WO2020015872A1 - Diffraktiver biosensor - Google Patents

Diffraktiver biosensor Download PDF

Info

Publication number
WO2020015872A1
WO2020015872A1 PCT/EP2019/059853 EP2019059853W WO2020015872A1 WO 2020015872 A1 WO2020015872 A1 WO 2020015872A1 EP 2019059853 W EP2019059853 W EP 2019059853W WO 2020015872 A1 WO2020015872 A1 WO 2020015872A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
light
phase
detector
biogrid
measuring
Prior art date
Application number
PCT/EP2019/059853
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Wolfgang Holzapfel
Michael Kugler
Marco Schade
Original Assignee
Dr. Johannes Heidenhain Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dr. Johannes Heidenhain Gmbh filed Critical Dr. Johannes Heidenhain Gmbh
Priority to CN201980047841.9A priority Critical patent/CN112424584A/zh
Priority to US17/261,259 priority patent/US20210270736A1/en
Priority to JP2021502488A priority patent/JP7278363B2/ja
Priority to EP19719788.2A priority patent/EP3824272A1/de
Publication of WO2020015872A1 publication Critical patent/WO2020015872A1/de

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/47—Scattering, i.e. diffuse reflection
    • G01N21/4788—Diffraction
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
    • G01N21/7703—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator using reagent-clad optical fibres or optical waveguides
    • G01N21/774—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator using reagent-clad optical fibres or optical waveguides the reagent being on a grating or periodic structure
    • G01N21/7743—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator using reagent-clad optical fibres or optical waveguides the reagent being on a grating or periodic structure the reagent-coated grating coupling light in or out of the waveguide
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B26/00—Optical devices or arrangements for the control of light using movable or deformable optical elements
    • G02B26/02—Optical devices or arrangements for the control of light using movable or deformable optical elements for controlling the intensity of light
    • G02B26/04—Optical devices or arrangements for the control of light using movable or deformable optical elements for controlling the intensity of light by periodically varying the intensity of light, e.g. using choppers
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B6/00—Light guides; Structural details of arrangements comprising light guides and other optical elements, e.g. couplings
    • G02B6/24—Coupling light guides
    • G02B6/42—Coupling light guides with opto-electronic elements
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B6/00—Light guides; Structural details of arrangements comprising light guides and other optical elements, e.g. couplings
    • G02B6/24—Coupling light guides
    • G02B6/42—Coupling light guides with opto-electronic elements
    • G02B6/4201—Packages, e.g. shape, construction, internal or external details
    • G02B6/4204—Packages, e.g. shape, construction, internal or external details the coupling comprising intermediate optical elements, e.g. lenses, holograms
    • G02B6/4215—Packages, e.g. shape, construction, internal or external details the coupling comprising intermediate optical elements, e.g. lenses, holograms the intermediate optical elements being wavelength selective optical elements, e.g. variable wavelength optical modules or wavelength lockers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/47—Scattering, i.e. diffuse reflection
    • G01N21/4788—Diffraction
    • G01N2021/479—Speckle
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2201/00—Features of devices classified in G01N21/00
    • G01N2201/06—Illumination; Optics
    • G01N2201/063—Illuminating optical parts
    • G01N2201/0633—Directed, collimated illumination
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2201/00—Features of devices classified in G01N21/00
    • G01N2201/06—Illumination; Optics
    • G01N2201/063—Illuminating optical parts
    • G01N2201/0635—Structured illumination, e.g. with grating

Definitions

  • the present invention relates to a diffractive biosensor.
  • Such sensors are based on the adsorption of biomolecules to be detected on a diffractive grating for diffraction of light.
  • the signal from a photodetector for the diffracted light serves as a measure of the mass loading of the biosensor with the biomolecules.
  • Planar waveguides arranged on a substrate are known from optics and have an optical grating for coupling in or coupling out light.
  • Such an optical grating is, for example, structures etched into the substrate or into the waveguide and thus consist of the material of the substrate or of the waveguide.
  • the grating period required depends on the wavelength of the light used and on the refractive index of the waveguide. Depending on the coupling angle, the grating period is in the range of the effective wavelength of the light Waveguides. It is typically about half the vacuum wavelength of the light.
  • biogrid In the field of biosensors, grids for coupling light in and out are also known which consist of biological matter and act as a receptor for the biomolecules to be examined. If such biomolecules attach themselves to the receptors structured to form a lattice, the biomolecules form an optically effective lattice. Such receptors structured to form a lattice with or without adsorbed biomolecules are referred to below as biogrid. Since the diffraction efficiency of such a biogrid depends on the mass occupancy of the grating with the biomolecules, a quantitative statement about the mass occupancy can be made on the basis of the intensity of the diffracted light measured by means of a detector.
  • a diffractive biosensor is known from W02015004264A1, in which divergent light falls through a substrate onto an optical grating for coupling light into a waveguide.
  • the light propagating in the waveguide then hits a biogrid that acts as a coupling-out grating.
  • the outcoupled light is focused through the substrate onto a detector.
  • the light intensity measured in the detector is a measure of the occupancy of the coupling-out grating with the biomolecule to be examined.
  • the use of two biogrids means a very low signal due to the double weak coupling. Since the desired measurement light is also overlaid by undesired scattered light, which is also in a fixed phase relationship to the measurement light and can interfere with it, optimal measurement signals are not obtained.
  • a diffractive biosensor is also described in US7008794B2. Here it is proposed to subtract a background diffraction pattern from the measurement signal in order to emphasize the actually desired signal. However, the fixed phase relationship of the scattered light to the measurement light is also neglected here.
  • Other biosensors are also described in EP2618130A1, EP2757374A1 and EP2929326B1.
  • a diffractive biosensor for the selective detection of biomolecules having a substrate and an optical biogrid arranged on the substrate, the biogrid having periodically arranged receptors for the biomolecules, and the efficiency of a diffraction of incident light and thus the intensity of an in a measuring light beam arriving at a detector depends on a mass occupancy of the biogrid with the biomolecules to be detected.
  • the biosensor has a device for generating a reference light beam directed at the detector, with which the phase position of scattered light arriving in the detector can be determined relative to the measurement light beam.
  • speckle occurs when illuminating scattering surfaces with coherent light. It is scattered light that interferes with itself with a random phase position and thus generates a random phase and amplitude distribution. This phenomenon also occurs with diffractive biosensors (e.g. as in the prior art cited above), and affects the measuring accuracy.
  • the diffractometric measuring field is coherently overlaid by a stray field and falsified by this.
  • E M or Es are the electrical field strengths of the measuring field or stray field
  • y M or cps the respective phases
  • IM + S the associated overall intensity in the detection plane.
  • the present invention therefore provides an apparatus and an associated method for measuring this phase difference in order to be able to draw off the stray field correctly, and thus to be able to infer the undisturbed measuring field E M or its intensity I M.
  • Unwanted scattering centers ie disturbances of all kinds such as surface roughness, contamination of the surface, grain boundaries in the waveguide, non-specifically attached particles / biomolecules, etc.
  • the unwanted scattering centers are not structured but arranged randomly, the scattered light is emitted in a wide solid angle and not specifically in the direction of the detection location. This is the reason why diffractive biogrids are extremely robust against non-specific deposits.
  • the unwanted scattering centers - especially in the case of scattering due to substrate roughness - are unstructured, but are nevertheless arranged in a stationary manner.
  • the phase position of the resulting stray field Es is thus random, but is constant over time. Only a very small, but not negligible part of the stray field is emitted in the direction of the detection location.
  • An optimal design of the detection optics allows only the light mode (hereinafter referred to as measurement mode) to reach the detector that generates the diffractive biogrid of the biomolecules to be detected and blocks all other modes through suitable apertures and apertures. The stray light is thus suppressed in these other modes and does not reach the detector.
  • the scattered light that is emitted into the measuring mode cannot, however, be suppressed due to the principle. With a field strength Es and phase cps, it contributes to the detected total intensity IM + S.
  • Scattered light in the measurement mode which is generated by non-stationary, ie fluctuating, scattering centers, can be suppressed by averaging the detected intensity over time, since the expected value of the interference term is zero.
  • Unwanted stray light that is generated in a process that differs in some parameter (e.g. location, wavelength, polarization, etc.) from the generation of the measurement light and is therefore not emitted into the measurement mode can be suppressed using this parameter.
  • the proportion of the scattered light that is emitted into the measuring mode arises at the same locations on the substrate as the measuring light and is generated in the same direction and with the same polarization.
  • the measuring light and the scattered light component in the measuring mode are thus inseparably mixed in an optical mode and can no longer be separated.
  • stray field So far only speckle has been considered, which occurs when illuminating scattering surfaces with coherent light.
  • Another concrete example (and a special case) of a stray field is the optical bias of a biogrid.
  • bias a constant zero signal appears as a background, which is referred to as bias, even without connecting biomolecules to be detected.
  • This bias can either overlap constructively or destructively with the measuring field and falsify it. It is therefore advantageous to fill the bias by filling it out (so-called "backfilling") To minimize or even eliminate grid gaps with a suitable material.
  • phase difference ACP MS between measuring field E M and stray field It cannot be distinguished whether the electrical field Es has its origin in speckle or bias.
  • the proposed method for measuring the phase difference ACP MS between the measuring field E M and the stray field Es and the subsequent coherent subtraction of the stray field thus also represent a possibility for measuring or eliminating the bias.
  • the associated increase in measuring accuracy of the biosensor is particularly advantageous since the measuring signal is no longer falsified by the bias or by speckle.
  • Another advantage is the fact that the bias does not have to be completely eliminated by backfilling, which allows greater tolerances in the production of such biogrids.
  • the present invention provides to measure the unknown phase difference ACP MS between measuring field E M and stray field Es in order to then be able to completely subtract the stray field by coherent difference formation.
  • the flow chart is as follows, the individual steps are explained in more detail below:
  • the accessible intensity distributions are measured in step (i).
  • the unknown phase of a light wave can be determined by interference with a known reference wave. Therefore, in addition to the already defined field strengths of the measuring field EM and stray field Es, the field strength of the reference field ER is defined here.
  • IM EM 2
  • the total intensity of different combinations (ie coherent overlays) of the measuring field, stray field and reference field is called IM + S + R, IM + S USW. designated.
  • the intensity distribution is understood to mean in particular the spatial intensity distribution on a 2-dimensional detector (for example a camera).
  • the evaluation of these intensity distributions can take place both per camera pixel and in areas, ie in order to save computing power, certain areas of the camera image can be summarized at the expense of accuracy and then the various evaluations can be carried out for these areas.
  • the reference field IR can be switched on and off by simply stopping down.
  • the whole Are emitted from the region of the measuring field and leakage field Biogitter be dimmed to only receive IR. Basically, the following five combinations of measuring field, stray field and reference field are experimentally accessible as measured variables:
  • the unknown phase of a light wave can be determined by interference with a known reference wave.
  • Either carrier wave methods in which the reference phase is impressed as carrier frequency are suitable for this (see D. Malacara, Interferogram analysis for optical testing, Chapter 8 "Spatial Linear and Circular Carrier analysis"), or phase-shifting methods in which the reference phase is in at least three Steps are varied (cf. D. Malacara, Interferogram analysis for optical testing, Chapter 7 "Phase shifting interferometry").
  • both methods are the same: The unknown phase of the output wave to be analyzed is determined. Both methods are briefly explained below.
  • the reference phase CP R is modulated by impressing a carrier frequency fo, for example by obliquely irradiating the reference wave.
  • the reference phase CP R is given depending on the geometry by:
  • the resulting intensity distribution on a detector is then characterized by the appearance of a stripe pattern, so-called “fringes”.
  • Output shaft is the same at all points.
  • the maxima of the stripe pattern shift for any output wave due to the phase distribution of the output wave: the stripe pattern shifts transversely to the stripe direction.
  • the sought phase information about the output wave to be analyzed is encoded, which can be extracted, for example, by Fitten, Hilbert or Fourier transformation.
  • Corresponding algorithms are described in multiple versions in the literature. The algorithms according to Takeda, J. Opt. Soc. At the. 72 (1) (1982) (short: Fourier transformation of the intensity distribution, deletion of unnecessary frequency components, shifting the carrier frequency peak to the origin and reverse transformation) or S.
  • the reference phase While the reference phase, defined by the geometry dependence, varies spatially by itself in the carrier wave method, the reference phase must be actively varied in the phase-shifting method, i.e. slide.
  • phase delay of the reference wave can be achieved by many different methods.
  • Known in the literature is e.g. the introduction of a plane-parallel (delay) glass / plastic plate in the reference beam path, the introduction of an electro-optical phase delay element, e.g. a liquid crystal element, the displacement of a mirror in the reference beam path by means of a linear actuator, or the displacement of a diffractive grating perpendicular to the beam in the reference beam path.
  • the relative phase of the reference wave is set to several (at least 3) fixed values, and the resulting intensity distributions of the coherent superimpositions of the reference wave and the output wave are recorded.
  • a large number of algorithms three, four and five, etc. step methods, continuous methods) are known for the subsequent calculation of the unknown phase (cf. D. Malacara, Interferogram analysis for optical testing, Chapter 6 “Phase Detection Algorithms ").
  • the three-step algorithm with 120 ° phase difference between the steps is described here as an example:
  • phase-shifting method is the acquisition of at least three images per intensity distribution, which means a certain additional effort.
  • the advantage of this method is that, in contrast to the carrier wave method, the reference wave does not necessarily have to be irradiated at an angle in order to separate it in k-space.
  • step (iii) Using the accessible intensity distributions described in step (i) and the methods described in step (ii), measure the phase of the measuring field and stray field relative to an irradiated reference field can, in step (iii), one can infer the sought undisturbed measurement intensity IM.
  • a first evaluation method (iii a) images of the intensity distributions of IS + R and IM + S + R are taken and the phase difference of the output wave (of the stray field Es or the addition of stray field and measuring field ES + EM) to the reference wave is calculated accordingly one of the above procedures. Then you take a picture of the intensity distribution IR and calculate the amounts of the electric fields Es and ES + EM with knowledge of the respective phase difference from the above formulas for IS + R and I M + S + R. Since the electrical fields Es or the addition of stray field and measuring field ES + EM according to amount and phase are now known, these can be subtracted from each other in vector form and obtain the EM sought.
  • phase difference (CPR - cps) is calculated therefrom by using one of the methods for phase calculation described in step (ii).
  • phase-shifting methods several equations are obtained with the cos term containing the phase difference, from which the phase can be reconstructed.
  • the phase information sought is obtained from the deviations of the stripe pattern from the carrier frequency.
  • the scattering intensity Is can then be calculated as follows:
  • phase difference (CP R - CP M ) is calculated from this.
  • phase-shifting processes see above, several equations with cos term are obtained from which the phase can be reconstructed, and only one with the carrier wave process.
  • the measurement intensity IM is then calculated as follows:
  • ls the intensity of the reference wave IR SO should be set to correspond approximately to that of the stray light background ls.
  • phase stability and intensity of the reference wave are incorporated into the following embodiments of the invention, which primarily involve the generation of a reference wave. There are also other advantages and details of the present invention from the following description of various embodiments with reference to the figures.
  • Figures 1 - 4 a first embodiment according to the
  • Carrier wave method with a flat reference wave and a focusing biogrid
  • FIGS. 5-9 show a second embodiment according to a phase-shifting method, with a spherical
  • FIGS. 10-13 show a third embodiment according to a phase-shifting method, with an external reference wave and a focusing biogrid
  • FIGS. 14-16 show a fourth embodiment with a Bragg
  • Figure 17 shows a fifth embodiment with an external
  • Reference wave and a focusing biogrid which is imaged on the detector with optics.
