CN106536707A - 在生物反应器系统中制造心脏类器官的方法和装置 - Google Patents

Abstract

本发明描述了并且在示例性附图中示出了用于制造心脏类器官腔室并用于其随后测试的生物反应器系统。生物反应器系统包括具有中空内部和开口顶部的第一容器。第一盖体与第一容器的开口顶部匹配。第一盖体具有形成在其上的第一开口。该系统还包括具有从开放的第一端延伸到开放的第二端的内腔的套管。套管设置在第一盖体的第一开口内，使得套管的一部分位于第一盖下方并且用于插入第一容器的中空内部。多孔环连接到套管开口的第二端处或附近。该系统还包括在导管轴的远端末端具有可膨胀气囊的气囊导管。当气囊处于放气状态时，气囊导管适于穿过套管的内腔。气囊导管在管腔内轴向调节，以使处于膨胀状态的气囊被设置靠近于：(1)套管的开放的第二端；和(2)用于在膨胀的气囊和多孔环周围制造心脏类器官腔室的多孔环。套管和多孔环的构造和组合使得可以将气囊放气并从套管的内腔移除，同时工程制造的心脏类器官腔室仍连接到多孔环。这使得能够测试类器官泵功能，例如类器官的压力和体积特征，而不必将工程制造的心脏类器官从一个器具(例如，孵育器)转移到另一个器具(例如功能测试装置)。

Description

在生物反应器系统中制造心脏类器官的方法和装置

相关申请的交叉引用

本申请要求2014年5月29日提交的序列号62/004,467的美国专利申请的优先权，其全部内容通过引用明确地并入本发明。

技术领域

本发明大体上涉及类器官生物反应器，更具体地，涉及为了从细胞源(例如，人细胞)制造心脏类器官(类器官腔室)的装置和方法，该装置配置用于泵送流体并模拟自然心脏泵功能的关键方面。

背景技术

由于人类心脏仅仅具有有限的自我再生能力并且对心脏肌肉的损伤通常导致不可逆的心脏功能障碍，受损心脏修复仍然是主要的挑战。许多研究正在开发能够利用新的肌肉修复心肌衰竭的技术。许多现有的用于体外模型的心脏组织构建体是组织条或贴片的形式。这些组织条和贴片可用于测量收缩力，但不能直接生成心脏病专家被培训理解的测量类型，例如体积、压力、射血分数和博出功。最近，已经开发出产生能够生成这些测量类型的心脏组织腔室(类器官)的技术，并且这些较新的技术需要许多复杂的步骤。

例如，用于创造心脏类器官的技术通常需要1)将冷的细胞-基质溶液引入外部杯形模具中；2)将细胞-基质溶液中的气囊导管充胀至所需的腔室尺寸，以形成内模具边界；3)在气囊上方放置接触细胞-基质溶液的小环，以防止培养期间组织滑动；4)在规定的时间段后，例如24小时，移除外部杯形模具；5)将剩余的细胞-基质溶液与气囊导管一起孵育规定的时间段，例如7至10天，在此期间制造出的心脏组织(类器官)将形成围绕气囊压紧的协调网络；6)小心将气囊放气，并在孵育期后从放气的气囊导管除去组织；及7)通过将其缝合到流体填充的套管来将所述类器官连接到隔离的心脏装置。

虽然这些较新的技术已经有效产生对于心脏病专家评价工程制造的心脏组织的功效有重要作用的测试类型，但是它们需要研究人员在移除气囊导管及将类器官缝合到套管时对类器官非常熟练，以避免损伤或损坏类器官的结构。

发明内容

本发明描述并且在示例性附图中示出了用于制造心脏类器官腔室并随后用于对其进行测试的生物反应器系统。所述生物反应器系统包括具有中空内部和开口顶部的第一容器。第一盖体匹配第一容器开口顶部。所述第一盖体具有在其上形成的第一开口。该系统还包括具有内腔的套管，所述内腔从开放的第一端延伸到开放的第二端。所述套管设置在所述第一盖体的第一开口内，使得套管的一部分位于第一盖体的下方并插入到第一容器的中空内部。多孔环连接到所述套管开放的第二端处或附近。该系统还包括气囊导管，所述气囊导管在导管轴(例如，柔性管状结构)的远端处具有可膨胀的气囊。当所述气囊处于放气状态时，所述气囊导管适于穿过所述套管的内腔。气所述囊导管在内腔内轴向地调节，以使处于膨胀状态的气囊被设置靠近于：(1)所述套管开放的第二端；和(2)为了在膨胀的气囊和多孔环周围制造心脏类器官腔室的多孔环。套管和多孔环构造及组合使得气囊放气并从套管的内腔移除，而工程化的心脏类器官腔室仍然连接到多孔环。这允许测试类器官的泵功能，例如类器官压力和体积特征，而不必将工程化的心脏类器官从一个工具(例如，孵育工具)转移到另一个工具(例如功能测试装置)，该转移会损坏类器官和损害活组织的无菌性和活力。

附图说明

图1A-C是心脏类器官腔室培养系统(生物反应器)的示意图，图1A是在内部硅胶气囊和外部琼脂糖模具之间的组织铸造，最初24小时；如图1B所示，除去琼脂糖模具后组织放置在细胞培养基中；如图1C所示是碳棒就位的整个生物反应器，为了电起搏；

图2是整个生物反应器设计的侧视图，包括为了hCOC模具外部和内部部件对齐的夹具；

图3A和3B分别示出了套管/电极夹具的侧视图和俯视图；

图4A和4B分别显示了琼脂糖模具夹具的侧视图和俯视图；

图5示出了用琼脂糖模具定位的芯棒(试管)的横截面图；

图6示出了移除芯棒的琼脂糖模具的横截面图；

图7示出了气囊导管穿过套管的内腔的横截面图；

图8示出了导管的气囊膨胀状态的横截面图；

图9是示例性类器官功能测试系统的示意图；

图10是另一个示例性类器官功能测试系统的示意图；

图11是在无橡胶O形环密封件就位的测试期间类器官腔室压力随时间的曲线图；

图12是橡胶O形环密封件就位时类器官腔室压力随时间的曲线图；及

图13是在电信号光学映射期间类器官腔室的曲线图。

具体实施方式

根据本发明，提供了用于制造工程制造的类器官结构的装置和方法，更具体地，用于使用生物反应器制造心脏类器官(心脏类器官腔室)，所述类器官配置用于泵送流体并模拟自然心脏泵功能的关键方面。与本发明所述的常规工程技术和测试技术不同，本发明的装置和系统不需要将心脏类器官从一个仪器移出然后将该工程制造的心脏类器官放置在用于测试该类器官泵功能的第二个仪器上。附录A列出了可用于本发明所述装置(生物反应器)和相关测试设备的示例性材料的列表。

