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Die
Erfindung bezieht sich auf Verbesserungen in und bezüglich der
Mikroskopie, im Besonderen auf die Oberflächenwellenmikroskopie.
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Oberflächenwellen-Mikroskopiesysteme sind
bekannt. Zum Beispiel sind bereits Systeme im Einsatz, die einen
bestimmten Typ von Oberflächenwellen,
Oberflächenplasmone
(SPs, Surface Plasmons) nutzen. Dies verwenden oftmals die so genannte
Kretschmann-Anordnung, bei der eine Metallschicht, in der Regel
in einer Dicke von 50 nm, auf der Hypotenuse eines Prismas aufgetragen
wird, das von einer der anderen Seiten angestrahlt wird. Das Interesse
an SPs besteht auf Grund der Tatsache, dass ihre Weiterleitungseigenschaften
stark durch das Vorhandensein von dielektrischen Materialien und
der Eigenschaften der dielektrischen Materialien beeinflusst werden,
die auf der Metalloberfläche
aufgetragen sind oder daran anhaften. Zum Beispiel stört eine
Atomschicht von dielektrischen Elementen den Winkel, in dem SPs
angeregt werden, in einem messbaren Maß. Diese Eigenschaft hat zu
der weitverbreiteten Verwendung der SP-Mikroskopie als chemische
und biologische Sensoren geführt.
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Ein
Problem bei bestehenden SP-Mikroskopiesystemen ist deren begrenzte
seitliche Auflösung (d.
h. entlang der Probenoberfläche).
Versuche wurden durchgeführt,
um eine gute seitliche Auflösung mit
konventionellen Fernfeldoptiken zu erzielen. Aber sogar hier ist
die erzielte seitliche Auflösung
von schlechter Qualität.
Die gewöhnliche
Erklärung
für die
schlechte Auflösung
ist, dass die SPs bei Anregung sich über einen großen Bereich
der Probenoberfläche
ausbreiten, da ihre Verfallslänge
in der Größenordnung
von ein paar zehn Mikron liegt. Das bedeutet, dass es sehr schwer
ist, die seitliche Auflösung
auf einen Wert zu verbessern, der viel besser ist als dieser Wert.
Systeme, die auf der mikroskopischen Untersuchung von Streulicht
aus der Kretschmann-Anordnung beruhen, erzielen daher eine ziemlich
schlechte Auflösung,
und die praktische Grenze scheint wenig besser als 3 μm zu sein,
selbst wenn besondere Maßnahmen
ergriffen werden. Die einzigen Verfahren, mit denen eine bessere
Auflösung
unter Verwendung von SPs erzielt werden kann, sind Sensormikroskoptechniken,
bei denen das verschwindend kleine Feld der SPs mit einem Näherungssensor
erfasst wird. Diese Techniken beinhalten das Untersuchen einer Probe
in der sehr nahen Umgebung, was es für viele Anwendungen unbrauchbar
macht. Die Probe wird über
die dielektrische Seite davon untersucht. Aber es ist bevorzugt, die
Probe aus der Ferne über
die Metallseite davon zu untersuchen und gleichzeitig eine gute
seitliche Auflösung
zu erzielen. Das gilt für
SP- und anderen Oberflächenwellen-Mikroskopiesysteme.
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In "Locally excited surface-plasmon-polaritons
for thickness measurement of LBK films"; Kano u. a.; Optics Communications,
Vol. 153, Nr. 4–6,
Seite 235–239;
Aug, 1998, wird ein Verfahren offengelegt, das eine Mikroskopvorrichtung
aufweist, um Oberflächenplasmon-Polaritone
(Surface-Plasmon-Polariton, SPP) zur Dickenmessung von LBK-Filmen
zu verwenden. Gemäß dem Verfahren
wird ein Glassubstrat-Objektträger,
der auf einer Seite mit einer dünnen
Metallfolie beschichtet ist, und eine dielektrische Probe von der
anderen Seite über
eine Ölimmersions-Objektivlinse
mit einer hohen numerischen Apertur angestrahlt, um die in allen
Richtungen der Metalloberfläche
sich ausbreitenden SPPs anzuregen. Das Dokument legt weiterhin offen,
dass die SPPs einander überlagern
und ein Interferenzmuster bilden. Als Ergebnis der Interferenz wird
ein starkes elektrisches Feld um einen fokussierten Punkt erzeugt.
Das ist die Lokalisierung der SPPs. Das Ergebnis einer Modellberechnung
zeigt, dass die Größe der Lokalisierung
bestenfalls in der Größenordnung
von 300 nm für
ein Anregungslicht mit einer Wellenlänge von 488 nm liegt. Darüber hinaus,
legt dieses Dokument weiterhin offen, dass die Methode auf einen
Mikroskopmodus erweiterbar ist. Sie bietet die Möglichkeit, ein Bild sowohl
mit hoher Empfindlichkeit bezüglich
der Variation der Filmdicke als auch der räumlichen Auflösung herzustellen,
die bislang unerreicht ist.
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Gemäß einem
ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Analyse
einer Probe aus leitfähigem
Material mit einer Mikroskopvorrichtung vorgesehen, das die Schritte
aufweist: (i) Bestrahlen der Probe mit einem Bestrahlungsstrahl, wobei
zumindest ein Teil des Bestrahlungsstrahls auf der Probe in einem
Winkel oder in Winkeln einfällt, die
zur Anregung der Oberflächenplasmone
führen; (ii)
Anregen der Oberflächenplasmone über einen Ring
an einer Oberfläche
des leitfähigen
Materials, indem die Oberfläche
mit einem ringförmigen
Bestrahlungsstrahl angestrahlt wird oder indem die Oberfläche des
leitfähigen
Materials an einer Position außerhalb
der Brennebene eines fokussierten Anregungsstrahls angeordnet wird;
(iii) Erfassen der Strahlung, die eine von den Oberflächenplasmonen erzeugte
Strahlung beinhaltet; und (iv) Analyse der erfassten Strahlung,
um Informationen über
die Probe zu erhalten; wobei die Fokusgröße der Oberflächenplasmone
und damit die Auflösung
in der gleichen Ebene wie das leitfähige Material beugungsbegrenzt
ist.
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Die
Analyse wird oft eine Aufnahme der Probe sein, aber es sind auch
andere Formen der Analyse möglich.
Die maximale Intensität
der Oberflächenplasmone
kann daher an einem Fokus erzielt werden. Die Größe des Fokus und damit die
durch dieses Verfahren erzielte Auflösung wird durch die Wellenlänge der
Oberflächenplasmonen
anstatt deren Weiterleitungslänge
bestimmt, d. h., er ist beugungsbegrenzt und nicht durch die Weiterleitungslänge begrenzt.
Die Größe des Fokus
in der Ebene der Probenoberfläche
ist unter Umständen
nicht gleich der Größe des Fokus
normal zur Ebene der Probenoberfläche. Der Fokusdurchmesser in
der Ebene der Beispieloberfläche
ist vorzugsweise 1 μm
oder weniger.
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Die
Oberflächenplasmone
können über einen
Ring der Probenoberfläche
angeregt werden und können
im Wesentlichen in der Mitte des Rings zu einem Fokus kommen. Die
Mitte des Rings fällt
vorzugsweise mit der Achse der Mikroskopvorrichtung zusammen. Die
Anregung über
einen Ring kann durch Bestrahlen der Probe mit einem ringförmigen Bestrahlungsstrahl
erzielt werden. Dies kann durch eine Strahlungsquelle erzielt werden,
die einen ringförmigen
Strahlungsstrahl erzeugt. Dies kann durch Bestrahlen der Probe durch
eine Objektlinse in der Mikroskopvorrichtung erzielt werden, die
einen Ring in deren hinteren Brennebene angeordnet hat. Der Ring
kann so positioniert sein, dass die Bestrahlung einer Probe über einen
Bereich von Winkeln stattfindet, zu denen der Bereich von Winkeln
für die
Anregung von Oberflächenplasmonen
gehört,
der aber im Wesentlichen andere Winkel ausschließt.
