DE102012106867B4

DE102012106867B4 - Vorrichtung und Verfahren zur resonator-verstärkten optischen Absorptionsmessung an Proben mit kleinem Absorptionswirkungsquerschnitt

Info

Publication number: DE102012106867B4
Application number: DE102012106867.4A
Authority: DE
Inventors: August Dorn
Original assignee: Universitaet Hamburg
Current assignee: DORN, AUGUST, DR., DE
Priority date: 2012-07-27
Filing date: 2012-07-27
Publication date: 2016-10-13
Anticipated expiration: 2032-07-28
Also published as: DE102012106867A1

Abstract

Konfokales Lichtmikroskop (100) mit oder ohne Lochblende zur Durchführung optischer Absorptionsmessung an einer Probe (17) mit kleinem Absorptionswirkungsquerschnitt, umfassend mindestens eine Lichtquelle (14), dadurch gekennzeichnet, dass das Lichtmikroskop (100) einen optischen Resonator (10) aufweist, der eingerichtet ist, um die Probe (17) aufzunehmen und mit Licht zu beaufschlagen.

Description

Bezeichnung des Gegenstandes
Die Erfindung betrifft ein konfokales Lichtmikroskop mit oder ohne Lochblende, geeignet zur Durchführung optischer Absorptionsmessungen an einer Probe mit kleinem Absorptionswirkungsquerschnitt gemäß dem Oberbegriff von Anspruch 1.
Technisches Gebiet
Die Absorptionsspektroskopie bietet sich neben der Fluoreszenzspektroskopie als optische Spektroskopiemethode zur Charakterisierung von Mikro- und Nanostrukturen an. Die optischen Eigenschaften von Nanostrukturen werden nicht nur durch deren Materialbeschaffenheit bestimmt, sondern können auch entscheidend von größenabhängigen plasmonischen und exzitonischen Effekten beeinflusst werden. Diese Eigenschaften sind sowohl in der Grundlagenforschung als auch für viele potentielle Anwendung in der Optoelektronik, sowie in den Material-, Medizin- und Biowissenschaften von Bedeutung.
1a) zeigt eine schematische Darstellung einer optischen Absorptionsmessung an einzelnen Mikro- und Nanostrukturen. Eine Probe, beispielsweise ein Virus, ein Nanokristall oder eine DNA-Sequenz befindet sich im Brennpunkt eines Objektivs, durch welches die Probe mit Licht beaufschlagt wird. Entsprechend der optischen Eigenschaften der Probe wird wellenlängenabhängig ein Teil des Lichtes absorbiert. Das Absorptionsspektrum wird anschliessend an einem Spektrometer dispergiert und analysiert.
Zwar sind die Fluoreszenzeigenschaften für viele Anwendung von großem Interesse, jedoch gibt das Fluoreszenzspektrum nur sehr begrenzt Aufschluss über die optischen Eigenschaften der jeweiligen Nanostruktur. So können beispielsweise Nanostrukturen in ihren Fluoreszenzeigenschaften übereinstimmen, obwohl ihre Form oder chemische Zusammensetzung und daher auch ihr Absorptionsspektrum unterschiedlich sind. Zudem zeigen viele Nanostrukturen wenig oder keine Fluoreszenz. Die hieraus resultierende Informationslücke kann mithilfe der Absorptionsspektroskopie geschlossen werden, die es ermöglicht, Rückschlüsse über die Zustandsdichte und das Streuverhalten einer Probe in einem breiten Energiefenster zu gewinnen.
Experimentell sind Absorptionsmessungen an sehr kleinen Probenvolumina schwer durchzuführen. Hingegen ist die Fluoreszenzspektroskopie an einzelnen Molekülen und Nanokristallen bereits ein etabliertes Arbeitsgebiet und hat wertvolle Einblicke in die Fotophysik dieser Strukturen ermöglicht. So konnte das stochastische An- und Abschalten der Fluoreszenz einzelner Moleküle und Nanokristalle, auch Blinken genannt, sowie deren spektrale Diffusion bereits beobachtet werden.
Über die entsprechenden Absorptionseigenschaften ist jedoch kaum etwas bekannt. Diese Effekte sind nicht in Ensemble-Messungen sichtbar, weil sie heraus gemittelt werden. Zwar ist der Nachweis einzelner Moleküle durch die Absorption vor kurzem gelungen, allerdings ist die Aufnahme eines Absorptionsspektrums mit diesen Methoden bislang nicht möglich. Absorptionsspektren von einzelnen Nanostrukturen enthalten somit Informationen, die in einer Ensemble-Messung heraus gemittelt würden und durch die Fluoreszenzspektroskopie nicht zugänglich sind.
1b) zeigt eine Gegenüberstellung des Absorptions- und Fluoreszenzspektrums eines Ensembles von nahezu monodispersen CdSe-Nanokristallen (Durchmesservariation < 5%), sowie die Fluoreszenzlinie eines einzelnen Nanokristalls und hypothetische Absorptionslinien eines einzelnen Nanokristalls.
Stand der Technik
In der US 2004/0114226 A1 wird ein konfokales Rastermikroskop offenbart, umfassend eine Faser, in welcher Laserübergange induziert werden. Die Faser bildet den Resonator eines Faserlasers, in dem Licht zum Ausleuchten einer außerhalb der Faser positionierten Probe verstärkt wird.
Aus der JPS 58-200209 A ist ein abtastendes Spektralanalyse-Mikroskop bekannt, mit dem eine qualitative und eine quantitative Analyse der Materialbestandteile einer Probe sowie die Beobachtung ihrer Form gleichzeitig durchgeführt werden. Die Probe wird mit z. B. einem Infrarotstrahl bestrahlt, der Infrarotstrahl wird mit einem Konkavspiegel konvergiert und das Absorptionsspektrum wird während eines zweidimensionalen Abtastens der Probenoberfläche detektiert. Ein Bild, in dem unterschiedliche Farben verschiedenen Wellenlängen entsprechen, wird dargestellt. Der durch die Probe tretende und absorbierte Strahl, z. B. Infrarotstrahl, wird durch ein Spektroskop in seine Spektralkomponenten zerlegt, von einem Detektor detektiert und in ein zeitserielles elektrisches Signal in Einheiten von Abtastpunkten umgewandelt. Diese Detektion wird wiederholt ausgeführt, während die Probe zweidimensional durch eine Abtasteinrichtung abgetastet wird. Das vom Detektor detektierte Signal wird durch eine Verstärkeranordnung verstärkt und durch eine Farbwiedergabe-Umwandlungsanordnung in ein Signal umgewandelt, das zur Farbwiedergabe verwendbar ist. Dieses Signal wird durch eine Abtast-Umwandlungsanordnung in ein Farbfernsehsignal umgewandelt und auf einem Farbfernsehbildschirm dargestellt.
Die DE 102 55 022 A1 zeigt eine als resonatorverstärktes Absorptions-Spektrometer bezeichnete Vorrichtung zur Bestimmung von Substanzmengen in einer Probe, enthaltend eine ungepulste, inkohärente Strahlungsquelle zur Erzeugung eines Messlichtstrahls, einen Resonator mit wenigstens zwei Spiegeln, in welchen der Messlichtstrahl einkoppelbar ist, ein Probenvolumen zur Aufnahme einer großvolumigen, gasförmigen, absorbierenden Probe innerhalb des Resonators und einen Detektor zur Aufnahme der Strahlung, welche aus dem Resonator auskoppelbar ist. Zwischen dem Resonator und dem Detektor sind Mittel zur spektralen Zerlegung des Messlichtstrahls vorgesehen. Das Mittel zur spektralen Zerlegung ist vorzugsweise ein dispergierendes Element, insbesondere ein Dispersionsgitter.