制造工程制造的心脏类器官腔室

参考图1-8，为了创造细胞密集的心脏类器官腔室，使用生物反应器(系统)100。如本发明所述，生物反应器100是整个系统的一部分，该系统配置用于在生物反应器100中工程制造出类器官后测试类器官功能，包括泵功能。

下面制造了一种示例性生物反应器100。气囊导管110用在生物反应器100中，并且包括具有远端末端114的细长轴112。轴112可以是柔性的管状结构形式。轴112包括在其中形成的至少一个内腔。在远端末端114设置有可膨胀的气囊120。可膨胀的气囊120与在轴112中形成的内腔流体连通，使得膨胀流体可以通过内腔输送或通过内腔或另一内腔移除，用于改变气囊120的膨胀特性。

应当理解，轴112可以延伸穿过气囊120以提供额外的支撑，并且在该实施例中，气囊120围绕该轴的远端末端。或者，气囊120可以是无支撑的并且密封地连接到轴112的远端末端，使得气囊120的至少一部分无支撑并且与轴112间隔开。

导管110可以通过改造现有的气囊导管来构造，如柔性Foley导管。特别地，通常在Foley导管中发现的远端尖端可以去除。当切除该导管的尖端时，气囊120的底部与导管轴112的端部齐平。轴的开口切割端可以用合适的材料密封，例如硅胶(填缝)。

如下所述，在细胞培养过程中使用第一环(多孔环)130。第一环130可以是亲水性多孔聚乙烯环的形式。第一环130与第一套管140一起使用。第一套管140是细长套管的形式，其具有远端末端142和相对的近端末端144。第一套管140由合适的生物相容性材料形成，该材料不会在生物反应器100中使用的培养基中腐蚀、生锈菌、降解、溶解等。此外，第一套管140由容易消毒(比如利用高压灭菌器、UV暴露等)的材料形成。

在一个实施例中，第一套管140是预定长度(例如，大约8cm)的9号不锈钢管，并且具有预定宽度(例如，外径(O/D)约0.15英寸及内径(I/D)约0.12英寸)。

第一环130在套管140上居中，并且O形环135优选地与第一环130组合使用(参见图9)。O形环135由合适的材料形成，例如橡胶。O形环135放置在套管140上，并且布置第一环130使得其设置在套管140的远端末端。O形环135被向下推至第一环130的顶部，但不会使第一环130从套管140的远端末端位移。O形环135提供防水密封，以防止流体泄漏。

应当理解，套管140具有足够的刚度，以使当所述一旦导管110插入通过套管140的内腔并且气囊120如下文所述膨胀时，以使膨胀的气囊120被保持在套管140的远端末端的适当位置。另外，套管140刚性足够使其保持形状并使导管110从其内腔插入及移除，并且还不会因密封地设置在其周围的O形环135变形。

模具的制造

如图5-6所示，通过准备合适的模具材料来制造模具150，然后将模具材料放置在第一模具容器(器皿(vessel))152内。第一模具容器152具有中空内部并且可以有矩形形状。然后将预定量的模具材料添加到第一模具容器152的中空内部。在一个示例性实施例中，模具材料是琼脂糖水凝胶溶液，例如2％的琼脂糖溶液，其提供结构支撑，并且仍是可渗透的和非粘性的。在一个实施例中，将约20mL的琼脂糖溶液加入到第一模具容器152中。然后通过将芯棒153引入模具材料中制造模具。芯棒153可以是带有半球形尖端的圆柱形结构形式，如试管(例如，13mm试管)。芯棒153在第一模具容器152内居中放置并定位成使其在第一模具容器152内与模具材料正交(垂直)。应当理解，当模制过程完成并且抽出芯棒时，一个芯棒153形成一个模具腔。

如图4A、4B、5和6所示，芯棒153可以使用第一支撑构件(盖体)或第一夹具200悬挂在模具材料中。第一夹具200设计成盖住第一模具容器152，很像鞋盒盖盖住盒子的底部。然而，应当理解，在本发明中可以使用其他夹具设计。第一夹具200具有上表面202和侧壁204。上表面202具有在其上形成的开口206，开口206配置用于接收芯棒153。因此，芯棒153可以由第一夹具200支撑，使得芯棒153可以锁定在所需的位置，以在芯棒153的底部和第一模具容器153的底部之间形成所需的间隔。因此，芯棒153可以在开口206内滑动，并且可以使用锁定机构210将芯棒153锁定在所需的位置。例如，可以使用延伸穿过一个侧壁204的第一固定螺钉212将芯棒153固定就位于模具材料内，该模具材料在第一模具容器152内。为了移动芯棒153，松开固定螺钉212以使芯棒153轴向移动，当芯棒153处于所需的位置时，紧固固定螺钉212。可以使用其他的锁定机构。

在一个实施例中，芯棒定位在模具材料(琼脂糖溶液)内，使得在芯棒的底部和第一模具容器152的底部之间有约0.5-0.75cm的模具材料。在模具材料凝固之后，将芯棒从模具材料小心中地移除，在模具材料中留下空隙(例如，试管的印记)。该空隙限定了形成的模具腔155，其为杯形(图1A和6)。然后将在第一模具容器152内形成的模具放在UV灯等下面灭菌。

可以进行附加步骤以对模具进行使用准备。例如，可以向模具中加入约1.5mL灭菌的2％BSA(牛血清白蛋白)溶液，然后盖上第一模具容器152，并将模具孵育预定的时间(例如，在约37℃下1h)。在孵育期结束后，可以用包含磷酸盐缓冲盐溶液和去离子水的一种或多种溶液洗涤模具。在一个具体实施例中，洗涤过程包括用磷酸盐缓冲盐溶液洗涤模具三次并用去离子水洗涤一次。然后从模具中除去去离子水并干燥模具。

模具150因此可以由在磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)中的2％琼脂糖形成。

根据本发明且如图3A和3B所示，提供第二支撑构件(盖体)或第一夹具220以与器皿或容器(例如第一模具容器152)的开口匹配。第二夹具220设计用于盖住第一模具容器152和另一个如下所述随后使用的器皿。第二夹具220具有上表面222和侧壁224(其可以安装在器皿300的侧壁上)。上表面222具有在其上形成的多个开口。在所示实施例中，第二夹具220具有在其上形成的三个开口230、232、234，第二开口232是中间的那个。

应当理解，开口230、232、234不必具有相同的特征(形状和/或尺寸)，并且在所示实施例中，开口232与开口230、234不同。更具体地，开口232代表开口230、234之间的中间开口，其比开口230、234更大(更大的直径)。