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Die
Anregung über
einen Ring kann erzielt werden, indem die Probe an einer Position
außerhalb der
Brennebene der Mikroskopvorrichtung angeordnet wird. Ein Bestrahlungskreis
fällt dann
auf die Probenoberfläche
ein, und wenn Oberflächenplasmone durch
die auf die Probe in bestimmten Bereichen von Winkeln einfallende
Bestrahlung angeregt werden, regt nur ein Ring des Bestrahlungskreises
die Oberflächenplasmone
an. Der Bereich der Winkel hängt von
dem Material der zu analysierenden Probe ab. Der Bereich der Winkel
kann 1, 2 oder 3 Grad sein, oder mehr oder weniger als diese Werte.
Der Ring kann einen Innen- oder eine Außendurchmesser in der Größenordnung
von einigen Mikron haben.
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Indem
die Probe an einer Position außerhalb der
Brennebene der Mikroskopvorrichtung angeordnet wird, wird das vorhandene
Hintergrundsignal verringert und der Beitrag der Strahlung, die
durch die Oberflächenplasmone
in der erfassten Strahlung erzeugt wird, erhöht sich.
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Die
Position der Probe außerhalb
der Brennebene der Mikroskopvorrichtung kann variiert werden. Dies
kann durch Mittel zum Verschieben der Probe erzielt werden. Zum
Beispiel kann die Probe zuerst direkt außerhalb der Brennebene angeordnet und
schrittweise aus der Brennebene entfernt werden. Alternativ kann
die Probe an einer Entfernung zu der Brennebene angeordnet werden
und schrittweise in Richtung der Brennebene bewegt werden. Dies wird
allgemein als Defokussierung der Probe bezeichnet, und der Abstand
der Probe von der Brennebene wird als Defokus, mit der Referenz
z, bezeichnet. Die Probe wird vorzugsweise über der Brennebene der Vorrichtung
angeordnet und von der Brennebene weg oder zu ihr hin verschoben.
Die Variation des Defokus z ermöglicht Änderungen
im Kontrast zwischen den verschiedenen Merkmalen der zu analysierenden
Probe. Die Variation des Defokus z kann zur Bestimmung verwendet
werden, den optimalen Defokus zu bestimmen, an dem die Probe zur
Analyse positioniert werden sollte. Natürlich kann die Probe fest sein
und zumindest ein Teil der Mikroskopvorrichtung wird bewegt: eine
relative Bewegung ist erforderlich. In einigen Ausführungsformen
können
wir die Objektivlinse bewegen (und den Körper des Mikroskops feststehend
lassen).
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Das
Verfahren kann eine Mikroskopvorrichtung aufweisen, die Mittel zum
Anregen von Oberflächenplasmonen
enthält.
Dies kann eine Flüssigkeitsimmersions-Objektivlinse,
z. B. Ölimmersions-Objektivlinse
sein. Die Probe kann in der Brennebene der Objektivlinse oder außerhalb
der Brennebene der Objektivlinse angeordnet sein.
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Dieses
Verfahren erlaubt vorzugsweise die Anregung der Oberflächenplasmone
und die Erfassung der Strahlung, die durch die Oberflächenplasmone
von einer Seite der Probe erzeugt werden. Das Verfahren ist bevorzugt
ein Fernfeldverfahren, d. h., das Anregen der Oberflächenplasmone
und das Erfassen der durch die Oberflächenplasmone erzeugten Strahlung
wird durch das Fernfeld verwirklicht. Damit wird vermieden, dass
ein Sensor in enger Nähe
zur Probe positioniert wird, was die Messung stören kann, was ein Nachteil
der Sensorverfahren ist.
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Ein
Probe kann immer entfernt von der Probenseite (was die Interferenz
reduziert) oder entfernt von der dielektrischen Seite untersucht
werden: dieses Verfahren ist nicht darauf beschränkt, nur eine Seite einer Probe
zu untersuchen: im Besonderen können
wir die Nicht-Probenseite mit inhärenten Vorteilen untersuchen.
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Wir
können
auch eine Probe in größeren Abständen untersuchen
als dies bei einigen anderen Techniken möglich ist: zum Beispiel kann
eine Mikroskoplinsen/Probentrennung in der Größenordnung von 100 Mikron oder ähnlichen
Werten (z. B. 100 μm, 200 μm, etc.)
typisch sein.
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Die
Probe kann mit einem Bestrahlungsstrahl eines Lasers bestrahlt werden.
Der Laser kann ein CW-Laser (Continuous Wave-Laser) sein, zum Beispiel
ein 633 nm HeNe-Laser. Der Laser kann ein gepulster Laser sein,
zum Beispiel ein Titan-Saphir-Laser.
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Die
Probe kann mit Abtastmitteln abgetastet werden, um Informationen über mehrere
Punkte davon zu liefern. Das Verfahren kann die Verwendung von mechanischen
Abtastmitteln umfassen. Das Verfahren kann die Verwendung von Spiegelabtastmitteln
umfassen.
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Das
Verfahren kann eine Mikroskopvorrichtung mit einer Weitfeldgestaltung
umfassen. Informationen über
mehrere Punkte der Probe können
daher erhalten werden, ohne dass ein Abtastverfahren verwendet werden
muss. In dem Verfahren kann ein Strahlungsstrahl durch einen Diffuser
durchgeleitet werden und der resultierende Strahl zum Bestrahlen der
Probe und eines Referenzspiegels jeweils mit einem Speckle-Muster
verwendet werden. Die Bestrahlung dieser kann überlagert werden, vorzugsweise
auf der Bildebene. Das Interferenzsignal bezieht sich auf die Starke
der Korrelation zwischen zwei Speckle-Mustern. Der Diffuser kann
rotiert werden, um sicherzustellen, dass der Durchschnittswert der
Korrelation erhalten wird, so dass das Speckle-Rauschen gemittelt
wird. Das Interferenzsignal kann aus dem Hintergrundsignal mit einem
Phasenschritt-Algorithmus
(Phase Stepping-Algorithmus) extrahiert werden. Solch ein Weitfeld-Bildgebungsverfahren
bietet eine beugungsbegrenzte Auflösung.
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Alternativ
kann auf einen Referenzstrahl verzichtet werden, und die Interferenzbedingungen
zwischen den verschiedenen Teilen der Strahlung, die die Probe anstrahlen,
können
geändert
werden. Dieses Verfahren kann die Verwendung eines herkömmlichen
optischen Mikroskops mit einer Ölimmersions-Objektivlinse umfassen
und die Probe auf entscheidende Weise anstrahlen. Bei der entscheidenden
Anstrahlung ist jeder Anstrahlungspunkt wechselseitig inkohärent, wobei
in der hinteren Brennebene der Linse das Feld aus einem Spektrum
der Ebenenwellen besteht, die in sich selbst kohärent, aber zueinander inkohärent sind.
Der Bildgebungsprozess kann somit daraus bestehen, jede dieser Ebenenwellen
zu einem Punkt in der Bildebene hinzuzufügen. Die Probe ist bevorzugt
an einer Position außerhalb der
Brennebene der Objektivlinse angeordnet, vorzugsweise direkt außerhalb
der Brennebene der Linse, d. h. die Probe ist etwas defokussiert.
Dies führt eine
Phasenverschiebung ein, so dass die durch Anregung der Oberflächenplasmone
erzeugten Strahlungen zur Phase hinzugefügt werden. Das Verfahren kann
weiterhin das Filtern der Eingangsverteilung in der hinteren Brennebene
umfassen, indem nur die Einfallswinkel nahe des normalen Einfalls
und die im Bereich von einigen Graden der Winkel, die zum Anregen
der Oberflächenplasmone
erforderlich sind, zugelassen sind. Dies verbessert den Kontrast
der Oberflächenplasmone
weiter. Ein räumlicher
Lichtmodulator in der hinteren Brennebene kann verwendet werden,
um die relative Phase des nahe des normalen Lichteinfalls einfallenden
Lichts zu ändern, und
des Lichts, das an der Anregung der Oberflächenplasmone beteiligt ist.