  • Figures 1 to 4 show a first embodiment in the two side views XZ (Fig. 1) and YZ (Fig. 4) and in plan views for the components biochip and aperture plate (Fig. 2) and shutter (Fig. 3).
  • Light L of a coherent laser light source is coupled via a coupling grating EKG into a planar waveguide W of a biochip BC arranged on a substrate SUB.
  • Biochip BC here denotes the substrate SUB with the elements arranged on the front and back of the substrate SUB. Together with the other elements such as light source and detector as well as the movable screens and other elements, this results in a biosensor.
  • the wavelength of the coherent laser light source is preferably in the range from 400 nm to 1000 nm.
  • the coupling-in grating EKG is located on the underside of the planar waveguide W.
  • the light L coupled into the planar waveguide W propagates in the X direction (outside the waveguide W, this falls Light mode exponentially) and strikes a first reference grating RG.
  • This first reference grating RG is designed as a linear grating on the underside of the planar waveguide W and is preferably produced by the same process steps that also generate the coupling-in grating EKG.
  • the decoupled first reference light bundle RL is collimated by the linear grating shape of the reference grating RG. It arrives at a detector D with several individual detectors, which is preferably designed as a CMOS or CCD image sensor. Only a small part of the light L propagating in the planar waveguide W is coupled out through the first reference grating RG. The majority continue to propagate to a first BG biogrid.
  • the first biogrid BG consists of the first capture molecules that are lattice-shaped, i.e. how the bars of a grid are connected to the surface of the BC biochip. These first capture molecules specifically bind first analyte molecules, which are thus also lattice-like and whose mass occupancy is to be measured.
  • the grating shape of the biogrid BG is selected - as described in WO 2015004264 A1 cited above - in such a way that the decoupled first measuring light bundle ML is focused on the detector D on a small focal area.
  • the grating shape thus represents a diffractive lens with the focal length f.
  • the first reference grating RG and the first biogrid BG are selected such that the first reference light bundle RL and the first measuring light bundle ML are superimposed at the location of the detector D.
  • This coherent superimposition results in a first intensity stripe system, which is detected by the detector D and evaluated in an evaluation unit (not shown).
  • the superposition of the two light beams RL, ML at the location of the detector D can be achieved, for example, by choosing the coupling-out angle of the first reference grating RG, which is given by the grating orientation and by the grating constant of the first reference grating RG.
  • the first biogrid BG also only couples out a very small proportion of the light L propagating in the planar waveguide W. The majority continue to propagate to a second reference grid RG and a subsequent second biogrid BG.
  • the second reference grating RG is identical to the first reference grating RG, likewise in the form of a linear grating, and decouples a second reference light bundle RL, which arrives at the detector D offset from the first reference light bundle.
  • the second biogrid BG consists of second capture molecules, which in turn are attached in a lattice shape. The lattice shape is identical to the lattice shape of the first biogrid BG and thus also represents a diffractive lens.
  • the second catcher molecules differ from the first catcher molecules of the first biogrid BG and thus bind other specific analyte molecules whose mass assignment is also to be measured.
  • the second reference and the second measurement light bundle RL, ML are again superimposed at the location of the detector D, where they strike the first reference and measurement light bundle so that they can be detected independently.
  • a second intensity stripe system is created, that is detected by the detector D and evaluated in the evaluation unit, not shown.
  • biochip BC in addition to the first and second reference and biogrid RG, BG, further reference and biogrid RG, BG are arranged in order to be able to detect further analyte molecules. With a single biochip BC from this exemplary embodiment, four different analyte molecules can therefore be examined.
  • a diaphragm plate BP is introduced in the beam path between the biochip BC and the detector D. It has openings OR, OM for the multiple reference and measurement light bundles RL, ML and blocks stray light which arises outside of these light bundles RL, ML.
  • the openings OR, OM are therefore chosen to be as small as possible in order to achieve high suppression of stray light, but sufficiently large so that the reference and measurement light bundles RL, ML are not appreciably impaired.
  • the aperture plate BP can be designed as a thin metal plate with openings OR, OM.
  • an absorbent layer can also be applied to a glass plate and provided with openings OR, OM accordingly. This second alternative has the advantage that this glass plate can at the same time be a cover plate of an optical module, which protects the detector D and other optical components from contamination which can arise when the biochip is inserted or removed.
  • the evaluation unit evaluates the intensity stripe systems on the focus areas of the measuring light bundles ML.
  • Intermediate individual detectors or pixels of the image sensor are not used for the evaluation, since they only detect scattered light that arises outside the measurement mode and is not relevant for the evaluation.
  • This selection of pixels only in the area of the focus areas corresponds to a virtual diaphragm structure at the location of the detector D.
  • OM of the diaphragm plate BP a diaphragm system is created which only allows light to pass through, with respect to location and Direction of the measuring mode corresponds. All other modes that differ from the measuring mode in terms of the location and / or direction of light are blocked. This results in the desired mode filter.
  • the determination of the scattered measurement intensity I M of the biogrid BG requires a series of measurements in which either only the reference light bundle RL or the measurement light bundle ML or both are detected together. It is therefore necessary to insert a shutter S in the beam path from the biochip BC to the detector D.
  • This shutter S has openings or transparent areas SO through which the reference and / or measuring light bundles RL, ML are transmitted.
  • beam-blocking regions SB can be pushed into the beam path of the reference light bundle RL or into the beam path of the measurement light bundle RB, so that a measurement of the intensity values IM + S + R, IM + S, and IR is enabled.
  • the intensity values IS + R and ls are measured before the analyte molecules are attached.
  • a partition T thus separates the area of the beam coupling from the area of the beam detection.
  • a beam trap F also absorbs the light transmitted through the coupling-in grating EKG. Both reduce the stray light.
  • Figures 5 to 9 show a second embodiment of the invention in the two side views XZ (Fig. 5) and YZ (Fig. 9) as well as in plan views for the components biochip (Fig. 6), aperture plate (Fig. 7) and the combined Shutter / delay plate carrier (Fig. 8).
  • the reference grids RG are now (in the z direction) below the associated biogrid BG and each couple a small proportion of the light in the planar waveguide W as a reference RL light bundle in the form of spherical waves.
  • the reference grids RG are designed as chirped gratings with curved grating lines and act as diffractive diverging lenses.
  • the Biogitter BG are linear grids with a constant grating period and couple collimated measuring light bundles ML out of the waveguide W.
  • the coupling takes place at an angle a + 90 °.
  • the reference grids RG are delimited in a circle and are each surrounded by circular rings with biogrids BG.
  • the emerging reference light bundles RL are thus each enclosed by associated measuring light bundles ML.
  • the decoupled measuring and reference light bundles ML, RL pass through a fixed diaphragm plate BP (FIG. 7) and subsequently meet a combined diaphragm and phase delay plate BPV that can be displaced in the x and y directions (FIG. 8).
  • aperture elements B1, B2 are provided on the combined aperture and phase delay plate BPV, which can block either the reference or the measurement light bundles RL, ML.
  • phase delay elements V1, V2, V3 which can be inserted into the beam path of the reference light bundle RL and which delay the phases of the reference light bundle RL by 60 °, 180 ° or 300 °.
  • All aperture and phase delay elements B1, B2, V1, V2, V3 are arranged in the grid of the measurement and reference light bundles RL, ML, so that the optical effect is always the same for all reference light bundles RL and also for all measurement light bundles ML.
  • the aperture structures B1, B2 and a corresponding x and y shift of the combined aperture and delay plate make it possible to determine the intensity values IR and IM + S + R, IM + S (after adding the analyte) or IS + R and ls (before adding the analyte).
  • phase delay elements V1, V2, V3 When inserting the phase delay elements V1, V2, V3 into the reference Light bundles RL can also delay the phase of the reference light bundles and thus determine the phases of the corresponding interference terms in accordance with the phase shifting method.
  • the phase delay elements V1, V2, V3 consist of a transparent, optically denser material such as the surrounding medium air, for example glass or a transparent polymer of suitable thickness, in order to obtain the desired phase delay.
  • the reference and the measurement light bundles RL, ML hit a lens array plate.
  • Collective lenses SL are arranged on this in the grid of the measuring light bundles RL, ML. They each focus the measuring light bundles ML on the detector D located underneath.
  • the distance between converging lenses SL or lens array plate and detector D is therefore chosen to be equal to the focal length of the converging lenses SL.
  • the reference light bundles RL are also concentrated on the detector D by the converging lenses SL of the lens array plate. However, the detector D is not in relation to the reference light bundle RL
  • Biogitter BG as a linear lattice structure is much easier than for a diffractive lens structure.
  • a diffractive lens structure shows a continuous variation of the local one
  • the measurement light bundles ML have disturbing fluctuations in intensity across their cross sections, which lead to a larger focus area on the detector D and thus to greater measurement noise. These disadvantages do not occur when producing biogrids BG with linear lattice structures.
  • the lithography can be optimized for this one grating constant, for example by choosing an optimal exposure divergence, an optimal exposure distance or the choice of an optimal exposure wavelength. If there are unavoidable fluctuations in the exposure intensity, there are corresponding fluctuations in the web-gap ratio of the biogrid BG, but these are constant over their transverse extent. The diffraction efficiency or the intensity of the measurement light bundle ML thus also remains constant over the transverse extent, so that the measurement light bundle ML can be focused on the detector D with limited diffraction. This in turn results in low measurement noise.
  • the fixed lattice constant of BG biogrids with a linear lattice structure enables the optimization of the bridge-gap ratio for this lattice constant. This leads to increased decoupling efficiency and thus increased intensity of the measuring light bundle ML.
  • the decoupling in this embodiment should be slightly oblique to the normal of the biochip BC in order to suppress multiple reflections and back reflections on optical elements and in the planar waveguide W.
  • this angle can again be aligned perpendicular to the detector D if necessary.
  • the zone without grating lines described in the prior art EP 2618130 A1
  • EP 2618130 A1 which are provided within the focusing grating to avoid back reflection in the waveguide
  • biogrid BG as a linear grating structure
  • the constant polarization of the collimated measuring light bundle ML in contrast to a polarization which varies over the transverse extent in the case of a diffractive grating structure.
  • biogrids BG with linear grating structures requires - as described above - subsequent focusing of the measurement light bundles and is therefore associated with the use of at least one converging lens SL or a lens array plate (for several biogrids BG on a biochip BC).
  • the positional tolerances of the converging lenses SL with respect to one another are sufficiently small only in the case of a lens array plate.
  • the adjustment of individual lenses that have to be arranged in a very narrow grid is far too complex.
  • the converging lenses SL of the lens array plate can be designed both refractive and diffractive.
  • the diffractive variant can be produced as a single-stage, binary structure or advantageously in several stages as a blazed structure. Since the position between detector D and converging lenses SL or lens array plate is fixed, the position of the focal areas on detector D does not change when the biochip BC is displaced relative to the scanning optics, which simplifies the evaluation. Such shifts in all three spatial directions can occur when the biochip is inserted into one Readout unit or occur due to thermal drift processes. Only rotation of the biochip BC around the x or y axis would shift the focus areas. The Biochip BC must therefore be aligned with stops close to the edges of the Biochip BC. A rotation around the z-axis is only of minor influence due to the slight deviation of the coupling angle a from 90 ° and can also be easily controlled by stops.
  • the reference light bundles RL in the form of spherical waves used in this embodiment are advantageous since the transverse extent of the reference light bundles RL on the detector D can be selected by the focal length of the reference grids RG in the form of diffractive diverging lenses. It can thus be designed in such a way that a uniform intensity of the reference light bundle RL is produced on the detector D over the focus areas of the measuring light bundle ML.
  • the phase-shifting method used here only requires light beams with low beam inclinations, ie with a low numerical aperture.
  • the measuring accuracy is increased accordingly.
  • the measuring and the associated reference beams ML, RL are coupled out at very adjacent locations from the biochip BC.
  • the temperature influence on the phase shift between the measurement and reference light bundles ML, RL, which arises from changes in the refractive index in the planar waveguide W, is accordingly correspondingly low.
  • the computational outlay in the evaluation unit is less than in the carrier wave method, since no stripe patterns have to be evaluated for the phase determination, but only simple arithmetic calculations and arctangent formation are necessary.
  • Figures 10 to 13 show a third embodiment in the side views XZ (Fig. 10) and in plan views for the components biochip waveguide (Fig. 1 1), top of the diaphragm plate with reference grating waveguide (Fig. 12) and bottom of the diaphragm plate (Fig. 13). Only the differences from the first embodiment are described below.
  • the biogrids BG are again designed as diffractive lenses and focus the measuring light bundles ML again on the detector D.
  • the reference light bundles R pass through an aperture plate BP.
  • the aperture plate BP has a substrate SUB ', a coupling grating EKG and a separate planar waveguide W'.
  • Part of the light L of the coherent laser light source (not shown) is phase-shifted via an electro-optical phase delay element PVE in the form of a liquid crystal element or an electro-optical modulator and coupled into the planar waveguide W 'of the aperture plate BP via the coupling-in grating EKG.
  • the light propagates there in the + x direction to reference grids RG, which couple out reference light bundles RL.
  • the reference grids RG are designed as linear grids, so that the reference light beams are collimated.
  • the grating constant of the reference grating is selected such that the reference light bundles RL couple out slightly obliquely (a F 90) to the normal direction of the biochip BC in order to avoid back reflections in the waveguide W '. This takes place in analogy to the Bragg zones described in EP 2618130 A1, in which grating lines are left out in the respective biogrids in order to avoid reflections in the planar waveguide according to the Bragg condition.
  • the reference grids RG are positioned relative to the biogrids BG in such a way that the reference light bundles RL each overlap with the associated measurement light bundles ML at the location of the detector D and interfere therewith.
  • phase shift of the reference light bundle RL by the electro-optical phase delay element PVE allows the relative phase to be shifted between the measuring and reference light bundles ML, MR and thus the determination of the relative phase in an evaluation unit, not shown, according to the phase shifting method described above.
  • a shutter S movable in the x direction allows the measurement or reference light bundles ML, RL to be blocked before the light L hits the respective coupling grating EKG.
  • the biochip BC also carries a referencing grid, also referred to as a phase drift reference grid PDBG.
  • a referencing grid also referred to as a phase drift reference grid PDBG.
  • a small part of the light L propagating in the planar waveguide W of the biochip is coupled out through this first referencing grating PDBG and generates a first referencing light bundle RZL.
  • the referencing grating PDBG is designed as a linear grating, so that the first referencing light bundle RZL1 emerges collimated. It is subsequently detected by detector D.
  • the aperture plate BP carries a further reference grating RG, which is arranged under the first referencing grating PDBG on the biochip BC and is likewise designed as a linear grating.
  • a small part of the light L propagating in the planar waveguide W of the diaphragm plate BP is coupled out, so that a collimated, second referencing light bundle RZL2 is produced.
  • the first and the second referencing light bundles RZL1, RZL2 overlap and interfere at the location of the detector D.
  • the second referencing light bundle RZL2 can be phase shifted by the electro-optical phase delay element PVE and also allows the determination of the relative phase of the first and second referencing light bundles RZL1, RZL2.
  • This relative phase depends on the relative position of the biochip BC and the aperture plate BP.
  • the relative position also influences the relative phases between the measuring and the associated reference light bundles ML, RL.
