部窗口进行类器官监测。在一些实施例中，可以在类器官仍在培养箱内的同时监测类器官。因此，培养箱可以包括用于类器官监测的成像系统。
容器可以实现光片3D成像。容器的腔室可以具有两个、三个或更多个光学窗口，并且光可以经由每个窗口传播到腔室中和/或从腔室中传播出来。例如，容器可以具有可以均为平面的底部窗口和一个或多个横向窗口。在一些实施例中，容器可以具有一对彼此相对布置的横向窗口。
多个容器主体(和容器)可以被组织为条带。该条带可通过在制造过程中将容器主体以呈直线状或二维阵列彼此预连接(例如通过将容器主体彼此整体地结合或成形，诸如通过注射成型)而形成。作为选择，条带可以在制造过程中形成，或者由用户通过将各个容器主体与合适的条带保持器组装来形成。在一些实施例中，条带保持器可以被构造成保持仅一个条带或两个条带以允许用于成像物镜的空间。容器主体的条带可以被装载到3D打印机中，以允许打印机在每个容器主体中打印支架和/或向每个容器主体添加密封构件。
本公开能够通过用内部和外部的不同培养基向类器官进料来产生大的功能类器官。大类器官的平均直径或最大直径可以大于约0.1、0.2、0.5、1或2毫米等。对大类器官的研究仍然是具有挑战性的，研究人员面临两个主要的限制。首先，每种类型的类器官需要不同的培养条件，如特定的水凝胶、作为基底的基质、或甚至机械性质(如由培养基流动引起的剪切力)。其次，大类器官的显微术是非常具有挑战性的。现有技术方法仍然是对类器官材料进行薄切片、染色、以及使用共焦点扫描显微镜或甚至载玻片读取器对固定样品的图像获取。
本公开提供了一种有助于克服一个或两个障碍的系统和方法。通过使用3D打印(支架和/或细胞)与通过重力流的培养基交换的组合，用户可以生成针对每种类型的类器官优化的独特3D环境。可以生长各种不同类型的类器官。可以通过容器的腔室和上覆储器之间的流体连通来解决进料和废物移除。将光学窗口集成到每个容器中，至少一个光学窗口用于激发光的进入并且另一个窗口用于发射光的离开，允许通过光片显微术监测类器官的活细胞。作为选择或者或另外地，可以通过经典的宽场显微术经由一个或多个窗口对类器官进行成像。因此，本文公开的容器可以使得能够对正在发育的和/或已发育的类器官实施活细胞显微术。可以对类器官实施高容量和/或高通量显微术。
在以下章节中描述了本公开的其它方面：
(I)用于类器官形成、培养、监测和/或分析的容器，(II)类器官形成、培养、监测和/或分析的方法，和/或(III)示例。
I.用于类器官形成、培养、监测和/或分析的容器
本章节描述用于类器官52(或其它有组织的多细胞结构)的形成、培养、监测和/或分析的示例性容器50；参见图1和图2。这里示意性地示出了容器50，容器的前壁和后壁不可见，以区分容器的封闭(图1)或打开(图2)的顶侧和底侧。
图1示出了在腔室54中容纳类器官52的容器50，其中类器官浸没在培养基56(例如，液体或半固体培养基，以促进类器官生长和发育)中。类器官52可以附着到腔室54的上部区域，例如腔室的顶壁58(顶壁可互换地称为顶板)。腔室的横向壁60和底壁62可以提供阻碍流体通过的屏障，从而使顶壁58下方的所有腔室流体密封。
容器50限定了位于腔室54上方的多个隔室63。每个隔室63可以与腔室54共用壁，并且初始可以与腔室流体连通或初始不与腔室流体连通。示例性隔室包括储器和进入管(参见示例7)。这里，容器50包括(至少)两个储器64a、64b，用于在腔室54上方容纳各自的液体培养基66a、66b。每个储器64a、64b可以经由相应的专用通道68a、68b独立于其它储器而与腔室54处于流体连通。每个通道68a、68b可以从储器64a、64b中的一个延伸穿过顶壁58到达腔室54，并且可与顶壁58的顶侧和底侧齐平，或者每个通道68a、68b可以从顶壁58的顶侧和/或底侧突出为环形突起的内腔(例如，参见示例4)。在其它示例中，容器50可以具有至少或确切地3、4、5、6或更多个上覆储器，每个上覆储器可通过顶壁58与腔室54处于流体连通和/或独立于其它储器而与腔室54处于流体连通(例如，参见示例3)。
容器50的两个或更多个储器可以容纳要供给到腔室54的任何合适的物质。示例性的物质包括营养物、效应物和试剂等。合适的营养物包括促进腔室54内的细胞健康和增殖并因此促进类器官52生长和发育的任何物质。示例性的营养物可以包括糖(诸如葡萄糖)、氨基酸、蛋白质、核苷酸、维生素、矿物质、脂肪酸等。效应物包括激活、控制或去活过程或作用(诸如分化、蛋白质合成、迁移等)的任何分子(诸如诱导物或阻抑物)。示例性的效应物包括抗癌化合物、生长因子、分化因子、寡核苷酸、mRNA等。试剂包括促进类器官分析的任何化合物。示例性的试剂包括标记物、固定剂和清除剂等。标记物可以包括染料(例如，可见着色剂和/或光致发光染料)。光致发光染料是响应于激发光的照射而发光的任何物质。
每个储器64a、64b可以具有横向壁70，以横向地容纳流体。如图1所示，至少一个横向壁可以在至少一对相邻的储器之间共用。在其它示例中，相同或不同容器的至少一对储器可以诸如经由在储器之间共用的壁70中形成的通道而彼此横向流体连通，而与腔室54无关(例如，参见示例2)。
每个储器64a、64b可以具有开口顶部72，以便于利用流体转移装置(例如移液管或其它泵)引入和移除流体。容器50可以包括单个可移除的盖子74，盖子74配合在容器上以在培养箱中培养期间覆盖每个储器64a、64b的开口顶部72。作为选择，容器可以包括两个或更多个盖子，这些盖子可彼此独立地被移除并且共同覆盖所有储器。每个盖子74可以具有凸缘76，凸缘76被构造成与每个储器的上端竖向重叠，并且当覆盖储器时限制盖子的横向运动，可选地不产生紧密配合。在一些实施例中，盖子可以是在一个或多个储器的顶部形成流体紧密密封的帽形件(例如，参见示例8)。
图2示出了图1的容器50的分解图，其中容器是空的。容器50可以包括盖子74、容器主体78和密封构件80。容器主体78可以限定储器64a、64b和储器下方的接受器82。接受器82提供了腔室54的顶壁58和横向壁60。然而，接受器82可以具有开口的底侧84，在支撑类器官形成物的支架86已经被布置在接受器82中之后，可以用平坦的密封构件80密封该开口的底侧以形成腔室54(参见图1和章节II)。密封构件可以结合到接受器82(和/或容器主体78)的底端以形成腔室54。在其它实施例中，密封构件可以在原位形成以密封接受器82的底侧84(参见章节II)。
容器50可以具有一个或多个光学窗口，以便于成像(参见图1)。每个光学窗口可以用于将光传播到腔室中，以照射腔室54的至少一部分，或者从腔室接收光，诸如用于成像。在示例性实施例中，容器50具有由密封构件80提供的底部窗口88，以及由容器主体78提供的一个或多个横向窗口90。每个光学窗口可以是透明的和/或平面的。底部窗口88可以横向于(例如，正交于)每个横向窗口90，并且横向窗口可以由腔室54的相对的横向壁60形成。(本文所用的术语“光”是指光学辐射，包括紫外线辐射、可见光辐射(即可见光)和/或红外线辐射。)