Aus der US 2011/0235022 A1 sind eine Vorrichtung, ein Verfahren sowie ein rechnerlesbares Speichermedium zum Bestimmen der Abklingzeit in einem Spektrometersystem bekannt. Das in dieser Druckschrift dargestellte System enthält ein sogenanntes Cavity-Ring-Down-Spektrometer, d. h. ein Hohlraum- oder Resonatorabklingzeitspektrometer, sowie einen Prozessor. Das Spektrometer ist zum Übertragen eines modulierten elektromagnetischen Dauerstrichsignals durch einen Hohlraumresonator bei einer oder mehreren wählbaren Übertragungsfrequenzen im Terahertzbereich des elektromagnetischen Spektrums ausgerüstet. Das Spektrometer umfasst einen Sender, der zusammen mit dem Hohlraumresonator zum Anregen eines einzigen Resonanzmodus des Hohlraumresonators ausgebildet ist. Der Prozessor ist ausgebildet zum Empfangen einer Messung des übertragenen Anteils des modulierten elektromagnetischen Signals und zum Bestimmen einer Phasenverschiebung des modulierten elektromagnetischen Signals auf Grundlage der Messung. Weiterhin ist der Prozessor eingerichtet zum Berechnen der Abklingzeit des Hohlraumresonators als Funktion der Phasenverschiebung. Der Hohlraumresonator enthält in einem bevorzugt gasförmigen Grundmedium, insbesondere Luft, ein Probenmedium, das vorzugsweise ebenfalls gasförmig oder als Aerosol vorliegt.
In der DE 690 15 968 T2 ist ein Spektrometer-Mikroskop für Infrarot beschrieben. Dieses enthält eine Lichtquelle, einen Kondensorspiegel zum Sammeln des von der Lichtquelle emittierten Lichts sowie zum Bestrahlen einer Probe mit dem gesammelten Licht, ferner einen Objektspiegel zur Fokussierung desjenigen Lichts, das durch die Probe hindurchgegangen oder von dieser reflektiert worden ist, ein Spektrometer-Messsystem zum Empfang sowie zur Analyse des durch den Objektspiegel fokussierten Lichts, wobei der Objektspiegel und das Spektrometer-Messsystem innerhalb einer Bildfokussierungseinrichtung enthalten sind. Außerdem umfasst das Spektrometer-Mikroskop Mittel zur Anordnung eines ATR-Kristalls zwischen dem Kondensorspiegel und dem Objektspiegel, um eine ATR-Analyse zu ermöglichen, und einen Verschiebemechanismus zur Verschiebung entweder des Kondensorspiegels oder des Objektspiegels in einer Richtung senkrecht zu einer optischen Achse. Getrennt von der Bildfokussierungseinrichtung ist eine Kollektoreinrichtung vorhanden, die die Lichtquelle und den Kondensorspiegel enthält. Der ATR-Kristall ist zwischen der Kollektoreinrichtung und der Bildfokussierungseinrichtung positionierbar. Durch den Verschiebemechanismus sind entweder die Kollektoreinrichtung oder die Bildfokussierungseinrichtung gegeneinander in der genannten Richtung verschiebbar.
Der Druckschrift DE 102007009560 A1 sind eine Spektroskopievorrichtung und ein Spektroskopieverfahren entnehmbar. Die Spektroskopievorrichtung ist mit einem primären Laser, mit dem ein Single-Mode-Lasersignal erzeugbar ist, und mit einem sekundären Laser, in dessen Resonator ein zu untersuchendes Medium bzw. eine zu untersuchende Substanz, insbesondere gasförmig und bevorzugt über Ventile, einbringbar ist, ausgebildet. Dabei wird das Single-Mode-Lasersignal des primären Lasers in den sekundären Laser derart eingekoppelt, dass die Frequenzen, die Phasen und die Polarisationen des Single-Mode Lasersignals des primären Lasers und eines durch dieses angeregten Lasersignals des sekundären Lasers übereinstimmen. Eine Wellenlänge des Lasersignals des sekundären Lasers ist über das Single-Mode-Lasersignal des primären Lasers steuerbar, und über das Lasersignal des sekundären Lasers ist eine Absorptionslinie des zu untersuchenden Mediums messbar. Die beschriebene Spektroskopievorrichtung und das beschriebene Spektroskopieverfahren nutzen dazu grundsätzlich ein Single-Mode Intracavity Spektroskopie-Verfahren. Intracavity Spektroskopievorrichtungen und -verfahren umfassen einen Detektor zur hochsensitiven, stoffspezifischen Konzentrationsmessung von Spurenkonzentrationen und werden daher als in besonderem Maße zur Messung von nur in geringen Mengen vorliegenden Gasen und Flüssigkeiten geeignet bezeichnet. Dabei wird eine Konzentrationsmessung für all diejenigen Analyte als möglich bezeichnet, deren Absorptionslinien in demjenigen spektralen Bereich liegen, der durch den Laser der Vorrichtung abgedeckt ist.
Nachteilig bei den bekannten Vorrichtungen und Verfahren der Absorptionsspektroskopie ist, dass es derzeit noch nicht möglich ist Absorptionsspektren an Proben mit kleinem Absorptionswirkungsquerschnitt, insbesondere an einzelnen Mikro- und Nanostrukturen, aufzunehmen.
Eine zentrale Herausforderung, die der Aufnahme von Absorptionsspektren an einzelnen Nanostrukturen entgegensteht, ist deren kleiner Absorptionswirkungsquerschnitt. So besitzt beispielsweise ein Nanokristall eine Querschnittsfläche, die ca. 3–4 Größenordnungen kleiner ist als die beugungslimitierte Fokal-Querschnittsfläche eines Objektivs. Ein einzelner Nanokristall der sich im Brennpunkt eines Objektivs befindet wird daher relativ zur Intensität des transmittierten Lichtes nur eine sehr geringe Menge Licht absorbieren. Somit wird das Absorptionssignal relativ zum Hintergrundsignal und dem damit verbundenen Hintergrundrauschen sehr schwach.
Bisherige Lösungsansätze zur Lösung dieses Problems beruhen beispielsweise auf einer Modulation der Probenposition innerhalb des Lichtfeldes eines konventionellen Konfokalmikroskops. Allerdings sind diese Methoden neben ihrer immer noch geringen Empfindlichkeit auch relativ langsam. Dies steht der Untersuchung schneller biochemischer oder fotophysikalischer Prozesse, sowie dem Einsatz als Rastermikroskopiemethode entgegen.
Darstellung der Erfindung: Aufgabe, Lösung, Vorteile
Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, ortsaufgelöste optische Absorptionsmessungen an Proben mit kleinem Absorptionswirkungsquerschnitt präzise und auf kurzen Zeitskalen durchzuführen, sowie Strukturen im Mikro- und Nanometerbereich, beispielsweise Nanokristalle oder Viren, schnell und kostengünstig zu detektieren und zu charakterisieren.
Diese Aufgabe wird durch die im Anspruch 1 angegebenen Merkmale eines konfokalen Lichtmikroskops mit oder ohne Lochblende zur Durchführung optischer Absorptionsmessungen an einer Probe mit kleinem Absorptionswirkungsquerschnitt, welches mindestens eine Lichtquelle sowie einen optischen Resonator umfasst, sowie durch die Bereitstellung eines Verfahrens mit den im Anspruch 17 angegebenen Merkmalen zur Durchführung optischer Absorptionsmessungen an einer Probe mit kleinem Absorptionswirkungsquerschnitt, gelöst.
Das erfindungsgemäße konfokale Lichtmikroskop ist geeignet zur Durchführung optischer Absorptionsmessungen an einer Probe mit kleinem Absorptionswirkungsquerschnitt und umfasst mindestens eine Lichtquelle, sowie einen optischen Resonator, der eingerichtet ist eine Probe aufzunehmen und mit dem Licht der Lichtquelle zu beaufschlagen. Die Fokalebene des konfokalen Lichtmikroskops befindet sich dabei innerhalb des optischen Resonators.