  • the part of the relative phases of measurement and associated reference light bundles ML, RL can be determined and subtracted which depends on the relative position of the biochip BC and the aperture plate BP.
  • a drift of the relative position of the biochip BC relative to the aperture plate BP during the measurement period can thus be compensated for.
  • there is a sensitive direction for the relative position which determines the relative phases of measurement and associated reference light bundles ML, RL.
  • the condition for an identical coupling direction for the measuring light bundles ML, the reference light bundles and the first and second referencing light bundles RZL1, RZL2 results. This is possible through a suitable grating constant and grating orientation of the reference grating RG and referencing grating PDBG.
  • the particular advantage of this embodiment is that the reference grating RG only has to be structured in a waveguide W permanently installed in the detection apparatus and does not have to be present in every biochip waveguide W. Calibration is also simplified. Also, no moving parts are required for the phase shift of the reference light bundle RL.
  • the shutter S is arranged in front of the coupling grating EKG, so that less stray light is produced when one of the two light beams is blocked.
  • FIGS. 14 to 16 show a fourth embodiment in the side view XZ (FIG. 14) and in plan views for the components biochip (FIG. 15), as well as the aperture plate and the combined shutter / delay plate carrier (FIG. 16).
  • This embodiment is based on an arrangement described in EP2929326B1.
  • the biogrids BG now only deflect the light L in the planar waveguide W, but do not couple it out of the planar waveguide W.
  • the BG biogrids are designed as linear grids.
  • the coupling out of the waveguide W takes place by means of additional coupling-out gratings AG.
  • the light L first passes through electro-optical phase delay elements PVE (for the portion of the light that is later directed onto the reference grating RG) and a shutter S in order to be able to separate the light portions on the bio and reference grids BG, RG separately ,
  • the light is coupled in analogously to the first embodiment via an EKG coupling grid.
  • the light L propagating in the x direction then strikes a first linear, two-part biogrid BG, in the middle of which a first reference grid RG is executed.
  • the grating lines of both grids BG, RG are equidistant and oblique to the direction of propagation of the light L, and meet the Bragg condition for deflecting the light in the waveguide in the direction of the coupling-out grating AG.
  • the distance between the grating lines d is thus linked via the angle Q of the light L to the grating lines with the wavelength of the light in the waveguide l.
  • the diffraction order n is usually 1 in order not to generate any additional, disturbing diffraction orders and to increase the diffraction efficiency.
  • the small portion of the total light L deflected by the biogrid BG and the reference grating RG strikes a focusing decoupling grating AG on the underside of the waveguide W, which directs both portions onto the detector D and superimposes them there.
  • the reference grating RG can be made slightly curved in order to ensure a small divergence of this reference light bundle RL.
  • a continuous variation of the coupling angle on the coupling grid EKG in the y direction via a suitable actuator is also useful in order to meet the Bragg condition of the biogrid BG and thus optimize the measurement intensity.
  • the light fraction remaining in the waveguide W is redirected and coupled out at another location in the next bio and reference grating BG, RG.
  • a particle spacer M with a suitable pore size is provided. This measure can also be useful in connection with all other embodiments.
  • the aim is to keep unwanted scattering particles SP (eg cells) away from the waveguide W by filtration.
  • the particle spacer M is provided outside the evanescent field of the waveguide W, and the pore size is selected so that it can be passed by the biomolecules or analytes A to be analyzed, while undesired larger particles SP are retained in the liquid supernatant.
  • the particle spacer M can be in the form of a membrane, or as a molecular layer or more porous Cover layer in the vicinity of the waveguide W or brought to the waveguide W.
  • the particle spacer M prevents larger particles such as tumor cells (typical diameter 10-30 pm) from changing the scattered light background when they reach the evanescent field on or near the waveguide W.
  • the advantage of this embodiment with particle spacer M is that it is ensured that the scattered light background can be measured with and without a measuring wave under identical conditions, without this being changed by larger particles or cells introduced with the analyte medium.
  • Figure 17 shows the fifth embodiment in the XZ side view. Above all, the differences from the first embodiment are explained.
  • Light L of a coherent laser light source LQ is split into two parts with the aid of a first beam splitter ST1, which are used below to generate the measuring light bundles ML (first part) and the external reference light bundle RL (second part) separately.
  • a first portion of the light split at the beam splitter ST1 is coupled via a coupling grating EKG into a planar waveguide W of a biochip BC arranged on a substrate SUB.
  • the biogrids BG are again designed as diffractive lenses with focal length f and focus the measuring light bundles ML on a focal plane BE which is at a distance f from the waveguide W.
  • the shutter S1 which can be moved in the x direction, allows the measuring light bundles ML to be blocked even before light hits the coupling grid EKG.
  • the focal plane BE is imaged with the aid of two objectives 01, 02 with focal lengths fo bj .i and fo bj, 2 on a detector D, which is located at a distance 2fob j, i + 2fobj , 2 from the focal plane BE.
  • a detector D which is located at a distance 2fob j, i + 2fobj , 2 from the focal plane BE.
  • this results in a 4f image with magnification M -1.
  • the optical imaging of the focal plane BE used in this embodiment on the detector D is particularly advantageous, since at a distance 2fobj , i from the focal plane BE or at a distance 2fo bj, 2 V from the detector D there is a Fourier plane into which a Fourier diaphragm FB is introduced with a suitable opening OF, so that k-space filtering (ie angular filtering) is realized.
  • the numerical aperture of the detection optics can be adapted in such a way that undesired scattered light, which is emitted in modes other than the measurement mode, is blocked. This thus results in a desired mode filter.
  • the Fourier diaphragm FB is designed to be displaceable in the X and Y directions, so that tilting of the measuring light bundle ML coupled out of the biochip BC can be compensated for about the R x and Ry axes.
  • a second portion of the light L split at the beam splitter ST1 is collimated with the aid of suitable second beam shaping optics SF02 and used as an external reference light bundle RL.
  • a second shutter S2 movable in the z direction allows the reference light bundle RL to be blocked.
  • the reference light bundle RL is directed onto the detector D with the aid of a second beam splitter ST2 (or another deflection element which serves to deflect and combine the beams) and overlapped with the measuring light bundle ML, so that both interfere at the location of the detector D.
  • the angle R y of the second beam splitter ST2 must be selected such that the incident reference light RL is irradiated at an angle greater than the numerical aperture of the measuring light and scattered light component in the measuring mode.
  • the second beam splitter ST2 can be designed to be adjustable by R y , so that when the angle of the measuring light bundle ML and scattered light drifts, the angle of the To be able to track the reference light beam RL accordingly. If no mechanical tracking is provided, the period of the intensity stripe system, which is caused by the interference of measurement light bundle ML and reference light bundle RL, should be estimated and the measured phases should be corrected for the associated slope error.
  • the phase measurement can also be carried out using the phase-shifting method.
  • the angle R y of the second beam splitter ST2 is again freely selectable and does not necessarily have to be adjustable.
  • a phase delay element In order to delay the phase of the reference light bundle RL by 60 °, 180 ° or 300 °, a phase delay element must then be introduced into the beam path of the reference light bundle RL at a suitable point.
  • the second portion of the light split at the first beam splitter ST1 can also be used to illuminate a small opening which, in addition to the first opening OF, is offset in the Xier direction from the optical axis in the Fourier diaphragm FB located.
  • This small illuminated opening acts like a point light source in the Fourier plane from the second objective 02, so that a plane reference light beam directed towards the detector D is created, which is overlapped with the measuring light beam ML and thus brought into interference at the location of the detector D.
  • the distance between this small second opening and the optical axis determines the angle R y by which the reference light bundle RL is irradiated against the measuring light bundle ML and the scattered light is irradiated onto the detector D, and can in turn be selected to be adjustable at one Drifting the angle of measuring light bundle ML and scattered light to be able to track the angle of the reference light bundle RL accordingly.
  • the light path from the first beam splitter ST1 to the Fourier diaphragm FB can also be bridged by guiding the light in an optical fiber.
  • the reference light bundle RL is not coupled out by a plurality of reference gratings RG, but by a first beam splitter ST1.
  • Only one reference light bundle RL is generated and used to measure all measuring light bundles ML.
  • This embodiment is particularly advantageous since no space for reference grids RG has to be provided on the surface of the biochip BC, so that the biogrid BG - in contrast to the first and fourth embodiments - is arranged more densely or - in contrast to the second and third embodiments - is used over the entire surface can be. It is also advantageous that the complex structuring of reference gratings RG is dispensed with, and only beam splitters ST1, ST2 are required which are permanently installed in the detection apparatus.
  • a disadvantage of this embodiment is first of all that the optical paths of the reference light bundle RL and measurement light bundle ML do not match.
  • a so-called “common path” geometry is usually chosen, in which the optical paths of the reference light bundle RL and measurement light bundle ML largely correspond, i.e. the same optical elements pass (as in the first, second and fourth embodiment, with restrictions also in the third embodiment).
  • mechanical or thermal drift processes have the same effect on both light beams RL, ML, so that the relative phase remains constant.
  • the solution described in this fifth embodiment represents a so-called “double-path” geometry, which is inherently susceptible to such drift processes.
  • the phase distribution cps of the resulting speckle background is constant in time and space, and can be used as an intrinsic phase standard to drift to measure and compensate for the relative phase between the reference light bundle RL and the measuring light bundle ML.
  • a common phase offset of the speckle background which can occur, for example, due to a drift of the biochip relative to the light source and / or relative to the detector, is here assigned to a phase shift of the reference wave, which would have the same effect.
  • the intensity distributions IS + R, IS and IR are recorded at a first point in time ti - the relative phase position between the stray field and the irradiated reference field is cps-cpR.
  • the intensity distribution IS + R ' is measured again - the relative phase position between the stray field and the irradiated reference field is now (PS- (PR'.
  • PS- PR'.
  • the pixel drift ⁇ cp R between the reference light bundle RL and scattered light can then be estimated using a wavefront model that contains the corresponding degrees of freedom for different drift processes (phase shift, phase tilt etc.), so that an overall phase drift ⁇ cp R is obtained and compensated accordingly can - usually by subtraction.
  • the time t 2 at which the phase drift between the reference light bundle RL and the measurement light bundle ML is to be determined is after the time of adding the analyte.
  • the intensity distribution IS + R ' is no longer accessible.
  • M + S + R I S + R '.
  • the unchanged speckle background outside the focus area can thus continue to be used as an intrinsic phase standard and the corresponding evaluation of the phase drift ⁇ cp R is carried out analogously according to the above formula.
  • a lateral shift of the biochip between the measurements can also be determined by correlating the speckle background.
  • the intensity distribution of the speckle background is used for this correlation.
  • the lateral shift can easily be corrected by a software shift of the pixel assignments.
  • the advantage of this method is that the speckle background can be used as an intrinsic phase standard over the entire detector area, and therefore no additional reference grids are required.
  • coupling-in gratings EKG and / or reference gratings RG can be designed not only on the underside of the waveguide W but also on the top of the waveguide W.
  • the excitation can also be carried out by a light beam totally reflected at the interface of the biochip BC.
  • the biogrid BG and reference grid RG are located at this interface.
  • the evanescent electrical field of the totally reflected light then interacts completely analogously to the variant with excitation via the waveguide with the respective gratings.
  • a flat single detector per detection location and an aperture with the diameter of the measuring field, ie the diameter of the measuring mode, can be used as detector D.
  • a diffraction grating that can be displaced perpendicular to the beam is also known as a phase shifter, since in its diffraction orders the phase varies depending on the position of the webs and gaps relative to the beam.
  • a mirror moved, for example, by a piezo actuator can vary the beam path of the reference beam in order to vary the phase.
  • the reference wave is polarized, for example, by means of a suitably oriented 1 ⁇ 2 plate inserted into the reference beam perpendicular to the Measuring wave, you can use a rotatable polarization filter in front of the detector to select which beam components you want to observe. Only the respective wave is then measured parallel to the polarization of the reference or measuring wave; with a setting between 0 ° and 90 ° relative to the polarization of the reference wave, the relative strength of the two partial waves can be set so that optimal interference contrast (see above) ), and bring them to interference on the detector.
  • separators can be inserted between the individual detection locations in all variants to prevent crosstalk.
  • the detector resolution and the focus diameter of the biogrid BG should be chosen so that the focus diameter is in the range of 5-50 pixels.
  • the detector resolution and the stripe spacing in the carrier wave method should be selected so that the stripe spacing is in the range of 5-50 pixels.
  • the reference grids RG can be applied offset in the x direction both before (as shown in the first exemplary embodiment) and after the biogrid BG in the carrier wave method.
  • An arrangement with an offset in the y direction or combinations thereof are also possible.
  • the advantage of an offset only in the y direction to the biogrid BG is that the optical path length in the waveguide W for the reference and biogrid RG, BG is identical, which minimizes drift in the phase between the reference and the biogrid.
  • the phase drift can also be compensated for by calculating the phase difference with one of the two reference grids Biogrid is calculated. The phase drift of the two reference gratings behaves in opposite directions and can thus be corrected.
  • a reference grid RG (e.g. by superimposing two grid structures that are rotated relative to one another or generating a strongly divergent wave) can also generate reference waves for several surrounding biogrid BG.
  • the aperture structure below selects the appropriate partial wave for the respective biogrid BG from the generated reference waves.
  • movable shutter can also electronically switchable elements such as LCDs to block or release
  • Beams of light can be used.

Abstract

Es wird diffraktiver Biosensor zum selektiven Nachweis von Biomolekülen, mit einem Substrat (S) und einem auf dem Substrat (S) angeordneten optischen Biogitter (BG) offenbart, wobei das Biogitter (BG) periodisch angeordnete Rezeptoren für die Biomoleküle aufweist, und wobei die Effizienz einer Beugung von einfallendem Licht (L) und damit die Intensität eines in einem Detektor (D) eintreffenden Mess-Lichtbündels (ML) von einer Massenbelegung des Biogitters (BG) mit den nachzuweisenden Biomolekülen abhängt. Der Biosensor weist eine Einrichtung (RG, ST1) zur Erzeugung eines auf den Detektor (D) gerichteten Referenz-Lichtbündels (RL) auf, mit dem die Phasenlage von im Detektor (D) eintreffendem Streulicht bestimmbar ist.

Description

BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG
Diffraktiver Biosensor
GEBIET DER TECHNIK
Die vorliegende Erfindung betrifft einen diffraktiven Biosensor. Solche Sensoren basieren auf der Adsorption zu detektierender Biomoleküle auf einem diffraktiven Gitter zum Beugen von Licht. Das Signal eines Fotodetektors für das gebeugte Licht dient als Maß für die Massenbelegung des Biosensors mit den Biomolekülen.
STAND DER TECHNIK
Aus der Optik sind auf einem Substrat angeordnete planare Wellenleiter bekannt, die ein optisches Gitter zum Ein- oder Auskoppeln von Licht aufweisen. Bei so einem optischen Gitter handelt es sich zum Beispiel um in das Substrat oder in den Wellenleiter geätzte Strukturen, die somit aus dem Material des Substrats bzw. des Wellenleiters bestehen. Die benötigte Gitterperiode hängt von der Wellenlänge des verwendeten Lichtes und vom Brechungsindex des Wellenleiters ab. Die Gitterperiode liegt abhängig vom Kopplungswinkel im Bereich der effektiven Wellenlänge des Lichtes im Wellenleiter. Typischerweise beträgt sie etwa die halbe Vakuumwellenlänge des Lichtes.