容器50的部件可以通过任何合适的程序由任何合适的材料形成。在示例性实施例中，容器主体78可由聚合物(诸如透明聚合物等)形成。容器主体可以不具有可移除/活动部件和/或可以诸如通过注射成型而形成为单件，使得容器主体的所有结构(例如，隔室)彼此一体地形成。因此，接受器82(和/或腔室54)和储器64a、64b可以具有相对于彼此固定的位置和/或可以不可移除地/牢固地彼此附接。密封构件80可以由玻璃或聚合物等形成，并且可以至少部分地或完全地在接受器82内部预先形成或在原位形成。
腔室54(和/或接受器82)和每个储器64a、64b可以具有任何合适的尺寸。腔室54可以具有至少约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.7或1mL的容积。腔室的尺寸可以被设计为容纳任何合适尺寸(例如，最大尺寸)的类器官，诸如具有至少约0.2、0.5、1、2、3、4或5mm直径的类器官，等等。在示例性实施例中，容器的每个上覆储器至少与腔室54(和/或接受器82)的容积一样大，或为腔室54(和/或接受器82)的容积的约2、5或10倍，上覆储器诸如具有至少约0.5、1、2、4或6mL的容积，等等。
容器50和/或其任何隔室可以具有任何合适的几何形状。例如，接受器82、腔室54和/或每个储器(例如，储器64a、64b)中的每一个独立地可以具有多边形(例如，矩形)、椭圆形(例如，圆形)、卵形、莲座形或其它形状的截面(例如，在水平面中)。因此，接受器82、腔室54和/或每个储器可以独立地为圆柱形、截头圆锥形、矩形棱柱、锥形棱柱或它们的组合等。
可以适用于类器官形成、培养、监测和/或分析的容器50的其它方面描述如下。
II.类器官形成、培养、监测和/或分析的方法
本章节描述了在本公开的容器中形成、培养、监测和/或分析类器官(或其它有组织的多细胞结构)的方法；参见图3至图15。在该章节中描述的方法步骤可以使用本文其它地方描述的任何容器、容器特征和/或程序以任何合适的顺序和组合来执行。
图3至图10示出了通过实施类器官培养和分析方法而产生的容器50、类器官52和培养基56、66a、66b的示例性构造。可以选择使用至少一个容器50的至少一个容器主体78。在一些实施例中，可以选择呈直线状或二维阵列的容器主体78(例如，参见示例1和6)，或者可在已执行以下步骤的至少一个子集之后创建阵列。
图3示出了已被选择并以倒置取向放置的容器主体78，其中接受器82在顶部开口。换言之，顶壁58位于开口底侧84的下方。这种取向利用重力来促进流体输送到顶壁58上，而横向壁60防止流体从接受器82横向流出。
用于类器官形成的支架86可以设置在接受器82内。如图4和图5所示，该支架可以包含在至少部分原位产生的水凝胶92中。例如，水凝胶92的支架86可以由3D打印机94三维打印到顶壁58上。3D打印机94可以利用任何合适的技术来输送支架的组分。在一些实施例中，3D打印机可以利用喷墨技术来输送流体的液滴(诸如液滴95)，这些液滴可以包含支架结构组分、细胞96、管、笼状效应物、生长因子等。作为选择或另外地，3D打印机94可以利用激光诱导正向转移来输送组分(例如，细胞96)等。在其它实施例中，支架86的至少一部分可以与容器主体78分开形成，并且随后被放置到接受器82中(例如，附接到顶壁58)。
水凝胶92可以是热致可逆凝胶或可以不是热致可逆凝胶。水凝胶可以具有高于类器官培养温度的凝胶点(胶凝温度)，使得水凝胶的支架在支架被打印时通过冷却形成。作为选择或者另外地，形成水凝胶的聚合反应可利用诸如紫外光或可见光等的光学辐射进行光诱导。
支架86(和/或水凝胶92)可以与一个或多个通道68a、68b的底端水平重叠。例如，在所描绘的实施例中，由通道68b限定的贯穿轴线(例如，竖向轴线)与水凝胶92相交并且延伸穿过支架86。在其它实施例中，支架86(和/或水凝胶92)可以与多个通道68a、68b重叠。
在水凝胶92中形成支架86期间，可以通过3D打印来延伸一个或多个通道68a、68b，以便于在类器官形成和培养期间向水凝胶92和其中的细胞96供给营养物和/或效应物。所得到的通道延伸部分可以是嵌入水凝胶92中的一个或多个横向可渗透管，并且可以分支以在水凝胶内形成通道网络。通道网络和/或嵌入水凝胶92中的横向可渗透管可以在容器主体78的至少一对通道68a、68b之间延伸。可以经由通道网络供给效应物(例如分化因子)以在水凝胶内建立浓度梯度，用于更受控的干细胞分化和类器官形成。这些管可以通过光诱导的聚合或热聚合等来形成。预先形成的管也可以或者作为选择可以被并入水凝胶或支架中，用于额外促进水凝胶/支架内的液体流动。
可以气密地密封接受器82的开口侧以形成其中容纳有水凝胶92和支架86的腔室54。如图6所示，可以将密封构件80结合到接受器82的端部。作为选择，如下所述，密封构件80可以通过密封流体的聚合和/或固化至少部分地在接受器82内原位产生。可以在细胞96已经放置到接受器中之前或之后，和/或在培养基56已经进入接受器82(和/或腔室54)中的水凝胶92周围之前或之后密封接受器82。
参见图7，可以将培养基56、66a、66b设置在容器50的腔室54和每个储器64a、64b中。可以将相同的培养基引入每个腔室和储器中，或者可以引入不同的培养基，这可以形成一种或多种营养物和/或效应物的浓度梯度。如上所述，在接受器被密封以形成腔室54之前，可以最初经由接受器82的开口侧引入培养基56。为了防止在形成腔室54之前培养基56通过一个或多个通道68a、68b从接受器82泄漏，每个通道的端部可以覆盖有水凝胶92(或不同的水凝胶)。不同的水凝胶可以被配置成在低于培养温度(例如37℃)之下熔化以用于类器官形成和培养。作为选择，可以从至少一个储器64a、64b经由至少一个通道68a、68b将培养基56引入到腔室54中(在形成腔室之后)。
如果储器中的流体水平不同，则重力可以将流体从储器之一驱动到腔室54中，和/或经由腔室在储器之间驱动流体。例如，在图7中，储器64a中培养基66a的顶部高于储器64b中培养基66b的顶部。因此，重力驱动培养基66a经由通道68a(其用作入口)流入腔室54中，并且经由通道68b(其用作出口)流出腔室54。随着时间的推移，培养基66a、66b的水平将趋于相等。因此，为了驱动流体在相同或相反方向上进一步的流动，可以将流体添加到一个或多个储器和/或从一个或多个储器移除，或者可以周期性地改变容器50的竖向方向(例如，参见示例2)。
