JP2006058642A - 自動焦点検出装置およびこれを備える顕微鏡システム - Google Patents

Abstract

【課題】 細胞のダメージや蛍光色素の退色を防ぎつつ正確な焦点検出ができる自動焦点検出装置を提供すること。
【解決手段】 ＡＦ用暗視野照明装置６０は、対物レンズ３１とともに、Ｚ方向に移動可能な保持部３０に固設されている。ＬＥＤ光源６３から射出した赤外光Ｌ５は、集光レンズ６４によって集光され、ペトリディッシュ１００中の生体試料Ｓへ斜め入射する。赤外光Ｌ５の照射により生体試料Ｓから散乱光Ｌ６が発生し、散乱光Ｌ６の一部は、対物レンズ３１を通り、ＣＣＤカメラにより暗視野顕微鏡像として撮像される。暗視野顕微鏡画像は、対物レンズ３１のＺ軸上の位置によって鮮明さが異なり、最も鮮明になったときの対物レンズ３１の位置を合焦位置とする。
【選択図】 図４

Description

本発明は、光学顕微鏡に用いられる自動焦点検出装置に関する。

半導体ウエハや金属表面の傷や異物などの欠陥を検出する装置には、オートフォーカス機能を備えたものがある。試料にレーザ光を照射し、試料からの散乱光による暗視野像を撮像し、その暗視野像の輝度が最も高くなった試料位置を合焦位置と判定する焦点検出技術が知られている（例えば、特許文献１参照）。

特開２００３−７２４３号公報（第３頁、図１）

培養容器に収容された生物試料（細胞等）を光学顕微鏡で観察する際に行われる焦点検出においては、照明光による細胞のダメージを極力小さくする必要がある。上記特許文献１の技術では、試料にエネルギー密度の高いレーザ光を照射するので、試料が細胞等の生物試料である場合には、細胞がダメージを受けたり、細胞を染色する蛍光色素が退色し、適正な顕微鏡観察ができないという問題がある。

（１）上記問題点を解決するために、請求項１に係る発明の自動焦点検出装置は、赤外光を発する照明光源と、照明光源からの照明光を透明容器に収容された試料へ照射する暗視野照明系と、試料の暗視野像を対物レンズを通して撮像する撮像手段と、試料と対物レンズとの距離を変更する移動手段と、試料と対物レンズとの距離を検出する位置検出手段と、試料と対物レンズとの距離を位置情報として記憶する記憶手段と、移動手段により試料と対物レンズとの距離を変更しながら所定回数撮像された複数の暗視野像の輝度を比較する演算手段とを備え、記憶手段により記憶された複数の位置情報のうち、演算手段により得られた暗視野像の輝度信号が最大となったときの位置情報により、試料の対物レンズに対する焦点位置を検出することを特徴とする。
（２）請求項２に係る発明の自動焦点検出装置は、請求項１の自動焦点検出装置と、試料を収容する透明容器の底板へ対物レンズを通してスリット光又はスポット光を照射し、底板からのスリット反射光を対物レンズを通して検出し、その検出位置に基づいて底板と対物レンズとの距離を検出するスリット照明／検出手段と、スリット照明／検出手段によりスリット反射光を検出したか否かを判定する判定手段と、判定手段によりスリット反射光が検出されないときに、請求項１の自動焦点検出装置による焦点検出動作へ移行させる切替え手段とを備えることを特徴とする。

（３）請求項１または２の自動焦点検出装置において、暗視野照明系は、対物レンズの鏡筒先端の外周に配置されてもよいし、その光路の一部が対物レンズの光軸に平行をなす落射型照明光学系であってもよい。
（４）請求項５に係る発明の自動焦点検出装置は、請求項１〜４のいずれかの自動焦点検出装置において、暗視野照明系は、輪帯照明系であり、対物レンズの鏡筒内には、その光軸周辺の光を遮蔽する遮蔽部材が配設されることが好ましい。

（５）請求項６に係る発明の顕微鏡システムは、請求項４の自動焦点検出装置と、試料へ蛍光を発するように励起光を照射する落射蛍光照明装置とを備え、対物レンズは、試料の蛍光顕微鏡像を形成し、暗視野照明系は、対物レンズの光軸に平行な光路の前段の光学系が対物レンズと落射蛍光照明装置の間に配置されることを特徴とする。
請求項６に係る発明の顕微鏡システムは、請求項４の自動焦点検出装置と、試料へ蛍光を発するように励起光を照射する落射蛍光照明装置とを備え、対物レンズは、試料の蛍光顕微鏡像を形成し、暗視野照明系は、対物レンズの光軸に平行な光路の前段の光学系が対物レンズと落射蛍光照明装置の下側に配置されることを特徴とする。
（６）請求項８に係る発明の焦点検出装置は、赤外光を発する照明光源と、照明光源からの照明光を試料へ照射する暗視野照明系と、試料により散乱された散乱光を対物レンズを通して検出する光電変換手段と、光電変換手段により変換された電気信号に基づいて試料の対物レンズに対する焦点位置を演算する演算手段とを備えることを特徴とする。