Die der Erfindung zu Grunde liegende Idee besteht darin, dass ein in den optischen Resonator eingekoppelter Lichtpuls den Resonator im Schnitt viele Male durchläuft bevor er ihn wieder verlässt. Bei jedem Durchlauf wechselwirkt der Lichtpuls erneut mit der Probe, welche innerhalb des Resonators in der Fokalebene des Lichtmikroskop anordbar ist. Diese Kombination von konfokaler Rastermikroskopie und Cavity-Ring-Down-Spectroscopy (CRDS) kann als Scanning-Cavity-Ring-Down-Absorption-Microscopy (SCRAM) bezeichnet werden.
Durch die mehrmalige Wechselwirkung des Lichtes mit der Probe wird der effektive Absorptionswirkungsquerschnitt, als Maß für die Wahrscheinlichkeit der Wechselwirkung zwischen Licht und Probe, erhöht, und somit das Absorptionssignal relativ zum Hintergrundsignal verstärkt. Durch Benutzung von Spiegeln mit nicht verschwindender optischer Transmissivität lässt sich eine Serie transmittierter Lichtpulse aus dem optischen Resonator auskoppeln. Die Serie transmittierter Lichtpulse, die ein einzelner im Resonator umlaufende Lichtpuls erzeugt, ist schematisch in dargestellt. Der exponentielle Abfall der Intensität der transmittierten Lichtpulse spiegelt die Abklingzeit des Resonators samt Probe wieder, während die Pulsbreite durch die Lichtquelle und der Pulsabstand durch die Umlaufzeit im Resonator bestimmt werden. In wird illustriert wie sich das Absorptionsspektrum der transmittierten Lichtpulse als Funktion der Zahl an Umläufen verändern kann. Die Tiefe der Absorptionsbanden nimmt mit jedem Umlauf zu, gleichzeitig nimmt die Intensität des Hintergrundsignals, bedingt durch Verluste im Resonator sowie durch breitbandige Mie- oder Rayleigh-Streuung an der Probe, beispielsweise an einer Nanostruktur, ab.
Es ist somit möglich auf kurzen Zeitskalen ortsaufgelöste optische Absorptionsmessungen an Proben mit kleinem Absorptionswirkungsquerschnitt durchzuführen.
Zweckmäßige Ausgestaltungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen gekennzeichnet.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der optische Resonator des konfokalen Lichtmikroskops als rasterbarer Resonator, insbesondere als rasterbarer Resonator mit hoher Lichtfeldintensität am Ort der Probe, ausgebildet. Die Probe ist dabei insbesondere in den zwei räumlichen Dimension der Konfokalebene rasterbar bzw. abtastbar, insbesondere ist die Probe in allen drei räumlichen Dimensionen rasterbar. Bevorzugt weist das konfokale Lichtmikroskop dafür eine Scanvorrichtung auf, insbesondere eine Piezoscanvorrichtung oder Closed-Loop-Piezoscanvorrichtung. Die Probe wird dabei insbesondere auf der Scanvorrichtung angeordnet. Durch die Kombination eines konfokales Lichtmikroskops mit einem rasterbaren optischen Resonator eignet sich das Lichtmikroskop vorteilhafterweise zur konfokalen Rastermikrokopie und zur Untersuchung schneller fotophysikalischer Prozesse. Besonders vorteilhaft ist, dass sich mit dem konfokalen Lichtmikroskop schneller und empfindlicher als mit bisherigen Techniken ortsaufgelöste optische Absorptionsspektren messen lassen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Lichtquelle als gepulste Lichtquelle oder als Dauerstrichlichtquelle ausgebildet. Weiter bevorzugt ist die Lichtquelle als monochromatische Lichtquelle oder als breitbandige Lichtquelle ausgebildet. Als Lichtquellen sind insbesondere Laser, Farbstofflaser, wellenlängen-scan bare Laser, Weißlicht-Laser, LEDs, cw-Weißlichtquellen, thermische Lichtquellen oder Dampflampen bevorzugt. Vorteilhafterweise können durch Verwendung einer breitbandigen Lichtquelle Informationen über die Zustandsdichte und das Streuverhalten einer Probe in einem breiten Energiefenster gewonnen werden. Bei Verwendung einer monochromatischen Lichtquelle kann diese beispielsweise auf eine bestimmte Wellenlänge eingestellt werden, bei der ein bestimmtes Molekül absorbiert. Es kann dann durch konfokales Abrastern der Probe in vorteilhafter Weise ein Konzentrationsbild des jeweiligen Stoffes in der Probe erstellt werden.
Weiter bevorzugt weist das konfokale Lichtmikroskop ein Spektrometer, insbesondere ein Prisma oder ein Gitterspektrometer auf, an dem das aus dem Resonator ausgekoppelte Licht dispergiert wird. Insbesondere bevorzugt umfasst das konfokale Lichtmikroskop einen Lichtintensitätsmesser, insbesondere eine Fotodiode, einen Fotomultiplier oder eine Kameravorrichtung, insbesondere eine CCD-Kamera oder eine Gated-CCD-Kamera. Besonders bevorzugt ist das Aufnahmefenster des Lichtintensitätsmessers, insbesondere der CCD-Kamera oder der Gated-CCD-Kamera mit der Pulsrate einer gepulsten Lichtquelle, bevorzugt mittels eines Triggersignals, synchronisiert. Durch Synchronisation des Lichtintensitätsmessers, beispielsweise einer Gated-CCD-Kamera, mit der Pulsrate einer gepulsten Lichtquelle, ist es in vorteilhafter Weise möglich aus einer Serie aus dem optischen Resonator ausgekoppelter Lichtpulse, einen oder mehrere Pulse, bei denen das Signal zu Rauschverhältnis optimal ist, bzw. nach einer vorbestimmten Anzahl von Resonatorumläufen, zur Messung auszuwählen. Bei Einsatz einer Dauerstrich-Lichtquelle besteht das detektierte Signal nicht mehr aus einem Puls nach einer bestimmten Zahl an Umläufen, sondern aus einer gemittelten durchschnittlichen Anzahl an Resonatorumläufen.
In einer weiteren Ausführungsform ist das konfokale Lichtmikroskop dadurch gekennzeichnet, dass der optische Resonator mindestens zwei reflektierende Spiegel umfasst, wobei die reflektierenden Spiegel insbesondere ein metallisches oder dielektrisches Material aufweisen. Weiter bevorzugt begrenzen ein erster und zweiter Spiegel den optischen Resonator, wobei insbesondere der erste und/oder der zweite Spiegel eine nicht verschwindende optische Transmissivität aufweisen, und wobei der Resonator insbesondere im Durchlichtbetrieb betreibbar ist.
Weiter bevorzugt weist der Resonator des konfokalen Lichtmikroskops einen ersten Strahlteiler, d. h. einen Spiegel mit nicht verschwindender optischer Transmissivität, insbesondere einen ebenen Strahlteiler auf. Der erste Strahlteiler ist dabei insbesondere in einem Winkel von beispielsweise 45° oder 30° zur Längsachse des Resonators angeordnet und eignet sich insbesondere zu seitlichen Einkopplung und/oder Auskopplung von Licht in den optischen Resonator. Der Winkel des ersten Strahlteilers zur Längsachse des Resonators kann aber auch jeden anderen Wert betragen, bei dem eine seitliche Einkopplung und/oder Auskopplung von Licht in den optischen Resonator möglich ist. Bevorzugt weist der erste Strahlteiler eine hohe optische Transmissivität und daraus folgend eine geringe Reflektivität auf. Die hohe optische Transmissivität des ersten Strahlteilers führt vorteilhafterweise zu einem nur geringen Intensitätsverlust im Absorptionssignal. Die aufgrund der geringen Reflektivität des Strahlteilers schwache Ausbeute des Anregungssignals, d. h. des einzukoppelnden Lichtes, kann durch eine entsprechend erhöhte Intensität der Lichtquelle ausgeglichen werden.