图8和图9示出了容纳有类器官52的容器50。类器官通过细胞96在水凝胶92中的增殖和分化而形成。在图9中，随着支架86被类器官的细胞重塑，类器官52的大小和形状相对于图8已经改变。在其它实施例中，类器官52的最终尺寸和形状可以基本上由支架86在形成时的尺寸和形状所限定。
图10示出了用于通过光片显微术捕获类器官52的图像102的示例性成像系统100。成像系统可以包括照明组件104，照明组件104包括产生用于光片(light sheet)108的光的光源106。如图10所示，光片可以被水平取向，并且可以从横向窗口90之一传播通过类器官52。作为选择，光片108可以被竖向取向，并且可以从底部窗口88竖向传播通过类器官52。可以利用物镜110从类器官52收集光，以便由图像传感器112捕获。可以收集传播通过底部窗口88的光，如在所描绘的实施例中那样，或者可以从横向窗口90之一收集光。可以通过照明组件104(或容器50)的对应运动来移动光片108，以允许捕获图像的堆叠，从而提供类器官的三维图像数据。如果类器官52不再需要存活，则可以通过从一个或多个储器64a、64b经过腔室54的顶壁58提供固定和清除试剂，而在成像之前固定和清除类器官。
图11至图13示出了密封接受器82的开口侧84以形成腔室54的替代性原位方法。图11示出了在形成包括支架86的水凝胶92之后的倒置的容器主体78。填充物水凝胶113也已经经由开口侧84分配到开口接受器82中，这可以防止接受器82通过通道68a泄漏。填充物水凝胶可以被配置成一旦类器官培养开始就溶化或溶解。图12示出了将密封液体114分配到接受器82中的3D打印机94。图13示出了密封液体114固化以气密地密封接受器82的开口侧从而形成腔室54。
密封液体可以被配置成固化以产生热塑性聚合物或热固性聚合物等。示例性的热塑性聚合物包括热塑性弹性体或蜡，优选具有低于100℃的熔点。较低的熔点会是期望的，但至少约50℃。热塑性聚合物可以在高于聚合物的熔化温度的温度下以液体形式分配到填充物水凝胶113的表面上，以形成密封层116，该密封层随着层冷却而硬化，从而产生密封构件80。
在其它示例中，该层可以是可固化的以产生热固性聚合物。图13示出了这样的示例：其中通过利用来自照明组件104的光辐射(例如，紫外光)照射，使密封层116固化为热固性聚合物。照明组件形成光片108，光片108优先用紫外光照射密封层116，从而使对已经存在于接受器82中的支架86和/或细胞96的光损伤最小化。
图14示出了翻转到其类器官培养取向的容器主体78，以及腔室54和储器64a、64b中的培养基56、66a、66b，其中密封层116固化以形成密封构件80。成像系统的物镜110收集来自腔室54的光以形成图像。培养基56和密封层116可以具有基本上相同的折射率，以改善图像质量。
图15示出了用于密封容器主体78的接受器82的开口侧的改进的原位方法(与图13相比)。在将热固性密封液体的层116加入接受器82之前，可以在填充物水凝胶113的表面上形成辐射阻挡层118。可用来自位于容器主体78上方的光源120的光辐射来照射层116，以促进层116的固化，从而形成密封构件80。辐射阻挡层118保护水凝胶92免受光损伤。
III.示例
本章节描述了用于类器官形成、培养、监测和/或分析的系统和方法的其它实施例。这些实施例仅用于说明，而不应限制本公开的整个范围。
示例1.类器官培养的条带
参见图16，本示例描述了用于形成、培养、监测和/或分析类器官阵列的示例性条带130。
条带130可以包括彼此连接的容器主体78的阵列。各容器主体可彼此一体形成，或独立形成然后在形成后(和/或在接受器82密封形成腔室54后)彼此连接(还参见图1)。独立形成的容器主体78可通过粘结、过盈配合、紧固件或保持器等彼此连接(例如参见示例6)。容器主体可以彼此连接以形成呈直线状或至少二维阵列的容器82。
示例2.容器储器之间的流体转移
该示例描述了在相同或不同容器50的储器64a、64b之间转移流体的示例性构造；参见图17、图17A、图17B和图18。
图17示出了在腔室54中培养类器官52期间的条带130。每个容器50具有由箭头132、134指示的独立的流动循环。由于在相应的储器64a、64b中的培养基66a、66b的水平差，由重力驱动在通道68b和68a之间通过每个腔室54的流132。由泵136驱动从储器64a到储器64b的补充流134。可以调节泵136的流速，以保持培养基66a、66b的相应水平基本上恒定，使得流体以基本上恒定的速率通过腔室54。该流可以在类器官52上施加压力，这能够促进类器官的生长和发育。在其它示例中，泵136的流速可以变化，从而在类器官52上施加变化的压力。
在其它实施例中，可以去除泵136，如图17A和图17B中的容器条带130所示。可以摇动条带130以使保持器以适当的速率从竖向方向倾斜，以便使重力驱动的流132的方向周期性地反转。换言之，保持器可以沿一个方向倾斜以经由通道68a、68b将流体从每个容器50内的储器64a驱动到储器64b，然后沿相反的旋转方向倾斜以经由通道68a、68b将流体从每个容器50内的储器64b驱动到储器64a。
图18示出了在腔室54中培养类器官52期间的另一个条带140。条带140类似于图16和图17的条带130，其中在每个容器50的通道68a、68b之间驱动流132。然而，相应的通道142提供了每对相邻的容器50之间的流体连通。更具体地说，如流动箭头144所示，每个通道142允许流体从一个容器50的储器64a直接流向相邻容器50的储器64b，反之亦然。为了保持流体循环，条带140可以周期性地倾斜(如图18所示)以驱动流体从左向右朝向保持器的一端流动，然后沿相反的旋转方向倾斜，以驱动流体从右向左朝向保持器的相对端流动。泵146可在位于条带140的相对两端处的储器64a、64b之间传送培养基，这由148处的流动箭头表示。泵可以用于替代周期性地倾斜条带140或除了周期性地倾斜条带140还可以使用泵。
示例3.容器实施例
该示例描述了章节I的容器50的示例性实施例150，该容器具有通过注射成型而形成的容器主体78并限定了四个储器64a至64d；参见图19至图25。
每个储器64a至64d可经由延伸穿过接受器82(和/或腔室54)的顶壁58的相应通道68a至68d而与接受器82(和/或腔室54)流体连通(参见图23和图25)。每个通道的上端可以与顶壁58齐平(参见图25)。
可以在容器150中并入各种光学窗口。在密封构件已经结合到容器主体78的底端表面152(见图21)之后，平面密封构件80(例如，类似于显微镜盖片)可以提供腔室54的底部窗口88。容器主体可以包括一对横向窗口90(参见图19至图21)，该对横向窗口可从竖向方向稍微倾斜以便于通过注射成型制造(参见图24)。
示例4.具有管的容器
该示例描述了具有预先形成和/或原位形成的管的示例性容器；参见图26和图27。