本発明によれば、赤外光の暗視野照明により試料からの散乱光を取得するので、試料のダメージや蛍光色素の退色を防ぎつつ正確な焦点検出信号が得られる。

以下、本発明の実施の形態による自動焦点検出装置およびこれを備える顕微鏡システムについて、図１〜９を参照しながら説明する。
〈第１の実施の形態〉
図１は、本発明の第１の実施の形態による自動焦点検出装置が備えられる顕微鏡システムの構成を模式的に示す全体構成図である。図２は、第１の実施の形態による自動焦点検出装置が備えられる光学顕微鏡の構成を模式的に示す構成図である。図３は、図２のＩ−Ｉ断面図である。図４は、図３の暗視野照明装置６０を拡大して示す部分断面図である。図１〜４では、三次元直交座標により方向を表わす。

第１の実施の形態による顕微鏡システムは、光学顕微鏡１とオートフォーカス（ＡＦ）制御系８０とを備えている。光学顕微鏡１は、落射蛍光照明装置１０と、透過照明装置２０と、対物レンズ３１を保持する保持部３０と、生体試料Ｓを収容するペトリディッシュ１００を載置するステージ３３と、保持部３０のＺ方向の位置を測定する位置検出部４０と、保持部３０をＺ方向に移動させる駆動部４３と、ＡＦ用スリット照明／検出装置５０と、ＡＦ用暗視野照明装置６０と、ＣＣＤカメラ７０とを備えている。

ＡＦ制御系８０は、モータ駆動回路８１、位置検出回路８２、ＡＦ用スリット照明駆動回路８３と、スリット反射光検出回路８４と、ＡＦ用暗視野照明制御回路８５と、画像比較演算回路８６と、カメラ制御回路８７と、これら各々と電気的に接続され、これら全体を統括制御する制御マイコン８８とを有する。カメラ制御回路８７には、ディスプレイ８９が接続され、制御マイコン８８には、データを入力するための入力部８８ａが接続されている。

モータ駆動回路８１は、駆動部４３のモータと電気的に接続され、モータの動きを制御する。位置検出回路８２は、位置検出部４０の位置センサと電気的に接続され、保持部３０のＺ軸上の位置を測定する。ＡＦ用スリット照明駆動回路８３は、ＡＦ用スリット照明／検出装置５０のＬＥＤ光源と電気的に接続され、ＬＥＤ光源のＯＮ／ＯＦＦ動作や発光量を制御する。スリット反射光検出回路８４は、ＡＦ用スリット照明／検出装置５０の光センサと電気的に接続され、光センサ上のスリット反射光の位置を測定する。

ＡＦ用暗視野照明制御回路８５は、ＡＦ用暗視野照明装置６０のＬＥＤ光源と電気的に接続され、ＬＥＤ光源のＯＮ／ＯＦＦ動作や発光量を制御する。画像比較演算回路８６は、ＣＣＤカメラ７０の撮像素子と電気的に接続され、Ｚ軸上の各位置で撮像した生体試料Ｓの画像を取り込んで画像の明るさ（鮮明さ）を比較演算する。カメラ制御回路８７は、ＣＣＤカメラ７０のゲインや撮影タイミングなどを制御する。

図２を参照しながら、光学顕微鏡１の構成を説明する。
落射蛍光照明装置１０は、水銀ランプ１１と、コレクタレンズ１２と、フィールドレンズ１３と、励起フィルタ１４ａおよびダイクロイックミラー１４ｂを収納するフィルタブロック１４とを備えている。透過照明装置２０は、ハロゲンランプ２１と、コレクタレンズ２２と、ミラー２３と、フィールドレンズ２４と、コンデンサレンズ２５とを備えている。