Im Bereich der Biosensoren sind auch Gitter zum Ein- und Auskoppeln von Licht bekannt, die aus biologischer Materie bestehen und als Rezeptor für die zu untersuchenden Biomoleküle wirken. Lagern sich solche Biomoleküle an den zum Gitter strukturierten Rezeptoren an, formen die Biomoleküle ein optisch wirksames Gitter. Solche zum Gitter strukturierten Rezeptoren mit oder ohne adsorbierten Biomolekülen werden im Folgenden als Biogitter bezeichnet. Da die Beugungseffizienz so eines Biogitters von der Massenbelegung des Gitters mit den Biomolekülen abhängt, kann anhand der mittels eines Detektors gemessenen Intensität des gebeugten Lichtes eine quantitative Aussage über die Massenbelegung getroffen werden.
Aus der W02015004264A1 ist ein diffraktiver Biosensor bekannt, bei dem divergentes Licht durch ein Substrat auf ein optisches Gitter zum Einkoppeln von Licht in einen Wellenleiter fällt. Das im Wellenleiter propagierende Licht trifft dann auf ein Biogitter, das als Auskoppelgitter wirkt. Das ausgekoppelte Licht wird durch das Substrat hindurch auf einen Detektor fokussiert. Die im Detektor gemessene Lichtintensität ist ein Maß für die Belegung des Auskoppelgitters mit dem zu untersuchenden Biomolekül. Die Verwendung von zwei Biogittern bedeutet allerdings ein sehr geringes Signal durch die zweifache schwache Kopplung. Da das gewünschte Messlicht zudem durch unerwünschtes Streulicht überlagert ist, das zudem noch in einer festen Phasenbeziehung zum Messlicht steht und mit diesem interferieren kann, erhält man keine optimalen Messsignale. Auch in der US7008794B2 wird ein diffraktiver Biosensor beschrieben. Hier wird vorgeschlagen, ein Hintergrund-Beugungsmuster vom Messsignal abzuziehen, um das eigentlich gewünschte Signal hervorzuheben. Allerdings wird auch hier die feste Phasenbeziehung des Streulichts zum Messlicht vernachlässigt. Weitere Biosensoren beschreiben auch die EP2618130A1 , die EP2757374A1 und die EP2929326B1.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es ist daher Aufgabe der Erfindung, einen diffraktiven Biosensor und ein Verfahren zu dessen Anwendung anzugeben, mit dem trotz der vergleichsweise geringen Beugungseffizienten der Biogitter und störendem Streulicht eine Erhöhung der Messgenauigkeit durch eine Reduzierung des Einflusses von Streulicht erreicht wird.
Diese Aufgabe wird gelöst durch eine Vorrichtung gemäß Anspruch 1. Vorteilhafte Details ergeben sich auch aus den abhängigen Ansprüchen.
Es wird ein diffraktiver Biosensor zum selektiven Nachweis von Biomolekülen offenbart, mit einem Substrat und einem auf dem Substrat angeordneten optischen Biogitter, wobei das Biogitter periodisch angeordnete Rezeptoren für die Biomoleküle aufweist, und wobei die Effizienz einer Beugung von einfallendem Licht und damit die Intensität eines in einem Detektor eintreffenden Mess-Lichtbündels von einer Massenbelegung des Biogitters mit den nachzuweisenden Biomolekülen abhängt. Der Biosensor weist eine Einrichtung zur Erzeugung eines auf den Detektor gerichteten Referenz-Lichtbündels auf, mit dem die Phasenlage von im Detektor eintreffendem Streulicht relativ zum Mess-Lichtbündel bestimmbar ist.
Kennt man diese Phasenlage, lässt sich der negative Effekt des Streulichts im Messsignal eliminieren.
Bei der Beleuchtung von streuenden Oberflächen mit kohärentem Licht tritt sogenanntes Speckle auf. Dabei handelt es sich um Streulicht, das mit zufälliger Phasenlage mit sich selbst interferiert und so eine zufällige Phasen- und Amplitudenverteilung erzeugt. Dieses Phänomen tritt auch bei diffraktiven Biosensoren (z.B. wie im oben zitierten Stand der Technik) auf, und beeinträchtigt die Messgenauigkeit. Das diffraktometrische Messfeld wird kohärent von einem Streufeld überlagert und durch dieses verfälscht. Die beiden elektrischen Felder überlagern sich kohärent gemäß:
Figure imgf000006_0001
Dabei sind EM bzw. Es die elektrischen Feldstärken von Messfeld bzw. Streufeld, IM=EM2 bzw. ls=Es2 die zugehörigen Intensitäten (im Folgenden auch kurz als Mess-Intensität und Streu-Intensität bezeichnet), yM bzw. cps die jeweiligen Phasen und IM+S die zugehörige Gesamtintensität in der Detektionsebene. Die Formeln gelten dabei z.B. je Pixel eines flächigen Detektors, die Ortsabhängigkeit auf der Detektorfläche ist implizit enthalten. Wenn die relative Phasenlage A(PMS=(PM-(PS zeitlich konstant ist, mittelt sich der Interferenzterm 2EMES cos(cpM-cps) auch bei langen Integrationszeiten nicht zu Null. Dann kann das Streufeld nur korrigiert werden, wenn der Phasenunterschied ACPMS bekannt ist. Die vorliegende Erfindung sieht deshalb eine Vorrichtung und ein zugehöriges Verfahren zur Messung dieses Phasenunterschieds vor, um das Streufeld korrekt abziehen zu können, und so auf das ungestörte Messfeld EM bzw. dessen Intensität IM schließen zu können.
Streulicht wird aber im Hinblick auf diffraktive Biosensoren bisher entweder gar nicht, oder nur unvollständig berücksichtigt. In der Regel wird vorgeschlagen, die Intensität des Streufeldes ls getrennt von der Intensität des Messfeldes IM ZU bestimmen und einfach dessen Mittelwert abzuziehen um das Messfeld zu bereinigen. Dieser Ansatz ist aber nur korrekt, wenn sich die Phasenlage des Streulichts zeitlich zufällig verändert und sich der Interferenzterm somit wegmittelt, oder näherungsweise korrekt, wenn gilt, dass die Intensität des Messfelds wesentlich größer ist als die Intensität des Streufelds. Für eine feste Streulichtphase und Mess-Intensitäten in der Nähe des Detektionslimits eines Sensors, liefert dieser vereinfachte Ansatz dagegen eine unzulängliche Genauigkeit. Ungewollte Streuzentren (d.h. Störungen aller Art wie z.B. Oberflächenrauheit, Verschmutzungen der Oberfläche, Korngrenzen im Wellenleiter, nichtspezifisch angelagerte Partikel/Biomoleküle, usw.) streuen ebenso wie das Biogitter Licht. Da die ungewollten Streuzentren aber nicht strukturiert, sondern zufällig angeordnet sind, wird das Streulicht in einen weiten Raumwinkel abgestrahlt und nicht spezifisch in Richtung des Detektionsortes. Dies ist der Grund, warum diffraktive Biogitter äußerst robust gegen nicht-spezifische Anlagerungen sind.
Es ist aber zu beachten, dass die ungewollten Streuzentren - vor allem im Fall von Streuung an Substratrauheit - zwar unstrukturiert, aber dennoch ortsfest angeordnet sind. Damit ist die Phasenlage des resultierenden Streufeldes Es zwar zufällig, aber dennoch zeitlich konstant. Nur ein sehr kleiner, aber nicht zu vernachlässigender Teil des Streufeldes wird in Richtung des Detektionsortes abgestrahlt. Eine optimale Auslegung der Detektionsoptik lässt nur diejenige Lichtmode (im Folgenden Messmode genannt) auf den Detektor gelangen, die das diffraktive Biogitter der zu detektierenden Biomoleküle erzeugt und sperrt alle anderen Moden durch geeignete Blenden und Aperturen. Damit wird das Streulicht in diesen anderen Moden unterdrückt und gelangt nicht auf den Detektor. Das Streulicht, das in die Messmode abgestrahlt wird, kann allerdings prinzipbedingt nicht unterdrückt werden. Es trägt mit einer Feldstärke Es und Phase cps zur detektierten Gesamt-Intensität IM+S bei. Der resultierende Interferenzterm 2EMESCOS((PM-(PS) kann nicht weggemittelt werden. Wenn die Mess-Intensität IM durch eine einfaches Abziehen der Streu-Intensität ls von der Gesamtintensität IM+S ermittelt wird (d.h. IM~IM+S-IS), ist sie mit einem Fehler der Größe 2EMES cos(cpM-cps) behaftet, der insbesondere für EM=ES die Messgenauigkeit limitiert.
Streulicht in der Messmode, das von nicht ortsfest angeordneten, also fluktuierenden Streuzentren erzeugt wird, kann über zeitliches Mitteln der detektierten Intensität unterdrückt werden, da der Erwartungswert des Interferenzterms Null ist. Ungewünschtes Streulicht, welches in einem Prozess erzeugt wird, der sich in irgendeinem Parameter (z.B. Ort, Wellenlänge, Polarisation etc.) von der Erzeugung des Messlichts unterscheidet und damit nicht in die Messmode abgestrahlt wird, kann unter Ausnutzung dieses Parameters unterdrückt werden. Der Anteil des Streulichts, der in die Messmode abgestrahlt wird, entsteht an denselben Orten auf dem Substrat wie das Messlicht und wird in dieselbe Richtung und mit derselben Polarisation erzeugt. Damit sind das Messlicht und der Streulichtanteil in der Messmode untrennbar in einer optischen Mode vermischt, und können nicht mehr getrennt werden. Alle Versuche die Streu-Intensität in der Messmode zu reduzieren, indem man z.B. die Kohärenzlänge der Lichtquelle reduziert, die Position des Wellenleiters zufällig vibrieren lässt oder die Phasenlage auf eine andere Weise zufällig fluktuieren lässt, sind ungeeignet, da sie in gleichem Maße auch die kohärente Mess-Intensität zerstören. Auch Filterung im Orts- oder k-Raum, z.B. über Blenden, ist nicht möglich, da Messlicht und Streulicht in der Messmode am selben Ort bzw. mit derselben k-Vektor-Verteilung erzeugt werden. Die einzige Möglichkeit, die ungestörte Mess-Intensität rekonstruieren zu können, ist dann die Messung des Phasenunterschieds ACPMS zwischen Messfeld und Streufeld und der kohärente Abzug des Streufeldes.
Als konkretes Beispiel für ein Streufeld Es wurde bisher nur Speckle betrachtet, welches bei der Beleuchtung von streuenden Oberflächen mit kohärentem Licht auftritt. Ein weiteres konkretes Beispiel (und ein Spezialfall) eines Streufeldes Es ist der optische Bias eines Biogitters.
Besteht zwischen den Stegen und Lücken eines Biogitters ein Brechungsindexkontrast, tritt bereits ohne Anbindung von zu detektierenden Biomolekülen ein konstantes Nullsignal als Hintergrund auf, welches als Bias bezeichnet wird. Dieser Bias kann sich entweder konstruktiv oder destruktiv mit dem Messfeld überlagern und dieses verfälschen. Daher ist es vorteilhaft, den Bias durch Ausfüllen (sogenanntes „Backfilling“) der Gitterlücken mit einem geeigneten Material zu minimieren oder sogar zu eliminieren.
Bei der fotolithographischen Herstellung solcher Biogitter ist es im Allgemeinen jedoch nicht möglich das Backfilling derart exakt auszuführen, dass der Bias vollständig verschwindet, sodass in der Regel ein Bias mit unbekanntem Vorzeichen verbleibt, welcher die Messgenauigkeit beeinflusst. Eine mögliche Lösung dieses Problems ist z.B. die Messung des Bias durch Zugabe einer Kalibrierlösung, was jedoch aufwändig und ggf. nicht zerstörungsfrei/reversibel möglich ist. Vollkommen analog zum bereits diskutierten Speckle kann auch der Bias als ein elektrisches Streufeld Es mit gegebener Phase cps und Intensität ls=Es2 beschrieben werden, das sich kohärent mit dem Messfeld EM überlagert. Der Bias stellt insofern einen Spezialfall eines solchen Streufeldes dar, als seine Phase im Gegensatz zum Speckle nicht beliebig zufällig orientiert sein kann, sondern entweder gleichphasig zum Messfeld EM (cps=cpM, positiver Bias), oder gegenphasig zum Messfeld EM ((PS=(PM+ 1 80°, negativer Bias) orientiert ist.
Bei der Messung des Phasenunterschieds ACPMS zwischen Messfeld EM und Streufeld Es kann nicht unterschieden werden, ob das elektrische Feld Es seinen Ursprung in Speckle oder Bias hat. Damit stellt die vorgeschlagene Methode zur Messung des Phasenunterschieds ACPMS zwischen Messfeld EM und Streufeld Es und der anschließende kohärente Abzug des Streufeldes auch eine Möglichkeit zur Messung bzw. Eliminierung des Bias dar.
Besonders vorteilhaft ist die damit verbundene Erhöhung der Messgenauigkeit des Biosensors, da das Messsignal nicht mehr durch den Bias oder durch Speckle verfälscht wird. Weiterhin vorteilhaft ist die Tatsache, dass der Bias nicht vollständig durch Backfilling eliminiert werden muss, was größere Toleranzen bei der Herstellung solcher Biogitter erlaubt. Die vorliegende Erfindung sieht vor, den unbekannten Phasenunterschied ACPMS zwischen Messfeld EM und Streufeld Es zu messen, um sodann das Streufeld durch kohärente Differenzbildung vollständig abziehen zu können. Das Ablaufschema ist wie folgt, die einzelnen Schritte werden im Folgenden genauer erläutert:
(i) Messung der benötigten Intensitätsverteilungen vor und nach Zugabe eines Analyten mit den zu detektierenden Biomolekülen.
(ii) Durchführung einer Phasenberechnung.
(iii) Rückrechnung auf ungestörtes Messfeld durch kohärentes Abziehen des Streufeldes bei Kenntnis der Phase.
Im Schritt (i) werden die zugänglichen Intensitätsverteilungen gemessen. Allgemein kann die unbekannte Phase einer Lichtwelle durch Interferenz mit einer bekannten Referenzwelle bestimmt werden. Daher wird hier zusätzlich zu den bereits definierten Feldstärken des Messfeldes EM, und Streufeldes Es die Feldstärke des Referenzfeldes ER definiert. Für die jeweiligen Intensitäten gilt IM=EM2, ls=Es und IR=ER2. Die Gesamtintensität verschiedener Kombinationen (d.h. kohärenter Überlagerungen) von Messfeld, Streufeld und Referenzfeld wird als IM+S+R, IM+S USW. bezeichnet. Als Intensitätsverteilung wird insbesondere die räumliche Intensitätsverteilung auf einem 2-dimensionalen Detektor (z.B. einer Kamera) verstanden. Die Auswertung dieser Intensitätsverteilungen kann sowohl pro Kamerapixel als auch bereichsweise erfolgen, d.h. um Rechenleistung zu sparen kann man, auf Kosten der Genauigkeit, bestimmte Bereiche des Kamerabildes zusammenfassen und dann die verschiedenen Auswertungen für diese Bereiche ausführen.