图26示出了容器50的另一个实施例160，用于与图25中的容器150比较。容器160的通道68a至68d与容器150的那些通道不同。更特别地，通道68b和68c部分地由从接受器82(和/或腔室54)的顶壁58的底侧突出的环形突起162限定。任何或所有通道的管腔可至少部分地由环形突起形成。
图27示出了横向多孔的管状延伸部164，该管状延伸部可以通过3D打印在一个或多个环形突起162上原位形成。每个管状延伸部可以是分支的或不是分支的。在所描绘的实施例中，管状延伸部164将通道68b和68c彼此连接。在其它实施例中，可以形成多孔的管状网络，该网络可以将通道的任何合适的子集或全部彼此连接。每个管状延伸部164可以由水凝胶92支撑和/或嵌入水凝胶中(参见章节II)。管状延伸部可以具有与水凝胶相同的成分，或者可以具有与水凝胶不同的成分，以例如最小化/促进细胞附着和/或重塑等。
示例5.具有电磁体的容器
该示例描述了具有电磁体172的容器50的示例性实施例170，该电磁体定位成当该电磁体通电(即，开启)时吸引铁磁标记的细胞174；参见图28至图30。
容器170可以类似于容器150构造，并且可以具有本文公开的容器特征的任何合适的组合(参见图28)。电磁体172可以具有工作端176，该工作端非常靠近接受器82和/或腔室54或位于接受器82和/或腔室54中，靠近通道64a至64d中的至少一个。在所描绘的实施例中，工作端176位于通道64b和64c之间的中央。电磁体可以经由其上端178通电。
图29和图30示出了如何利用电磁体172将铁磁标记的细胞174吸引到腔室54内的水凝胶92和/或支架86。支架86和水凝胶92可以如上所述形成。在接受器被密封以形成腔室54之前，或在密封之后，可以将铁磁标记的细胞174与培养基56一起从一个或多个上覆储器经由一个或多个通道68a至68d而引入接受器中。在任何情况下，如图29中所示，铁磁标记的细胞174最初在水凝胶92的外部，并且可以在电磁体开启之前沉降到底部腔室54。图30示出了给电磁体通电如何将铁磁标记的细胞174吸引到支架86处和/或吸引到支架86中。在将细胞引入接受器/腔室之前，可以将铁磁标记的细胞与铁磁材料(例如，包含铁、钴和/或镍的化合物等)相结合。例如，可以向细胞提供铁磁性颗粒(诸如氧化铁颗粒)以使细胞呈铁磁性，或者可以用铁磁性探针涂覆细胞，等等。
示例6.用于容器模块的架子
该示例描述了分别以呈直线状阵列或二维阵列保持容器150以形成条带130的示例性架子180、182；参见图31至图34。
每个架子180、182(可互换地称为保持器)具有一系列开口184，以容纳容器150的容器主体78。开口184可以沿同一条线(架子180)或以矩形网格图案(架子182)等布置。每个容器主体78可以可拆卸地放置在开口184中。开口的尺寸和形状可被设计成防止容器主体完全穿过开口。可通过任何合适的机构将容器主体连接到开口184，该机构包括卡扣配合或单独的保持器等。
示例7.具有进入管的容器
该示例描述了包括进入管的示例性容器，以及进入管的用于容纳各种器械的用途；参见图35至图51。
图35示出了包括容器主体78的容器50的实施例190，容器主体78在其底端用密封构件80密封以形成腔室54。除了容器主体限定至少一个进入管192之外，容器主体78类似于上面针对容器160所描述的容器主体(参见图26)。进入管在其顶端194处开口，但进入管可以具有由屏障196封闭的底端。该屏障可以是腔室的顶壁58的在进入管192和腔室54之间共用的壁区域，并且该壁区域在屏障完整时防止进入管和腔室之间的流体连通。为了简化附图，在示例7的任何附图中，腔室54和储器64a、64b未被示出为容纳流体(例如，培养基或其它液体)。
如以下进一步描述的，屏障196可构造成被锋利或钝的器械破裂以进入腔室54。因此，如图35所示，屏障可以比顶壁58的相邻区域薄，和/或屏障可以包括预定结构(例如，厚度较小的预定易碎区域)，在该预定结构处，屏障可被优先撕裂或用合适的工具破裂。
图35示出了插入到进入管192中的示例性器械198。在此，器械198是永磁体200，该磁体的磁极202邻近屏障196。在其它实施例中，该磁体可以是电磁体或本文公开的任何其它器械。磁体200可以足够强以形成在屏障196是完整的情况下延伸到腔室54中的磁场。在其它情况下，磁体200的底端可以在屏障196被破裂(并且甚至磁体可以破裂屏障)之后插入到腔室54中。无论磁体是否进入腔室54，磁体均可以向腔室54内的铁磁性物品(例如铁磁标记的细胞)施加吸引力。磁体可以是可缩回的/可移除的和/或可以牢固地附接到进入管192。
图36示出了容器190，其中在腔室54中存在类器官52，并且磁体200由构造为针204的器械198替代(与图35相比)。针204的锐利尖端206已经刺穿屏障196(现在称为破裂的屏障196')并且已经进入类器官52。针可以是中空的或实心的。在任一情况下，针可以允许类器官52的样品被收集并且经由进入管192从腔室54中移除，用于类器官的活组织检查。作为选择，或另外地，针可以用于将流体、细胞和/或效应物等引入类器官52和腔室54中。例如，针可以允许组织或细胞移植到类器官，以实现异种移植、同种异体移植或同种移植。
图37示出了如图36中的容器190，除了器械198是包括电连接器210(例如，一个或多个导电线)的传感器/电极208。传感器/电极208的感测/刺激端部区域212已经刺穿屏障196(现为破裂的屏障196')并进入类器官52。在其它实施例中，屏障196可以首先被诸如专用破裂器械等不同器械198破裂，然后被传感器/电极208(或本文公开的任何其它器械等)替代。传感器/电极208可以包括至少一个电极或电极阵列，用于类器官52的电刺激。作为选择，或另外地，传感器/电极208可以包括任何合适的(一个或多个)传感器，诸如电传感器(例如电容传感器)、测量pH的pH传感器、电化学传感器、氧传感器、CO2传感器和/或类似物。
图38至图40示出了被构造为刺穿器具器械214的器械198在进入管192的底端处的屏障196被刺穿之前、期间和之后的图示。在图38中，破裂器械214的尖端216向下行进(由218处的运动箭头所示)，并且几乎到达屏障196。在图39中，尖端216与屏障196接触，并向屏障施加变形力。在图40中，尖端216已经完全穿过屏障并进入腔室54。形成屏障196的壁区域可以具有足够的弹性，以在屏障已经被刺穿之后保持与破裂器械214的径向接触。该径向接触可以在容器主体78(在破裂的屏障216'处)和破裂器械214之间形成流体紧密密封220，这可基本上阻止腔室54中的流体向上行进到进入管192中。