対物レンズ３１は、無限遠光学系を有するレンズ鏡筒であり、レボルバ３２に取り付けられ、レボルバ３２は、保持部３０に固定されている。保持部３０は、図中、−Ｚ方向に延在する脚部３０ａを有する。脚部３０ａは、駆動部４３に連結され、駆動部４３によりＺ方向に移動可能である。つまり、保持部３０のＺ方向の移動に伴って対物レンズ３１もＺ方向に移動する。ステージ３３は、Ｘ−Ｙ二次元方向には移動可能であるが、Ｚ方向は固定であるので、対物レンズ３１のＺ方向の移動により焦点検出動作が行われる。対物レンズ３１のＺ方向の位置は、位置検出部４０によって測定される。位置検出部４０は、脚部３０ａに取り付けられたリニアスケール４１と位置センサ４２から成る。

図３を参照すると、ＡＦ用スリット照明／検出装置５０は、近赤外光Ｌ４を発するＬＥＤ光源５１と、コレクタレンズ５２と、スリット５３と、集光レンズ５４と、ダイクロイックミラー５５とを備えている。また、光学顕微鏡１の左側（図中、−Ｘ方向）には、撮像素子７０ａを有するＣＣＤカメラ７０が直筒７１を介して取り付けられている。

ＡＦ用暗視野照明装置６０は、保持部３０に固設された支柱６１に支持されている。従って、保持部３０のＺ方向の移動に伴ってＡＦ用暗視野照明装置６０もＺ方向に移動する。ＡＦ用暗視野照明装置６０は全体として、対物レンズ３１の鏡筒先端の外周に配置されている。

図４の拡大された部分断面図を参照すると、ＡＦ用暗視野照明装置６０は、対物レンズ３１を挟んで左右一対に配置される赤外光Ｌ５を発するＬＥＤ光源６３と集光レンズ６４とを備えている。赤外光Ｌ５としては近赤外光も用いられる。各ＬＥＤ光源６３は、電源ケーブル６２から電力の供給を受ける。図示されるように、左右のＬＥＤ光源６３からの赤外光Ｌ５は、いずれも対物レンズ３１の焦点位置に集光する。なお、ＡＦ用暗視野照明装置６０を輪帯照明系として構成し、この輪帯照明系からの赤外光Ｌ５で生体試料Ｓを照明してもよい。この場合は、対物レンズ３１の鏡筒内に、その光軸周辺の光を遮蔽する遮蔽部材を設ける。

なお、通常は、焦点距離などが異なる複数本の対物レンズ３１がレボルバ３２に取り付けられ、レボルバ３２の回転により任意の対物レンズを光路に挿入することができる。このような対物レンズの切り換えを行っても焦点位置は変わらない。本実施の形態では、ＡＦ用暗視野照明装置６０の支柱６１もレボルバ３２も共に保持部３０に固設されているので、対物レンズ３１を切り換えても、赤外光Ｌ５の集光位置と対物レンズ３１の焦点位置は常に合致している。これとは別に、ＡＦ用暗視野照明装置６０を保持部３０に固定せず、対物レンズ３１の切り換えやＺ方向の移動とは無関係に、赤外光Ｌ５の集光点とペトリディッシュ１００（または、生体試料Ｓ）の位置関係を常に一定とするように構成してもよい。

再び図２を参照して、照明光学系、観察光学系、ＡＦ光学系について説明する。
蛍光観察の場合は、水銀ランプ１１から射出した紫外領域の励起光Ｌ１は、コレクタレンズ１２、フィールドレンズ１３を通り、励起フィルタ１４ａにより所望の波長域が選択され、ダイクロイックミラー１４ｂにより選択的に反射されてＺ方向に進み、対物レンズ３１に下側から入射する。対物レンズ３１を通った励起光Ｌ１は、ペトリディッシュ１００の底板１０１を透過して生体試料Ｓを照射する。励起光Ｌ１の照射により、生体試料Ｓの蛍光色素で染色された部位から蛍光Ｌ２が発する。

蛍光Ｌ２は、励起光Ｌ１よりも波長の長い光であり、底板１０１を透過して対物レンズ３１に入射し、ダイクロイックミラー１４ｂを透過して結像レンズ３４を通過する。結像レンズ３４を通過した蛍光Ｌ２は、ハーフプリズム３５で２つに分岐され、２０％の光量の蛍光Ｌ２は、全反射プリズム３６，３７、ミラー３８を経由して接眼レンズ３９により蛍光像として観察される。他方の８０％の光量の蛍光Ｌ２は、図中、−Ｘ方向へ進み、図３に示されるＣＣＤカメラ７０の撮像素子７０ａ上で結像し、蛍光像として撮像される。