Die Intensität ohne Messfeld kann vor Zugabe des Analyten (Hintergrundmessung, IM=0) gemessen werden, die Intensität mit Messfeld nach Zugabe des Analyten. Das Referenzfeld IR kann durch einfaches Abblenden ein- und ausgeschaltet werden. Außerdem kann das gesamte Biogitter, aus dessen Bereich Messfeld und Streufeld emittiert werden, abgeblendet werden, um nur IR aufzunehmen. Damit sind grundsätzlich die folgenden fünf Kombinationen aus Messfeld, Streufeld und Referenzfeld als Messgrößen experimentell zugänglich:
Figure imgf000011_0001
4 +R = 4 + 4 + 2EsEfi cos(cpR - <ps )
Zs = fs
ZR = 4
Nicht experimentell zugänglich sind dagegen IM und IM+R, da das Messfeld immer mit dem Streufeld in der Messmode vermischt auftritt (dies ist die eigentliche Problemstellung). Ziel ist es im Folgenden die gesuchte Mess- Intensität IM berechnen zu können. Wie bereits oben angedeutet, kann im Schritt (ii) die unbekannte Phase einer Lichtwelle durch Interferenz mit einer bekannten Referenzwelle bestimmt werden. Hierzu eignen sich entweder Trägerwellenverfahren, bei denen die Referenzphase als Trägerfrequenz aufgeprägt wird (vgl. D. Malacara, Interferogram analysis for optical testing, Kap 8„Spatial Linear und Circular Carrier analysis“), oder phasenschiebende Verfahren, bei denen die Referenzphase in mindestens drei Schritten variiert wird (vgl. D. Malacara, Interferogram analysis for optical testing, Kap 7„Phase shifting interferometry“). Im Ergebnis sind beide Methoden gleich: Die unbekannte Phase der zu analysierenden Ausgangswelle wird bestimmt. Im Folgenden werden beide Methoden kurz erläutert.
Als erstes wird die Phasenberechnung anhand des Trägerwellenverfahrens beschrieben: Beim Trägerwellenverfahren wird die Referenzphase CPR durch Aufprägen einer Trägerfrequenz fo moduliert, beispielsweise durch schräges Einstrahlen der Referenzwelle. Im Fall einer ebenen Referenzwelle ist die Referenzphase CPR in Abhängigkeit der Geometrie gegeben durch:
YH — 2 TcfoxX "I" 2nf0yy.
Die resultierende Intensitätsverteilung auf einem Detektor ist dann durch das Auftreten eines Streifenmusters, sog.„Fringes“, geprägt.
Strahlt man nur die Referenzwelle zusammen mit einer ebenen, unverkippten Ausgangswelle ein, entspricht die räumliche Frequenz dieses Streifenmusters genau der Trägerfrequenz, da die Phase der
Ausgangswelle an allen Stellen gleich ist. Für eine beliebige Ausgangswelle verschieben sich im Gegensatz dazu die Maxima des Streifenmusters aufgrund der Phasenverteilung der Ausgangswelle: Das Streifenmuster verschiebt sich quer zur Streifenrichtung. In den Abweichungen dieses resultierenden Streifenmusters vom ungestörten Streifenmuster ist die gesuchte Phaseninformation über die zu analysierende Ausgangswelle kodiert, die man z.B. durch Fitten, Hilbert- oder Fourier- Transformation extrahieren kann. Entsprechende Algorithmen sind in der Literatur in vielfacher Ausführung beschrieben. Als Beispiele seien hier die Algorithmen nach Takeda, J. Opt. Soc. Am. 72(1 ) (1982) (kurz: Fouriertransformation der Intensitätsverteilung, Löschen nicht benötigter Frequenzanteile, Verschieben des Trägerfrequenzpeaks zum Ursprung und Rücktransformation) oder S. Wang, Optik 124 (2013), 1897-1901 (kurz: Vierfache Hilberttransformation mit Differenzbildung und Phasengewinnung basierend auf f = arctan (sin f/cos cp)) genannt, vgl. für dieses und weitere Verfahren auch D. Malacara, Interferogram analysis for optical testing, Kap 8„Spatial Linear und Circular Carrier analysis“). Für eine stabile Phasenberechnung ist sicherzustellen, dass die Referenzwelle unter einem Winkel größer als die numerische Apertur (plus Sicherheitsabstand zur vollständigen Separation der Referenzwelle im Fourierraum) von Messlicht und Streulichtanteil in der Messmode eingestrahlt wird. Die Referenzwelle muss also außerhalb des Biogitters erzeugt werden, damit der transversale k-Vektor der Referenzwelle größer ist als jeder transversale k-Vektor des Messlichts kmax=2uNA / l. In anderen Worten bedeutet dies, dass die Steigung der Wellenfront der Referenzwelle größer sein muss, als die der zu analysierenden Ausgangswelle. Auf diese Weise ist die Trägerfrequenz vom übrigen Frequenzspektrum separiert und die vorgenannten Auswerteverfahren können angewendet werden.
Als zweites wird die Phasenberechnung anhand des phasenschiebenden Verfahrens beschrieben:
Während beim Trägerwellenverfahren die Referenzphase, definiert durch die Geometrieabhängigkeit, von selbst räumlich variiert, muss man beim phasenschiebenden Verfahren die Referenzphase aktiv variieren, d.h. schieben.
Hierbei kann die Phasenverzögerung der Referenzwelle durch viele verschiedene Verfahren erreicht werden. In der Literatur bekannt ist z.B. das Einführen einer planparallelen (Verzögerungs-) Glas/Plastikplatte im Referenzstrahlengang, die Einbringung eines elektro-optischen Phasenverzögerungselements, z.B. ein Flüssigkristallelement, das Verschieben eines Spiegels im Referenzstrahlengang mittels linearem Aktuator, oder das Verschieben eines diffraktiven Gitters senkrecht zum Strahl im Referenzstrahlengang.
Die relative Phase der Referenzwelle wird auf mehrere (mindestens 3) feste Werte eingestellt, und die resultierenden Intensitätsverteilungen der kohärenten Überlagerungen von Referenzwelle und Ausgangswelle aufgenommen. Für die anschließende Berechnung der unbekannten Phase sind eine Vielzahl von Algorithmen (Drei-, Vier- und Fünf-, usw. -schrittverfahren, kontinuierliche Verfahren) bekannt (vgl. D. Malacara, Interferogram analysis for optical testing, Kap 6„Phase-Detection Algorithms“). Als Beispiel sei hier der Drei-Schritt Algorithmus mit 120° Phasendifferenz zwischen den Schritten beschrieben:
Dazu werden drei Bilder der Überlagerung von Referenz- und Ausgangswelle aufgenommen, wobei die Referenzwelle zwischen den Bildern jeweils um einen festen Betrag (60°, 180° und 300°) in der Phase verändert/verzögert wird. Die aufgenommenen Intensitäten werden nach untenstehender Formel A miteinander verrechnet, über den Arkustangens erhält man die gesuchte Phasendifferenz cp: f = arctan
Figure imgf000014_0001
(Formel A)
Dieses Verfahren kann angewendet werden, da folgendes gilt: Seien die drei Phasenverzögerungen der Referenzwelle cp , cpR2, (PR3 = 60°, 180°, 300°. Für jeden Punkt in der Bildebene mit Ausgangsphase f ergibt sich so eine Intensität der Form I, = a+b-cos (cp + CPR,). Dies lässt sich umschreiben zu I, = a+b-cos f cos f™ - b-sin f -sin f™. Damit ergibt sich nach kurzer Umformung (Herleitung in D. Malacara, Interferogram analysis for optical testing, Kap 6.2.1„120° Three-Step-Algorithm“) obige Formel A, wodurch die unbekannte Phasendifferenz der zu analysierenden Ausgangswelle zur Referenzwelle eindeutig rekonstruiert wird.
Ein Nachteil des phasenschiebenden Verfahrens ist die Aufnahme von mindestens drei Bildern je Intensitätsverteilung, was einen gewissen Mehraufwand bedeutet. Vorteil dieses Verfahrens ist, dass im Gegensatz zum Trägerwellenverfahren, die Referenzwelle nicht zwingend schräg eingestrahlt werden muss, um sie im k-Raum abzutrennen.
Mit den zu Schritt (i) beschriebenen zugänglichen Intensitätsverteilungen und den zu Schritt (ii) beschriebenen Methoden, die Phase von Messfeld und Streufeld relativ zu einem eingestrahlten Referenzfeld messen zu können, kann man nun im Schritt (iii) auf die gesuchte ungestörte Mess- Intensität IM schließen.
Hierzu bieten sich verschiedene Verfahren an, die bis zu 5 der obigen Ausgangsgleichungen nutzen, und die alle gemeinsam haben, dass mindestens einmal IS+R und IM+S+R gemessen werden muss, um anschließend die unbekannte Phase des Interferenzterms zu rekonstruieren. Im Folgenden werden 2 Auswerteverfahren exemplarisch erläutert:
In einem ersten Auswerteverfahren (iii a) nimmt man Bilder der Intensitätsverteilungen von IS+R und IM+S+R auf und berechnet daraus jeweils die Phasendifferenz der Ausgangswelle (des Streufelds Es bzw. der Addition von Streufeld und Messfeld ES+ EM) zur Referenzwelle gemäß einem der obigen Verfahren. Anschließend nimmt man ein Bild der Intensitätsverteilung IR auf und berechnet mit Kenntnis der jeweiligen Phasendifferenz aus den obigen Formeln für IS+R und I M+S+R die Beträge der elektrischen Felder Es bzw. ES+ EM. Da nun die elektrischen Felder Es bzw. der Addition von Streufeld und Messfeld ES+ EM nach Betrag und Phase bekannt sind, kann man diese vektoriell voneinander abziehen und erhält das gesuchte EM.
Im Einzelnen: Man misst man die Intensitätsverteilung IS+R. Durch Anwendung eines der zu Schritt (ii) beschriebenen Verfahren zur Phasenberechnung wird daraus der Phasenunterschied (CPR - cps) berechnet. Bei phasenschiebenden Verfahren erhält man hierbei mehrere Gleichungen mit dem die Phasendifferenz enthaltenden cos-Term, aus denen sich die Phase rekonstruieren lässt. Beim Trägerwellen verfahren erhält man die gesuchte Phaseninformation aus den Abweichungen des Streifenmusters zur Trägerfrequenz. Zusammen mit einer Aufnahme der Intensität der Referenzwelle IR kann man dann die Streu-Intensität Iswie folgt berechnen:
Figure imgf000015_0001
Mit dem Betrag Es=Vls und Phase (CPR - cps) ist nun der komplexe E- Feldvektor des Streufeldes Es (relativ zur Referenzwelle) vollständig bekannt.
Anschließend wird IM+S+R aufgenommen und durch Anwendung eines der in Schritt (ii) beschriebenen Verfahren die relative Phase des kombinierten Feldes EM+S=EM+ES zur Referenzwelle bestimmt. Mit der Kenntnis von IR wird analog wiederum der Betrag von EM+s aus IM+S+R errechnet: Nun ist auch der komplexe E-Feldvektor von EM+S nach Betrag und Phase relativ zur Referenzwelle vollständig bekannt. Das gesuchte Messfeld EM ergibt sich anschließend aus vektorieller Subtraktion von EM+S und Es, und nach anschließender Quadrierung erhält man IM = | EM|2- Die Referenzwellenphase entfällt durch die Differenzbildung.
Vorteil dieses Verfahrens ist, dass nur drei Intensitätsverteilungen aufgenommen werden müssen. Nimmt man alternativ zu IR die Intensitätsverteilungen ls und IM+S auf, kann man auch daraus durch I = |E|2 die Beträge der elektrischen Felder Es und EM+S entnehmen anstatt diese nach der Phasenbestimmung aus den referenzwellen behafteten Intensitätsverteilungen unter Zuhilfenahme von IR zurückzurechnen. Dann erhält man dasselbe Ergebnis mit den vier Intensitätsverteilungen IM+S+R, IM+S, IS+R und ls-
In einem zweiten Auswerteverfahren (iii b) wird unter Nutzung aller 5 Messgrößen zunächst die Intensität
Figure imgf000016_0001
gebildet, die bereits vollkommen frei von Streufeld-Termen ist. Durch Anwendung eines der in (ii) beschriebenen Algorithmen zur Phasenberechnung wird daraus der Phasenunterschied (CPR - CPM) berechnet. Bei phasenschiebenden Verfahren (s.o.) erhält man hier mehrere Gleichungen mit cos-Term, aus denen sich die Phase rekonstruieren lässt, beim Trägerwellenverfahren nur eine. Anschließend wird die Mess-Intensität IM wie folgt berechnet:
Figure imgf000017_0001
Vorteil dieses Verfahrens ist, dass man alle experimentell zugänglichen Informationen nutzt und bereits vor der Phasenmessung eine streufeld-freie Intensitätsverteilung erhält. Sowohl bei Trägerwellen- als auch bei phasenschiebenden Verfahren handelt es sich um eine kohärente Differenzbildung. Die Messunsicherheit dieser Methoden ist durch die Messunsicherheit der relativen Phasenlage begrenzt und beträgt 2EMES cos(Acp). Der relative Messfehler der Mess- Intensität IM beträgt somit
rel. Fehler
Figure imgf000017_0002
und die Standardabweichung s des relativen Fehlers
2-/4 a(cos(A< >))
Figure imgf000017_0005
^rel.Fehler
Figure imgf000017_0004
Figure imgf000017_0003
Bei der einfachen Differenzbildung IM+S-IS (Stand der Technik) ist die Phasenlage gänzlich unbekannt, und mit a(cos(A< )) = 1/V2
folgt
Figure imgf000018_0001
Jede Methode, die die Phase genauer misst, stellt also bereits eine Verbesserung gegenüber dem Stand der Technik dar. Um eine hohe Genauigkeit zu erreichen, muss sichergestellt werden, dass sich die relative Phasenlage zwischen den verschiedenen Messungen nicht ändert. Insbesondere der benötigte Austausch der Probe zwischen Hintergrundmessung (ls, IS+R) und der eigentlichen Intensitätsmessung (IM+S, IM+S+R) ist kritisch, da sich hierbei Temperatur T, Analytkonzentration C und Druck p ändern können.
Allgemein gilt weiter, dass der interferometrische Kontrast zweier Wellen gegeben ist durch
Figure imgf000018_0002
ls), also sein Maximum x =1 für IR=IS erreicht. Sowohl für das Trägerwellen- als auch für das phasenschiebenden Verfahren bedeutet das, dass die Intensität der Referenzwelle IR SO eingestellt werden sollte, dass sie ungefähr der des Streulichthintergrunds ls entspricht.
Diese Überlegungen zu Phasenstabilität und Intensität der Referenzwelle fließen in die folgenden Ausführungsformen der Erfindung ein, die vor allem die Erzeugung einer Referenzwelle ein. Auch ergeben sich weitere Vorteile und Einzelheiten der vorliegenden Erfindung aus der nachfolgenden Beschreibung verschiedener Ausführungsformen anhand der Figuren.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN Dabei zeigen die
Figuren 1 - 4 eine erste Ausführungsform gemäß dem
Trägerwellenverfahren, mit einer ebenen Referenzwelle und einem fokussierenden Biogitter,
Figuren 5 - 9 eine zweite Ausführungsform gemäß einem phasenschiebenden Verfahren, mit einer Kugel-
Referenzwelle und einem kollimierenden Biogitter,
Figur 10 - 13 eine dritte Ausführungsform gemäß einem phasenschiebenden Verfahren, mit einer externen Referenzwelle und einem fokussierenden Biogitter, Figur 14 - 16 eine vierte Ausführungsform mit einer Bragg-
Umlenkung innerhalb eines Wellenleiters und mit einem Zellabstandshalter,
Figur 17 eine fünfte Ausführungsform mit einer externen
Referenzwelle und einem fokussierenden Biogitter, das mit einer Optik auf den Detektor abgebildet wird.