容器190可以仅具有一个进入管192或具有多个进入管192。例如，图41示出了大致如图24那样截取的容器190，使得三个进入管192可见。如上所述，每个进入管192可以在相应的屏障196处终止。此外，每个屏障196可以是顶壁58的位于相应的进入管192和腔室54之间的壁区域和/或在进入管192和腔室54之间共用的壁区域。因此，该壁区域可以是共同的壁区域或可以不是共同的壁区域。在所描绘的实施例中，相应的破裂器械214设置在三个进入管192的每一个中，其中仅一个破裂器械延伸到腔室54中。(破裂的屏障用196'表示。)在其它实施例中，可以使任何合适数量的屏障196破裂，从而为器械198的任何合适组合提供进入腔室54的通路。
图42至图44示出了如图38至图40那样所截取的在利用破裂器械214破裂屏障196之前、期间和之后的容器50的不同实施例230的局部截面图。容器230的屏障196具有易碎的网232，在该易碎的网处，屏障响应于由破裂器械214施加的压力而优先地被撕裂。在图44中，破裂器械214的端部已经进入腔室54。流体可从腔室54向上行进到进入管192中，或者该流体行进可由破裂器械214与进入管192的紧密径向配合和/或在进入管192的顶部处围绕破裂器械的气密密封等限制。
图45示出了具有设置在进入管192中并延伸到腔室54中的类器官52中的衰减全反射(ATR)光纤探针234的容器190。ATR探针234具有照明光纤236，以将来自光源的光引导到探针234的底端(如238所示)，并且ATR探针234还具有传感器光纤240，以将来自底端的光引导到光学传感器(例如，光谱仪、光度计等)(如242所示)。探针234可以允许使用IR光谱(例如，用于类器官的化学分析)、拉曼光谱(诸如表面增强拉曼光谱)等。
图46示出了具有设置在进入管192中并延伸到腔室54中的类器官52中的光纤成像探针244的容器190。成像探针244可以具有内窥镜前透镜246和用于将光从前透镜246传播到图像传感器的光纤束248。成像探针可以允许内窥镜成像、共焦成像和/或仅照明(例如，用于利用未耦合到光纤束248的图像传感器成像、用于光遗传学等)等。
图47示出了具有设置在进入管192中并延伸到腔室54中的类器官52中的照明装置250的容器190。照明装置250可以包括光纤252，以将来自光源254的光引导到光纤252的远端处的出口孔256。照明装置250的示例性用途包括照明类器官52，用于由未耦合到光纤252的图像传感器成像，作为波前感测的光源(自适应光学器件)、作为光遗传学的光源等。
图48示出了具有位于进入管192中的气动装置258的容器190。气动装置258具有位于类器官52内的可膨胀囊体260。该囊体可操作地连接到压力调节装置(诸如泵262)，该压力调节装置可以使囊体260膨胀以在类器官52中产生内部机械应变，这如264所示。气动装置258可以使囊体260膨胀和收缩，以根据需要使囊体扩大和缩小。囊体260可与支架86一起打印，并且随后连接到气动装置258的管266。在其它实施例中，囊体260可以经由针或其它尖锐物体被引入到类器官52中。
图49示出了如图41那样的容器190，但是还具有设置在相应的进入管192中的一对气动装置258a、258b。除了具有位于类器官外部的可膨胀囊体260以在类器官52的相对侧产生外部机械应变之外，每个气动装置与图48的气动装置相似。
图50和图51示出了分别如图35和图36那样的容器190，但是还具有经由相应的进入管192延伸到腔室54中的一对安装磁体270a、270b。磁体270a、270b磁性吸引相应的已经经由磁性吸引附接到预制的支架结构274或生物芯片的磁体272a、272b。
示例8.具有柔性膜的容器
该示例描述了利用一个或多个柔性膜(可互换地称为隔膜)来驱动容器内的流体流动的示例性容器190；参见图52和图53。
容器190包括安装在容器主体78顶部的帽形件282。帽形件282与容器主体78形成气密密封。该帽形件包括紧密地配合在容器主体78的顶部边缘上的框架284。至少一个柔性膜286安装到框架284上并且覆盖至少两个储器(例如64a、64b)。柔性膜的未变形构造以虚线在288处示出。可以将压力290施加到储器64a或64b上方的柔性膜286，以将膜向下推动，这如292所示。该压力驱动流体从一个储器经由腔室54流到另一个储器，这如箭头294、296所示。柔性膜286可以响应地向上偏转，这如298所示。如图52和图53所示，可以将压力施加到柔性膜286，或者施加到储器64a、64b上方，以在储器之间沿相反方向驱动流体。
示例9.所选实施例
该示例将本公开的所选实施例描述为一系列索引段落。
段落A1.一种类器官培养和/或分析的方法，该方法包括：(a)密封接受器的开口侧以形成腔室；以及(b)在腔室中形成类器官。
段落A2.根据段落A1所述的方法，其中，密封包括将密封构件附接到接受器的开口侧。
段落A3.根据段落A2所述的方法，其中，附接密封构件包括将密封构件结合到接受器。
段落A4.根据段落A3所述的方法，其中，结合包括将预制密封构件结合到接受器。
段落A5.根据段落A2或A3所述的方法，其中，密封包括使密封材料在接受器中至少部分地硬化/固化以形成密封构件。
段落A6.根据段落A5所述的方法，其中，密封材料包括热固性树脂。
段落A7.根据段落A6所述的方法，其中，密封包括在接受器中形成热固性树脂层，以及用电磁辐射(诸如紫外光等)照射热固性树脂层以固化热固性树脂。
段落A8.根据段落A7所述的方法，其中，接受器含有支架，以促进类器官形成，并且其中，利用定位和取向为相对于支架优先照射热固性树脂层的光片进行照射。
段落A9.根据段落A7所述的方法，其中，接受器包含支架以促进类器官形成，并且还包含位于热固性树脂层和支架之间的光阻层，并且其中，进行照射以使光传播通过热固性树脂层到达光阻层，光阻层为支架基本上屏蔽了光。
段落A10.根据段落A7至A9中任一项所述的方法，其中，形成热固性树脂层包括利用3D打印机将热固性树脂沉积在位于接受器中的水凝胶上。
段落A11.根据段落A10所述的方法，其中，水凝胶包括支持类器官形成的支架。
段落A12.根据段落A11所述的方法，其中，水凝胶包括促进类器官形成的第一水凝胶和临时支持热固性树脂层的第二水凝胶，并且其中，第二水凝胶配置为当腔室用于类器官培养时基本上溶化或溶解。
段落A13.根据段落A1至A3和A5中任一项所述的方法，其中，接受器包含支架，以促进类器官形成，并且其中，密封包括在包含支架的水凝胶上形成热塑性材料层，并通过冷却使热塑性材料层硬化以气密密封接受器的开口侧。
段落A14.根据段落A1至A13中任一项所述的方法，其中，接受器由容器主体限定，并且其中，密封包括将密封构件附接到容器主体的底端。
段落A15.根据段落A1至A14中任一项所述的方法，该方法还包括将流体和/或至少一种物质从上覆储器引入到腔室中(用于与类器官接触)，并且其中，可选地，腔室和上覆储器彼此一体形成。