如第一夹具200，第二夹具220具有锁定机构，用于牢固地定位和固定插入开口230、232、234任一个中的构件(工具/器械)。例如，可以使用多个固定螺钉240，并且特别地，固定螺钉240穿过一个或多个侧壁224。在所示实施例中，用于中间开口232的固定螺钉240穿过一个侧壁224，而其它两个用于开口230、234的固定螺钉240穿过相对的侧壁224以便于单独的固定螺钉240的无阻碍操作。固定螺钉240可以是尼龙螺钉的形式，以避免腐蚀并使对插入的工具/器械的损坏最小化。

中间开口232构造用于接收套管140。因此套管140的远端末端穿过中间开口232，以便将套管140的远端末端定位在第二夹具220下。应当理解，套管140包括第一环130和O形环135(两者都设置在套管的远端末端处或附近)。

为了进一步制造工程制造的心脏类器官腔室，导管110穿过在套管140中形成的内腔。当导管110穿过内腔时，气囊120处于放气状态(图7)。导管110前进通过内腔直到气囊120延伸超过套管140的开口的远端末端。然后通过将膨胀液(例如，去离子水)注入气囊120中使气囊120膨胀。气囊120膨胀后，轻轻地拉回导管110，以便使膨胀的气囊120抵靠在套管140的远端末端定位(图8)。因此膨胀的气囊120位于第一环130(支撑环)的正下方。

固定螺钉240可用于将套管140相对于第二夹具220固定定位。

导管110通常是柔性构件，其尺寸设定为略小于套管的内腔，因此，在导管110和套管140之间可以形成摩擦连接。在任何情况下，导管110在套管140的内腔内滑动地行进，以使其重新定位以及插入和移除导管110。

一旦导管110相对于套管140处于上述所需的位置，利用固定机构可以将导管110固定在所需的位置。例如，夹具250或类似部件可以用于将导管110固定在适当位置，或者可以使用固定螺钉对位于套管140的内腔内的导管110施加张力。或者，在导管110和套管140之间可以存在摩擦配合，因此，导管110摩擦地固定在套管140内的适当位置。上述技术有助于维持内部气囊120和外部琼脂糖模具150对齐，如上所述且下面进一步详细的描述。

一旦气囊导管110在气囊120膨胀时固定在所需的位置，接着将第二夹具220插入到第一模具容器152中，第一模具容器152包含有形成的杯形琼脂糖模具150。然后可以在需要时进一步操纵膨胀的气囊120至需要的位置，以将气囊120定位在杯形模具腔中的目标位置。例如，气囊120可以在模具腔内居中放置，使得在琼脂糖壁和气囊120之间存在约2mm的均匀分布的间隙。还可以调节气囊120的体积以增加或减小间隙间距，该间隙间距最终决定所得的类器官腔室的壁厚。另外，可以调节第二夹具220的位置，并且特别地，第二夹具220可以定位成一角度，以辅助气囊120在模具腔内对齐。气囊120还在模具腔155内下降，直到其处于目标位置。例如，可以降低气囊120，直到气囊120被放置在距琼脂糖模具底部约2mm处。因此，气囊120可以同心地位于模具150内。应当理解，上述2mm尺寸的间隔仅仅是示例性而不限制本发明，因为在不同的应用中，该间距的尺寸可以不同于2mm。例如，气囊120可以与模具间隔开(均匀地)约0.5mm至约3mm之间的距离。在附图中以夸张的状态示出了间隙，以看到气囊和模具腔的侧壁。

制备细胞和组织溶液

根据本发明，人心肌细胞(hCM)用作形成人工制造的心脏类器官腔室(hCOC)过程的一部分。如下更详细的描述，使用纯化的牛真皮1型胶原制备冰冻的无菌胶原溶液。将该凝胶与基质胶(Matrigel)胶基底膜基质和细胞悬浮液按照预定的比例混合。这最终形成冷的细胞-基质溶液，且下文详述的实施例描述了用于产生一种冷的细胞-基质溶液的详细步骤。

开口230、234中未被占据的一个可以用作基质进入端口，或者可以形成专用端口235，用于使用合适的仪器将冷的细胞-基质溶液(组织培养混合物)输送到模具腔155中(图1A)。例如，移液管(例如，1000mL移液管)可用于输送冷的细胞-基质溶液。因此，冷的细胞-基质溶液在膨胀的气囊120周围流动并且包含在模具腔155内，模具腔155由外部杯形模具150和膨胀的气囊120和套管140周围的间隙空间限定。第一环130应该完全浸没在冷的细胞-基质溶液中，因此，可以调节气囊120的轴向位置或冷的细胞-基质溶液的体积，以确保第一环130保持浸没。第一环130用于防止在组织培养期间的组织滑动。

然后将所有组件在规定的条件下孵育，引发胶原凝胶聚合。例如，可以在37℃20％O₂、5％CO₂和95％环境湿度下孵育该组件2小时。此外，该组织可以“漂浮”两小时，通过加入足够的新生牛血清(NBS)—补充的培养基以将组织完全浸没组织，然后组件可以返回到培孵育箱中(图1A)。

将组织保持在生物反应器中

在预定的时间段过去(例如，48小时)并且组织已经在第一模具容器152的模具腔内经历自组装构造后，将夹具组件(由夹具220限制并连接套管140和气囊导管110)从模具腔155中移除。然后将夹具组件放置在第二容器300的顶部，该第二容器300与第一模具容器152相似或相同，除了第二容器300不包括琼脂糖模具而是空的。第二容器300的尺寸可以与第一容器152的相同。在将夹具组件配接到第二容器300顶部开口之前，也对第二容器300进行灭菌。

然后经在第二夹具220上形成的基质进入端口(例如开口235)将培养基添加到第二容器300中(图1B)。每天更新一半的培养基。

当组织在第二容器300内的培养基中制备时，气囊120保持膨胀，而第一环130保持在膨胀的气囊120的正上方并围绕套管140。将含有培养基的第二容器300在孵育箱中保持预定的时间，比如7至10天。在此期间，随着工程制造的组织在气囊120周围变得紧密，心肌细胞开始收缩并形成协调网络。换句话说，工程制造的心脏类器官腔室在气囊120周围产生，并且一旦移除气囊120，类器官199(图1C)保持在原位并且密封地连接到围绕套管140设置的第一环130。

根据本发明，跳动的心室(心脏类器官)由人心脏细胞产生。本发明将类器官腔室工程技术与源自多能干细胞的人心肌细胞结合。这种结合得到独特的人的跳动心室，该人的跳动心室在传统的体外培养系统和动物与人类患者临床前测试之间提供了新的桥梁。

测试组织的性能(例如，类器官泵功能)