BESCHREIBUNG DER AUSFUHRUNGSFORMEN
Erste Ausführungsform
Die Figuren 1 bis 4 zeigen eine erste Ausführungsform in den beiden Seitenansichten XZ (Fig. 1 ) und YZ (Fig. 4) sowie in Draufsichten für die Bauteile Biochip und Blendenplatte (Fig. 2) und Shutter (Fig. 3). Licht L einer nicht dargestellten, kohärenten Laserlichtquelle wird über ein Einkoppelgitter EKG in einen auf einem Substrat SUB angeordneten planaren Wellenleiter W eines Biochips BC eingekoppelt. Mit Biochip BC wird hier das Substrat SUB mit den auf der Vorder-und Rückseite des Substrats SUB angeordneten Elementen bezeichnet. Zusammen mit den weiteren Elementen wie Lichtquelle und Detektor sowie den beweglichen Blenden und weiteren Elementen ergibt sich ein Biosensor.
Die Wellenlänge der kohärenten Laserlichtquelle liegt vorzugsweise im Bereich von 400 nm bis 1000 nm. Das Einkoppelgitter EKG befindet sich auf der Unterseite des planaren Wellenleiters W. Das in den planaren Wellenleiter W eingekoppelte Licht L propagiert in X-Richtung (außerhalb des Wellenleiters W fällt diese Lichtmode exponentiell ab) und trifft auf ein erstes Referenzgitter RG. Dieses erste Referenzgitter RG ist als lineares Gitter auf der Unterseite des planaren Wellenleiters W ausgebildet und wird vorzugsweise durch dieselben Prozessschritte, die auch das Einkoppelgitter EKG erzeugen, hergestellt.
Durch die lineare Gitterform des Referenzgitters RG ist das ausgekoppelte erste Referenz-Lichtbündel RL kollimiert. Es gelangt auf einen Detektor D mit mehreren Einzeldetektoren, der vorzugsweise als CMOS- oder CCD- Bildsensor ausgebildet ist. Nur ein kleiner Teil des im planaren Wellenleiter W propagierenden Lichts L wird durch das erste Referenzgitter RG ausgekoppelt. Der überwiegende Teil propagiert weiter zu einem ersten Biogitter BG. Das erste Biogitter BG besteht aus ersten Fängermolekülen, die gitterförmig, d.h. wie die Stege eines Gitters auf der Oberfläche des Biochips BC angebunden sind. Diese ersten Fängermoleküle binden spezifisch erste Analyt-Moleküle, die damit ebenfalls gitterförmig angelagert sind und deren Massenbelegung gemessen werden soll.
Durch die gitterförmige Anlagerung der ersten Analyt-Moleküle an den Fängermolekülen wird ein kleiner Teil des im planaren Wellenleiter W propagierenden Lichts L als erstes Mess-Lichtbündel ML ausgekoppelt und gelangt ebenfalls auf den Detektor D. Die Gitterform des Biogitters BG ist dabei - wie in der oben zitierten WO 2015004264 A1 beschrieben - so gewählt, dass das ausgekoppelte erste Mess-Lichtbündel ML auf eine kleine Fokusfläche auf den Detektor D fokussiert wird. Die Gitterform stellt damit eine diffraktive Linse mit der Brennweite f dar. Das erste Referenzgitter RG und das erste Biogitter BG sind so gewählt, dass am Ort des Detektors D das erste Referenz-Lichtbündel RL und das erste Mess-Lichtbündel ML überlagert werden. Diese kohärente Überlagerung ergibt ein erstes Intensitätsstreifensystem, das durch den Detektor D erfasst und in einer nicht dargestellten Auswerteeinheit ausgewertet wird. Die Überlagerung beider Lichtbündel RL, ML am Ort des Detektors D kann z.B. durch die Wahl des Auskoppelwinkels des ersten Referenzgitters RG erreicht werden, der durch die Gitterorientierung und durch die Gitterkonstante des ersten Referenzgitters RG gegeben ist.
Auch das erste Biogitter BG koppelt nur einen sehr kleinen Anteil des im planaren Wellenleiter W propagierenden Lichtes L aus. Der überwiegende Teil propagiert weiter zu einem zweiten Referenzgitter RG und einem nachfolgenden zweiten Biogitter BG. Das zweite Referenzgitter RG ist identisch zum ersten Referenzgitter RG ebenfalls als lineares Gitter ausgebildet und koppelt ein zweites Referenz-Lichtbündel RL aus, das versetzt zum ersten Referenz-Lichtbündel auf den Detektor D gelangt. Das zweite Biogitter BG besteht aus zweiten Fängermolekülen, die wiederum gitterförmig angebunden sind. Die Gitterform ist identisch zur Gitterform des ersten Biogitters BG und stellt damit ebenfalls eine diffraktive Linse dar. Die zweiten Fängermoleküle unterscheiden sich von den ersten Fängermolekülen des ersten Biogitters BG und binden damit andere spezifische Analyt-Moleküle, deren Massenbelegung ebenfalls gemessen werden soll. Das zweite Referenz- und das zweite Mess-Lichtbündel RL, ML werden wieder am Ort des Detektors D überlagert, wobei sie zum ersten Referenz- und Mess-Lichtbündel versetzt auftreffen, so dass sie unabhängig detektiert werden können. Es entsteht ein zweites Intensitätsstreifensystem, das durch den Detektor D erfasst und in der nicht dargestellten Auswerteeinheit ausgewertet wird.
Wie in der Draufsicht des Biochips BC dargestellt, sind neben dem ersten und zweiten Referenz- und Biogitter RG, BG noch weitere Referenz- und Biogitter RG, BG angeordnet, um weitere Analyt-Moleküle detektieren zu können. Mit einem einzigen Biochip BC aus diesem Ausführungsbeispiel können also vier verschiedene Analyt-Moleküle untersucht werden.
Im Strahlengang zwischen dem Biochip BC und dem Detektor D ist eine Blendenplatte BP eingebracht. Sie weist Öffnungen OR, OM für die mehreren Referenz- und Mess-Lichtbündel RL, ML auf und blockiert Streulicht, das außerhalb dieser Lichtbündel RL, ML entsteht. Die Öffnungen OR, OM sind deshalb möglichst klein gewählt, um eine hohe Streulicht- Unterdrückung zu erreichen, aber ausreichend groß, so dass die Referenz- und die Mess-Lichtbündel RL, ML nicht nennenswert beeinträchtigt werden. Die Blendenplatte BP kann als dünne Metallplatte mit Öffnungen OR, OM ausgeführt sein. Alternativ kann auch auf einer Glasplatte eine absorbierende Schicht aufgebracht und entsprechend mit Öffnungen OR, OM versehen werden. Diese zweite Alternative hat den Vorteil, dass diese Glasplatte zugleich eine Deckplatte eines Optikmoduls sein kann, die den Detektor D und weitere optische Bauteile vor einer Verschmutzung schützt, die beim Ein- oder Ausbringen des Biochips entstehen kann.
Die nicht dargestellte Auswerteeinheit wertet die Intensitätsstreifensysteme an den Fokusflächen der Mess-Lichtbündel ML aus. Dazwischen liegende Einzeldetektoren bzw. Pixel des Bildsensors werden nicht für die Auswertung genutzt, da sie nur Streulicht detektieren, das außerhalb der Mess-Mode entsteht und für die Auswertung nicht relevant ist. Diese Auswahl von Pixeln nur im Bereich der Fokusflächen entspricht einer virtuellen Blendenstruktur am Ort des Detektors D. Zusammen mit den Blendenöffnungen OR, OM der Blendenplatte BP entsteht ein Blendensystem, das nur Licht hindurch lässt, das bezüglich Ort und Richtung der Mess-Mode entspricht. Alle anderen Moden, die sich ja im Lichtort und/oder in der Lichtrichtung von der Mess-Mode unterscheiden, werden blockiert. Dies ergibt damit den gewünschten Modenfilter.
Wie im allgemeinen Teil der Beschreibung erklärt, ist für die Bestimmung der gestreuten Mess-Intensität IM der Biogitter BG eine Folge von Messungen erforderlich, bei denen entweder nur die Referenz-Lichtbündel RL oder die Mess-Lichtbündel ML oder beide gemeinsam detektiert werden. Es ist deshalb notwendig, einen Shutter S in den Strahlengang vom Biochip BC zum Detektor D einzufügen. Dieser Shutter S weist Öffnungen oder transparente Bereiche SO auf, durch die die Referenz- und/oder Mess- Lichtbündel RL, ML transmittiert werden. Durch eine Verschiebung des Shutters S in x-Richtung können strahlblockierende Bereiche SB in den Strahlengang der Referenz-Lichtbündel RL oder in den Strahlengang der Mess-Lichtbündel RB geschoben werden, so dass eine Messung der Intensitätswerte IM+S+R, IM+S, und IR ermöglicht wird. Die Messungen der Intensitätswerte IS+R und ls erfolgt vor der Anlagerung der Analyt-Moleküle.
In den Figuren 1 - 4 sind weitere vorteilhafte Bauelemente gezeigt. So trennt eine Trennwand T den Bereich der Strahleinkopplung vom Bereich der Strahldetektion. Außerdem absorbiert ein Strahlfänger F das durch das Einkoppelgitter EKG transmittierte Licht. Beides verringert das Streulicht.
Zweite Ausführungsform
Die Figuren 5 bis 9 zeigen eine zweite Ausführungsform der Erfindung in den beiden Seitenansichten XZ (Fig. 5) und YZ (Fig. 9) sowie in Draufsichten für die Bauteile Biochip (Fig. 6), Blendenplatte (Fig. 7) und den kombinierten Shutter/Verzögerungsplattenträger (Fig. 8).
Im Folgenden werden nur die Unterschiede zur ersten Ausführungsform geschildert. Die Referenzgitter RG befinden sich nun (in z-Richtung) unterhalb der zugehörigen Biogitter BG und koppeln dort jeweils einen kleinen Anteil des Lichts im planaren Wellenleiter W als Referenz- Lichtbündel RL in Form von Kugelwellen aus. Die Referenzgitter RG sind zu diesem Zweck als gechirpte Gitter mit gekrümmten Gitterlinien ausgeführt und wirken als diffraktive Zerstreuungslinsen. Die Biogitter BG hingegen sind als lineare Gitter mit konstanter Gitterperiode ausgeführt und koppeln kollimierte Mess-Lichtbündel ML aus dem Wellenleiter W aus. Um Rückreflexe der linearen Gitter zurück in den planaren Wellenleiter W durch Beugung in zweiter Ordnung gemäß der Bragg-Bedingung zu vermeiden, erfolgt die Auskopplung unter einem Winkel a + 90°. Wie aus der Draufsicht in Fig. 6 ersichtlich, sind die Referenzgitter RG kreisförmig begrenzt und werden jeweils von Kreisringen mit Biogittern BG umschlossen. Damit werden die austretenden Referenz-Lichtbündel RL jeweils von zugehörigen Mess-Lichtbündeln ML umschlossen.
Die ausgekoppelten Mess- und Referenz-Lichtbündel ML, RL passieren eine ortsfeste Blendenplatte BP (Fig. 7) und treffen nachfolgend auf eine in x- und y-Richtung verschiebbare, kombinierte Blenden- und Phasenverzögerungsplatte BPV (Fig. 8). Wie in der Draufsicht gemäß Fig. 8 ersichtlich, sind auf der kombinierten Blenden- und Phasenverzögerungsplatte BPV Blendenelemente B1 , B2 vorgesehen, die entweder die Referenz- oder die Mess-Lichtbündel RL, ML abblocken können. Daneben gibt es Phasenverzögerungselemente V1 , V2, V3, die in den Strahlengang der Referenz-Lichtbündel RL eingeschoben werden können und die die Phasen der Referenz-Lichtbündel RL jeweils um 60°, 180° oder 300° verzögern. Alle Blenden- und Phasenverzögerungselemente B1 , B2, V1 , V2, V3 sind im Raster der Mess- und Referenz-Lichtbündel RL, ML angeordnet, so dass die optische Wirkung stets für alle Referenz- Lichtbündel RL gleich ist und ebenso für alle Mess-Lichtbündel ML.
Durch die Blendenstrukturen B1 , B2 und eine entsprechende x- und y- Verschiebung der kombinierten Blenden- und Verzögerungsplatte ist es möglich, die Intensitätswerte IR und IM+S+R, IM+S (nach der Zugabe des Analyten) bzw. IS+R und ls (vor der Zugabe des Analyten) zu erfassen. Bei Einschieben der Phasenverzögerungselemente V1 , V2, V3 in die Referenz- Lichtbündel RL können auch die Phase der Referenz-Lichtbündel verzögert werden und damit die Phasen der entsprechenden Interferenzterme gemäß dem phasenschiebenden Verfahren bestimmt werden. Die Phasenverzögerungselemente V1 , V2, V3 bestehen aus einem transparenten, optisch dichteren Material wie das umgebende Medium Luft, beispielsweise Glas oder einem transparenten Polymer passender Dicke, um die gewünschte Phasenverzögerung zu erhalten.
Im weiteren Strahlenverlauf treffen die Referenz- und die Mess-Lichtbündel RL, ML auf eine Linsenarray-Platte. Auf dieser sind Sammellinsen SL im Raster der Mess-Lichtbündel RL, ML angeordnet. Sie fokussieren jeweils die Mess-Lichtbündel ML auf den darunter liegenden Detektor D. Der Abstand zwischen Sammellinsen SL bzw. Linsenarray-Platte und Detektor D ist deshalb gleich der Brennweite der Sammellinsen SL gewählt. Auch die Referenz-Lichtbündel RL werden durch die Sammellinsen SL der Linsenarray-Platte auf den Detektor D konzentriert. Der Detektor D befindet sich aber in Bezug auf die Referenz-Lichtbündel RL nicht in der
Fokusebene, da die Referenz-Lichtbündel RL als Kugelwellen eingestrahlt werden.
Die Verwendung von linearen Gitterstrukturen der Biogitter BG und damit kollimierten Mess-Lichtbündel ML in Kombination mit einer Linsenarray- Platte mit Sammellinsen SL, die die Mess-Lichtbündel ML auf einen Detektor fokussieren, hat erhebliche Vorteile, die im Folgenden beschrieben werden.
Die Herstellung der Biogitter BG als lineare Gitterstruktur ist wesentlich einfacher als für eine diffraktive Linsenstruktur. Eine diffraktive Linsenstruktur weist eine kontinuierliche Variation der lokalen
Gitterkonstanten auf. Bei der kontaktlosen Lithographie, die für die
Herstellung von Biogittern BG notwendig ist, beeinträchtigen Talbot-Effekte des Maskengitters die Lichtabbildung von der Maske hin zum Substrat SUB des herzustellenden Biochips BC, indem störende Interferenzen verschiedener Beugungsordnungen des Maskengitters auftreten und zu ungewollten Lichtmodulationen führen. Bei der Herstellung von diffraktiven Linsenstrukturen werden nicht alle lokalen Gitterkonstanten gleichermaßen gut abgebildet und es entstehen zusätzliche Modulationen. Die entsprechenden Störungen der Biogitter BG führen dazu, dass das Licht des planaren Wellenleiters W mit geringerer Beugungseffizienz aus dem planaren Wellenleiter W ausgekoppelt wird und zusätzliche Lichtbündel entstehen, die als Streulicht die Detektion stören. Zudem weisen die Mess- Lichtbündel ML störende Intensitätsschwankungen über deren Querschnitte auf, die zu einer größeren Fokusfläche auf dem Detektor D führen und damit zu größerem Messrauschen. Bei der Herstellung von Biogittern BG mit linearen Gitterstrukturen treten diese Nachteile nicht auf. Zudem kann die Lithographie für diese eine Gitterkonstante beispielsweise durch Wahl einer optimalen Belichtungsdivergenz, eines optimalen Belichtungsabstandes oder der Wahl einer optimalen Belichtungswellenlänge optimiert werden. Bei unvermeidbaren Schwankungen der Belichtungsintensität treten zwar entsprechende Schwankungen des Steg-Lücke-Verhältnisses der Biogitter BG auf, diese sind jedoch konstant über deren Querausdehnung. Damit bleibt auch die Beugungseffizienz bzw. die Intensität der Mess-Lichtbündel ML über die Querausdehnung konstant, so dass das Mess-Lichtbündel ML beugungsbegrenzt auf den Detektor D fokussiert werden kann. Dies hat wiederum ein geringes Messrauschen zur Folge.