Dies ermöglicht
einen modifizierten Phasenschritt-Algorithmus, um den Oberflächenplasmon-Beitrag
einzeln wiederherzustellen. Eine CCD-Kamera eines eingeschränkten dynamischen
Bereichs kann zur Erfassung der Strahlung verwendet werden, die
von den Oberflächenplasmonen
erzeugt wurde. Ist dies der Fall, sind die Defokussierung, die räumliche
Filterung und die Phasenschrittbildung wichtige Stufen bei der Herstellung
eines praktischen Vollfeld-Oberflächenplasmon-Mikroskops. Diese Prozesse erhöhen das
Oberflächenplasmon-Signal,
reduzieren den Hintergrund und entfernen das Hintergrundsignal.
Die Verarbeitung stellt sicher, dass das Oberflächenplasmon-Signal ein gutes
Signal-zu-Rauschen-Verhältnis aufweist,
aber es ist auch sehr wichtig sicherzustellen, dass das Hintergrundsignal
nicht so hoch ist, um sicherzustellen, dass die verfügbaren Graustufen
der CCD-Kamera nicht durch ein dominantes Hintergrundsignal absorbiert
werden. Dieses Verfahren kann letztendlich eine bessere Leistung
hinsichtlich Stabilität
und Einfachheit bieten.
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Die
Probe kann ein leitfähiges
Material umfassen, z. B. eine Metallschicht mit einem dielektischen
Material oder mehreren dielektischen Materialien, die auf einer
Oberfläche
eines leitfähigen
Materials aufgetragen oder anhaftend sind. Die Oberflächenplasmone
können
in einer Oberfläche
des leitfähigen
Materials angeregt werden. Bei allgemeinen Oberflächenplasmonen
können
weitere Schichten zur Unterstützung
der Oberflächenplasmone
verwendet werden. Die über
die Probe erhaltenen Information kann Information über das
Vorhandensein und/oder die Zusammensetzung und/oder die Funktion
des einen oder der mehreren dielektrischen Materialien sein. Das
eine dielektrische Material oder die mehreren dielektrischen Materialien
können
ein biologisches oder chemisches oder pharmazeutisches Material
bzw. Materialien aufweisen.
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Zwei
oder mehr Oberflächenplasmone
können
miteinander Fluoreszenz in der Probe erzeugen. Die Oberflächenplasmone
sind Photone, und dies ist als Multi- Photonen-Anregung bekannt und basiert auf
der zusammenwirkenden Anregung durch eine Reihe von Photonen, die
zusammenwirken, um einen Träger
von einem Grundzustand in einen angeregten Zustand über eine
Energielücke
anzuregen, die größer ist
als die Energie der einzelnen Photonen, aber kleiner als die Gesamtenergie
der zusammenwirkenden Photonen. Eine Zwei-Photonen-Anregung ist im Allgemeinen
ein dominanter Prozess. Wenn der Träger wieder in den Grundzustand
zurückkehrt,
gibt er fluoreszierende Strahlung ab, deren Energie im Allgemeinen
größer ist
als die Energie der einzelnen anregenden Photonen. Die Multi-Photonen-Anregung
beruht daher auf der Anregung von Photonen mit einer langen Wellenlänge, zum
Beispiel in der Größenordnung
von 800 nm, was eine fluoreszierende Strahlung mit einer kürzeren Wellenlänge, zum
Beispiel in der Größenordnung
von 400 bis 500 nm erzeugt. Die fluoreszierende Strahlung liefert
Informationen über
die Probe. Die erfasste Strahlung kann fluoreszierende Strahlung
von der Probe enthalten. Ein oder mehrere Eigenschaften dieser Strahlung
können
erfasst und nachfolgend analysiert werden. Die eine oder mehreren
Eigenschaften können zum
Beispiel die Anzahl oder das Energiespektrum der fluoreszierenden
Photone umfassen.
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Die
Stärke
der Zwei-Photonen-Emission ist proportional zum Quadrat der Dichte
der angeregten Oberflächenplasmone.
Allgemein ist die Stärke
der Emission proportional zur Intensität für die Potenz der Ordnung des
Prozesses (z. B. das Quadrat der Intensität für einen Zwei-Photonen-Prozess,
die dritte Potenz der Intensität
für einen
Drei-Photonen-Prozesses). Wenn in diesem Verfahren die Oberflächenplasmone
zu einem Fokus kommen, wird ihre Intensität im Fokus verbessert und daher
wird die Multi-Photonen-Anregung im Fokus verbessert. Darüber hinaus,
wenn die Probe eine Metallschicht mit einem dielektrischen Material
oder mehreren dielektrischen Materialien an dessen Oberfläche aufgetragen
oder daran anhaftend enthält,
wird die Anregung der Oberflächenplasmonen
verbessert. Multi-Photonen-Anregung mit Oberflächenplasmonen sind daher sehr
für die
Untersuchung von Eigenschaften von Übergangsstellen und Oberflächen sehr
geeignet.
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Wenn
die Probe eine Metallschicht mit einem dielektrischen Material oder
mehreren dielektrischen Materialien auf der Oberfläche davon
aufgetragen oder anhaftend aufweist, kann das Material gewählt werden,
um mindestens im Wesentlichen für
die Strahlung, mit der die Probe bestrahlt wird, opak zu sein. Das
ist eine Bedingung für
eine wirksame Anregung und Ausbreitung der Oberflächenplasmone. Das
Metall kann im Wesentlichen auch transparent für die fluoreszierende Strahlung
von der Probe sein. Dies ermöglicht
die verbesserte Übertragung
der fluoreszierenden Strahlung durch die Probe. Die Probe kann dann
von der Oberfläche
bestrahlt werden und die fluoreszente Strahlung von der Oberfläche davon entdeckt
werden. Ein Metall, das dies erfüllt,
ist Gold. Es ist im Wesentlichen für Strahlung mit einer Wellenlänge von
etwa 800 nm opak, und im Wesentlichen für Strahlung mit einer Wellenlänge von
500 nm oder weniger transparent.
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Die
Probe kann ein oder mehrere Fluorophore hinzugefügt haben. Die erfasste fluoreszierende Strahlung
wird durch die Gegenwart von Fluorophoren beeinflusst und liefert
Informationen über
die Probe. Zum Beispiel kann das Vorhandensein der Fluorophore die
Analyse der Zusammensetzung oder der Funktion der Probe ermöglichen.
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Multi-Photonen-Anregung
kann durch Oberflächenplasmone
erhalten werden, die über
einen Ring der Beispieloberfläche
angeregt werden. Dies kann erhalten werden, indem die Probe an einer
Position außerhalb
der Brennebene der Mikroskopvorrichtung angeordnet wird und die
im Wesentlichen im Zentrum des Rings zu einem Fokus kommt. Dies kann
erhalten werden, indem ein Ring in der hinteren Brennebene der Vorrichtung
angeordnet wird. Dies kann erzielt werden, indem die Polarisierung
der Strahlung, mit der die Probe bestrahlt wird, gesteuert wird.
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Das
Verfahren kann eine Mikroskopvorrichtung aufweisen, die eine Flüssigkeitsimmersions-Objektivlinse,
wie eine Ölimmersions-Objektivlinse,
enthält.
Die Probe kann in der Brennebene der Objektivlinse angeordnet sein
oder außerhalb
der Brennebene der Objektivlinse. Ein Teil des zum Bestrahlen der Probe
verwendeten Strahlungsstrahls kann von der Probenoberfläche reflektiert
werden. Die fluoreszierende Strahlung der Probe kann schwächer sein
als diese reflektierte Strahlung. Das Verfahren kann zumindest teilweise
das Blockieren der von der Probe reflektierten Strahlung umfassen.
Dies kann durch Sperrmittel, wie einen Interferenzfilter, erzielt
werden.
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Die
Probe kann mit einem Bestrahlungsstrahl eines gepulsten Lasers bestrahlt
werden. Solch ein Laser hat hohe Spitzenleistungen und verbessert
somit die Stärke
der Multi-Photonen-Anregung. Der gepulste Laser kann ein Titan-Saphir-Laser sein.