在预定时间段(如7-10天)培养后，制造用于测试的自发跳动的心脏类器官。具体地，可以在7至10天开始进行起搏和标测实验。首先通过小心地给气囊120放气，从夹具组件移出导管110，同时留下心脏类器官。松开夹具250(图1C)，移除导管110。移除导管110的一种技术是来回轻轻地扭转导管110，以检查组织与气囊120的任何连接。如果察觉到组织的任何连接，将组织放回到孵育箱15分钟，因为这通常有助于组织从气囊120分离。

气囊120放气后，然后将导管110从套管140的开口近端末端缓慢地抽出(移除)(参见图1C)。随着移除导管110，少量(100-200μl)的NBS培养基可以添加到套管140的开口近端末端。通常，随着移除导管110在模具腔(腔室)中形成真空。添加NBS培养基有助于减小真空(如果形成)。另外，当导管110被移除时，导管110可以来回扭转，因为这也有助于释放任何真空。

优选地，在闭环系统400中测试组织(心脏类器官)，如图9(其是示例性类器官功能测试系统的示意图)示出的一个。系统400包括生物反应器100，并且具体地，第二容器300填充有培养基，类器官在199处示出。在常规技术中，从气囊导管物理移除类器官，然后将其缝合或以其他方式连接到测试仪器，不同于常规技术，根据本发明的教导制成的类器官199在套管140周围原位生长，并且特别地，类器官199通过多孔支撑环130和防水密封O形环135连接到套管140，以防止流体泄漏。

连接器410，如T形连接器，密封地且流体地连接到套管140的开口近端末端。因此，连接器410具有可以连接其他物体的第一支架412和第二支架414。开放的储液罐420通过导管430密封地连接到第一支架412。开放的储液罐420含有培养基并且可以含有其他物质，例如酚红，以使得能够监测pH并增强类器官图像的对比度。导管430可以是允许培养基流动的柔性管类型。

平均腔室压力(在类器官199内)可以通过调节开放的储液罐420的高度来控制，具体地，开放的储液罐420可以安装在可调节的平台上(升降台425)，该平台使得可以调节(例如，手动地或通过马达控制)储罐420的高度，以控制负载在类器官199上的静水压力。使用合适的压力传感器440，例如留置式电子压力传感器，测试相对于外部储罐420的腔室压力。传感器440具有探针元件442，该探针元件442穿过第二支架414并穿过套管140的内腔进入类器官199的中心。探针元件442用合适的密封材料415密封到第二支架414，例如一堆可延展的胶，通过连接到开放的储液罐420的导管430保持闭合的流体连接。由压力传感器440记录类器官腔室内产生的被动和主动压力，用于评估收缩功能。高速摄像机(数码相机)450用于监测与压力记录同步的类器官尺寸的变化。

对于收缩性能的电生理学控制的测量，或者在类器官培养期间的慢性电刺激，使用已知为电场刺激的技术，采用一对电极500(连接到电刺激器装置)对类器官腔室进行电起搏。电极500通过在第二夹具220的顶部上形成的开口230、234接收。由于开口230、234相对于开口232处于固定的间隔的关系，电极500保持在固定位置并且与套管140(因此与类器官)间隔开固定的距离，以确保起搏期间良好限定的电场梯度。可以使用任何数量的技术将电极500牢固地连接或耦接到第二夹具220，例如尼龙固定螺钉240。如图所示，电极500向下悬垂到培养基中并且至少大体上与套管140平行。电极500可以选自任何数量合适的导电和非腐蚀性电极材料，包括碳棒电极。因此，电极500靠近并与类器官199间隔开，该类器官199在套管140远端末端处连接到第一环130。

得到的细胞外电图可以使用常规装置记录，例如微电极AC放大器，该微电极AC放大器包括带通滤波器并以预定的频率采样。可以使用个人计算机上的A/D转换器同时获取细胞外电压、腔室压力和数字视频。通过应用灰度阈值并使用合适的图像处理软件(例如ImageJ)自动检测组织边界，可以从数字影像测量腔室横截面积。

下面的图表示出了无O形环密封件135(图11)和有O形环密封件135(图12)时类器官腔室内的压力随时间的变化。使用Millar Mikro-Tip压力传感器测量压力数据，压力传感器穿过套管140并进入类器官腔内，管/传感器的端部用橡皮泥密封以产生封闭的流体系统(图10)。图11中的数据清楚地示出了无O形环密封件135，类器官上的压力负载可以增加但迅速下降，由于流体泄漏出系统。为了确认泄漏源，我们向腔室内的流体添加了染料，以检验流体在多孔支撑环130和刚性管140之间的界面泄漏。当加入O形环135以在该界面产生防水密封时，然后我们能够将腔室压力增加到更高的水平并保持压力稳定，以使在受控的负载压力下测量(图12)。这对精确评估类器官腔室负载相关的泵功能是必要的，其是自然心脏泵功能基本的和临床相关的特征。我们还展示了使用电压敏感荧光染料在类器官腔室表面上电激活波的光学标测(图13)。

图11：在适当位置无橡胶O形环密封件的实施例测试期间类器官腔室压力随时间的变化。当压力增加约8mmH2O(区域A)时，压力没有保持稳定，并且由于流体泄漏出腔室，在小于10秒内快速回落到基线(区域B)。注意，压力信号中的振荡是由于测试期间类器官的跳动。负载压力的不稳定性质极大地阻碍了这些振荡的精确分析。

图12：在适当位置有橡胶O形环密封件的实施例测试期间类器官腔室压力随时间的变化。区域A显示以每5秒约5mmH2O的增量负载从约2mm H2O的基线升高到40mmH2O。每次增量后的稳定区域表明封闭系统能够保持恒定的压力。在接近最大值(区域B)的一些调整后，压力降低至约35mm H2O并保持稳定约20秒(区域C)，表明系统中没有明显的流体泄漏。然后在测试结束时(区域C)压力快速降低至零，表明在宽的范围内精确控制类器官腔室压力的能力。注意图11中压力轴和时间轴刻度差异，其与图12相比，是放大很多的。

图13：在电信号光学标测期间的类器官腔室。该图像显示了使用电压敏感荧光染料(di-4-ANEPPS)荧光强度的伪色，其中在类器官的多个位点处，单独追踪信号强度(即电压)与时间的关系，表明电波从左到右的传播。

生物反应器系统的优点

生物反应器100和相关设备的构建克服了常规设备相关的缺陷，因为类器官腔室直接在仪器上生长(在这种情况下套管140)，所述仪器配置用于在测试阶段以及生成类器官的初始培养阶段使用，类器官在该仪器上生成。因此，本发明的生物反应器100的构建避免了从气囊导管物理分离类器官以及接着使用缝合或类似的方法将类器官转移并连接到测试仪器(例如压力传感器设备)的需要，该过程经常导致类器官的损伤并破坏活的工程制造的组织的无菌性和存活力。