In einer weiteren Ausführungsform ist ein erster Strahlteiler des konfokalen Lichtmikroskops außerhalb des optischen Resonators, insbesondere auf der Fortführung der Längsachse des optischen Resonators, angeordnet. Bevorzugt kann Licht an dem ersten Strahlteiler reflektiert und durch einen der den optischen Resonator begrenzenden Spiegel in den Resonator eingekoppelt werden. Weiter bevorzugt kann aus dem optischen Resonator ausgekoppeltes Licht vom ersten Strahlteiler transmittiert und anschließend analysiert werden. Durch die Anordnung des ersten Strahlteilers außerhalb des optischen Resonators wird vorteilhafterweise die Güte des Resonators verbessert.
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform des konfokalen Lichtmikroskops sind ein erster und ein zweiter Strahlteiler, sowie ein, insbesondere gewinkelter, Spiegel außerhalb des optischen Resonators angeordnet. Der erste und der zweite Strahlteiler sowie der gewinkelte Spiegel sind dabei insbesondere so angeordnet, dass der in den Resonator einzukoppelnde Lichtstrahl oder Lichtpuls in einen reflektierten und einen transmittierten Teil zerlegt werden kann, dass der reflektierte Teil in den Resonator eingekoppelt werden und diesen durchlaufen kann, und dass nach Durchlaufen des Resonators der reflektierte Lichtstrahl mit dem transmittierten Lichtstrahl in Überlagerung gebracht werden kann. Besonders bevorzugt kann der am ersten Strahlteiler reflektierte Teil des Lichtstrahls oder des Lichtpulses in den Resonator eingekoppelt, nach Durchlaufen des Resonators ausgekoppelt und durch den ersten und zweiten Strahlteiler hindurch transmittiert werden, während der am ersten Strahlteiler transmittierte Teil des Lichtstrahls über den gewinkelten Spiegel auf den zweiten Strahlteiler geworfen und an diesem reflektiert werden kann. Durch die Überlagerung der reflektierten und transmittierten Lichtanteile lässt sich eine probenbedingte Änderung der Phase des Lichtes in ein Intensitätssignal umwandeln. Die probenbedingte Phasenverschiebung des reflektierten Lichtes drückt sich dann im Interferenzbild der beiden überlagerten Strahlen aus und kann als Intensitätssignal detektiert werden. Weiter bevorzugt ist der gewinkelte Spiegel verschiebbar angeordnet. Somit lässt sich in vorteilhafter Weise durch Verschieben des gewinkelten Spiegels die Phasenbeziehung zwischen dem reflektierten und dem transmittierten Teil des Lichtstrahls einstellen, bzw. durchstimmen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das konfokale Lichtmikroskop dadurch gekennzeichnet, dass der optische Resonator mindestens eine Linse und/oder mindestens ein Objektiv aufweist. Insbesondere bevorzugt weist der optische Resonator mindestens zwei Objektive oder Linsen auf, wobei die Linsen und/oder Objektive insbesondere konfokal angeordnet sind, und wobei insbesondere die Probe konfokal in den gemeinsamen Brennpunkt der mindestens zwei Objektive oder Linsen anordbar ist. Besonders bevorzugt ist mindestens eine der Linsen als achromatische Linse oder als Linse hoher numerischer Apertur oder als Wasser- oder Öl-Immersions-Linse ausgebildet, oder mindestens eines der Objektive ist als achromatisches Objektiv oder als Objektiv hoher numerischer Apertur oder als Wasser- oder Öl-Immersions-Objektiv ausgebildet. Durch die konfokale Anordnung der Probe in dem gemeinsamen Brennpunkt der mindestens zwei Objektive oder Linsen eignet sich das konfokale Lichtmikroskop vorteilhafterweise für die konfokale Rastermikroskopie. Vorteilhaft an einer Benutzung achromatischer Linsen oder Objektive ist, dass diese den gleichen Brennpunkt für verschiedene Wellenlängen aufweisen, und somit die Mikroskopiemethode in einem großen Wellenlängenbereich anwendbar ist. Linsen oder Objektive hoher numerischer Apertur weisen kleine Fokaldurchmesser auf, wodurch vorteilhafter Weise eine höhere Ortsauflösung erreicht werden kann. Durch den Einsatz von Wasser- oder Öl-Immersions-Objektiven oder -Linsen können vorteilhafterweise Streuverluste an den Proben bzw. Substraten und deren Oberflächen reduziert werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weist mindestens ein erster und/oder ein zweiter der den optischen Resonator begrenzenden Spiegel eine fokussierende Wölbung auf. Dabei sind insbesondere der erste und der zweite Spiegel einzeln oder in Kombination geeignet ein in den Resonator einzukoppelndes Lichtfeld oder einen in den Resonator einzukoppelnden Lichtpuls in einer Ebene innerhalb des optischen Resonator, in welcher insbesondere die Probe anordbar ist, zu fokussieren. Insbesondere sind der erste und der zweite Spiegel konfokal angeordnet, weisen also einen gemeinsamen Brennpunkt auf, und die Probe ist bevorzugterweise in der gemeinsamen Fokusebene des ersten und des zweiten Spiegels anordbar. Vorteilhaft an dieser Ausführungsform ist, dass durch Verzicht auf fokussierende Objektive oder Linsen die Anzahl der Grenzflächen innerhalb des optischen Resonators verringert werden, und somit Streuverluste weiter reduziert werden können. Entsprechend ermöglicht dies auch höhere Gütefaktoren. Zusätzlich ist die Fokussierung durch entsprechend gewölbte Resonatorspiegel besonders achromatisch und der Wellenlängenbereich in dem diese Art der Optik funktioniert ist vorteilhafter Weise besonders groß.
Besonders bevorzugt ist die Probe im Wesentlichen auf der Oberfläche eines ersten der reflektierenden Spiegel anordbar, wobei insbesondere der Brennpunkt der mindestens einen Linse oder des mindestens einen Objektivs oder des mindestens einen fokussierenden zweiten Spiegels mit der Oberfläche des ersten reflektierenden Spiegels zusammenfällt. Dieser Aufbau ist in Bezug auf Justierung und Handhabung der Probe in vorteilhafter Weise sehr effizient.
In einer insbesondere bevorzugten Ausführungsform weist mindestens ein erster reflektierender Spiegel eine transparente Schicht auf, insbesondere eine Schicht die entsprechend einer vorbestimmten Wellenlänge λ eine optische Dicke von λ/4 besitzt. Insbesondere bevorzugt fällt dabei der Brennpunkt der mindestens einen Linse oder des mindestens einen Objektivs oder des mindestens einen fokussierenden zweiten Spiegels mit der Oberfläche des ersten reflektierenden Spiegels zusammen. Weiter ist insbesondere die Probe auf der transparenten Schicht anordbar. Eine an dem ersten reflektierenden Spiegel reflektierte Lichtwelle der Wellenlänge λ Bildet im Abstand von λ/4 über der Oberfläche des Spiegels einen Wellenbauch aus. Es ist daher von Vorteil eine Probe, zum Beispiel eine Nanostruktur, am Ort maximale Lichtintensität zu positionieren und deshalb eine dünne transparente Schicht mit einer optischen Dicke von λ/4 auf den reflektierenden Spiegel aufzutragen und die Probe auf dieser Schicht anzuordnen.