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Das
Verfahren kann das Anregen harmonischer Oberflächenplasmone enthalten. Diese
können
zweite oder dritte oder höhere
harmonische Oberflächenplasmonen
umfassen. Zweite harmonische Oberflächenplasmone haben die halbe
Wellenlänge
der Strahlung, mit der die Probe bestrahlt wird, dritte harmonische
Oberflächenplasmone
haben ein Drittel dieser Wellenlänge
usw. Die erfasste Strahlung kann eine Strahlung aufweisen, die durch
harmonische Oberflächenplasmone
erzeugt wird. Die Strahlung, mit der die Probe bestrahlt wird, erzeugt Oberflächenplasmone
darin und Nicht-Linearitäten
in der Probe, im Besonderen führen
Regionen an der Oberfläche,
an der die Symmetrie unterbrochen ist, zur Erzeugung zweiter (oder
höherer)
harmonischer Oberflächenplasmone.
Einige dieser Oberflächenplasmone
können
erfasst werden, zum Beispiel können
Sie von der Probe durch die Objektlinse der Vorrichtung zu einem
Detektor davon zurückfließen. Die hohe
Intensität
der Strahlung, die zum Bestrahlen der Probe nahe der optischen Achse
verwendet wird, stellt sicher, dass der Großteil der harmonischen Oberflächenplasmone
in diesem Bereich erzeugt wird.
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Die
durch die harmonischen Oberflächenplasmone
erzeugte Strahlung kann mit einem Referenzstrahlungsstrahl kombiniert
werden. Diese können
dann kombiniert werden, indem sie veranlasst werden, einander zu überlagern.
Das Verfahren kann die Verwendung einer Vorrichtung umfassen, die
mit einem Interferometer bereitgestellt oder als solches konfiguriert
ist, um die Interferenzen dieser Strahlungen zu erhalten. Der Referenzstrahlungsstrahl
sollte kohärent
mit der Strahlung sein, die von den harmonischen Oberflächenplasmonen
erzeugt wird. Dies kann erzielt werden, indem der Strahlungsstrahl
aufgeteilt wird, mit dem die Probe bestrahlt wird und ein Teil davon
durch einen nicht-linearen Kristall durchgeleitet wird. Die von
den harmonischen Oberflächenplasmonen
erzeugte Strahlung und der Strahl aus dem Kristall können dann überlagert
werden. Die Interferenz der beiden Strahlungen kann erhalten werden,
indem ein Überlagerungsinterferometer
verwendet wird. Dieses kann eine Bragg-Zelle nutzen. Die Interferenz
der beiden Strahlungen kann mit Hilfe des Phasen-Schritt-Ansatzes erhalten
werden.
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Das
Verfahren liefert einen Kontrast, der bei herkömmlichen linearen Bildgebungsverfahren
nicht erhältlich
ist, und besonders sensitiv gegenüber den Eigenschaften von Übergangsstellen
ist, an denen die Symmetrie aufgebrochen ist. Die hohe Sensitivität, die durch
die Interferenzgestaltung gewährt
ist, ermöglicht
die Erfassung einer sehr schwachen harmonischen Oberflächenplasmon-Strahlung
auf relativ einfache Weise. Bei der Interferenz kann auch die komplexe
Suszeptilität
der Probe gemessen werden, was wichtige Informationen über die
internen Entspannungsprozesse der zu untersuchenden Probe liefert,
im Besonderen von biologischen Proben.
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Das
Verfahren kann die Verwendung eines Strahlungsstrahls zur Bestrahlung
des Beispiels umfassen, der durch einen gepulsten Laser erzeugt
wurde, der vorzugsweise eine hohe Spitzenleistung aufweist. Der
gepulste Laser kann ein Titan-Saphir-Laser sein.
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Die
Erfassung der Strahlung, die durch die harmonischen Oberflächenplasmone
erzeugt wurde, kann auch ohne den Referenzstrahl erzielt werden.
d. h. ohne Verwendung eines Interferometers. Informationen über die
komplexen Mengen der Probe sind dann nicht zugreifbar und unterschiedliche
Erfassungsmethodologien sind erforderlich, aber dieses Verfahren
ist auf Grund seiner Einfachheit sehr attraktiv. Das Verfahren kann
auch eine Zwei-Photonen-Anregung
der fluoreszierenden Strahlung beinhalten. Sowohl die durch die
zweiten harmonischen Oberflächenplasmone
erzeugte Strahlung wie auch die fluoreszierende Strahlung können gleichzeitig
erfasst werden, indem die Strahlungen an unterschiedlichen Wellenlängen erfasst
werden. Die durch die zweiten harmonischen Oberflächenplasmone
erzeugte Strahlung wird mit der halben Wellenlänge der Strahlung ausgesendet,
mit der die Probe bestrahlt wird.
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Die
fluoreszierende Strahlung wird in einer Wellenlänge ausgesendet, die etwas
größer ist
als die Wellenlänge
der Strahlung, die zum Bestrahlen der Probe verwendet wird. Die
beiden Strahlungen können
durch Komponenten getrennt werden, die in der Wellenlänge selektiv
sind, wie dichromatische Spiegel oder Interferenzfilter.
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Oberflächenplasmone
werden nur durch p-polarisierte Strahlung angeregt. Der Polarisierungszustand
der Strahlung, die auf die Probe einfällt, hängt vom Polarisierungszustand
der Strahlung ab, die auf die hintere Brennebene der Vorrichtung einfällt. Die
Strahlung, die auf die hintere Brennebene einfällt, kann linear polarisiert
werden (einige Laser senden linear polarisiertes Licht aus, aber
wir können Polarisierungssteuerungsoptiken,
z. B. lineare Polarisatoren aufnehmen). In diesem Fall variiert
die Polarisierung der Strahlung, die auf die Probe einfällt, zwischen
der reinen p-Polarisierung, durch eine Kombination der p- und s-Polarisierung,
und einer reinen s-Polarisierung, wenn der Azimutwinkel geändert wird.
Die Folge hiervon ist, dass die Stärke der p-Polarisierung der
Strahlung im Ring der Strahlung, die auf die Probe in einem solchen
Winkel oder solchen Winkeln zum Anregen der SPs einfällt, variiert,
wobei sie am stärksten
in einer Richtung parallel zur Polarisationsrichtung der Strahlung
ist, die auf die hintere Brennebene einfällt, und am schwächsten in
der Richtung normal dazu. Die auf die hintere Brennebene einfallende
Strahlung kann kreisförmig
polarisiert sein. In diesem Fall variiert die Stärke der p-Polarisierung der
Strahlung im Ring der Strahlung, die auf die Probe in einem solchen
Winkel oder in solchen Winkeln einfällt, um die SPs anzuregen,
nicht. Die auf die hintere Brennebene einfallende Strahlung kann kreisförmig polarisiert
sein, d. h., sie kann in einer Richtung entlang des Radius der hinteren
Brennebene polarisiert werden. In diesem Fall wird die Anregung
der SPs verbessert. Die auf die hintere Brennebene einfallende Strahlung
kann linear polarisiert werden, so dass sich die Phase der Strahlung
um 180 Grad in verschiedenen Halbkreisen davon unterscheidet. Hierdurch
kann die SP-Anregung in der Mitte des Rings der Strahlung verbessert
werden, die auf die Probe in solchen einem Winkel oder Winkeln zum
Anregen der SPs einfällt,
wenn die Probe defokussiert ist.
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Die
erfasste Strahlung kann eine Strahlung enthalten, die durch Oberflächenplasmone
erzeugt wird. Die erfasste Strahlung kann Strahlung enthalten, die
von der Probenoberfläche
abgestrahlt wird, die darin angeregte Oberflächenplasmonen aufweist. Eine
oder mehrere Eigenschaften der Strahlung können erfasst und analysiert
werden. Die einen oder mehreren Eigenschaften können die Phase und/oder Amplitude
der Strahlung umfassen.
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Die
erfasste Strahlung kann weiterhin Strahlung enthalten, die von der
Probenoberfläche
abgestrahlt wird, die keine angeregten Oberflächenplasmonen darin aufweist.
Eine oder mehrere Eigenschaften dieser Strahlung können erfasst
und analysiert werden. Zu den einen oder mehreren Eigenschaften
können
die Phase und/oder Amplitude der Strahlung gehören.