本发明公开的人类类器官腔室和相关的生物反应器系统具有广泛的实际应用，用于创建具有功能性体外模型——具有仿生结构和功能属性的人类心脏，用于增强的药物/毒性筛选和其他(细胞、基因)治疗发现/临床前测试应用。因此，通过为人的心脏创建仿生体外替代品，本技术有助于弥补传统细胞培养系统与体内动物模型及最终临床试验之间的长期差距。本发明基本上提供了体外临床前人体类器官模型，其具有减少和控制的生物复杂性，用于改善的筛选应用，可以提高新型或改变用途的药物的效率和成功率。从人成体多能干细胞(例如iPSCs)产生组织甚至可以实现患者特异性个性化的药物筛选，用于功效或毒性的个体评价。

当需要临床相关的压力-体积特征时，或当对电生理特征的光学标测感兴趣时，使用本发明公开的生物反应器系统产生的人类类器官腔室也是特别合适的。

3D细胞对齐

根据本发明，通过硅胶气囊表面图案化实现3D细胞对齐。更具体地，在气囊120的外表面上可以形成各种表面图案。这些纹理化的气囊在3D类器官腔室中诱导细胞和基质对齐，更像是自然心脏壁。所产生的各向异性从根本上影响组织的结构组织及产生的机械性能和电传导性质，提供一种提高类器官的整体泵功能的新型策略。

实施例

提供以下实施例以更好地说明本发明的实施方式。然而，应当理解，这些实施例本质上仅用作说明，而本发明的实施方案不限于此。

细胞的制备

在单细胞重新聚集成小的细胞群集(例如15-20个细胞的群集)后，hCM备用。在细胞转移之前应当检查存在hCM的板，并且大量细胞已经粘附到板上，细胞可以用细胞刮铲刮除，例如康宁(Corning)细胞刮铲。然后通过以下步骤进一步准备细胞/组织培养物：沉淀细胞(在选择的时间段(例如3分钟)，300×g)，然后吸出上清液，留下约500μL溶液(所得溶液)。然后将上清液重悬于500μL溶液中并转移至不同容器，例如艾本德(Eppendorf)管。细胞在微离心机中以预定的时间(例如5分钟)再次(200×g)经历沉淀过程。然后将所得溶液(组织培养物)放在一边。

可以遵循常规方案来制备用于本发明的hCM。在孵育完成(例如48小时)后，将细胞转移到离心管(例如，15mL管)。

组织的制备

1.早上的第一件事，解冻冰上(或放于冰上在4℃过夜)的基质胶(Matrigel)；

2.将所有的试剂放在冰上(胶原、NaOH、10x PBS、无菌水、HEPES、10x MEM、基质胶)；

3.打开excel文档“Human Tissue Strip Calculations”(“人体组织带计算”)(软件应用)；

4.在“Start Here”(“从这里开始”)选项下，输入所需组织的总数、组织体积(通常1.2mL)和所需的细胞浓度(通常为1千万hCM/mL)；

5.点击“Final Solution”(“最终的溶液”)选项，查看每种混合物的组分。你将在三个试管中创建三种溶液：1)胶原的稀释物，Collagen Dilution(胶原稀释液)；2)胶原与MEM和HEPES的混合，Collagen Mix(胶原混合物)；及3)含有细胞的最终的组织混合物，Tissue Mixture(组织混合物)。最终的组织混合物由2mg/mL牛I型胶原和0.9mg/mL基质胶组成；

6.在excel文档中的“Final Solution”(“最终的溶液”)的选项下，组织混合物出现两次。第一组，组织混合物(已知[细胞])，如果你知道你的细胞浓度，将给出每个组分的量。使用hCM这是相当困难的。相反，可以使用第二组，即组织混合物(已知细胞数目)，其将告诉你重悬hCM的体积，以便得到用于组织的正确的细胞浓度。然而，组织混合物(已知细胞数目)取决于已知溶液中细胞的总数。通常，假设来自再重聚的所有2百万个细胞存活到组织阶段，所以每个再聚板将有2百万个细胞；

7.使用excel文档中规定的体积创建每个溶液。通常，组分可以以从上到下的顺序加入(例如，胶原，然后是10x PBS，然后是1M NaOH，然后是胶原稀释溶液的灭菌水)；

a.如果使用组织混合物(已知细胞数目)，通过用p20移液管轻轻吸取上清液，从hCM细胞沉淀中去除所有上清液(参见第II部分，步骤5)，并用描述在组织混合物(已知细胞数)的基质体积替换。

b.可以将10x MEM和HEPES直接加入到胶原稀释物中以形成胶原混合物。这避免了可能引入错误的额外的移液步骤。

c.注意：根据所用的基质胶的批次，可能需要更改“Tissue Mix”(“组织混合”)选项下的“Matrigel Stock Concentration”(“基质胶保存浓度”)。通常需要致电供应商以获得批次的基质胶浓度。

d.注意：对于1腔室(1.2mL)，这些体积通常为：

·胶原稀释物

0.75mL胶原原液(5mL/mL)

0.12mL 10x PBS

0.019mL 1M NaOH

0.311mL灭菌去离子水

·胶原混合物

1.056mL胶原稀释液(上述溶液)

0.132mL 10x MEM

0.132mL HEPES(pH 9)

·最终的组织混合物

1.056mL胶原混合物(上述含有MEM和HEPES的溶液)

0.113mL心肌细胞(在此体积中重悬细胞沉淀)

0.150mL基质胶

形成示例性的闭环测试系统(图10)

为了形成闭环：

1.将柔性管(从肌肉浴)连接到3路鲁尔(Luer)锁定阀600的任一端。

2.将20mL注射器610连接到鲁尔锁定阀的第三出口。

3.用培养基填充大培养皿或烧杯420，并将其放置在可调节的升降台425上。

4.将其中一个管的开口端放在储罐中的基质中，打开注射器和储罐之间的阀门。

5.通过管道将基质吸入注射器中，回拉时确保避免任何气泡进入管道。

6.关闭连到储罐420的阀600，并打开注射器610和第二组管道601之间的阀600。

7.将第二组管道601连接到T形连接器410(T的杆412)。

8.使压力传感器442穿过T形连接器410，使其位于另一侧。

a.注意：传感器将最终进入腔室的内腔，这样其有助于预测量传感器所需的距离，使得其穿过T型连接器位于适当位置，并且一旦所有部件都连接起来其将位于腔室内腔(传感器行进的距离＝T型连接器距离+皮下注射管距离)。