段落A16.根据段落A15所述的方法，其中，引入包括将流体和/或至少一种物质经由从上覆储器延伸到腔室的通道传递到腔室中，并且其中，可选地，通道与上覆储器和腔室一体形成。
段落A17.根据段落A15或A16所述的方法，其中，引入包括使营养物通过腔室的顶壁从而为类器官进料。
段落A18.根据段落A15至A17中任一项所述的方法，其中，引入包括使标记物通过腔室的顶壁以标记至少一部分类器官。
段落A19.根据段落A15至A18中任一项所述的方法，其中，引入包括：
(i)使一种或多种效应物穿过腔室的顶壁，并且其中，一种或多种效应物选自下述群组，所述群组包括：分化因子、生长因子、抗癌化合物、表达载体、病毒、寡核苷酸、信使RNA和小干扰RNA；和/或
(ii)使分子穿过腔室的顶壁，其中，分子被配置用于类器官的基因组编辑(例如，类器官的细胞内的靶序列的一个或多个核苷酸的删除、插入或取代)，诸如使用CRISPR-Cas系统、TALEN系统等的基因组编辑；和/或
(iii)使分子穿过腔室的顶壁，以在体内标记类器官的一个或多个基因组基因座和/或通过与那些基因结合来改变一个或多个基因的表达，其中，分子基于CRISPR-Cas系统、TALEN系统等。
上述(ii)或(iii)的分子可以包括指导RNA、CRISPR-Cas表达的效应分子、含有指导RNA和/或CRISPR-Cas系统蛋白的表达载体的病毒、或CRISPR-Cas蛋白的任意组合。
段落A20.根据段落A15或A19所述的方法，其中，引入包括使一种或多种固定剂和/或清除剂穿过腔室的顶壁。
段落A21.根据段落A15至A20中任一项所述的方法，其中，引入包括利用重力将流体从储器驱动到腔室中。
段落A22.根据段落A15至A21中任一项所述的方法，其中，引入包括将流体从腔室的入口驱动到出口，并且其中，该入口和出口各自包括延伸穿过腔室的顶壁的相应通道。
段落A23.根据段落A15至A22中任一项所述的方法，其中，腔室与第一上覆储器和第二上覆储器处于独立流体连通，并且其中，引入包括将流体和/或至少一种物质从第一上覆储器和第二上覆储器中的每一个引入到腔室中。
段落A24.根据段落A23所述的方法，其中，类器官限定位于其内部的内部空间和位于类器官外部并在腔室内的外部空间，并且其中，由第一上覆储器保持的流体被供给到内部空间，由第二上覆储器保持的流体被供给到外部空间。
段落A25.根据段落A15至A24中任一项所述的方法，其中，腔室与第一储器和第二储器处于独立流体连通，该方法还包括利用泵将流体从第二储器转移至第一储器，以促进从第一储器经由腔室到第二储器的重力驱动流。
段落A26.根据段落A25所述的方法，其中，泵以与重力驱动流的速率基本匹配的速率将流体从第二储器转移到第一储器。
段落A27.根据段落A26所述的方法，其中，腔室与由容器主体限定的第一储器和第二储器处于独立流体连通，该方法还包括反复倾斜容器主体，以交替地产生从第一储器到第二储器以及从第二储器到第一储器的重力驱动流。
段落A28.根据段落A15至A27中任一项所述的方法，其中，第一储器和第二储器经由各自的第一通道和第二通道而与腔室处于流体连通，其中，第一储器和第二储器彼此经由在腔室的顶壁上方且与腔室的顶壁间隔开的第三通道而处于直接流体连通。
段落A29.根据段落A15至A28中任一项所述的方法，其中，第一储器和第二储器位于腔室之上并与腔室处于独立流体连通，该方法还包括在第一储器上方设置柔性膜，以及向柔性膜的顶侧施加压力以驱动流体从第一储器经由腔室流到第二储器。
根据段落A30.根据段落A29所述的方法，其中，设置柔性膜包括在第一储器和第二储器中的每一个上方设置柔性膜，并且其中，施加压力包括交替地向第一储器上方的柔性膜的顶侧和向第二储器上方的柔性膜的顶侧施加压力，以沿相反方向交替地驱动第一储器和第二储器之间的流体。
段落A31.根据段落A1至A30中任一项所述的方法，还包括在密封接受器的开口侧之前将支架设置于接受器内，支架被构造成促进类器官形成。
段落A32.根据段落A31所述的方法，其中，设置支架包括在接受器内形成支架。
段落A33.根据段落A31所述的方法，其中，设置支架包括将预制的支架放置在接受器中。
段落A34.根据段落A31至A33中任一项所述的方法，还包括在密封接受器的开口侧之前将生物细胞引入到接受器中。
段落A35.根据段落A34所述的方法，其中，生物细胞包括干细胞。
段落A36.根据段落A34或A35所述的方法，其中，在形成支架时将生物细胞引入到支架中。
段落A37.根据段落A32和A34至A36中任一项所述的方法，其中，通过3D打印来形成支架。
段落A38.根据段落A37所述的方法，其中，形成支架包括在接受器中3D打印至少两种不同的水凝胶。
段落A39.根据段落A38所述的方法，其中，至少一种水凝胶在3D打印时含有细胞，以实现促进特定类器官形成的任意形状的3D支架。
段落A40.根据段落A31至A39中任一项所述的方法，其中，接受器具有与开口侧相对的壁，并且其中，支架附接到该壁。
段落A41.根据段落A31至A40中任一项所述的方法，还包括在密封接受器的开口侧以形成腔室后将用于形成类器官的生物细胞引入到腔室中。
段落A42.根据段落A31至A41中任一项所述的方法，其中，腔室具有顶壁，并且其中，类器官在形成时由顶壁支撑。
段落A43.根据段落A31至A42中任一项所述的方法，其中，腔室经由通道而与多个上覆储器处于流体连通，该方法还包括通过3D打印形成一个或多个通道的延伸部，和任选将延伸部嵌入水凝胶中。
段落A44.根据段落A43所述的方法，还包括通过3D打印延长和分支每个延伸部以形成一个或多个横向可渗透的管，用于将物质供给到水凝胶内部的细胞。
段落A45.根据段落A44所述的方法，还包括经由一个或多个横向可渗透的管供给一个或多个效应物，以在腔室内建立效应物的一个或多个浓度梯度，用于更受控的干细胞分化和类器官形成。
段落A46.根据段落A43至A45中任一项所述的方法，还包括将聚合物或金属微管掺入水凝胶中以促进流体流动。
段落A47.根据段落A1至A46中任一项所述的方法，该方法还包括在类器官仍留在腔室中时收集与类器官相关的数据。
段落A48.根据段落A47所述的方法，其中，收集数据包括捕获类器官的至少一部分的图像。
段落A49.根据段落A48所述的方法，其中，捕获包括通过光片显微术捕获图像。
段落A50.根据段落A48或A49所述的方法，其中，捕获包括检测来自类器官的光致发光。
段落A51.根据段落A48至A50中任一项所述的方法，其中，捕获包括捕获代表类器官的至少一部分的3D结构的图像堆叠。
段落A52.根据段落A51所述的方法，其中，捕获包括经由腔室的横向窗口照射类器官的至少一部分，以及检测经由腔室的底部窗口传播出腔室的光学辐射，反之亦然。
段落A53.根据段落A47至A52中任一项所述的方法，其中，收集数据包括针对分析物来分析来自腔室或上覆隔室的流体。