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Die
von der Probenoberfläche
abgestrahlte Strahlung, die darin angeregte Oberflächenplasmonen
hat und die von der Probenoberfläche
abgestrahlte Strahlung, die keine Oberflächenplasmone darin angeregt
hat, können
mit einem Referenzstrahlungsstrahl kombiniert werden. Diese Strahlungen und
der Referenzstrahlungsstrahl können
kombiniert werden, indem sie einander überlagern. Das Verfahren kann
die Verwendung einer Mikroskopvorrichtung umfassen, die mit einem
Interferometer bereitgestellt oder als solches konfiguriert ist,
um die Interferenzen dieser Strahlungen zu erzielen. Im Allgemeinen
sind die von der Probenoberfläche
abgestrahlte Strahlung, die darin angeregte Oberflächenplasmonen
besitzt, und die von der Probenoberfläche abgestrahlte Strahlung,
die keine Oberflächenplasmone
darin angeregt hat, räumlich
getrennt. Der Referenzstrahlungsstrahl kann zur Überlappung veranlasst werden
und sich daher mit diesen beiden Strahlungen überlappen. Der Strahlungsstrahl
zum Bestrahlen der Probe und der Referenzstrahlungsstrahl können mit
derselben Bestrahlungsquelle erzeugt werden. Das erzeugte Gesamtinterferenzsignal,
das durch die Interferenz der Strahlungen und dem Referenzstrahlungsstrahl
erzeugt wird, kann analysiert werden, um Informationen über die
Probe zu erhalten. Im Besonderen kann die Größenordnung des Gesamtinterferenzsignals
analysiert werden. Dies wird als Ausgangsreaktion V der Mikroskopvorrichtung
bezeichnet. Die Analyse der Phase dieses Signals würde zusätzliche
Informationen liefern, aber es ist nicht immer erforderlich. Die
Schwingung der Größe des Gesamtinterferenzsignals,
das sich in der Phasendifferenz-zwischen
ihnen ändert, durch
die Defokussierung der Probe verursacht, kann analysiert werden.
Wenn die Probe defokussiert ist, liegt die seitliche Auflösung, die
durch eine Analyse der Schwingung der Größe des Gesamtinterferenzsignals
erhalten wird, vorzugsweise in einem Bereich zwischen 0,3 bis 0,5 μm. Die Schwingung
der Größe des Gesamtinterferenzsignals
mit Veränderungen
in der Phasendifferenz zwischen ihnen, die durch Defokussierung
der Probe verursacht werden, können
analysiert werden, um den optimalen Wert der Defokussierung zu bestimmen,
die den besten Kontrast zwischen den Merkmalen der Probe liefert.
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Wenn
ein Referenzstrahlungsstrahl verwendet wird, kann das Verfahren
den Einsatz einer Mikroskopvorrichtung aufweisen, die einen Bestrahlungsarm
einer ersten Probe und einen Bestrahlungsarm einer zweiten Probe
umfasst. Eine Ölimmersions-Objektivlinse
kann im ersten Arm der Vorrichtung vorgesehen sein. Eine Bragg-Zelle
kann in jedem Arm verwendet werden, um die Frequenzverschiebung
der Strahlung, die durchgeleitet wird, zu beeinflussen. Vorzugsweise
führt eine
erste Bragg-Zelle eine Frequenzverschiebung von zum Beispiel 80
MHz ein und eine zweite Bragg-Zelle führt eine Frequenzverschiebung
von zum Beispiel 80 MHz ± 1
kHz ein, wodurch das Gesamtsignal an einer Differenzfrequenz von
1 kHz erfasst werden kann. Die Verwendung von zwei Bragg-Zellen
kann so die Auswirkungen von Störreflektionen
in den Bragg-Zellen verringern. Durch den Einsatz von zwei Bragg-Zellen
kann das Gesamtsignal an einer praktischen Frequenz erfasst werden,
z. B. 1 kHz oder 10 kHz. Solch eine Mikroskopvorrichtung kann als Überlagerungsinterferometrie-Mikroskopvorrichtung
beschrieben werden. Das Verfahren kann die Verwendung einer Mikroskopvorrichtung
umfassen, die einen Photodetektor aufweist, dessen Ausgangssignal
in einem Lock-in-Verstärker und
einem PC erfasst und analysiert wird. Sie können zur Erfassung und Aufzeichnung
der Amplitude und Phase der erfassten Strahlung als Funktion des
Defokus z verwendet werden.
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Gemäß einem
zweiten Aspekt der Erfindung ist eine Mikroskopvorrichtung vorgesehen,
die das Verfahren gemäß dem ersten
Aspekt der Erfindung ausführt.
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Die
Mikroskopvorrichtung ist bevorzugt ein Fernfeldvorrichtung, d. h..
das Anregen der Oberflächenplasmonen
und das Erfassen der durch die Oberflächenplasmonen erzeugten Strahlung
wird durch das Fernfeld erhalten.
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Die
Mikroskopvorrichtung kann einen Emitter eines einfallenden Strahls
umfassen, der einen zum Bestrahlen der Probe verwendeten Strahlungsstrahl erzeugt.
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Die
Strahlungsquelle kann einen Laser aufweisen. Der Laser kann ein
CW-Laser (Continuous Wave-Laser)
sein, zum Beispiel ein 633 nm HeNe-Laser. Der Laser kann ein gepulster
Laser sein, zum Beispiel ein Titan-Saphir-Laser. Gepulste Laser sind
vor allem für
den Einsatz in Multi-Photonen- oder harmonischen Systemen geeignet.
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Die
Mikroskopvorrichtung kann auch eine Linse aufweisen, durch die die
Probe vom Bestrahlungsstrahl bestrahlt wird. Die Linse kann eine
Flüssigkeitsimmersions-Objektivlinse
sein. Die Linse kann eine Ölimmersions-Objektivlinse sein.
Die Linse kann eine Zeiss CP-Achromat 100x/1,25oil Ölimmersions-Objektivlinse
sein. Die Linse kann eine andere kommerziell erhältliche Objektivlinse mit ausreichender
numerischer Apertur haben, um die gewünschten Oberflächenplasmonen
anzuregen. Die Linse kann eine numerische Apertur (NA) von 1,2,
oder höher
als 1,5 zum Beispiel 1,65 haben. Für Linsen mit hoher numerischer
Apertur wird ein Immersionsfluid mit einem hohen Brechungsindex
verwendet. Zum Beispiel bei einer Linse mit einer numerischen Apertur von
1,65 kann der Brechungsindex des Fluids in der Linse etwa 1,78 betragen.
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Die
Mikroskopvorrichtung kann Erweiterungsoptiken für den Strahlungsstrahl aufweisen. Diese
können
einen Strahl-Expander enthalten. Die Mikroskopvorrichtung kann ein
oder mehrere Strahl-Splitter aufweisen. Die Mikroskopvorrichtung kann
ein oder mehrere optische Frequenz-Shifter umfassen, zum Beispiel
Bragg-Zellen.
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Die
Mikroskopvorrichtung kann einen Strahlungsdetektor aufweisen. Die
Mikroskopvorrichtung kann einen oder mehrere Photodetektoren aufweisen.
Diese können
eine oder mehrere Photodioden und/oder eine oder mehrere Photomultiplier
umfassen, wie Lawinen- oder Vakuum-Photomultiplier. Die Mikroskopvorrichtung
kann ein oder mehrere Lock-in-Verstärker aufweisen.
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Das
von dem Detektor oder jedem Detektor erzeugte Signal kann gefiltert
und/oder durch ein oder mehrere Lock-in-Verstärker verstärkt werden.
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Die
Mikroskopvorrichtung kann einen Signalanalysierer aufweisen. Der
Analysierer analysiert das erfasste Signal aus dem Strahlungsdetektor.
Darüber hinaus
können
die Analysemittel mit dem einen oder jeden oder einigen der Lock-in-Verstärker gekoppelt sein,
und können
Signale von dem oder jeden oder einigen der Lock-in-Versträrker aufnehmen
und analysieren. Die Analysemittel können ein Signal anzeigen, das
von dem oder jeden oder einigen der Detektoren oder von dem oder
jeden oder einigen Lock-in-Verstärkern
empfangen wurde. Die Analysemittel können einen PC umfassen.
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Die
Mikroskopvorrichtung kann eine Probenhalterung aufweisen, die die
Probe hält.
Wenn die Probe eine biologische Probe ist, kann der Probenhalter
die Probe in einer wässrigen
Umgebung halten.