透過観察の場合は、ハロゲンランプ２１から射出した照明光Ｌ３は、コレクタレンズ２２により平行光束となり、ミラー２３で反射し、フィールドレンズ２４、コンデンサレンズ２５を通ってペトリディッシュ１００の上方から生体試料Ｓを照射する。生体試料Ｓからの透過光は、底板１０１を透過して対物レンズ３１に入射し、前述した蛍光Ｌ２と同じ光路を通り、生体試料Ｓの像の観察や撮像が行われる。なお、透過型位相差顕微鏡では、例えば、透過照明装置２０にリング絞りを設け、対物レンズ３１内に位相リングを設け、リング絞りと位相リングとを共役の位置に配置した光学系が用いられる。

続いて、ＡＦ用スリット照明／検出装置５０の光学系とＡＦ用暗視野照明装置６０の光学系について説明する。
図３を参照すると、ＡＦ用スリット照明／検出装置５０のＬＥＤ光源５１から射出した近赤外光Ｌ４は、コレクタレンズ５２によりスリット５３へ集光し、スリット光として集光レンズ５４を通り、ダイクロイックミラー５５によりＺ方向へ反射し、対物レンズ３１を通ってペトリディッシュ１００の底板１０１へ投影される。このスリット光は、その長手方向に延びる中心線で２分割し、一方を遮光し、他方を照明光として用いるものである。また、近赤外光Ｌ４としては、スリット光に限らずスポット光を用いてもよい。

底板１０１で反射した近赤外光（反射スリット光）Ｌ４は、対物レンズ３１を通り、ダイクロイックミラー５５で反射してＡＦ用スリット照明／検出装置５０内の光センサ（不図示）へ入射する。この光センサは、複数の画素を集積したラインセンサまたはエリアセンサである。光センサでは、反射スリット光Ｌ４の反射角に依存する受光面上の位置を検出する。例えば、反射スリット光Ｌ４が光センサの受光面の中央に入射したとき、底板１０１が対物レンズ３１の焦点位置にある、つまりピントが合っていると判定される。反射スリット光Ｌ４の検出状態は、光センサからスリット反射光検出回路８４へ受光面上の位置情報として送出され、同時に、対物レンズ３１のＺ軸上の位置情報が位置検出部４０の位置センサ４２から位置検出回路８２へ送出される。従って、反射スリット光Ｌ４の検出状態と対物レンズ３１のＺ軸上の位置とが対応付けられる。なお、反射スリット光Ｌ４には、底板１０１の外側表面Ｐ１で反射する第１の反射光と内側表面Ｐ２で反射する第２の反射光があり、これらの検出過程については後述する。

ＡＦ用暗視野照明装置６０のＬＥＤ光源６３は、電源ケーブル６２により供給される電力により赤外光Ｌ５を射出する。ＬＥＤ光源６３から射出した赤外光Ｌ５は、集光レンズ６４によって集光され、ペトリディッシュ１００中の生体試料Ｓへ斜め入射する。赤外光Ｌ５の照射により生体試料Ｓから散乱光Ｌ６が発生する。散乱光Ｌ６の一部は、対物レンズ３１を通り、ダイクロイックミラー５５、フィルタブロック１４を透過し、結像レンズ３４で結像される。図３を参照すると、ハーフプリズム３５で反射した散乱光Ｌ６は、−Ｘ方向へ進み、ＣＣＤカメラ７０の撮像素子７０ａにより暗視野顕微鏡像として撮像される。このような試料の暗視野像を得る照明を暗視野照明という。

得られた暗視野顕微鏡画像は、対物レンズ３１のＺ軸上の位置によって鮮明さが異なり、もちろん、最も鮮明になったときの対物レンズ３１の位置が合焦位置である。顕微鏡画像の鮮明さは、例えば、対物レンズ３１のＺ軸上の位置を変えながら、撮像素子７０ａの各画素からの輝度信号の大きさを比較することにより判定される。暗視野顕微鏡画像データは、ＣＣＤカメラ７０の撮像素子７０ａから画像比較演算回路８６へ送出され、同時に、対物レンズ３１のＺ軸上の位置情報が位置検出部４０の位置センサ４２から位置検出回路８２へ送出される。従って、画像の鮮明さ（画素の輝度信号の大きさ）と対物レンズ３１のＺ軸上の位置とが対応付けられる。

図５を参照して、本実施の形態によるＡＦ制御系８０のアルゴリズムを説明する。図５は、第１の実施の形態による自動焦点検出装置の焦点検出プロセスを示すフローチャートである。入力部８８ａのスタートボタン（不図示）を押すことにより開始信号が送出され、ＡＦ用スリット照明／検出装置５０が作動状態となり、ＡＦ調節動作が始まる。ステップＳ１で、対物レンズ３１のＺ軸上の原点位置が検出される。ステップＳ２では、高速送りで対物レンズ３１を待機位置に移動させる。この待機位置は、対物レンズ３１がペトリディッシュ１００の底板１０１に接触しない安全な位置である。ステップＳ３では、中速送りで対物レンズ３１を＋Ｚ方向に移動させる。