9.用密封剂(例如橡皮泥等)封闭压力传感器和T型连接器之间的开放空间。T型连接器现在应该仅只有一端打开，传感器伸出从该端伸出。

10.通过第二组管道601抽出基质，同样确保避免气泡进入。基质应该穿过T型连接器的开口端，从而确保其被浸没。

11.移除腔室生物反应器100的顶部并将其放置在基质中。

12.将腔室和管道浸入基质中，确保除去管道中可能存在的任何气泡。需要浸没生物反应器的整个顶部，这是比较好的。最重要的事情是确保将所有空气从皮下注射管中移除。

13.此时，还要检查O形环135的位置，并且如果需要，移动O形环135以接触PPE环的顶部。

a.注意：O形环帮助密封PPE环和皮下注射管之间的间隙，以确保在封闭系统中产生最大的压力并由传感器进行检测。

14.将T型连接器的开口端连接到皮下注射管，以使压力传感器的探针位于腔室的内腔中。

15.将生物反应器的顶部重新连接到生物反应器的下半部分。

16.将生物反应器放置在加热台620上，在位于高速照相机450前面可调节的升降台上。

a.注意：进入腔室内腔的压力将由较大储罐中的流体与生物反应器中的流体之间的高度差确定。因此，生物反应器和开放的储液罐中的流体水平应当相等。

17.如果需要，将碳电极穿线通过生物反应器顶部的指定孔，并将它们连接到Grass刺激器。

一旦闭环系统建立，在NBS介质中可以进行以下测试：

1.建立基线功能

a.在自发、0.5、1、1.5、2.0、2.5、3.0Hz测量随时间变化的压力

ⅰ.在每个频率获得压力和体积数据，从而可以重新构建P-V环

ⅱ.使用体积数据进行估计射血分数计算

ⅲ.对于每个频率，使用压力数据来显示压力与时间的关系(显示捕获和起搏能力)

b.在设定的频率下测量形成压力相对管腔压力的变化(I表示1、1.5或2Hz)

ⅰ.以5mm的增量增加储液罐的高度，并每步长20s记录视频和压力，至最大40mmH₂O

ⅱ.该数据将能得出形成压力相对管腔压力的曲线图，并且因此测试活动的弗兰克-斯达林机理(Frank-Starling mechanism)

2.建立药理试剂对腔室功能的影响(例如，CaCl₂、异丙肾上腺素、维拉帕米)

a.重复上述“a”和“b”，但在药理学试剂的存在下

ⅰ.据此，评价来自药理学试剂的压力输出、弗兰克-斯达林响应和压力瓣环的变化

b.注意：对于已知的β-肾上腺素激动剂，自发频率变化是重要的，但是为了控制得到频率效应，还必须在设定的频率(例如，1、1.5或2Hz)收集数据。

其它的生物反应器详情：

套管140

套管140可以具有一个或多个以下特征/性质：

·外径(OD)必须小于最终类器官气囊120的直径；

·内径(ID)必须足够大以使放气的气囊导管110能通过并随后能使用于测量腔室内腔压力的压力传感器(例如Millar Mikro-Tip或类似物)通过；

·材料必须是坚硬/刚性的，以在类器官培养期间将气囊120精确地保持在合适位置；

·套管140的内壁应该是光滑的以使导管和传感器容易地通过；

·外壁可以是光滑的或粗糙的，但是必须支撑住用于生长类器官的多孔支撑环(第一环130)以及用于保持压力的O形环密封件135，以使多孔支撑环与O形环135形成良好的密封，外表面是光滑的很可能是优选的；

·套管140的几何形状可以是直的，或者可以在底端附近具有集成的扩口或凸缘或类似特征，多孔支撑环130可以抵靠该底端被按压以帮助保持水密密封；

·刚性套管140的底部尖端略微呈锥形，以便于将坚硬的多孔支撑环130装配到套管140的端部上，特别是如果环/类器官需要被移除或偶然意外地在类器官测试期间从刚性套管140上脱落；和

·套管140可以由包含聚苯乙烯的其他材料形成或是具有相似ID/OD尺寸的聚碳酸酯管或各种生物相容性金属合金管。

多孔支撑环130

多孔支撑环(第一环130)可以是环的形式，该环由具有70μm孔径的经亲水处理的多孔聚乙烯的1/16”厚片形成(切割/冲压)；然而，第一环130可以由其他合适的材料形成并具有其他性质。

多孔支撑环130可以具有一个或多个以下特征/性质：

·亲水性，使得当湿润时胶原/细胞溶液将通过毛细作用进入所述材料，所述环可以是疏水性的，然后进行化学处理(例如用硫酸)以使其亲水；

·易于通过紫外或气体灭菌进行灭菌；

·孔径足够大以使溶液和细胞自由地通过毛细作用进入所述材料中，但是也足够小以提供大的表面积和许多接触点，用于在培养期间与类器官牢固粘附。我们已成功测试了50-150μm范围内的孔径；

·足够厚以提供所需的结构稳定性，但也不能太厚而吸收过量的细胞/基质溶液(例如，1/16”和1/8”厚度)；

·足够硬以能用镊子抓住并且为类器官提供结构支撑，但也足够软以切割成球形并且打孔以安装刚性管。不能太脆，否则当压配安装到刚性套管管道140上时可能折断/破碎；

·便宜且是一次性的——清洗和再利用太困难/不切实际；

·其它纹理化物质，包括其它多孔塑料(例如聚苯乙烯)和一些多孔金属(例如镍泡沫)，可以是多孔聚乙烯的合理替代物。

在一个示例性实施例中，第一环130可以从具有70μm孔径的经亲水处理的多孔聚乙烯的1/16”厚片切割而成。

O形环135

在一个示例性实施例中，O形环135可以是具有约5/64”的内径和约13/64”的外径的硅胶橡胶O形环，厚度约1/16”。O形环135可以具有一个或多个以下特征：

·O形环135必须紧密地安装在套管140(刚性管)上以形成防水密封，并且同时其柔性足够，以压靠多孔支撑环130并形成防水密封；

·必须易于通过乙醇、UV、气体或蒸汽高压灭菌器进行灭菌；

·最好是便宜的并且可以是一次性的；及

·O形环135可以由其它材料形成，包括氯丁橡胶、聚氨酯和用于商业上的柔软/柔性O形环密封件的其它标准材料。

应当理解，在替换实施例中，在连接到套管140之前，O形环135和多孔环130可以彼此连接(至少暂时地)。

附录A

人工工程制造的心脏类器官结构

试剂

牛I型胶原(Life Technologies(生命科技)，目录号A10644-01)

10x极限必需培养基Eagle(MEM)(Sigma，目录号M0275)

牛血清白蛋白(Sigma，目录号A9418)

高真空润滑脂(道康宁(Dow Corning))(飞世尔科技(Fisher Scientific)，目录号146355D)

PBS(Sigma，目录号P3813)