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Die
Mikroskopvorrichtung kann Mittel zum Erzeugen eines ringförmigen Strahlungsstrahls
aufweisen, der zum Bestrahlen der Probe verwendet wird, in der Form
einer Strahlungsquelle, die den ringförmigen Strahlungsstrahl erzeugt.
Dies kann eine Objektlinse umfassen und einen Ring, der in der hinteren
Brennebene der Linse angeordnet ist. Dieser kann so positioniert
sein, dass die Bestrahlung einer Probe über einen Bereich von Winkeln
stattfindet, zu denen der Bereich von Winkeln für die Anregung von Oberflächenplasmonen
gehört,
aber im Wesentlichen andere Winkel ausschließt.
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Die
Mikroskopvorrichtung kann Abtastmittel enthalten. Damit kann eine
Probe abgetastet werden, um Informationen über mehrere Punkte davon liefern.
Die Abtastmittel können
mechanische Abtastmittel umfassen. Die mechanischen Abtastmittel
können
ein oder mehrere mechanische Stufen aufweisen, die die Probe in
einer Rasterabtastung bewegen können.
Die Abtastmittel können
darüber
hinaus oder alternativ Spiegelabtastmittel enthalten. Diese können ähnlich denen
sein, die in kommerziell erhältlichen
konfokalen Mikroskopen verfügbar
sind. Wenn bereitgestellt, kann die Linse bewegt werden, um die Probe
abzutasten. Der Strahlungsstrahl, der zum Bestrahlen der Probe dient,
kann bewegt werden, um die Probe abzutasten. Dies kann durch Spiegelabtastmittel
erzielt werden.
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Alternativ
kann die Mikroskopvorrichtung eine Weitfeldgestaltung besitzen.
Dies beinhaltet das Bestrahlen der Probe über einen Bereich von Winkeln,
was eine größere Fläche der
Probe abdeckt. Informationen über
mehrere Punkte der Probe können daher
erhalten werden, ohne dass ein Abtastverfahren verwendet werden
muss. Die Weitfeld-Mikroskopvorrichtung kann einen Diffuser aufweisen,
der zum Ablenken der Strahlung verwendet werden kann, mit dem die
Proben über
einen Bereich von Winkeln bestrahlt wird. Die Weitfeld-Mikroskopvorrichtung
kann Interferenzmittel enthalten, die verwendet werden können, um
die Strahlung der Probe und einen Referenzstrahlungsstrahl zu kombinieren.
Alternativ kann auf einen Referenzstrahl verzichtet werden, und
die Vorrichtung kann Mittel zum Ändern der
Interferenzbedingungen zwischen den verschiedenen Teilen der Strahlung,
die auf die Probe abgestrahlt wird, umfassen. Dieses Verfahren kann
auch die Verwendung eines herkömmlichen
optischen Mikroskops mit einer Ölimmersions-Objektivlinse
umfassen und die Probe auf entscheidende Weise anstrahlen. Die Vorrichtung
kann weiterhin einen Filter umfassen, um die Eingangsverteilung
in der hinteren Brennebene der Vorrichtung zu filtern. Die Vorrichtung
kann einen räumlichen
Lichtmodulator in der hinteren Brennebene aufweisen, um die relative
Phase des nahe des normalen Lichteinfalls einfallenden Lichts zu
andern, und des Lichts, das an der Anregung der Oberflächenplasmone
beteiligt ist. Der SLM führt
verschiedene Phasenänderungen
an unterschiedlichen Strahlungsteilen ein, um den Kontrast zwischen
den verschiedenen Bereichen der Probe zu optimieren. Der Phasenschritt-Algorithmus
kann dann angewendet werden, um weitere quantitative Informationen
zu extrahieren. Die Vorrichtung kann eine CCD-Kamera oder eine andere Kamera mit einem
ausreichend dynamischen Bereich aufweisen. Damit kann die durch
die Oberflächenplasmone
erzeugte Strahlung erfasst werden.
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Die
Mikroskopvorrichtung kann Mittel zum Bewegen der Probe aufweisen,
um die Position der Probe außerhalb
der Brennebene der Mikroskopvorrichtung zu variieren, d. h., um
den Defokus z der Probe zu variieren. Das wird als Defokussierung
der Probe bezeichnet. Die Mittel zum Bewegen der Probe können die
Position der Probe außerhalb
der Brennebene der Linse der Mikroskopvorrichtung variieren. Die
Mikroskopvorrichtung kann Mittel zum Messen der Position der Probe
außerhalb
der Brennebene aufweisen, d. h. den Defokus z.
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Die
Mikroskopvorrichtung kann einen Polarisator aufweisen oder damit
verbunden sein. Der Polarisator führt vorzugsweise zu einer Strahlung,
mit der die Probe bestrahlt wird, die zumindest in der Ebene der
Probenoberfläche
im Wesentlichen p-polarisiert und normal zu dieser Richtung im Wesentlichen
s-polarisiert ist.
Die Mikroskopvorrichtung kann Mittel zum Steuern der Bereiche der
einfallenden Azimutwinkel der Strahlung enthalten, mit der die Probe bestrahlt
wird, verwenden, so dass die einfallende s-polarisierte Strahlung
verringert wird.
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Wenn
die erfasste Strahlung eine Strahlung aufweist, die von der Probenoberfläche abgestrahlt wird,
die eine oder mehrere angeregte Oberflächenplasmone darin aufweist,
und die Strahlung von der Beispieloberfläche, die keine angeregten Oberflächenplasmone
darin hat, kann die Mikroskopvorrichtung mit einem Interferometer
ausgestattet sein oder als solches gestaltet sein, um die Interferenz
dieser Strahlungen zu erhalten, unter der Voraussetzung, dass sie
zueinander kohärent
sind.
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Die
Analysemittel der Mikroskopvorrichtung können das Signal analysieren,
das durch die Interferenz dieser Strahlungen erzeugt wird, um Informationen über die
Probe zu erhalten. Die Analysemittel können die Größe des durch die Interferenz
dieser Strahlungen erzeugten Signals analysieren. Die Analysemittel
können
die Schwingung der Größe des Signals
analysieren, das durch die Interferenz dieser Strahlungen erzeugt
wird, wobei Änderungen
in der Phasendifferenz zwischen ihnen durch die Defokussierung der
Probe verursacht werden.
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Wenn
das Signal, das durch die Kombination der Strahlung erzeugt wird,
die von der Probenoberfläche
abgestrahlt wird, die ein oder mehre angeregte Oberflächenplasmone
darin aufweist, und die Strahlung, die von der Probenoberfläche abgestrahlt
wurde, die keine angeregten Oberflächenplasmone darin aufweist,
zu einem Referenzstrahlungsstrahl zusammengefasst werden soll, kann
die Mikroskopievorrichtung eine Referenzstrahlungsquelle aufweisen oder
damit verbunden sein. Die Mikroskopvorrichtung kann eine einzelne
Strahlungsquelle umfassen, die einen Strahlungsstrahl zum Bestrahlen
der Probe und den Referenzsstrahlungsstrahl erzeugen kann. Diese
Strahlungen können
zum Beispiel mit einem Strahl-Splitter erzeugt werden. Die Mikroskopvorrichtung
kann mit einem Interferometer ausgebildet oder als solches gestaltet
sein, um eine Interferenz des Signals und des Referenzstrahls der
Strahlung zu erhalten.
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Die
Analysemittel der Mikroskopvorrichtung können das Gesamtsignal analysieren,
das durch die Interferenz des obigen Signals und des Referenzstrahlungsstrahls
erzeugt wurde, um Informationen über
die Probe zu erhalten. Die Analysemittel können die Größe des Gesamtsignals analysieren.
Die Analysemittel können
die Schwingung der Größe des Gesamtsignals
analysieren, mit Änderungen
in der Phasendifferenz zwischen ihnen, die durch Defokussierung
der Probe verursacht werden.
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Wenn
ein Referenzstrahlungsstrahl verwendet wird, kann die Mikroskopvorrichtung
einen Bestrahlungsarm einer ersten Probe und einen Bestrahlungsarm
einer zweiten Probe aufweisen. Eine Ölimmersions-Objektivlinse kann im ersten Arm der
Vorrichtung ausgebildet sein. Eine Bragg-Zelle kann in jedem Arm verwendet werden,
um die Frequenzverschiebung der Strahlung, die dadurch durchgeleitet wird,
zu beeinflussen.