Weiter bevorzugt weist das konfokale Lichtmikroskop eine Vorrichtung auf, welche zur Berechnung der für die Absorptionsmessung optimalen Betriebsparameter geeignet ist. Insbesondere ist die Vorrichtung geeignet, die optimale Zahl an Umläufen eines Lichtpulses innerhalb des Resonators zu bestimmen. Für die Bestimmung der optimalen Zahl an Umläufen nach der ein ausgekoppelter, bzw. transmittierter, Lichtpuls bei der Detektion das optimale Signal zu Rauschverhältnis zeigt, können folgende Faktoren eine Rolle spielen: Streuverluste bzw. Gütefaktor des Resonators bedingt durch die enthaltenen Linsen, Objektive, sowie Verluste an Spiegeln und durch den Bruchteil des ausgekoppelten Lichtes für die Detektion, Absorption und Streuung an der Probe, die Intensität des Lichtfeldes, Eigenschaften des Detektors sowie weitere Rauschquellen, zum Beispiel die mechanische Stabilität des Resonators. Eine automatische Berechnung der optimalen Betriebsparameter führt zu einer vorteilhaften Messgenauigkeit und/oder Zeitersparnis im Betrieb des Lichtmikroskops.
In einer weiteren Ausführungsform ist das konfokale Lichtmikroskop dadurch gekennzeichnet, dass das Mikroskop als Multi-Photonen-Mikroskop, insbesondere als 2-Photonen-Mikroskop ausgebildet ist. Anders als bei der herkömmlichen 1-Photonen-Absorption nimmt bei der nicht linearen 2-Photonen-Absorption der Wirkungsquerschnitt stark mit größer werdender Lichtintensität zu. Dadurch kann vorteilhafterweise eine noch größere effektive Fokussierung erzielt werden, als durch das Beugungslimit gegeben ist. Dies gilt sowohl in den räumlichen Dimension der Fokalebene, als auch in der räumlichen Dimension senkrecht zur Fokalebene. Daher erlaubt dieses Verfahren vorteilhafterweise auch eine bessere 3D-Rasterung der Probe.
Eine weitere Lösung des Problems besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens mit den Merkmalen des Anspruchs 17 zur Durchführung von Absorptionsmessungen an Proben mit kleinem Absorptionswirkungsquerschnitt mit einem konfokalen Lichtmikroskop, welches mindestens eine Lichtquelle sowie einen optischen Resonator aufweist.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Durchführung von Absorptionsmessungen an einer Probe mit kleinem Absorptionswirkungsquerschnitt mit einem konfokalen Lichtmikroskop, welches mindestens eine Lichtquelle sowie einen optischen Resonator umfasst, ist dadurch gekennzeichnet, dass sich die Konfokalebene des konfokalen Lichtmikroskops innerhalb des Resonators befindet, dass die Probe in der Konfokalebene angeordnet wird, und dass die Probe mit Licht beaufschlagt wird.
Vorteilhaft an dem erfindungsgemäßen Verfahren ist, dass ein Lichtpuls welcher in den optischen Resonator eingekoppelt wird im Schnitt den optischen Resonator viele Male durchläuft bevor er den Resonator wieder verlässt. Bei jedem Durchlauf wechselwirkt der Lichtpuls mit der Probe, so dass der effektive Absorptionswirkungsquerschnitt, als Maß für die Wahrscheinlichkeit der Wechselwirkung des Lichtes mit der Probe, erhöht wird.
Bevorzugte Ausführungen des Verfahrens sind in den Unteransprüchen gekennzeichnet.
Eine bevorzugte Ausführung des Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass die Probe gerastert wird, wobei bevorzugt die Probe auf einer Scanvorrichtung, insbesondere auf einer Piezoscanvorrichtung angeordnet wird. Durch das Rastern der Probe lässt sich vorteilhafterweise das Verfahren als Raster-Mikroskopieverfahren einsetzen.
In einer weiteren Ausführung des Verfahrens wird die Lichtquelle gepulst oder im Dauerstrichbetrieb betrieben. Bevorzugt strahlt die Lichtquelle monochromatisches oder breitbandiges Licht ab. Weiter bevorzugt wird das Licht der Quelle oder mindestens ein Lichtpuls der Lichtquelle in den optischen Resonator eingekoppelt. Insbesondere bevorzugt durchlaufen die Photonen des in den optischen Resonator eingekoppelten Lichtes oder des mindestens einen in den optischen Resonator eingekoppelten Lichtpulses den Resonator mindestens einmal, wobei bei jedem Durchlauf das Licht bzw. der Lichtpuls mit der in der Konfokalebene angeordneten Probe wechselwirkt. Durch die mehrmalige Wechselwirkung des Lichtes mit der Probe wird vorteilhafter Weise der effektive Absorptionswirkungsquerschnitt und somit das Signal zu Rauschverhältnis erhöht.
In einer besonders bevorzugten Ausführung des Verfahrens wird bestimmt durch die Güte des optischen Resonators ein Teil des Lichtes aus dem optischen Resonator ausgekoppelt, oder bei jedem Umlauf wird ein Teil des Lichtpulses in einer Serie transmittierter Lichtpulse ausgekoppelt. Besonders bevorzugt wird das ausgekoppelte Licht oder die Serie transmittierter Lichtpulse an einem Spektrometer insbesondere an einem Prisma oder an einem Gitterspektrometer dispergiert. Insbesondere bevorzugt wird das ausgekoppelte Licht oder die Serie transmittierter Lichtpulse mit einem Lichtintensitätsmesser, insbesondere einer Fotodiode, einem Fotomultiplier oder einer Kamera, insbesondere einer CCD-Kamera bzw. einer Gated-CCD-Kamera detektiert, wobei insbesondere das Aufnahmezeitfenster des Lichtintensitätsmessers mit der Pulsrate der Lichtquelle synchronisiert ist. Dabei entspricht bevorzugt das Aufnahmezeitfenster das Lichtintensitätsmessers einer gemittelten Anzahl von Resonatorumläufen der Photonen, oder das Aufnahmezeitfenster des Lichtintensitätsmessers isoliert mindestens einen der transmittierten Lichtpulse.
In einer weiter bevorzugten Ausführung des Verfahrens wird die probenbedingte Änderung der Phase des Lichts durch Interferenz mit dem einfallenden Lichtstrahl in ein Intensitätssignal umgewandelt und detektiert. Insbesondere wird der einfallende Lichtstrahl an einem Strahlteiler in einen reflektierten und einen transmittierten Teil zerlegt, wobei der reflektierte Teil in den optischen Resonator eingekoppelt wird und diesen durchläuft, und mit dem vom Strahlteiler transmittierten Teil des Lichtes in Überlagerung gebracht wird. Weiter bevorzugt ist die Phasenbeziehung zwischen dem reflektierten und dem transmittierten Teil des Lichts durchstimmbar.
In einer besonders bevorzugten Ausführung des Verfahrens umfasst dieses zur Optimierung des Signal zu Rauschverhältnisses einen Algorithmus, der die optimalen Betriebsparameter bestimmt. Insbesondere bestimmt dieser Algorithmus die optimale Zahl an Umläufen der Photonen innerhalb des Resonators, nach welcher ein transmittierter Puls gemessen wird. Dabei bezieht der Algorithmus insbesondere die Streuverluste bzw. den Gütefaktor des Resonators mit ein, welche durch die enthaltenen Linsen, Objektive, oder Verluste an Spiegeln und den Bruchteil des ausgekoppelten Lichtes für die Detektion bedingt sind. Weiter beachtet der Algorithmus die Absorption und die Streuung des Lichtes an der Probe, die Intensität des Lichtfelds sowie die Eigenschaften des Detektors und weitere Rauschquellen, zum Beispiel die mechanische Stabilität des Resonators.