在150μL等分试样中的基质胶-hESC-合格的基质(BD生物科学(BD Biosciences)，目录号354277)

HEPES(Sigma，目录号H4034)

Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)-高葡萄糖(Sigma，目录号D5648)

新生牛血清(NBS)(亚特兰大生物制品公司(Atlanta Biologics)，目录号S11250)

青霉素-链霉素(Pen-Strep)(CellGro，目录号30-002-CI)

两性霉素B(Sigma，目录号A2411-1G)

琼脂糖I(VWR，目录号0710-25G)

硅胶填缝(家得宝公司(Home Depot)，目录号GE281 3TG)

溶液

2％BSA的PBS溶液

0.2N HEPES，pH 9

1M NaOH

无菌水

NBS培养基(DMEM，10％NBS，1％Pen-Strep，0.2％两性霉素B)

1x PBS

10x PBS

材料

15mL离心管(BD Falcon，目录号352096)

宽钳(例如，飞世尔科技(Fisher Scientific)，目录号10300)

细镊子(例如，Fine Science Tools，目录号11251-20)

弯曲钳(例如，飞世尔科技(Fisher Scientific)，目录号12-460-518)

黑色实验室标记(VWR，目录号52877-310)

非组织培养处理的10cm培养皿(飞世尔科技(Fisher Scientific)，目录号68-757-12)

20、200和1000μL移液管和移液管头

聚苯乙烯盒，3×3×6cm(Container Store，目录号60260)

亲水性多孔聚乙烯，1.6mm厚，70μm孔径(Interstate Specialty Products，目录号POR-4899-ICA-01)

6-Fr Foley导管(Cook Medical，目录号G17203)

橡胶槌(McMaster-Carr，目录号5878A3)

11/32不锈钢锤驱动冲头(McMaster-Carr，目录号3424A24)

3mL注射器(BD，目录号309657)

尼龙螺杆压缩机(飞世尔科技(Fisher Scientific)，目录号05-834)

13-mm玻璃试管(VWR，目录号8900-480)

可选的：康宁细胞刮铲#3008(飞世尔科技(Fisher Scientific)，目录号07-200-364)。

Claims (37)

1.用于制造心脏类器官腔室并用于随后对其进行测试的生物反应器系统，包括：

第一容器，其具有中空内部和开口顶部；

第一盖体，其与所述第一容器的开口顶部匹配，所述第一盖体具有在其上形成的第一开口；

套管，其具有从开放的第一端延伸到开放的第二端的内腔，所述套管设置在所述第一盖体的第一开口内，使得所述套管的一部分位于所述第一盖体的下方并用于插入到所述第一容器的中空内部；

多孔环，其连接到所述套管开放的第二端处或附近；及

气囊导管，其在导管轴的远端末端具有可膨胀的气囊，其中当所述气囊处于放气状态时，所述气囊导管适于穿过所述套管的内腔，所述气囊导管在所述内腔内可轴向地调节，以使处于膨胀状态的气囊被设置靠近于：(1)所述套管的开放的第二端；和(2)用于在膨胀的气囊和多孔环周围制造心脏类器官腔室的多孔环。

2.根据权利要求1所述的系统，其中所述第一开口在所述第一盖体的顶壁中形成，并且所述第一盖体包括在所述顶壁内形成的第二开口和第三开口，所述第一开口在所述第二开口和第三开口之间形成。

3.根据权利要求2所述的系统，其中所述第一盖体具有用于将所述套管牢固地连接到所述第一盖体的装置。

4.根据权利要求3所述的系统，其中所述构件包括机械固定件，所述机械固定件将所述套管保持并固定在所述第一开口内相对于所述第一盖体所需的位置。

5.根据权利要求4所述的系统，其中所述机械固定件包括固定螺钉，所述固定螺钉延伸穿过所述第一盖体的侧壁，用于对所述套管施加固定力。

6.根据权利要求1所述的系统，其中所述套管由刚性材料形成。

7.根据权利要求1所述的系统，其中所述套管由选自金属和刚性塑料的材料形成。

8.根据权利要求1所述的系统，其中所述多孔环由亲水性多孔聚乙烯材料形成。

9.根据权利要求1所述的系统，其中所述多孔环配置用于防止组织培养期间组织滑动，以形成心脏类器官腔室。

10.根据权利要求1所述的系统，还包括O形环，所述O形环围绕所述套管设置并与所述多孔环的上表面紧密接触，所述O形环配置用于提供防水密封。

11.根据权利要求1所述的系统，其中所述气囊导管具有柔性轴。

12.根据权利要求11所述的系统，其中所述气囊导管的柔性轴在所述套管的内腔中是摩擦配合的，以相对于所述套管将所述气囊导管固定在一相对位置。

13.根据权利要求11所述的系统，其中使用外部装置将所述气囊导管固定在所述套管的内腔中，使得所述气囊导管保持在所述内腔中的固定位置，同时膨胀的气囊与所述套管开放的第二端和多孔环保持相邻。

14.根据权利要求2所述的系统，还包括一对电极，所述一对电极设置在所述第二和第三开口内，用于在所制造的心脏类器官腔室培养期间进行电生理学控制的测量或慢性电刺激。

15.根据权利要求14所述的系统，其中所述第一盖体具有用于将所述一对电极牢固地连接到所述第一盖体的装置。

16.根据权利要求15所述的系统，其中所述装置包括机械固定件，所述机械固定件将每个电极保持并固定在所述第二和第三开口中的一个内相对于所述第一盖体所需的位置。

17.根据权利要求16所述的系统，其中所述机械固定件包括一对固定螺钉，所述一对固定螺钉延伸穿过所述第一盖体的侧壁，用于对各个电极施加固定力。

18.根据权利要求1所述的系统，其中所述心脏类器官腔室由源自多能干细胞的人心肌细胞工程制造。

19.根据权利要求1所述的系统，其中所述可膨胀的气囊包括在其外表面上形成的表面图案，用于在3D制造心脏类器官腔室中诱导细胞和基质对齐。

20.根据权利要求1所述的系统，还包括：

闭环类器官功能测试系统，包括：

连接器，其连接到所述套管的开放的第一端，所述连接器通过导管流体连接到开放的储液罐；

压力传感器，其具有探针，所述探针在心脏类器官腔室被工程制造出且所述气囊导管从所述套管移除后可以穿过所述套管的内腔，所述压力传感器配置用于测量所述工程制造的心脏类器官腔室内的腔室压力；和