ステップＳ４では、スリット光Ｌ４がペトリディッシュ１００の底板１０１の外側表面Ｐ１で反射する第１の反射光を検出したか否かを判定する。否定判定されると、ステップＳ５へ移行し、Ｚ軸上の位置が対物レンズ３１の移動範囲内であるか否かを判定する。否定判定されると、ステップＳ６へ移行し、対物レンズ３１の移動を停止してエラー表示を行い、終了する。ステップＳ５で、Ｚ軸上の位置が対物レンズ３１の移動範囲内であれば、ステップＳ３へ戻り、対物レンズ３１をさらに＋Ｚ方向に移動させる。

ステップＳ４で、第１の反射光を検出した場合は、ステップＳ７で、一定間隔での微動送りで対物レンズ３１をさらに＋Ｚ方向に移動させる。予め、ペトリディッシュ１００の底板１０１の厚さを想定し、第１の反射光を検出した位置を基準に対物レンズ３１の移動量に制限を設けておき、その制限値を例えば０．５ｍｍとする。ステップＳ８では、対物レンズ３１の移動量が０．５ｍｍ未満であるか否かを判定する。否定判定されると、つまり、対物レンズ３１を０．５ｍｍ以上動かしても第２の反射光が検出されない場合は、スリット反射光検出による焦点検出を中止してステップＳ１５へ移行し、ＡＦ用暗視野照明装置６０に切り換える。このような状況は、例えばペトリディッシュ１００がプラスチック製で、底板１０１の内側表面Ｐ２の平面性が悪い場合に発生し易い。ステップＳ１５以降のプロセスについては後述する。

ステップＳ９では、スリット光Ｌ４がペトリディッシュ１００の底板１０１の内側表面Ｐ２で反射する第２の反射光を検出したか否かを判定する。否定判定されると、ステップＳ７へ戻り、対物レンズ３１をさらに＋Ｚ方向に移動させる。ステップＳ９で、第２の反射光が検出されたときには、ステップＳ１０で、対物レンズ３１をさらに＋Ｚ方向に移動させる。ステップＳ１１では、対物レンズ３１の焦点位置と底板１０１の内側表面Ｐ２が合致したか否かを判定する。否定判定されると、ステップＳ１０へ戻る。ステップＳ１１で、合焦したと判定されると、ステップＳ１２へ移行し、対物レンズ３１の移動を停止する。ステップＳ１３で、合焦したときの対物レンズ３１の位置を記憶する。ステップＳ１４で、落射蛍光照明装置１０または透過照明装置２０を起動して顕微鏡像の撮像を行う。

以上は、ＡＦ用スリット照明／検出装置５０のみを用いた焦点検出プロセスであるが、前述したように、ペトリディッシュ１００の底板１０１の内側表面Ｐ２の平面性が悪いときには、ステップＳ８からステップＳ１５へ移行する場合がある。以下、ＡＦ用暗視野照明装置６０を用いた場合の焦点検出プロセスについて説明する。
ステップＳ１５で、入力部８８ａからＡＦ用暗視野照明装置６０を作動状態とする。ステップＳ１６で、ＣＣＤカメラによる暗視野像を撮像すると同時に対物レンズ３１の位置を記憶する。ステップＳ１７では、一定間隔で対物レンズ３１を移動させ、そのときの暗視野像の撮像と対物レンズ３１の位置の記憶を行う。

ステップＳ１８では、移動と撮像の度に暗視野像を比較演算する。例えば、各暗視野像の所定の画素の輝度を比較し、輝度の差異量を算出してもよいし、ある暗視野像におけるコントラストを他の暗視野像のコントラストと比較し、コントラストの差異量を算出してもよい。ステップＳ１９で、対物レンズ３１の移動が予め設定した範囲に達したか否かを判定する。否定判定されると、ステップＳ１７へ戻り、対物レンズ３１をさらに＋Ｚ方向に移動させる。ステップＳ１９で、対物レンズ３１の移動が予め設定した範囲に達したときは、ステップＳ２０へ移行する。ステップＳ２０では、暗視野像の最大輝度を得たときのＺ軸上の位置に対物レンズ３１を移動させる。ステップＳ２１で、落射蛍光照明装置１０または透過照明装置２０を起動して顕微鏡像の撮像を行う。