In einer weiteren Ausführung des Verfahrens wird das Licht im Resonator durch mindestens eine Linse oder mindestens ein Objektiv oder durch mindestens einen gewölbten Spiegel auf die Probe fokussiert. Insbesondere bevorzugt wird die Probe im Wesentlichen auf einem der reflektierenden Spiegel angeordnet. Weiter bevorzugt wird auf einem der Spiegel entsprechend einer vorbestimmten Wellenlänge λ eine transparente Schicht der optischen Dicke λ/4 aufgetragen. Dabei wird die Probe insbesondere auf der transparenten Schicht positioniert.
In einer besonders bevorzugten Ausführung des Verfahrens werden mit dem Verfahren biologische und/oder anorganische Proben detektiert und, insbesondere durch ihre wellenlängenabhängige optische Absorption oder Streuung, charakterisiert. Insbesondere bevorzugt werden mit dem Verfahren Zellen, Viren, DNA und DNA-Sequenzen, histologische Schnitte, Nanokristalle, Nanodrähte, Cluster, Graphen, dünne und ultradünne Schichten, Mikro- und Nanopartikel, sowie Staub- und Pulverpartikel detektiert und charakterisiert.
In einer weiter bevorzugten Ausführung des Verfahrens werden mit diesem ohne Zuhilfenahme von Farbstoffen stoffliche und strukturelle Informationen von Proben gewonnen. Insbesondere erlaubt die Fähigkeit breitbandige Absorptionsspektren an einem Punkt mit dem Verfahren schnell aufzunehmen eine feine Rasterung der Probe mit hoher Informationstiefe, wobei diese Fähigkeit insbesondere für die Untersuchung histologischer Schnitte von Interesse ist.
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird die nicht lineare 2-Photonen-Absorption einer Probe gemessen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Im Folgenden wird das erfindungsgemäße konfokale Lichtmikroskop und das erfindungsgemäße Verfahren zur Durchführung von optischen Absorptionsmessungen an einer Probe mit kleinem Absorptionswirkungsquerschnitt anhand eines Ausführungsbeispiels beschrieben. Es zeigen in rein schematischer Darstellung
1a) eine Illustration einer optischen Absorptionmessung an einzelnen Mikro- und Nanostrukturen,
1b) ein Absorptions- und Fluoreszenzspektrum eines Ensembles von CdSe-Nanokristallen sowie die Fluoreszenzlinien und hypothetischen Absorptionslinien einzelner Nanokristalle,
2a) eine erste Ausführungsform des konfokalen Lichtmikroskops umfassend eine gepulste Weißlichtquelle sowie einen optischen Resonator,
2b) den Intensitätsverlauf der durch einen umlaufenden Lichtpuls verursachten transmittierten Lichtpulse,
2c) die Spektren der transmittierten Lichtpulse als Funktion der Zahl an Umläufen,
3a) eine zweite Ausführungsform des konfokalen Lichtmikroskops ohne Linsen oder Objektive im Durchlichtbetrieb,
3b) eine dritte Ausführungsform des konfokalen Lichtmikroskops mit seitlicher Lichteinkopplung sowie mit einem mit einem Substrat der optischen Dicke λ/4 beschichteten reflektierenden ersten Spiegel,
3c) eine vierte Ausführungsform des konfokalen Lichtmikroskops im Durchlichtbetrieb,
3d) eine fünfte Ausführungsform des konfokalen Lichtmikroskops mit seitlicher Lichteinkopplung, einem Objektiv sowie einem mit einem Substrat beschichteten Spiegel,
3e) eine sechste Ausführungsform des konfokalen Lichtmikroskops mit einem außerhalb des optischen Resonators angeordneten Strahlteiler, und
3f) eine siebte Ausführungsform des konfokalen Lichtmikroskops mit zwei außerhalb des optischen Resonators angeordneten Strahlteilern sowie einem gewinkelten Spiegel.
Bevorzugte Ausführungsform der Erfindung
2a) zeigt eine erste Ausführungsform des erfindungsgemäßen konfokalen Lichtmikroskops (100). Das Lichtmikroskop (100) besteht aus einem Resonator (10) der Länge (L) welcher aus einem ersten reflektierenden Spiegel (11) und einem zweiten reflektierenden Spiegel (12) gebildet wird. Sowohl der erste Spiegel (11) als auch der zweite Spiegel (12) weisen eine nicht verschwindende optische Transmissivität auf. Ein Lichtpuls (13) eines gepulsten Weißlicht-Lasers (14) wird durch den ersten reflektierenden Spiegel (11) in den Resonator (10) eingekoppelt und durchläuft diesen viele Male. Innerhalb des Resonators (10) sind ein erstes Objektiv (15) und ein zweites Objektiv (16) konfokal angeordnet. In der gemeinsamen Fokalebene (F) ist eine Nanostruktur (17) angeordnet, welche sich auf einer Piezoscanvorrichtung (18) befindet. Mittels der Scanvorrichtung (18) ist die Nanostruktur (17) in zwei Dimensionen rasterbar. Bei jedem Durchlauf des Lichtpulses wechselwirkt der Lichtpuls mit der Probe (17) und ein Teil des Lichtes wird von der Probe (17) absorbiert. Weiter wird bei jedem Durchlauf ein Teil des Lichtes durch den zweiten Spiegel (12) nicht verschwindender optischer Transmissivität ausgekoppelt. Die ausgekoppelten Lichtpulse (19) werden an einem Gitterspektrometer (20) dispergiert. Das Dispersionsspektrum (21) wird mit einer Gated-CCD-Kamera (22) detektiert. Die Gated-CCD-Kamera (22) wird mittels eines Triggersignals (23) mit dem gepulsten Weißlicht-Laser (14) synchronisiert. Entsprechend der Absorptionseigenschaften der Probe (17) sowie den internen Streuverlusten und dem Gütefaktor des Resonators (10) wird die Synchronisationsbedingung so gewählt, dass mindestens einer der transmittierten und dispergierten Lichtpulse (19, 20) mit der Gated-CCD-Kamera (22) aufgezeichnet wird, wobei darauf geachtet wird das das Signal zu Rauschverhältnis optimal ist.
Eine weitere Ausführungsform des optischen Resonators (10) des konfokalen Lichtmikroskops (100) ist in 3a) dargestellt. Der optische Resonator (10) besteht aus einem ersten (11) und einem zweiten reflektierenden Spiegel (12). Licht wird durch den ersten Spiegel (11) in den optischen Resonator (10) eingekoppelt und durchläuft diesen mehrere Male. Der erste (11) und der zweite Spiegel (12) sind dabei so gewölbt, dass sie das Licht auf einen gemeinsamen Brennpunkt (B) fokussieren. In der Ebene (F) des gemeinsamen Brennpunktes (B) befindet sich ein 3D-Piezoscanner (18), auf dem eine Nanostruktur (17) positioniert ist. Bei jedem Umlauf des Lichtes wechselwirkt dieses mit der Nanostruktur (17) und ein entsprechender Teil des Lichtes wird absorbiert. Durch den zweiten Spiegel (12), welcher eine nicht verschwindende optische Transmissivität aufweist wird bei jedem Umlauf ein Teil des Lichtes ausgekoppelt, und kann analysiert werden.