成像装置，其用于监测所述类器官尺寸的变化。

21.根据权利要求20所述的系统，其中所述成像装置与所述压力传感器同步，以使所述类器官尺寸的变化与由所述压力传感器记录的腔室压力测量同步。

22.根据权利要求20所述的系统，其中所述成像装置包括高速摄像机。

23.用于制造心脏类器官腔室并用于随后对其进行测试的生物反应器系统，包括：

第一容器，其具有中空内部和开口顶部；

第一盖体，其与所述第一容器的开口顶部匹配，所述第一盖体具有在其上形成的第一开口；

套管，其具有从开放的第一端延伸到开放的第二端的内腔，所述套管设置在所述第一盖体的第一开口内，使得所述套管的一部分位于所述第一盖体的下方并用于插入所述第一容器的中空内部；

多孔环，其连接到所述套管的开放的第二端处或附近；

O形环，其围绕所述套管设置并与所述多孔环的上表面紧密接触，所述O形环配置用于提供防水密封；及

气囊导管，其在导管轴的远端末端具有可膨胀的气囊，其中当所述气囊处于放气状态时，所述气囊导管适于穿过所述套管的内腔，所述气囊导管在内腔内可轴向地调节，以使处于膨胀状态的气囊被设置靠近于：(1)所述套管的开放的第二端；和(2)用于在膨胀的气囊和多孔环周围制造心脏类器官腔的多孔环。

24.用于生物反应器系统中并配置用于制造心脏类器官腔室及随后对其进行测试的套管组件，包括：

细长套管，其具有从开放的第一端延伸到开放的第二端的内腔；

多孔环，其围绕所述套管的开放的第二端处或附近设置，所述多孔环从所述套管径向向外延伸；

O形环，其围绕所述套管设置并与所述多孔环的上表面紧密接触，所述O形环从所述套管径向向外延伸，相对于所述套管和多孔环，所述O形环配置用于提供防水密封；及

气囊导管，其在导管轴的远端末端具有可膨胀的气囊，其中当所述气囊处于放气状态时，所述气囊导管适于穿过所述套管的内腔，所述气囊导管在内腔内轴向地调节，以使处于膨胀状态的气囊被设置靠近于：(1)所述套管的开放的第二端；和(2)用于在膨胀的气囊和多孔环周围制造心脏类器官腔室的多孔环，所述多孔环作为在生物反应器系统中进行的工程化过程的一部分。

25.根据权利要求24所述的组件，其中所述多孔环和O形环由不同的材料形成且具有不同的尺寸。

26.根据权利要求24所述的组件，其中所述气囊导管包括柔性轴，所述气囊连接到所述柔性轴，以使所述气囊导管插入并穿过所述套管的内腔。

27.根据权利要求24所述的组件，其中所述套管包括刚性管状结构，所述刚性管状结构支撑所述膨胀的气囊并将其保持在适当位置，并且提供稳定的、限定的内腔，以实现所述气囊导管的插入和移除。

28.用于工程制造心脏类器官腔室的工艺，包括以下步骤：

在第一容器中制造模具，所述模具包括开口模具腔；

将套管定位在所述开口模具腔内，所述套管具有围绕其远端末端设置的多孔环，所述套管设置在所述开口模具腔内；

将气囊导管插入并穿过在所述套管上形成的内腔，使得可膨胀的气囊超出所述套管的远端末端；

使所述气囊膨胀并使所述气囊导管定位，使得所述膨胀的气囊靠近所述套管的远端末端和所述多孔环设置；

使所述第一容器处于孵育条件下经历第一时间段，以促进组织在所述膨胀的气囊和多孔环上形成；

从所述第一容器移除结合的套管和气囊导管，并将所述结合的套管和气囊导管插入含有细胞培养基的第二容器；和

使所述第二容器处于孵育条件下经历第二时间段，得到在所述膨胀的气囊和多孔环周围形成的工程制造的心脏类器官腔室。

29.根据权利要求28所述的工艺，还包括使所述膨胀的气囊放气并从所述套管的内腔移除所述气囊导管、留下连接到所述套管的多孔环上的工程制造的心脏类类器官室的步骤。

30.根据权利要求28所述的工艺，其中所述套管穿过盖体上的第一开口，所述盖体设置在所述第一容器和第二容器中每个的开口端上方，用于将所述套管定位在其中，所述套管固定地连接到所述盖体。

31.根据权利要求29所述的工艺，还包括以下步骤：测试类器官功能，同时所述类器官仍固定地连到所述多孔环，并且在所述气囊导管从所述套管移除之后仍设置在所述第二容器内。

32.根据权利要求31的工艺，其中所述测试类器官功能的步骤包括建立闭环类器官功能测试系统的步骤，包括：

连接器，其连接到所述套管的开放的第一端，所述连接器通过导管流体连接到开放的储液罐；

压力传感器，其具有探针，所述探针在所述心脏类类器官室被工程制造出并且所述气囊导管从所述套管移除后可以穿过所述套管的内腔，所述压力传感器配置用于测量所述工程制造的心脏类类器官室内的腔室压力；和

成像装置，其用于监测类器官尺寸的变化。

33.根据权利要求32所述的工艺，其中所述成像装置与所述压力传感器同步，以使所述类器官尺寸的变化与由所述压力传感器记录的腔室压力测量同步。

34.根据权利要求32所述的工艺，其中所述成像装置包括高速摄像机。

35.根据权利要求31所述的工艺，还包括以下步骤：

将所述套管穿过盖体上的第一开口，所述盖体设置在所述第一容器和第二容器中的每个的开口端上方，用于将所述套管定位在其中，所述套管固定地连接到所述盖体；

将一对电极穿过在所述盖体上形成的两个其它开口，所述第一开口在所述两个其它开口之间形成；和

使用所述电极进行电生理学测试。

36.用于工程制造心脏类器官腔室的工艺，包括以下步骤：

提供具有在其中形成内腔的末端开口的套管；

将多孔环围绕在所述套管的远端末端设置；

将气囊导管插入并穿过在所述套管上形成的内腔，使得可膨胀的气囊超出所述套管的远端末端；

使所述气囊膨胀并使所述气囊导管定位，使得所述膨胀的气囊靠近所述套管和多孔环的远端末端设置，以形成套管组件；和

将所述套管组件放置在容器内，所述容器经历孵育条件，得到在所述膨胀的气囊和多孔环周围形成的工程组织的心脏类器官腔室。

37.根据权利要求36所述的方法，还包括以下步骤：

首先将所述套管组件放置在包括模具的第一容器中，所述可膨胀的气囊和多孔环设置在模具腔内并浸没在第一溶液中；

使所述第一容器经历孵育条件，所述孵育条件能促进所述膨胀的气囊和多孔环上的组织形成；

从所述第一容器移除所述套管组件，并将所述套管组件插入到含有细胞培养基的第二容器中；和

使所述第二容器经历孵育条件，得到在所述膨胀的气囊和多孔环周围形成的工程组织的心脏类器官腔室。