根据段落A54.根据段落A47至A53中任一项所述的方法，其中，利用至少部分位于腔室内的传感器进行数据收集。
段落A55.根据段落A47至A54中任一项所述的方法，其中，收集数据包括收集在腔室的底部保持密封的同时从腔室移除的细胞和/或流体的数据。
段落A56.根据段落A55所述的方法，其中，收集数据包括在腔室的顶壁中形成开口以及经由开口从腔室移除细胞和/或流体。
段落A57.根据段落A1至A56中任一项所述的方法，该方法还包括在腔室的壁中形成开口；以及将器械的端部从开口插入到腔室中。
段落A58.根据段落A57所述的方法，其中，多个上覆隔室与腔室共用公共壁，并且其中，开口形成在上覆隔室之一的底端处的公共壁中。
段落A59.根据段落A58所述的方法，其中，多个上覆隔室包括多个储器和一个或多个进入管，并且其中，开口形成在进入管之一的底端处。
段落A60.根据段落A58或A59所述的方法，其中，利用器械形成开口，并且其中形成开口包括利用器械的端部破裂公共壁。
段落A61.根据段落A57至A60中任一项所述的方法，其中，器械的端部是锐利端部。
段落A62.根据段落A60或A61所述的方法，其中，形成开口包括在开口处形成器械与公共壁之间的流体紧密密封。
段落A63.根据段落A60至A62中任一项所述的方法，其中，公共壁限定了如下特征：公共壁被构造成通过经由器械施加在公共壁上的机械压力而被撕裂。
段落A64.根据段落A57至A63中任一项所述的方法，其中，器械选自下述群组，所述群组包括：针、可操作地连接到光源的光导、内窥镜、电极、ATR探针、可选地联接到囊体的气动/液压的源、以及磁体。
段落A65.根据段落A57至A64中任一项所述的方法，其中，器械包括位于其端部的传感器。
段落A66.根据段落A65所述的方法，还包括使用传感器感测腔室和/或类器官的参数。
段落A67.根据段落A57至A66中任一项所述的方法，其中，器械包括构造成电刺激类器官的电极。
段落A68.根据段落A67所述的方法，该方法还包括使用电极电刺激类器官。
段落A69.根据段落A57至A68中任一项所述的方法，其中，器械包括光导，光导与光源光学耦合且在引入腔室中的端部处具有孔。
段落A70.根据段落A57至A69中任一项所述的方法，其中，器械包括位于引入腔室中的端部处的磁体。
段落A71.根据段落A57至A70中任一项所述的方法，其中，器械包括衰减全反射(ATR)探针。
段落A72.根据段落A57至A71中任一项所述的方法，其中，器械包括内窥镜。
段落A73.根据段落A57至A72中任一项所述的方法，其中，器械联接至气动或液压的源。
段落A74.根据段落A1至A73中任一项所述的方法，还包括将测试化合物引入到腔室中。
段落A75.根据段落A1至A74中任一项所述的方法，其中，该方法包括在相应的多个腔室中形成多个类器官。
段落A76.根据段落A75所述的方法，还包括对每个类器官施加不同的处理。
段落A77.根据段落A76所述的方法，其中，施加不同的处理包括将不同的测试化合物引入到多个腔室中的每个腔室。
段落A78.根据段落A77所述的方法，其中，每种不同的测试化合物是潜在的抗癌药物。
段落A79.根据段落A76至A78中任一项所述的方法，还包括将一种或多种细胞(可选地癌细胞)引入到每个腔室中。
段落A80.根据段落A79所述的方法，其中，可选地经由针将一个或多个细胞引入到腔室中的类器官中，可选地其中，针刺破腔室的顶壁。
段落A81.根据段落A76至A80中任一项所述的方法，还包括收集多个类器官中每个类器官的数据以测试不同的处理对类器官的影响。
段落A82.根据段落A81所述的方法，其中，收集数据包括在每个类器官各自的腔室中原位成像每个类器官。
段落A83.根据段落A81或A82所述的方法，其中，收集数据包括针对分析物来分析与每个类器官相关的相应流体。
段落A84.根据段落A81至A83中任一项所述的方法，其中，收集数据包括可选地在移除密封构件之后从每个类器官的腔室移除该类器官。
段落A85.根据段落A84所述的方法，其中，收集数据包括在从每个类器官的腔室移除该类器官后对每个类器官进行成像。
段落A86.根据段落A85所述的方法，其中，收集数据包括在从每个类器官的腔室移除该类器官之后对每个类器官进行物理切片；以及可选地，对通过物理切片产生的多个切片进行成像。
段落B1.一种类器官培养和/或分析的方法，该方法包括：(a)在腔室内形成类器官，其中，进入管在腔室上方，并且其中，进入管的底端由腔室的顶壁区域封闭；(b)向腔室供给营养物从而为类器官进料；(c)形成穿过顶壁区域的开口；以及(d)将器械的端部从进入管插入到腔室中。
段落C1.一种类器官培养和/或分析的方法，该方法包括：(a)密封接受器的开口侧以形成腔室；(b)在腔室内形成类器官；(c)将物质/流体供给到腔室；以及(d)在类器官仍被腔室的壁封闭的同时捕获类器官的至少一部分的图像。
段落D1.一种用于有组织的多细胞结构(例如类器官)的培养和/或分析的装置，该装置包括：(a)主体，主体限定接受器和至少两个储器，至少两个储器置于接受器上并且经由相应的通道与接受器处于独立流体连通；以及(b)密封构件，密封构件在接受器的开口侧处结合或可结合到主体，以形成用于多单元结构的腔室。
段落D2.根据段落D1所述的装置，还包括将生物细胞附着于接受器的壁的支架。
段落D3.根据段落D2所述的装置，其中，支架包括在水凝胶中。
段落D4.根据段落D3所述的装置，其中，水凝胶含有生物细胞。
段落D5.根据段落D4所述的装置，其中，生物细胞包括干细胞。
段落D6.根据段落D3至D5中任一项所述的装置，其中，水凝胶含有药物的沉积物。
段落D7.根据段落D6所述的装置，其中，沉积物能够通过光诱导释放来打开，以从沉积释放药物。
段落D8.根据段落D1至D7中任一项所述的装置，其中，接受器和至少两个储器彼此一体地形成。
段落D9.根据段落D1至D8中任一段所述的装置，其中，主体被注射成型为单件。
段落D10.根据段落D1至D9中任一项所述的装置，其中，至少两个储器中的每个储器与接受器共用壁。
段落D11.根据段落D1至D10中任一项所述的装置，其中，每个通道延伸穿过位于相应储器和接受器之间的壁，并且该壁可选地在相应储器和接受器之间共用。
段落D12.根据段落D1至D11中任一项所述的装置，还包括可移除的盖子，可移除的盖子被构造成覆盖至少两个储器中的每个储器的开口顶部。
段落D13.根据段落D1至D12中任一项所述的装置，其中，装置处于灭菌条件。
段落D14.根据段落D1至D13中任一项所述的装置，其中，密封构件结合至主体。
段落D15.根据段落D14所述的装置，其中，在腔室中容纳有类器官。
段落D16.根据段落D1至D15中任一项所述的装置，其中，主体限定至少四个储器，每个储器设置成与接受器处于流体连通。