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Wenn
die erfasste Strahlung eine fluoreszierende Strahlung von der Probe
enthält,
kann die Mikroskopvorrichtung einen Detektor umfassen, der eine
oder mehrere Eigenschaften dieser Strahlung erfasst. Der Detektor
kann die Anzahl und/oder das Energiespektrum der fluoreszierenden
Photone erfassen. Ein Teil des zum Bestrahlen der Probe verwendeten
Strahlungsstrahls kann von der Probenoberfläche reflektiert werden. Die
fluoreszierende Strahlung der Probe kann schwächer sein als diese reflektierte
Strahlung. Die Mikroskopvorrichtung kann Blockiermittel umfassen,
um zumindest teilweise die von der Probe reflektierte Strahlung
zu blockieren. Das Blockiermittel kann einen Interferenzfilter enthalten.
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Eine
Ausführungsform
der Erfindung sind im Folgenden nur in beispielhafter Weise mit
Bezugnahme auf die begleitenden Zeichnungen beschrieben, in denen:
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1 ein
Schemadiagramm des Strahlungsstrahls zeigt, der durch eine Ölimmersionslinse übertragen
wird und auf eine defokussierte Probe einfallt;
-
2 ein
Schemadiagramm einer ersten Ausführungsform
der Mikroskopvorrichtung gemäß einem
zweiten Aspekt der Erfindung zeigt;
-
3 den
gemessenen Schwingungsmodul der Größe des Gesamtsignals mit einer
Variation des Defokus z einer ersten Probe (Linie 1) und
einer zweiten Probe (Linie 2) zeigt:
-
4 Aufnahmen zeigt, die durch das mechanische
Abtasten einer Probe mit
- (a) der erhaltenen
Aufnahme einer Probe mit einem Defokus z von im Wesentlichen 0 μm zeigt;
- (b) der erhaltenen Aufnahme einer Probe mit einem Defokus z
von –1,5 μm zeigt;
und
- (c) der erhaltenen Aufnahme einer Probe mit einem Defokus z
von –1,85 μm zeigt;
und
-
5 eine
andere Ausführungsform
der Erfindung zeigt.
-
1 zeigt
die Situation, wenn ein Strahlungsstrahl über eine Ölimmersionslinse übertragen wird
und eine Probe bestrahlt, die außerhalb der Brennebene der
Linse angeordnet ist. Die Probe weist ein metallbeschichtetes Deckglas
auf. Wenn die Probe sich oberhalb der Brennebene befindet, wie gezeigt,
fällt ein
Bestrahlungskreis auf die Probenoberfläche ein, und wenn Oberflächenplasmone durch
die auf die Probe in bestimmten Winkelbereichen einfallende Bestrahlung
weitergeleitet werden, regt nur ein Ring des Bestrahlungskreises
die Oberflächenplasmone
an. Diese werden entlang der Beispieloberfläche angeregt, wie durch Linie
1 dargestellt,
und kommen in der Mitte des Rings zu einem Fokus. Reziprokizitätsüberlegungen
besagen, dass Energie fortlaufend in die Ölimmersionslinse zurück entweicht,
wenn die SPs sich ausbreiten, so dass die Oberflächenplasmon-Strahlung durch
die Linse entlang dem Pfad B zurückfließt und diese
Strahlung erfasst wird. Wenn der Defokus z der Probe variiert wird,
verändert
sich die Phasendifferenz zwischen der Strahlung, die sich entlang
der Pfade A und B bewegt. Die Kombination der Strahlung aus den
Pfaden A und B miteinander und mit einem gemeinsamen Referenzstrahl
führt zu
einem Gesamtinterferenzsignal, dessen Größe (V(z)) oszilliert, wenn
die Phase zwischen den Pfaden A und B sich ändert. Die Periodizität dieses
Interferenzsignals ist gleich der Änderung im Defokus, der für die relative
Phase zwischen den beiden Pfaden erforderlich ist, um sich um 2π Bogenmaß zu verändern. Die
Periodizität Δz der Schwingungen
im V(z)-Signal kann einfach gezeigt werden als gleich:
wobei λ die Wellenlänge des Strahlungsstrahls in
Vakuum ist, n der Brechungsindex des Öls in der Ölimmersionslinse (als gleich
zu dem des Deckglases angenommen), θ
p der
Einfallswinkel der Strahlung ist, mit der die Probe bestrahlt wird,
die die Oberflächenplasmonen
anregt. Dies verändert
sich, wenn ein dielektrisches Element auf der Metallbeschichtung
aufgetragen wird.
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2 zeigt
ein Schemadiagramm einer Ausführungsform
einer Mikroskopvorrichtung 1 gemäß der Erfindung. Dies umfasst
eine Abtast- Überlagerungsinterferometer-Mikroskopvorrichtung.
Die Vorrichtung enthält
eine 633 nm HeNe-Laser-Bestrahlungsquelle 1 und einen Polarisator 1'. Eine Strahlungsquelle 2 des
Lasers 1 fällt
auf einem Strahl-Splitter 3 ein, wobei er in einen ersten
Strahlungsstrahl 4 aufgeteilt wird, der entlang eines Beispielstrahlungsarms 5 der
Vorrichtung fließt
und einem zweiten Strahlungsstrahl 6, der entlang eines Referenzstrahls 7 der
Vorrichtung fließt.
Der Beispielbestrahlungsarm umfasst eine erste Bragg-Zelle 8, einen
Strahl-Expander 9 und eine Ölimmersions-Objektivlinse 10,
die an einer Probe 11 anliegt. Diese Linse ist eine Zeiss
CP-Achromat 100x/1.25oil Ölimmersions-Objektivlinse
mit einer numerischen Apertur (NA) von 1,25. Der Brechungsindex
des Öls
ist 1,52. Die Probe wird in einer Probenhalterung (nicht dargestellt)
gehalten, befestigt am Probenbewegungsmittel (nicht dargestellt),
das zum Bewegen der Probe in verschiedenen Positionen außerhalb
der Brennebene der Linse 10 dient, d. h. dazu dient, den Defokus
z der Probe zu variieren. Der Referenzstrahlungsarm 7 umfasst
eine zweite Bragg-Zelle 12 und einen Spiegel 13.
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Der
Strahlungsstrahl 4 geht dann die Bragg-Zell 8,
den Strahlen-Expander 9 und die Linse 10 durch
und fallt auf die Probe 11 ein. Der Strahlungsstrahl enthält eine
Mischung aus p-polarisierter und s-polarisierter Strahlung. Wenn
die Strahlung linear in der hinteren Brennebene der Vorrichtung
polarisiert wird, dann bestehen gleiche Durchschnittsintensitäten von
p und s der polarisierten Strahlung, die mit dem Azimutwinkel des
Strahls der einfallenden Strahlung variiert. Die Variation der Eingangspolarisation
und der räumlichen
Verteilung in der hinteren Brennebene ermöglicht das Gleichgewicht zwischen den
beiden Polarisationszuständen
zu steuern.
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Der
Ring der auf die Probenoberfläche
einfallenden Strahlung, die Oberflächenplasmone erzeugt, fällt in etwa
45 Grad zur Normalen ein, wenn die Probe mit Luft hinterlegt ist.
Diese breiten sich entlang der Beispieloberfläche aus und kommen in der Mitte
der Linse 10 zum Fokus. Die Strahlung 14 wird
von der Probenoberfläche
abgestrahlt, die darin angeregte Oberflächenplasmone hat, und Strahlung wird
von der Probenoberfläche
abgestrahlt, die keine Oberflächenplasmone
darin angeregt hat.
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Der
zweite Strahlungsstrahl 6 verläuft entlang des Referenzstrahlungsarms 7 und
geht durch die zweite Bragg-Zelle 12 hindurch und fällt auf
den Spiegel 13 ein. Ein Strahlungsstrahl 16 wird
vom Spiegel 13 reflektiert, und läuft zurück entlang des Referenzstrahlungsarms
durch die Bragg-Zelle 12 und fallt auf den Strahl-Splitter 3 ein.
Der Strahlungsstrahl 16 dient als Referenzstrahlungsstrahl.