以上説明したＡＦ用暗視野照明装置６０を用いた焦点検出では次のような作用効果を奏する。ペトリディッシュ１００の底板１０１の平面性が良くない場合でも、生体試料Ｓそのものにピントを合わせることができる。すなわち、ペトリディッシュ１００の底板１０１の外側表面Ｐ１からの反射も内側表面Ｐ２からの反射も利用せずに合焦が可能である。また、生体試料Ｓを照明するのはエネルギーの小さい赤外光なので、生体試料Ｓにダメージを与えたり蛍光色素の退色を招くことがない。

ＡＦ用スリット照明／検出装置５０とＡＦ用暗視野照明装置６０を併用した焦点検出では次のような作用効果を奏する。スリット反射光検出方式は、検出から対物レンズ３１の位置演算までの時間が短いので、焦点検出の前段にＡＦ用スリット照明／検出装置５０を用い、後段にＡＦ用暗視野照明装置６０を用いることにより、全体として短時間で焦点検出を終了できる。なお、生体試料Ｓが平面性の良いスライドガラスに載置されている場合は、前段に用いられるＡＦ用スリット照明／検出装置５０だけで焦点検出を終了でき、時間短縮を図ることができる。

〈第２の実施の形態〉
本実施の形態による顕微鏡システムは、光学顕微鏡１Ａと自動焦点検出装置の動作を制御するＡＦ制御系とを備えている。図６は、本発明の第２の実施の形態による自動焦点検出装置が備えられる光学顕微鏡１Ａの構成を模式的に示す構成図である。図７は、第２の実施の形態による自動焦点検出装置の焦点検出プロセスを示すフローチャートである。

光学顕微鏡１Ａは、第１の実施の形態で説明した光学顕微鏡１（図２参照）と比べて、ＡＦ用スリット照明／検出装置５０が省略されている点が異なるだけで、他の構成は同じである。これに付随して、本実施の形態のＡＦ制御系も、図１に示したＡＦ制御系８０からＡＦ用スリット照明駆動回路８３とスリット反射光検出回路８４を除外した構成となる。以下、同じ構成部品には同一符号を付し、説明を省略する。

本実施の形態の自動焦点検出装置では、ＡＦ用暗視野照明装置６０のみを用いて焦点検出を行うものであり、この焦点検出動作のプロセスは、第１の実施の形態で説明したＡＦ用暗視野照明装置６０によるプロセスとほぼ同様である。図７のフローチャートを参照すると、入力部８８ａのスタートボタン（不図示）を押すことにより開始信号が送出され、ＡＦ用暗視野照明装置６０が作動状態となり、ＡＦ調節動作が始まる。ステップＳ１で、対物レンズ３１のＺ軸上の原点位置が検出される。ステップＳ２では、高速送りで対物レンズ３１を待機位置に移動させる。ステップＳ３では、中速送りで対物レンズ３１を＋Ｚ方向に移動させる。ここまでのプロセスは、第１の実施の形態では、ＡＦ用スリット照明／検出装置５０による反射スリット光検出のために行われるが、本実施の形態では、ＣＣＤカメラによる暗視野像を最初に撮像する位置に対物レンズ３１を移動させるために行われる。ステップＳ４以降の焦点検出プロセスは、第１の実施の形態で説明したとおりである。

本実施の形態の自動焦点検出装置によれば、第１の実施の形態の自動焦点検出装置のＡＦ用暗視野照明装置６０と同じ作用効果を奏する。さらに、本実施の形態の自動焦点検出装置によれば、焦点検出がＡＦ用暗視野照明装置６０のみで行われるので、光学顕微鏡１Ａの小型化と焦点検出のアルゴリズムの単純化を図ることができる。

次に、図８を参照して、ＡＦ用暗視野照明装置６０の構成の変形例について説明する。図８は、本実施の形態の変形例であり、ＡＦ用暗視野照明装置１６０を拡大して示す部分断面図である。対物レンズ３１が取り付けられるレボルバ３２は、保持部１３０に固定されている。ＡＦ用暗視野照明装置１６０は、前段の光学系が保持部１３０の中にあり、後段の光学系が対物レンズ３１の鏡筒周辺にあり、光軸に沿ってＺ方向に進む赤外光Ｌ５を生体試料Ｓに照射する落射型照明光学系である。