3b) zeigt eine weitere Ausführungsform das konfokalen Lichtmikroskops (100). Der optische Resonator (10) wird durch einen ebenen ersten Spiegel (11) sowie einen gewölbten zweiten Spiegel (12) gebildet. Bei dieser Ausführungsform wird ein Lichtpuls seitlich in den optischen Resonator (10) mittels eines ersten Strahlteilers (24) eingekoppelt. Der zweite den Resonator begrenzende Spiegel (12) fokussiert einen Lichtpuls oder ein Lichtfeld auf der Oberfläche des ersten ebenen reflektierten Spiegels (11). Durch die Reflektion des Lichtes einer Wellenlänge λ an dem ersten ebenen Spiegel (11) bildet sich ein Wellenbauch (25) im Abstand von λ/4 über dem ersten ebenen Spiegel (11). Um die Struktur (17) an diesem Ort maximaler Lichtintensität zu positionieren, ist der erste ebene Spiegel (11) mit einer transparenten Schicht (26) der optischen Dicke λ/4 beschichtet, auf der die Nanostruktur (17) angeordnet wird. Bei jedem Umlauf des Lichtpulses wird ein Teil des Lichtes durch den zweiten den Resonator begrenzenden Spiegel (12) zur weiteren Analyse aus gekoppelt. Zur Rasterung der Nanoprobe (17) ist der erste Spiegel (11) auf einer Piezoscanvorrichtung (18) angebracht.
3c) zeigt eine mit 2a) identische Ausführungsform des optischen Resonators (10).
Der optische Resonator (10) aus 3d) zeigt eine weitere mögliche Ausführungsform. Dieser optische Resonator (10) wird durch einen ersten ebenen (11) und einen zweiten gewölbten Spiegel (12) begrenzt. Licht wird seitlich mittels eines ersten Strahlteilers (24) welcher sich in einem Winkel von 45° zur Längsachse des Resonators (10) befindet in diesen eingekoppelt. Mittels eines Objektives (15) wird das Licht oder ein umlaufender Lichtpuls auf der Oberfläche des ersten den Resonator begrenzenden reflektierenden Spiegels (11) fokussiert. Ein umlaufender Lichtpuls der Wellenlänge λ wird an dem ersten ebenen Spiegel reflektiert (11), und es bildet sich ein Wellenbauch (25) maximaler Lichtintensität im Abstand von λ/4 über der Oberfläche des ersten reflektierenden Spiegels (11). Auf dem ersten reflektierenden Spiegel (11) befindet sich daher ein Substrat (26) der optischen Dicke λ/4, auf dem die Nanostruktur (17) positioniert wird.
3e) zeigt eine weitere mögliche Ausführungsform des konfokales Lichtmikroskops (100), welche sich durch eine verbesserte Güte des Resonators (10) auszeichnet. Ein einfallender Lichtpuls wird an einem Strahlteiler (24) reflektiert und durch den zweiten der den optischen Resonator (10) begrenzenden Spiegel (12) in den Resonator (10) eingekoppelt. Das durch den zweiten Spiegel (12) aus dem Resonator (10) ausgekoppelte Licht wird durch den ersten Strahlteiler (24) hindurch transmittiert und kann analysiert werden.
Mit der in 3e) gezeigten möglichen Ausführungsform des konfokalen Lichtmikroskops (100) lässt sich die probenbedingte Phasenverschiebung des Lichtes durch Interferenz mit dem einfallenden Licht in ein Intensitätensignal umwandeln. Einfallendes Licht oder ein einfallender Lichtpuls wird an einem ersten Strahlteiler (24) in einen reflektierten und in einen transmittierten Teil zerlegt. Der reflektierte Teil des Strahls durchläuft den Resonator (10) und wird nach Verlassen des Resonators (10) durch den ersten Strahlteiler (24) und durch einen zweiten Strahlteiler (27) transmittiert. Der vom ersten Strahlteiler (24) transmittierte Teil des einfallenden Lichtstrahls wird über einen gewinkelten Spiegel (28) auf den zweiten Strahlteiler (27) geworfen und an diesem reflektiert. Zum Durchstimmen der Phasenbeziehung zwischen dem reflektierten und dem transmittierten Teil des einfallenden Lichtstrahls ist der gewinkelte Spiegel (28) verschiebbar angeordnet.
Bezugszeichenliste

100: Konfokales Lichtmikroskop
10: Optischer Resonator
11: Erster reflektierender Spiegel
12: Zweiter reflektierender Spiegel
13: Lichtpuls von Lichtquelle
14: Weißlicht-Laser
15: Erstes Objektiv
16: Zweites Objektiv
17: Nanostruktur
18: Piezoscanvorrichtung
19: Transmittierter Lichtpuls
20: Gitterspektrometer
21: Dispersionsspektrum
22: Gated-CCD-Kamera
23: Triggersignal
24: Erster Strahlteiler
25: Wellenbauch
26: Transparente Schicht
27: Zweiter Strahlteiler
28: Gewinkelter Spiegel
L: Länge des Resonators
F: Fokalebene
B: Brennpunkt

Claims

Konfokales Lichtmikroskop (100) mit oder ohne Lochblende zur Durchführung optischer Absorptionsmessung an einer Probe (17) mit kleinem Absorptionswirkungsquerschnitt, umfassend mindestens eine Lichtquelle (14), dadurch gekennzeichnet, dass das Lichtmikroskop (100) einen optischen Resonator (10) aufweist, der eingerichtet ist, um die Probe (17) aufzunehmen und mit Licht zu beaufschlagen.
Konfokales Lichtmikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Konfokalebene (F) des Lichtmikroskops innerhalb des optischen Resonators (10) verortet ist, wobei die Probe (17) in der Konfokalebene (F) anordbar ist.
Konfokales Lichtmikroskop nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Resonator (10) als rasterbarer Resonator (10) ausgebildet ist, wobei die Probe (17) in den zwei räumlichen Dimensionen der Konfokalebene (F) rasterbar ist und/oder dass das Lichtmikroskop eine Scanvorrichtung (18) aufweist und die Probe (17) auf der Scanvorrichtung (18) anordbar ist.
Konfokales Lichtmikroskop nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe (17) in allen drei räumlichen Dimensionen rasterbar ist.
Konfokales Lichtmikroskop nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Scanvorrichtung (18) als Piezoscanvorrichtung (18) ausgebildet ist.
Konfokales Lichtmikroskop nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtquelle (14) als gepulste Lichtquelle (14) oder als Dauerstrich-Lichtquelle (14) ausgebildet ist, und/oder dass die Lichtquelle (14) als monochromatische Lichtquelle (14) oder als breitbandige Lichtquelle (14) ausgebildet ist.
Konfokales Lichtmikroskop nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtquelle (14) als Laser, Farbstofflaser, wellenlängenscanbarer Laser, Weißlichtlaser, LED, thermische Lichtquelle oder als Dampflampe ausgebildet ist.
Konfokales Lichtmikroskop nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Lichtmikroskop ein Spektrometer (20) aufweist, und/oder dass das Lichtmikroskop einen Lichtintensitätsmesser (22) aufweist, und/oder dass das Aufnahmefenster des Lichtintensitätsmessers (22) mit der Pulsrate einer gepulsten Lichtquelle (14) synchronisiert ist.
Konfokales Lichtmikroskop nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Spektrometer (20) ein Prisma (20) oder ein Gitterspektrometer (20) ist.
Konfokales Lichtmikroskop nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Lichtintensitätsmesser (22) eine Photodiode oder ein Photomultiplier oder eine Kameravorrichtung (22) ist.
Konfokales Lichtmikroskop nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Kameravorrichtung (22) eine CCD-Kamera (22) oder Gated-CCD-Kamera (22) ist.
Konfokales Lichtmikroskop nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der optische Resonator (10) mindestens zwei reflektierende Spiegel (11, 12) umfasst, wobei die reflektierenden Spiegel (11, 12) ein metallisches oder dielektrisches Material aufweisen, und/oder dass ein erster (11) und ein zweiter (12) Spiegel den Resonator (10) begrenzen, wobei der erste (11) und/oder der zweite Spiegel (12) eine nicht verschwindende optische Transmissivität aufweist, und wobei der Resonator (19) im Durchlichtbetrieb betreibbar ist, und/oder dass der Resonator (10) einen ersten ebenen Strahlteiler (24) aufweist, wobei der erste Strahlteiler (24) in einem Winkel zur Längsachse des Resonators (10) angeordnet ist, und wobei der erste Strahlteiler (24) zur seitlichen Einkopplung und/oder Auskopplung von Licht in den Resonator (10) vorgesehen ist.