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Die
Bragg-Zelle 8 führt
eine Frequenzverschiebung von 80 MHz ± 1 kHz in dem Signal ein,
das durch die Interferenz der Strahlungen 14 und 15 erzeugt
wird, und die Bragg-Zelle 13 führt eine Frequenzverschiebung
von 80 MHz im Strahlungsstrahl 16 ein. Die Verwendung der
beiden Bragg-Zellen verringert die Effekte von Störreflexionen
darin.
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Die
Strahlungen 14 und 15 und der Referenzstrahl der
Strahlung 16 werden in einem Strahl-Splitter 3 kombiniert,
der als Interferometer dient. Dies erzeugt ein Gesamtsignal, das
auf Grund der Frequenzverschiebung der Bragg-Zellen an einer Differenzfrequenz
von 1 kHz erfasst werden kann. Das Gesamtsignal wird an einen Detektor 17 übergeben,
der die Amplitude und Phase des Gesamtsignals erfasst. Das Signals
von dem Detektor 17 wird an einen Lock-in-Verstärker 18 übergeben,
der das Signal filtert und verstärkt.
Das Signal vom Verstärker 18 wird
an Analysemittel übergeben,
die einen PC 19 umfassen. Die Analyse der Gesamtsignale
liefert Informationen über
die Probe 11.
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3 zeigt
den gemessenen Schwingungsmodul der Größe des Gesamtsignals mit Variation des
Defokus z von zwei Proben. Man beachte, dass der negative Defokus
angibt, dass die Probe in Richtung der Brennebene der Objektivlinse 10 bewegt wird.
Die Linie 1 wurde aus einer ersten Probe erhalten, die
ein Deckglas aufweist, das eine etwa 1 nm dicke Schicht aus Chrom überzogen
mit einer Goldschicht von 50 nm umfasst, und eine Linie 2 wurde von
der zweiten Probe erhalten, die ein Deckglas aufweist, das eine
etwa 1 nm dicke Schicht aus Chrom überzogen mit einer Goldschicht
von 50 nm und einer etwa 20 nm dicken Siliziumdioxid auf der Goldschicht aufweist.
Das Glas der Deckgläser
wurde so gewählt, dass
der Brechungsindex fast identisch mit dem Brechungsindex des Öls der Linse 10 ist.
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Das
Ergebnis zeigt ein charakteristisches Wellenmuster, das von der
Anregung der Oberflächenplasmone
herrührt.
Die Periodizität
der Wellen von Linie 1 ist 761 nm, was sehr nahe am Wert
758 nm liegt, der aus der obigen Gleichung (1) abgeleitet wird.
Die Periodizität
der Linie 2 ist 676 nm, auch wieder nahe am Wert von 672
nm, der aus der Gleichung (1) abgeleitet wird. Aus den Linien 1 und 2 ist
ersichtlich, dass wenn die Proben an der Brennebene der Linse 10 angeordnet
sind, sehr wenig Kontrast zwischen den Proben zu erwartet ist. Wenn
aber die Proben in Richtung der Objektivlinse 10 bewegt
werden, erscheint die erste Probe hell im Vergleich zur zweiten
Probe, man vergleiche hierzu den Defokus A in 3.
Für größere Defokuswerte
ist der Kontrast umgekehrt, zum Beispiel für den Defokus B.
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Die
Serie der Aufnahmen von 4 wurden durch
mechanisches Abtasten einer Probe erhalten, die ein Deckglas mit
einer ca. 1 nm dicken Chromschicht überzogen mit einer etwa 50
nm dicken Goldschicht und einer etwa 20 nm dicken Siliziumdioxidschicht
auf dem Gold umfasst, die weggeätzt
wurden, so dass 2 μm
breite rine Goldstreifen gefolgt von 6 μm breiten Streifen aus dielektrisch
beschichtetem Gold übrig
bleiben. Die in 4a, 4b und 4c dargestellten Beispiele wurden durch
Abtasten der Objektlinse 10 über die Probe erhalten. 4a wurde erhalten, indem die Probe nahe
der Brennebene der Linse 10 war, und zeigt einen kaum unterscheidbaren
Kontrast zwischen den verschiedenen Streifen, wie erwartet. 4b wurde an einem Defokus z der Probe von –1,5 μm (A in 3)
erhalten und zeigt helle reingoldene Streifen. 4c wurde
an einem Defokus z der Probe von –1,85 μm (B in 3) erhalten
und zeigt dunkle rein goldene Streifen. Messungen aus den Liniespuren,
die aus den Aufnahmen extrahiert wurden, zeigen, dass der Übergang
zwischen den Streifenübergangsstellen
etwa 300 nm ist, was eine beugungsbegrenzte anstelle einer durch
die Weiterleitungslänge
der Oberflächenplasmonen
begrenzte seitliche Auflösung
angibt.
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5 zeigt
eine weitere Ausführungsform der
Erfindung mit einer Weitfeldgestaltung. In der Weitfeldgestaltung
wird ein Lichtstrahl aus einer Lichtquelle wie einem Laser 40 an
einen Glas-Diffuser 41 mit rotierendem Boden in der Bildebene
des Systems angeordnet. Das aus dem Diffuser austretende Licht wird
durch eine Umwandlungslinse 42 transformiert, so dass es
auf einen Raumfilter 43 trifft, der in der Fourier-Ebene
des Bildgebungssystems angeordnet ist. Dadurch können die verschiedenen Komponenten
des Bestrahlungsstrahls verändert werden,
entweder in der Amplitude oder in der Phase relativ zueinander.
Der Strahl wird durch einen Strahl-Splitter 44 geleitet
und die Probe 46 wird durch ein Ölimmersionsobjektiv 45 geleitet.
Die Probe 46 wird so in einem Bereich von Winkeln angestrahlt,
die Winkel umfassen, die Oberflächenplasmone
oder optische Oberflächenwellen
anregen. Das von der Probe reflektierte Licht wird durch den Strahl-Splitter 44 zurückreflektiert,
und ein räumlicher
Lichtmodulator 47 (Spatial Light Modulator, SLM) wird in
der Fourier-Ebene angeordnet. Dies kann die relative Amplitude und
Phase des reflektieren Lichts ändern
(unterschiedliche Regionen des SLM verändern das Licht in verschiedener
Weise). Das daraus hervorgehende Licht wird durch eine zusätzliche
Linse 48 transformiert und mit einem Lichterfassungsgerät wie einer CCD-Kamera 49 erfasst.
Das Ausgangssignal wird an den PC 50 zur Verarbeitung und
Anzeige übergeben.
Die Beziehung der Phasen zwischen den verschiedenen Teilen des Strahls
kann weiterhin gesteuert werden, indem die Fokuslage der Probe mit
einer Probenpositionierungseinrichtung, wie als 51 dargestellt,
verändert
wird.
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Dabei
ist hervorzuheben, dass in einigen Ausführungsformen das Defokussieren
der Probe sehr wichtig ist, da dadurch die Beiträge der Oberflächenplasmonen
variiert werden können,
und dies ermöglicht,
den Kontrast für
bestimmte Merkmale zu verbessern. Der Betrieb des Interferometers
im Fokus verleiht den Oberflächenplasmonen
wenig Kontrast. Wenn das Interferometer im Fokus verwendet wird,
ist es bevorzugt, dieses mit einer ringförmigen Öffnung zu betreiben, um den
Beitrag der Oberflächenwellen
zu verbessern. Dies führt
wahrscheinlich zu großen
Nebenkeulen und zu schlechterer Bildgebungsleistung. Weiterhin ermöglicht dies
nicht mehr, den Kontrast durch Variieren des Defokus "feineinzustellen". Verändert man
die Trennung zwischen Probe und Objektivlinse, so wird die Reaktion
sehr sensitiv für
die relative Phase der Strahlen A und B (in 1). Diese
macht das System robuster und ermöglicht Weiterleitungseigenschaften
der Oberflächenplasmone
als die Amplitude des Interferenzsignals zu kodieren (wie auch der
Phase). Die führt
zu einer präzisen Messung
und einen Bildgebungsmodus, der nicht verfügbar ist, wenn die Probe im
Fokus gehalten wird, unabhängig
von der Art der Anstrahlung.