前段の光学系は、赤外光を発するＬＥＤ光源１６１と、集光レンズ１６２と、コリメータレンズ１６３と、リング状スリットが形成されたスリット板１６４と、ドーナツ状の全反射ミラー１６５とを有する。後段の光学系は、全反射ミラー１６６のみを有する。ＬＥＤ光源１６１から射出した赤外光Ｌ５は、集光レンズ１６２によって集光され、コリメータレンズ１６３によって平行光となり、スリット板１６４によって輪帯状の光となる。この輪帯状の赤外光Ｌ５は、全反射ミラー１６５によってＺ方向に反射し、対物レンズ３１の鏡筒の外側を通り、先端付近に配置された全反射ミラー１６６によって方向が変えられ、その結果、輪帯照明が形成される。この場合は、対物レンズ３１の光軸周辺の光を遮蔽する遮蔽部材を設ける。なお、この落射型照明光学系においては、輪帯照明のみに限られず、図４に示したようなスポット光照明を形成するように構成してもよい。

ＡＦ用暗視野照明装置１６０のように落射型照明光学系とすると、ＡＦ用暗視野照明装置を光学顕微鏡１，１Ａの任意の場所に配置でき、構成上の自由度が増す。図８に示されるように、ＡＦ用暗視野照明装置１６０を対物レンズ３１と落射蛍光照明装置１０の間に配置してもよいし、図８の配置と異なる配置、例えばＡＦ用暗視野照明装置１６０を落射蛍光照明装置１０の下側に配置してもよい。

また、自動焦点検出装置がＡＦ用スリット照明／検出装置５０とＡＦ用暗視野照明装置１６０の両方を有する構成では、ＡＦ用スリット照明／検出装置５０とＡＦ用暗視野照明装置１６０をＺ軸上で同じ位置に配置してもよい。例えば、ＡＦ用スリット照明／検出装置５０のＬＥＤ光源５１から射出される近赤外光Ｌ４の向きをＸ方向とし、ＡＦ用暗視野照明装置１６０から射出される赤外光Ｌ５の向きを−Ｘ方向とし、両者の光軸を一致させ、ＡＦ用スリット照明／検出装置５０のダイクロイックミラー５５をＡＦ用暗視野照明装置１６０のドーナツ状全反射ミラー１６５の内側に配置する。この配置では、ＡＦ用スリット照明／検出装置５０とＡＦ用暗視野照明装置１６０をＺ方向に重ねることなく、１段で構成できるので、光学顕微鏡のＺ方向の距離（高さ）を短縮することができる。

次に、図９を参照して、顕微鏡システムの構成の変形例について説明する。図９の変形例は、図１の第１の実施の形態の顕微鏡システムにおける制御マイコン８８をＰＣ９０に置き換えたものである。ＰＣ９０は、不図示の入力部とディスプレイ９１を備え、ＡＦ制御系８０の焦点検出アルゴリズムを統括制御する。この構成によれば、ＡＦ制御系８０に市販のＰＣ９０を接続するだけで第１の実施の形態の顕微鏡システムと同様の作用効果を奏する。また、第２の実施の形態の顕微鏡システムに対しても同様の作用効果を奏する。

以上は、自動で焦点検出を行う装置の説明であるが、単に焦点検出のみを行う装置にも暗視野照明装置６０，１６０を用いることができる。この焦点検出装置では、暗視野照明装置６０，１６０から赤外光Ｌ５を生体試料へ照射し、生体試料からの散乱光Ｌ６を対物レンズ３１を通して光センサにより受光し、光センサがその受光光を電気信号に変換する。電気信号の大きさは、受光した散乱光Ｌ６の強度に比例する。生体試料と対物レンズ３１との距離を変えながら受光光の強度を測定し、生体試料が対物レンズ３１の焦点位置にあるときに受光光の強度が最大になるので焦点位置を知ることができる。受光光の強度が最大値をとった時点で検出動作を終了する。このような焦点検出装置では、受光する散乱光Ｌ６を必ずしも像として撮像する必要はないので、ＣＣＤカメラ７０の代わりに画素数の少ないフォトセンサを使用して焦点位置を演算してもよい。本発明は、その特徴を損なわない限り、以上説明した実施の形態に何ら限定されない。

本発明の第１の実施の形態に係る自動焦点検出装置が備えられる顕微鏡システムの構成を模式的に示す全体構成図である。 本発明の第１の実施の形態に係る自動焦点検出装置が備えられる光学顕微鏡の構成を模式的に示す構成図である。 図２のＩ−Ｉ断面図である。 図３の暗視野照明装置６０を拡大して示す部分断面図である。 本発明の第１の実施の形態に係る自動焦点検出装置の焦点検出プロセスを示すフローチャートである。 本発明の第２の実施の形態に係る自動焦点検出装置が備えられる光学顕微鏡の構成を模式的に示す構成図である。 本発明の第２の実施の形態に係る自動焦点検出装置の焦点検出プロセスを示すフローチャートである。 本発明の実施の形態のＡＦ用暗視野照明装置６０の変形例である。 本発明の実施の形態の自動焦点検出装置が備えられる顕微鏡システムの変形例である。