Konfokales Lichtmikroskop nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Lichtmikroskop mindestens einen außerhalb des optischen Resonators (10) auf der Fortführung der Längsachse des optischen Resonators (10) angeordneten Strahlteiler (24) aufweist, oder dass das Lichtmikroskop mindestens zwei Strahlteiler (24, 27) sowie einen gewinkelten, dritten Spiegel (28) aufweist, wobei die Strahlteiler (24, 27) und der dritte, gewinkelte Spiegel (28) dazu vorgesehen sind, eine probenbedingte Phasenverschiebung zwischen dem aus dem Resonator (10) ausgekoppelten Licht und dem einfallenden Licht durch Überlagerung und Interferenz in ein Intensitätssignal umzuwandeln, wobei weiter der am ersten Strahlteiler (24) reflektierte Teil des einfallenden Lichtstrahls oder des Lichtpulses in den Resonator (10) eingekoppelt, nach Durchlaufen des Resonators ausgekoppelt und durch den ersten (24) und zweiten Strahlteiler (27) hindurch transmittiert werden kann, während der am ersten Strahlteiler (24) transmittierte Teil des einfallenden Lichtstrahls über den gewinkelten, dritten Spiegel (28) auf den zweiten Strahlteiler (27) geworfen und an diesem reflektiert werden kann.
Konfokales Lichtmikroskop nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der optische Resonator (10) mindestens eine Linse (15) und/oder mindestens ein Objektiv (15) aufweist, und/oder dass der Resonator (10) mindestens zwei Objektive (15, 16) oder Linsen (15, 16) aufweist, wobei die Linsen (15, 16) und/oder Objektive (15, 16) konfokal angeordnet sind, und wobei die Probe (17) konfokal in dem gemeinsamen Brennpunkt (B) der mindestens zwei Objektive (15, 16) oder Linsen (15, 16) anordbar ist, und/oder dass der Resonator (10) mindestens eine Linse (15) aufweist, welche als achromatische Linse (15) und/oder als Linse hoher numerischer Apertur (15) und/oder als Wasser- oder Öl-Immersions-Linse (15) ausgebildet ist, oder dass der Resonator (10) mindestens ein Objektiv (15) aufweist, welches als achromatisches Objektiv (15) und/oder als Objektiv hoher numerischer Apertur (15) und/oder als Wasser- oder Öl-Immersions-Objektiv (15) ausgebildet ist.
Konfokales Lichtmikroskop nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens der erste (11) und/oder der zweite der den optischen Resonator (10) begrenzenden Spiegel (12) eine fokussierende Wölbung aufweisen, wobei der erste (11) und der zweite Spiegel (12) einzeln oder in Kombination geeignet sind ein in den Resonator (10) einzukoppelndes Lichtfeld oder einen in den Resonator (10) einzukoppelnden Lichtpuls in einer Ebene (F) innerhalb des optischen Resonators (10), in welcher die Probe (17) anordbar ist, zu fokussieren, und/oder dass der erste (11) und der zweite Spiegel (12) konfokal angeordnet sind, also einen gemeinsamen Brennpunkt (B) aufweisen, und wobei die Probe (17) in der gemeinsamen Fokusebene (F) des ersten (11) und des zweiten Spiegels (12) anordbar ist.
Konfokales Lichtmikroskop nach einem der vorgenannten Ansprüchen, dadurch gekennzeichnet, dass auf mindestens einem ersten der reflektierenden Spiegel (11) eine transparente Schicht (26) aufgebracht ist, wobei die Schicht (26) entsprechend einer vorbestimmten Wellenlänge λ eine optische Dicke von λ/4 aufweist, wobei der Brennpunkt (B) der mindesten einen Linse (15) oder des mindestens einen Objektivs (15) oder des mindestens einen fokussierenden zweiten Spiegels (12) mit der Oberfläche des ersten reflektierenden Spiegels (11) zusammenfällt, und wobei die Probe (17) auf der transparenten Schicht (26) anordbar ist.
Verfahren für die Verwendung einer Vorrichtung (100) entsprechend einem der Ansprüche 1 bis 16 zur Durchführung von Absorptionsmessungen an einer Probe (17) mit kleinem Absorptionswirkungsquerschnitt mit einem konfokalen Lichtmikroskop (100), umfassend mindestens eine Lichtquelle (14) sowie einen optischen Resonator (10), dadurch gekennzeichnet, dass sich die Konfokalebene (F) des konfokalen Lichtmikroskops (100) innerhalb des Resonators (10) befindet, dass die Probe (17) in der Fokalebene (F) angeordnet wird, und dass die Probe (17) mit Licht beaufschlagt wird.
Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe (17) gerastert wird, wobei die Probe (17) auf einer Scanvorrichtung (18) angeordnet wird.
Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe (17) auf einer Piezoscanvorrichtung (18) angeordnet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 17, 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtquelle (14) gepulst betrieben wird oder dass die Lichtquelle (14) im Dauerstrichbetrieb betrieben wird, und/oder dass die Lichtquelle (14) monochromatisches oder breitbandiges Licht abstrahlt, und/oder dass das Licht der Lichtquelle oder dass mindestens ein Lichtpuls der Lichtquelle in den optischen Resonator eingekoppelt wird, und/oder dass die Photonen des in den optischen Resonator (10) eingekoppelten Lichtes oder des mindestens einen in den optischen Resonator (10) eingekoppelten Lichtpulses den Resonator (10) mindestens einmal durchlaufen, dass bei jedem Durchlauf das Licht oder der Lichtpuls mit der in der Konfokalebene (F) angeordneten Probe (17) wechselwirkt, wodurch der effektive Absorptionswirkungsquerschnitt, und somit das Signal-zu-Rauschverhältnis, erhöht wird, und/oder dass entsprechend der Güte des optischen Resonators (10) ein Teil des Lichtes aus dem optischen Resonator (10) ausgekoppelt wird, oder dass bei jedem Umlauf ein Teil des Lichtpulses in einer Serie transmittierter Lichtpulse ausgekoppelt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die probenbedingte Änderung der Phase des aus dem optischen Resonator (10) ausgekoppelten Lichts durch Interferenz mit dem einfallenden Lichtstrahl in ein Intensitätssignal umgewandelt und detektiert wird, wobei der einfallende Lichtstrahl an einem Strahlteiler (24) in einen reflektierten und einen transmittierten Teil zerlegt, wobei der reflektierte Teil in den optischen Resonator (10) eingekoppelt wird und diesen durchläuft, und mit dem vom ersten Strahlteiler (24) transmittierten Teil des Lichtes in Überlagerung gebracht wird und wobei die Phasenbeziehung zwischen dem reflektierten und dem transmittierten Teil des Lichts durchstimmbar ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass zur Optimierung des Signal-zu-Rauschverhältnisses ein Algorithmus benutzt wird der die optimale Zahl an Umläufen der Photonen bestimmt, wobei der Algorithmus Streuverluste oder den Gütefaktor des Resonators (10), bedingt durch die enthaltenen Linsen (15, 16), Objektive (15, 16), Verluste an Spiegeln (11, 12, 24) und den Bruchteil des ausgekoppelten Lichtes für die Detektion, Absorption und Streuung der Probe (17), Intensität des Lichtfeldes, Eigenschaften des Detektors, sowie weitere Rauschquellen berücksichtigt.