段落D17.根据段落D1至D16中任一项所述的装置，其中，密封构件被构造成提供底部窗口，用于对容纳在腔室中的类器官的至少一部分成像。
段落D18.根据段落D1至D17中任一所述的装置，其中，主体设置有一对横向窗口，以允许经由任一横向窗口照射容纳在腔室中的类器官的至少一部分。
段落D19.根据段落D1至D18中任一项所述的装置，其中，主体限定具有开口顶端和封闭底端的进入管，并且其中，共用壁将腔室与管的底端分开。
段落D20.根据段落D1至D19中任一项所述的装置，还包括彼此连接的基本相同单元的直线状阵列，其中，单元之一包括接受器和至少两个储器。
如本公开中所使用的术语“示例性”是指“说明性的”或“作为示例”。类似地，术语“举例说明”是指“通过给出示例来说明”。该术语既不意味着合意性也不意味着优越性。
上述公开内容可以包括具有独立效用的多个不同的发明。尽管这些发明中的每一个都以其优选形式公开，但是这里公开和示出的其具体实施例不应被认为是限制性的，因为许多变化是可能的。本发明的主题包括本文公开的各种元件、特征、功能和/或特性的所有新颖和非显而易见的组合和子组合。所附的权利要求特别指出了被认为是新颖的和非显而易见的某些组合和子组合。在特征、功能、元件和/或特性的其它组合和子组合中实施的发明可以在要求本申请或相关申请的优先权的申请中要求保护。无论是针对不同的发明还是针对相同的发明，并且无论是比原始权利要求的范围更宽、更窄、相等或不同，这样的权利要求均被认为包括在本公开的发明的主题内。此外，除非另有明确说明，否则用于所标识的元件的诸如第一、第二或第三的顺序指示符只是用于区分元件，并且不指示这些元件的特定位置或顺序。

Claims (29)

1.一种类器官培养的方法，所述方法包括：
将支架设置在具有开口侧的接受器中；
将密封构件结合到所述接受器的所述开口侧以形成腔室；以及
使用所述支架在所述腔室中形成类器官。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，结合包括将预制的密封构件结合到所述接受器。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，结合包括通过使密封材料在所述接受器中至少部分地固化来形成所述密封构件。
4.根据权利要求1所述的方法，还包括将流体和/或至少一种物质从与所述接受器一体形成的上覆储器引入到所述腔室中。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，设置支架包括在所述接受器中3D打印支架。
6.根据权利要求1所述的方法，还包括在所述类器官位于所述腔室中时捕获所述类器官的至少一部分的图像。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，捕获包括通过光片显微术捕获图像。
8.一种类器官培养的方法，所述方法包括：
将支架设置在接受器的壁上；
将密封构件附接到所述接受器的定位成与所述壁相对的开口侧以形成腔室；以及
在所述密封构件位于所述腔室的底部的同时，使用所述支架在所述腔室中形成类器官。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，设置支架包括在所述接受器中3D打印所述支架。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，3D打印包括将干细胞掺入所述支架中。
11.根据权利要求8所述的方法，其中，附接密封构件包括将所述密封构件结合到所述接受器的所述开口侧。
12.根据权利要求8所述的方法，还包括：
在所述腔室的顶壁中形成开口；以及
将器械的端部从所述开口插入所述腔室中。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述器械选自下述群组，所述群组包括：针、可操作地连接到光源的光导、内窥镜、电极、ATR探针、联接到囊体的气动/液压的源、以及磁体。
14.一种类器官培养的方法，所述方法包括：
将支架设置在接受器的壁上；
将密封构件附接到所述接受器以形成腔室；
使用所述支架在所述腔室中形成类器官；以及
将流体和/或至少一种物质从上覆储器穿过所述壁引入到所述腔室中以与所述类器官接触。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，引入包括使所述流体和/或至少一种物质经由通道进入所述腔室，所述通道延伸穿过位于所述上覆储器和所述腔室之间的壁。
16.根据权利要求14所述的方法，其中，引入包括使营养物通过所述腔室的顶壁从而为所述类器官进料。
17.根据权利要求14所述的方法，其中，引入包括使一种或多种固定剂和/或清除剂通过所述腔室的顶壁。
18.根据权利要求14所述的方法，其中，引入包括利用重力将流体从所述储器驱动到所述腔室中。
19.根据权利要求14所述的方法，其中，引入包括将流体从所述腔室的入口驱动到出口，并且其中所述入口和所述出口中的每一个包括延伸穿过所述腔室的顶壁的通道。
20.根据权利要求14所述的方法，还包括：
在相应的多个腔室中形成多个类器官；以及
对每个所述类器官施加不同的处理。
21.根据权利要求20所述的方法，其中，施加不同的处理包括将不同的测试化合物引入所述多个腔室的每个腔室中。
22.根据权利要求20所述的方法，其中，施加不同的处理包括通过基因组编辑改变每个类器官的相应腔室中的遗传物质。
23.根据权利要求20所述的方法，其中，施加不同的处理包括使用一种或多种DNA结合剂在每个类器官的相应腔室中体内标记所述每个类器官的至少一个基因组基因座或改变所述每个类器官的基因表达谱。
24.根据权利要求20所述的方法，还包括收集所述多个类器官中的每个类器官的数据，以测试所述不同的处理对所述类器官的影响。
25.根据权利要求24所述的方法，其中，收集数据包括在每个类器官的相应腔室中原位成像每个类器官。
26.根据权利要求24所述的方法，其中，收集数据包括针对分析物来分析与每个类器官相关联的相应流体。
27.根据权利要求24所述的方法，其中，收集数据包括从每个类器官的腔室中移除每个类器官，以及在从每个类器官的腔室移除每个类器官后从所述类器官收集数据。
28.根据权利要求27的方法，其中，收集数据包括在从每个类器官的腔室移除每个类器官之后对每个类器官进行物理切片。
29.根据权利要求14所述的方法，其中，第一储器和第二储器置于所述腔室上并且与所述腔室处于独立流体连通，所述方法还包括将柔性膜设置在所述第一储器上方，以及将压力施加到所述柔性膜的顶侧，以将流体从所述第一储器经由所述腔室驱动到所述第二储器。
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