Die feste Gitterkonstante von Biogittern BG mit linearer Gitterstruktur ermöglicht die Optimierung des Steg-Lücke-Verhältnisses für diese Gitterkonstante. Dies führt zu erhöhter Auskopplungseffizienz und damit zu erhöhter Intensität der Mess-Lichtbündel ML.
Die Auskopplung in dieser Ausführungsform sollte leicht schief zur Normalen des Biochips BC erfolgen, um Mehrfachreflexionen und Rückreflexe an optischen Elementen und im planaren Wellenleiter W zu unterdrücken. Durch eine geeignete Linsenform der Sammellinsen SL der Linsenarray- Platte kann dieser Winkel bei Bedarf wieder senkrecht auf den Detektor D ausgerichtet werden. Weiterhin entfällt bei Biogittern BG mit linearer Gitterstruktur auch die im Stand der Technik (EP 2618130 A1 ) beschriebene Zone ohne Gitterlinien, die innerhalb der fokussierenden Gitter zur Vermeidung von Rückreflektion in den Wellenleiter vorgesehen sind. Dies verringert den Fertigungsaufwand und erhöht durch die größeren Flächen der Biogitter BG die Intensitäten der Mess-Lichtbündel ML.
Ein weiterer Vorteil eines Biogitters BG als lineare Gitterstruktur ist die konstante Polarisation des kollimierten Mess-Lichtbündels ML im Gegensatz zu einer über die Querausdehnung variierende Polarisation bei einer diffraktiven Gitterstruktur. Durch den Wegfall der Krümmung steht die Polarisation der propagierenden Wellen auch immer parallel zu den Gitterlinien, was die Auskopplungseffizienz erhöht.
Die Verwendung von Biogittern BG mit linearen Gitterstrukturen erfordert - wie oben beschrieben - eine nachfolgende Fokussierung der Mess- Lichtbündel und ist daher mit der Verwendung von wenigstens einer Sammellinse SL bzw. einer Linsenarray-Platte (für mehrere Biogitter BG auf einem Biochip BC) verbunden. Nur bei einer Linsenarray-Platte sind die Lagetoleranzen der Sammellinsen SL zueinander hinreichend klein. Die Justierung von Einzellinsen, die in einem sehr engen Raster angeordnet werden müssen, ist viel zu aufwändig.
Die Sammellinsen SL der Linsenarray-Platte können sowohl refraktiv als auch diffraktiv ausgeführt werden. Die diffraktive Variante kann als einstufige, binäre Struktur oder vorteilhafterweise mehrstufig als geblazte Struktur hergestellt werden. Da die Lage zwischen Detektor D und Sammellinsen SL bzw. Linsenarray- Platte fest ist, ändert sich bei Verschiebungen des Biochips BC relativ zur Abtastoptik die Lage der Fokusflächen auf dem Detektor D nicht, was eine Vereinfachung der Auswertung zur Folge hat. Solche Verschiebungen in allen drei Raumrichtungen können beim Einlegen des Biochips in eine Ausleseeinheit oder aufgrund von thermischen Driftvorgängen auftreten. Lediglich Rotation des Biochips BC um die x- oder y-Achse würden die Fokusflächen verschieben. Der Biochip BC muss daher über Anschläge nahe an den Rändern des Biochips BC ausgerichtet werden. Eine Rotation um die z-Achse ist wegen der geringen Abweichung des Auskoppelwinkels a zu 90° nur von untergeordnetem Einfluss und kann ebenfalls durch Anschläge leicht kontrolliert werden.
Die in dieser Ausführungsform verwendeten Referenz-Lichtbündel RL in Form von Kugelwellen sind vorteilhaft, da die Querausdehnung der Referenz-Lichtbündel RL auf dem Detektor D durch die Brennweite der Referenzgitter RG in Form von diffraktiven Zerstreuungslinsen gewählt werden kann. Sie kann damit so ausgelegt werden, dass auf dem Detektor D eine gleichmäße Intensität der Referenz-Lichtbündel RL über die Fokusflächen der Mess-Lichtbündel ML entsteht.
Das hier zum Einsatz kommende phasenschiebende Verfahren benötigt, verglichen mit dem Trägerwellenverfahren, nur Lichtbündel mit geringen Strahlneigungen, d.h. mit geringer numerischer Apertur. Die nicht vermeidbaren und auch mehrfachen Reflexionen an optischen Bauteilen wie z.B. an der Blendenplatte BP führen aufgrund der geringen Strahlneigungen nicht zu einem Übersprechen von einem Mess-Lichtbündel ML zu einem benachbarten Mess-Lichtbündel ML. Die Messgenauigkeit ist entsprechend erhöht. Außerdem werden die Mess- und die zugehörigen Referenzstrahlenbündel ML, RL an sehr benachbarten Stellen aus dem Biochip BC ausgekoppelt. Damit ist der Temperatureinfluss auf die Phasenverschiebung zwischen Mess- und Referenz-Lichtbündel ML, RL, der durch Brechungsindexänderungen im planaren Wellenleiter W entsteht, entsprechend gering. Zudem ist der rechnerische Aufwand in der Auswerteeinheit geringer als beim Trägerwellenverfahren, da für die Phasenbestimmung keine Streifenmuster ausgewertet werden müssen, sondern nur einfache arithmetische Berechnungen und eine Arkustangensbildung notwendig sind. Dritte Ausführungsform
Die Figuren 10 bis 13 zeigen eine dritte Ausführungsform in der Seitenansichten XZ (Fig. 10) sowie in Draufsichten für die Bauteile Biochip- Wellenleiter (Fig. 1 1 ), Oberseite der Blendenplatte mit Referenzgitter- Wellenleiter (Fig. 12) und Unterseite der Blendenplatte (Fig. 13). Im Folgenden werden nur die Unterschiede zur ersten Ausführungsform geschildert.
Die Biogitter BG sind in dieser Ausführungsform wieder als diffra ktive Linsen ausgebildet und fokussieren die Mess-Lichtbündel ML wieder auf den Detektor D. Die Referenz-Lichtbündel R durchlaufen eine Blendenplatte BP. Dazu weist die Blendenplatte BP ein Substrat SUB‘, ein Einkoppelgitter EKG und einen separaten planaren Wellenleiter W‘ auf. Ein Teil des Lichts L der nicht dargestellten, kohärenten Laserlichtquelle wird über ein elektrooptisches Phasenverzögerungselement PVE in Form eines Flüssigkristallelements oder eines elektrooptischen Modulators phasenverschoben und über das Einkoppelgitter EKG in den planaren Wellenleiter W‘ der Blendenplatte BP eingekoppelt. Das Licht propagiert dort in +x-Richtung zu Referenzgittern RG, die Referenz-Lichtbündel RL auskoppeln. Die Referenzgitter RG sind als lineare Gitter ausgebildet, so dass die Referenz-Lichtbündel kollimiert sind. Die Gitterkonstante der Referenzgitter ist so gewählt, dass die Referenz-Lichtbündel RL leicht schräg (a F 90) zur Normalenrichtung des Biochips BC auskoppeln, um Rückreflexe in den Wellenleiter W‘ zu vermeiden. Dies erfolgt in Analogie zu den in der EP 2618130 A1 beschriebenen Bragg-Zonen, in denen Gitterlinien in den jeweiligen Biogittern ausgespart werden, um Reflektionen in den planaren Wellenleiter gemäß der Bragg-Bedingung zu vermeiden. Die Referenzgitter RG sind relativ zu den Biogittern BG so positioniert, dass die Referenz-Lichtbündel RL jeweils mit den zugehörigen Mess-Lichtbündeln ML am Ort des Detektors D überlappen und damit interferieren. Die Phasenverschiebung der Referenz-Lichtbündel RL durch das elektrooptische Phasenverzögerungselement PVE erlaubt die Verschiebung der Relativphase zwischen Mess- und Referenz-Lichtbündel ML, MR und damit die Bestimmung der Relativphase in einer nicht dargestellten Auswerteeinheit gemäß dem oben dargestellten Phasenschiebe-Verfahren.
Ein in x-Richtung beweglichen Shutter S erlaubt das Blocken der Mess- oder der Referenz-Lichtbündel ML, RL noch bevor das Licht L auf die jeweiligen Einkoppelgitter EKG trifft.
Der Biochip BC trägt neben den Biogittern BG auch ein Referenzierungsgitter, auch als Phasendrift-Bezugsgitter PDBG bezeichnet. Ein kleiner Teil des im planaren Wellenleiter W des Biochips propagierenden Lichts L wird durch dieses erste Referenzierungsgitter PDBG ausgekoppelt und erzeugt ein erstes Referenzierungs-Lichtbündel RZL. Das Referenzierungsgitter PDBG ist als lineares Gitter ausgebildet, so dass das erste Referenzierungs-Lichtbündel RZL1 kollimiert austritt. Es wird nachfolgend durch den Detektor D detektiert. Die Blendenplatte BP trägt ein weiteres Referenzgitter RG, das unter dem ersten Referenzierungsgitter PDBG auf dem Biochip BC angeordnet und ebenfalls als lineares Gitter ausgebildet ist. Auch hier wird ein kleiner Teil des im planaren Wellenleiter W der Blendenplatte BP propagierenden Lichts L ausgekoppelt, so dass ein kollimiertes, zweites Referenzierungs-Lichtbündel RZL2 entsteht. Das erste und das zweite Referenzierungs-Lichtbündel RZL1 , RZL2 überlappen und interferieren am Ort des Detektors D.
Das zweite Referenzierungs-Lichtbündel RZL2 kann durch das elektrooptische Phasenverzögerungselement PVE phasenverschoben werden und erlaubt auch hier die Bestimmung der Relativphase von erstem und zweitem Referenzierungs-Lichtbündel RZL1 , RZL2. Diese Relativphase hängt von der Relativposition von Biochip BC und Blendenplatte BP ab. Die Relativposition beeinflusst aber auch die Relativphasen zwischen den Mess- und den zugehörigen Referenz-Lichtbündeln ML, RL. Durch die Bestimmung der Relativphase zwischen dem ersten und zweiten Referenzierungs- Lichtbündel RZL1 , RZL2 kann der Teil der Relativphasen von Mess- und zugehörigen Referenz-Lichtbündeln ML, RL bestimmt und abgezogen werden, der von der Relativposition von Biochip BC und Blendenplatte BP abhängt. Ein Driften der Relativposition des Biochips BC relativ zur Blendenplatte BP während der Messdauer kann damit kompensiert werden. Dabei ist zu beachten, dass es eine sensitive Richtung für die Relativposition gibt, die die Relativphasen von Mess- und zugehörigen Referenz-Lichtbündeln ML, RL bestimmen. Ebenso gibt es eine sensitive Richtung für die Relativphase von erstem und zweitem Referenzierungs- Lichtbündel RZL1 , RZL2. Beide sensitiven Richtungen sind jeweils durch die Richtung des Lichtbündels L vor dem Einkoppelgitter EKG und durch die Richtung der ausgekoppelten Lichtbündel gegeben. Beide sensitiven Richtungen sollten möglichst identisch sein. Bei gleichem Einkoppelwinkel für den Biochip BC und der Blendenplatte BP ergibt sich die Bedingung für eine gleiche Auskoppelrichtung für die Mess-Lichtbündel ML, die Referenz- Lichtbündel und die ersten und zweiten Referenzierungs-Lichtbündel RZL1 , RZL2. Dies ist durch eine geeignete Gitterkonstante und Gitterorientierung der Referenzgitter RG und Referenzierungsgitter PDBG möglich.
Bei Bedarf können weitere Referenzierungsgitter PDBG auf dem Biochip BC und dazugehörige Referenzgitter RG auf der Blendenplatte BP eingebracht werden. Die entsprechenden weiteren Messungen der Relativphasen erlauben neben der Kompensation von linearen Verschiebungen zwischen Biochip BC und Blendenplatte BP auch die Kompensation von Drehungen. Dies ergibt eine besonders genaue Ausführungsvariante.
Der besondere Vorteil dieser Ausführungsform ist, dass das Referenzgitter RG nur in einem fest in der Detektionsapparatur verbauten Wellenleiter W strukturiert werden muss und nicht in jedem Biochip - Wellenleiter W vorhanden sein muss. Darüber hinaus wird auch die Kalibrierung vereinfacht. Auch werden keine beweglichen Teile für die Phasenverschiebung der Referenz-Lichtbündel RL benötigt.
Durch die räumliche Trennung der Lichtbündel L, die auf die Einkoppelgitter EKG des Biochips bzw. der Blendenplatte BP treffen, ist eine getrennte Einstellung von deren Intensität durch entsprechende Bauelemente im Strahlengang möglich. Damit kann das Intensitätsverhältnis von Mess- und Referenz-Lichtbündel ML, RL eingestellt werden und für eine optimale Detektion optimiert werden. Der Shutter S ist in diesem Fall vor den Einkoppelgittern EKG angeordnet, so dass bei einem Blockieren einer der beiden Lichtbündel weniger Streulicht entsteht.
Vierte Ausführungsform
Die Figuren 14 bis 16 zeigen eine vierte Ausführungsform in der Seitenansicht XZ (Fig. 14) sowie in Draufsichten für die Bauteile Biochip (Fig. 15), sowie Blendenplatte und den kombinierten Shutter/Verzögerungsplattenträger (Fig. 16).
Im Folgenden werden nur die Unterschiede zur ersten Ausführungsform geschildert.
Diese Ausführungsform basiert auf einer Anordnung, die in EP2929326B1 beschrieben ist. Es lenken nun die Biogitter BG das Licht L im planaren Wellenleiter W nur ab, koppeln es aber nicht aus dem planaren Wellenleiter W aus. Die Biogitter BG sind als lineare Gitter ausgeführt. Die Auskoppelung aus dem Wellenleiter W erfolgt durch zusätzliche Auskoppelgitter AG.
Das Licht L passiert analog zu den oben beschriebenen Ausführungen zunächst elektrooptische Phasenverzögerungselemente PVE (für den Anteil des Lichts, der später auf Referenzgitter RG gelenkt wird) und einen Shutter S, um die Lichtanteile auf Bio- und Referenzgitter BG, RG getrennt voneinander abblenden zu können. Die Einkopplung des Lichts erfolgt analog zu ersten Ausführungsform über ein Einkoppelgitter EKG. Das in x-Richtung propagierende Licht L trifft danach auf ein erstes lineares, zweigeteiltes Biogitter BG, in dessen Mitte ein erstes Referenzgitter RG ausgeführt ist. Die Gitterstriche beider Gitter BG, RG sind äquidistant und schräg zur Propagationsrichtung des Lichts L ausgeführt, und erfüllen die Bragg-Bedingung zur Umlenkung des Lichts im Wellenleiter in Richtung des Auskopplungsgitters AG. Der Abstand der Gitterlinien d ist damit über den Winkel Q des Lichts L zu den Gitterlinien mit der Wellenlänge des Lichts im Wellenleiter l verknüpft. Die Beugungsordnung n ist in der Regel 1 , um keine zusätzlichen, störenden Beugungsordnungen zu erzeugen und die Beugungseffizienz zu erhöhen.