符号の説明

１，１Ａ：光学顕微鏡
１０：落射蛍光照明装置
２０：透過照明装置
３０：保持部
３１：対物レンズ
３３：ステージ
４０：位置検出部
４３：駆動部
５０：ＡＦ用スリット照明／検出装置
６０，１６０：ＡＦ用暗視野照明装置
７０：ＣＣＤカメラ
８０：ＡＦ制御系
１００：ペトリディッシュ
１０１：底板
Ｌ１：励起光
Ｌ２：蛍光
Ｌ３：照明光
Ｌ４：近赤外光（反射スリット光）
Ｌ５：赤外光
Ｌ６：散乱光
Ｐ１：外側表面
Ｐ２：内側表面
Ｓ：生体試料

Claims (8)

1. 赤外光を発する照明光源と、
   前記照明光源からの照明光を透明容器に収容された試料へ照射する暗視野照明系と、
   前記試料の暗視野像を対物レンズを通して撮像する撮像手段と、
   前記試料と前記対物レンズとの距離を変更する移動手段と、
   前記試料と前記対物レンズとの距離を検出する位置検出手段と、
   前記試料と前記対物レンズとの距離を位置情報として記憶する記憶手段と、
   前記移動手段により前記試料と前記対物レンズとの距離を変更しながら所定回数撮像された複数の暗視野像の輝度信号を比較する演算手段とを備え、
   前記記憶手段により記憶された複数の位置情報のうち、前記演算手段により得られた前記暗視野像の輝度が最大となったときの位置情報により、前記試料の前記対物レンズに対する焦点位置を検出することを特徴とする自動焦点検出装置。
2. 請求項１に記載の自動焦点検出装置と、
   前記試料を収容する透明容器の底板へ前記対物レンズを通してスリット光又はスポット光を照射し、前記底板からのスリット反射光を前記対物レンズを通して検出し、その検出位置に基づいて前記底板と前記対物レンズとの距離を検出するスリット照明／検出手段と、
   前記スリット照明／検出手段により前記スリット反射光を検出したか否かを判定する判定手段と、
   前記判定手段により前記スリット反射光が検出されないときに、請求項１に記載の自動焦点検出装置による焦点検出動作へ移行させる切替え手段とを備えることを特徴とする自動焦点検出装置。
3. 請求項１または２に記載の自動焦点検出装置において、
   前記暗視野照明系は、前記対物レンズの鏡筒先端の外周に配置されることを特徴とする自動焦点検出装置。
4. 請求項１または２に記載の自動焦点検出装置において、
   前記暗視野照明系は、その光路の一部が前記対物レンズの光軸に平行をなす落射型照明光学系であることを特徴とする自動焦点検出装置。
5. 請求項１〜４のいずれか一項に記載の自動焦点検出装置において、
   前記暗視野照明系は、輪帯照明系であり、
   前記対物レンズの鏡筒内には、その光軸周辺の光を遮蔽する遮蔽部材が配設されることを特徴とする自動焦点検出装置。
6. 請求項４に記載の自動焦点検出装置と、
   前記試料へ蛍光を発するように励起光を照射する落射蛍光照明装置とを備え、
   前記対物レンズは、前記試料の蛍光顕微鏡像を形成し、
   前記暗視野照明系は、前記対物レンズの光軸に平行な光路の前段の光学系が前記対物レンズと落射蛍光照明装置の間に配置されることを特徴とする顕微鏡システム。
7. 請求項４に記載の自動焦点検出装置と、
   前記試料へ蛍光を発するように励起光を照射する落射蛍光照明装置とを備え、
   前記対物レンズは、前記試料の蛍光顕微鏡像を形成し、
   前記暗視野照明系は、前記対物レンズの光軸に平行な光路の前段の光学系が前記対物レンズと落射蛍光照明装置の下側に配置されることを特徴とする顕微鏡システム。
8. 赤外光を発する照明光源と、
   前記照明光源からの照明光を試料へ照射する暗視野照明系と、
   前記試料により散乱された散乱光を対物レンズを通して検出する光電変換手段と、
   前記光電変換手段により変換された電気信号に基づいて前記試料の前記対物レンズに対する焦点位置を演算する演算手段とを備えることを特徴とする焦点検出装置。

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