Der von Biogitter BG und Referenzgitter RG abgelenkte, kleine Anteil des Gesamtlichts L trifft auf einen fokussierendes Auskoppgitter AG an der Unterseite des Wellenleiters W, der beide Anteile auf den Detektor D lenkt und dort zur Überlagerung bringt. Um eine sichere Überlagerung beider Anteile zu gewährleisten, kann das Referenzgitter RG leicht gekrümmt ausgeführt werden, um eine kleine Divergenz dieses Referenz-Lichtbündels RL zu gewährleisten. Auch eine kontinuierliche Variation des Einkopplungswinkels am Einkoppelgitter EKG in y-Richtung über einen geeigneten Aktuator ist nützlich, um die Bragg-Bedingung des Biogitters BG zu treffen und so die Messintensität zu optimieren.
Der im Wellenleiter W verbleibende Lichtanteil wird im nächsten Bio- und Referenzgitter BG, RG an einem weiteren Ort umgelenkt und ausgekoppelt.
Zusätzlich wird ein Partikel-Abstandshalter M mit geeigneter Porengröße vorgesehen. Diese Maßnahme kann auch im Zusammenhang mit allen anderen Ausführungsformen nützlich sein. Ziel ist, ungewünschte streuende Partikel SP (z.B. Zellen) durch Filtration vom Wellenleiter W fernzuhalten. Hierzu wird der Partikel-Abstandshalter M außerhalb des evaneszenten Feldes des Wellenleiters W vorgesehen, und die Porengröße so gewählt, dass er von den zu analysierenden Biomolekülen bzw. Analyten A passiert werden kann, während unerwünschte größere Partikel SP im Flüssigkeitsüberstand zurückgehalten werden. Der Partikel-Abstandshalter M kann in Form einer Membran, oder auch als Molekülschicht oder poröser Deckschicht in die Nähe des Wellenleiters W oder auf den Wellenleiter W gebracht werden. Durch den Partikel-Abstandshalter M wird verhindert, dass größere Partikel wie Tumorzellen (typischer Durchmesser 10-30 pm) den Streulichthintergrund verändern, wenn sie ins evaneszente Feld auf oder in der Nähe des Wellenleiters W gelangen.
Vorteil dieser Ausführungsform mit Partikel-Abstandshalter M ist, dass so sichergestellt ist, dass man den Streulichthintergrund mit und ohne Messwelle unter identischen Bedingungen messen kann, ohne dass diese von mit dem Analyten-Medium eingebrachten, größeren Partikeln oder Zellen verändert wird.
Fünfte Ausführungsform
Figur 17 zeigt die fünfte Ausführungsform in der XZ Seitenansicht. Es werden vor allem die Unterschiede zur ersten Ausführungsform erklärt.
Licht L einer kohärenten Laserlichtquelle LQ wird mit Hilfe eines ersten Strahlteilers ST1 in zwei Anteile aufgespalten, die im Folgenden genutzt werden, um getrennt voneinander die Mess-Lichtbündel ML (erster Anteil) und das externe Referenz-Lichtbündel RL (zweiter Anteil) zu erzeugen.
Ein erster Anteil des am Strahlteiler ST1 aufgespaltenen Lichts wird nach Durchgang durch eine geeignete erste Strahlformungsoptik SF01 und einen ersten Shutter S1 über ein Einkoppelgitter EKG in einen auf einem Substrat SUB angeordneten planaren Wellenleiter W eines Biochips BC eingekoppelt. Die Biogitter BG sind in dieser Ausführungsform wieder als diffraktive Linsen mit Brennweite f ausgebildet und fokussieren die Mess- Lichtbündel ML auf eine Brennebene BE, die sich im Abstand f zum Wellenleiter W befindet. Der in x-Richtung bewegliche Shutter S1 erlaubt das Blockieren der Mess-Lichtbündel ML, noch bevor Licht auf das Einkoppelgitter EKG trifft. Die Brennebene BE wird mit Hilfe zweier Objektive 01 , 02 mit Brennweiten fobj.i und fobj,2 auf einen Detektor D abgebildet, der sich im Abstand 2fobj,i +2fobj,2 von der Brennebene BE befindet. Im Falle zweier Objektive 01 , 02 mit identischen Brennweiten fobj,i =fobj,2=fobj ergibt sich somit eine 4f- Abbildung mit Vergrößerung M=-1. Die in dieser Ausführungsform verwendete optische Abbildung der Brennebene BE auf den Detektor D ist besonders vorteilhaft, da sich im Abstand 2fobj,i von der Brennebene BE bzw. im Abstand 2fobj,2 Vom Detektor D eine Fourierebene ergibt, in welche eine Fourierblende FB mit einer geeigneten Öffnung OF eingebracht ist, sodass eine k-Raum-Filterung (d.h. Winkelfilterung) realisiert ist. Auf diese Weise kann die numerische Apertur der Detektionsoptik derart angepasst werden, dass unerwünschtes Streulicht, welches in andere Moden als die Messmode abgestrahlt wird, blockiert wird. Dies ergibt somit einen erwünschten Modenfilter. Die Fourierblende FB wird in X- und Y-Richtung verschiebbar ausgeführt, sodass Verkippungen des aus dem Biochip BC ausgekoppelten Mess-Lichtbündels ML um die Rx- und RyAchse kompensiert werden können.
Ein zweiter Anteil des am Strahlteiler ST1 aufgespaltenen Lichts L wird mit Hilfe einer geeigneten zweiten Strahlformungsoptik SF02 kollimiert und als externes Referenz-Lichtbündel RL genutzt. Ein in z-Richtung beweglicher zweiter Shutter S2 erlaubt das Blockieren des Referenz-Lichtbündels RL. Anschließend wird das Referenz-Lichtbündel RL mit Hilfe eines zweiten Strahlteilers ST2 (oder einem anderen Ablenkelement, das der Umlenkung und Strahlvereinigung dient) auf den Detektor D gerichtet und mit dem Mess-Lichtbündel ML zur Überlappung gebracht, sodass beide am Ort des Detektors D interferieren. Um eine Phasenmessung nach dem Trägerwellenverfahren durchführen zu können, ist der Winkel Ry des zweiten Strahlteilers ST2 derart zu wählen, dass das eingestrahlte Referenzlicht RL unter einem Winkel größer als die numerische Apertur von Messlicht und Streulichtanteil in der Messmode eingestrahlt wird. Des Weiteren kann der zweite Strahlteiler ST2 verstellbar um Ry ausgeführt werden, um bei einem Driften des Winkels von Mess-Lichtbündel ML und Streulicht den Winkel des Referenz-Lichtbündels RL entsprechend nachführen zu können. Falls keine mechanische Nachführung vorgesehen ist, sollte die Periode des Intensitätstreifensystems, das durch die Interferenz von Mess-Lichtbündel ML und Referenz-Lichtbündel RL entsteht, geschätzt und die gemessene Phasen um den zugehörigen Steigungsfehler korrigiert werden.
Abweichend von der gezeichneten Ausführung, kann die Phasenmessung auch nach dem phasenschiebenden Verfahren durchgeführt werden. In diesem Fall ist der Winkel Ry des zweiten Strahlteilers ST2 wieder frei wählbar und muss nicht notwendigerweise verstellbar ausgeführt werden. Um die Phase des Referenz-Lichtbündels RL um 60°, 180° oder 300° zu verzögern, muss dann an geeigneter stelle ein Phasenverzögerungselement in den Strahlengang des Referenz-Lichtbündels RL eingebracht werden.
Abweichend von der gezeichneten Ausführung kann der zweite Anteil des am ersten Strahlteiler ST1 aufgespaltenen Lichts auch dazu genutzt werden, um eine kleine Öffnung zu beleuchten, welche sich, zusätzlich zur ersten Öffnung OF, in x-Richtung von der optischen Achse versetzt in der Fourierblende FB befindet. Diese kleine beleuchtete Öffnung wirkt wie eine Punktlichtquelle in der Fourierebene vom zweiten Objektiv 02, sodass ein auf den Detektor D gerichtetes, ebenes Referenz-Lichtbündel entsteht, welches mit dem Mess-Lichtbündel ML zur Überlappung und damit am Ort des Detektors D zur Interferenz gebracht wird. Der Abstand zwischen dieser kleinen zweiten Öffnung und der optischer Achse bestimmt den Winkel Ry, um den das Referenz-Lichtbündel RL gegen das Mess-Lichtbündel ML und das Streulicht verkippt auf den Detektor D eingestrahlt wird, und kann wiederum verstellbar gewählt werden um bei einem Driften des Winkels von Mess-Lichtbündel ML und Streulicht den Winkel des Referenz-Lichtbündels RL entsprechend nachzuführen zu können. Der Lichtweg vom ersten Strahlteiler ST1 zur Fourierblende FB kann auch durch Führen des Lichts in einer optischen Faser überbrückt werden. Im Gegensatz zu den bisherigen Ausführungsformen wird das Referenz- Lichtbündel RL nicht durch eine Vielzahl von Referenzgittern RG, sondern durch einen ersten Strahlteiler ST1 ausgekoppelt. Es wird nur ein Referenz- Lichtbündel RL erzeugt und zur Vermessung aller Mess-Lichtbündel ML genutzt. Diese Ausführungsform ist besonders vorteilhaft, da auf der Oberfläche des Biochips BC kein Platz für Referenzgitter RG vorgehalten werden muss, sodass die Biogitter BG - im Gegensatz zur ersten und vierten Ausführungsform - dichter angeordnet bzw. - im Gegensatz zur zweiten und dritten Ausführungsform - vollflächig genutzt werden können. Weiterhin vorteilhaft ist, dass die aufwändige Strukturierung von Referenzgittern RG entfällt, und nur Strahlteiler ST1 , ST2 benötigt werden, welche fest in der Detektionsapparatur verbaut sind.
Ein Nachteil dieser Ausführungsform ist zunächst, dass die optischen Pfade von Referenz-Lichtbündel RL und Mess-Lichtbündel ML nicht übereinstimmen. Um interferometrische Stabilität zu erreichen, wählt man üblicherweise eine sogenannte „Common-Path“ Geometrie, bei der die optischen Pfade von Referenz-Lichtbündel RL und Mess-Lichtbündel ML weitestgehend übereinstimmen, d.h. dieselben optischen Elemente passieren (wie in der ersten, zweiten und vierten Ausführungsform, mit Einschränkungen auch in der dritten Ausführungsform). Auf diese Weise stellt man sicher, dass sich mechanische oder thermische Driftvorgänge auf beide Lichtbündel RL, ML gleich stark auswirken, sodass die relative Phase konstant bleibt. Die in dieser fünften Ausführungsform beschriebene Lösung stellt jedoch wegen der verschiedenen optischen Pfade für die Lichtbündel RL, ML eine sogenannte „Double-Path“ Geometrie dar, welche inhärent anfällig für derartige Driftvorgänge ist.
Dieser Nachteil kann jedoch auf besonders einfache Weise behoben werden. Da das unvermeidbare Streufeld Es hauptsächlich von Streuung an ortsfester Rauheit des Substrats SUB erzeugt wird, ist die Phasenverteilung cps des resultierenden Speckle-Hintergrunds zeitlich und räumlich konstant, und kann als intrinsischer Phasenstandard genutzt werden, um ein Driften der relativen Phase zwischen Referenz-Lichtbündel RL und Mess- Lichtbündel ML zu messen und zu kompensieren. Ein gemeinsamer Phasenoffset des Speckle-Hintergrunds, der z.B. durch eine Drift des Biochips relativ zur Lichtquelle und/oder relativ zum Detektor auftreten kann, wird hier einer Phasenverschiebung der Referenzwelle zugeordnet, was dieselbe Wirkung aufweisen würde.
Zu diesem Zweck werden zu einem ersten Zeitpunkt ti die Intensitätsverteilungen IS+R, IS und IR aufgenommen - die relative Phasenlage zwischen Streufeld und eingestrahltem Referenzfeld sei cps-cpR. Zu einem späteren Zeitpunkt t2 wird die Intensitätsverteilung IS+R‘ ein weiteres Mal gemessen - die relative Phasenlage zwischen Streufeld und eingestrahltem Referenzfeld sei nun (PS-(PR‘. Unter der oben genannten Voraussetzung, dass die Phase des Streulichts konstant ist (cps = const.), kann dann die Differenz der Referenzphase zwischen den Zeitpunkten ti und t2 an jedem Ort des flächigen Detektors D (d.h. je Pixel) wie folgt berechnet werden:
fi
Figure imgf000038_0001
Die pixelweise gemessene Phasendrift ÄcpR zwischen Referenz-Lichtbündel RL und Streulicht kann dann mit einem Wellenfrontmodell, das entsprechende Freiheitsgrade für verschiedene Driftvorgänge (Phasenhub, Phasenverkippung etc.) enthält, geschätzt werden, sodass man eine Gesamt-Phasendrift ÄcpR erhält und diesen entsprechend kompensieren kann - in der Regel durch Subtraktion.
Da Streulicht und Mess-Lichtbündel ML am gleichen Ort auf dem Wellenleiter W entstehen und entlang des gleichen optischen Pfades auf den Detektor D abgebildet werden, ist ihre relative Phasenlage A(PMS=(PM-(PS zeitlich konstant. Wenn also die Phase des Referenz-Lichtbündels RL um ÄcpR gegen die Phase cps des Streulichts driftet, driftet sie ebenso um ÄcpR gegen die Phase yM des Mess-Lichtbündels ML. Somit ist die Phasendrift zwischen Referenz-Lichtbündel RL und Mess-Lichtbündel ML bestimmt, sodass interferometrische Stabilität zwischen beiden Strahlenbündeln hergestellt werden kann.
In der Regel liegt der Zeitpunkt t2, zu dem die Phasendrift zwischen Referenz-Lichtbündel RL und Mess-Lichtbündel ML bestimmt werden soll, nach dem Zeitpunkt der Zugabe des Analyten. In diesem Fall ist die Intensitätsverteilung IS+R‘ nicht mehr zugänglich. Da sich bei Zugabe des Analyten die Signalintensität jedoch nur innerhalb einer kleinen Fokusfläche des Mess-Lichtbündels ML ändert, gilt außerhalb der Fokusfläche |M+S+R=IS+R‘. Somit kann der unveränderte Speckle-Hintergrund außerhalb der Fokusfläche weiterhin als intrinsischer Phasenstandard genutzt werden und die entsprechende Auswertung der Phasendrift ÄcpR erfolgt analog nach obiger Formel.
Auch eine laterale Verschiebung des Biochips zwischen den Messungen kann durch Korrelation des Speckle-Hintergrunds bestimmt werden. Bei einer Messung ohne Referenz-Lichtbündel verwendet man die Intensitätsverteilung des Speckle-Hintergrunds für diese Korrelation. Mit Referenz-Lichtbündel ist es günstiger, die ortsabhängige Phasenverteilung für die Korrelation heranzuziehen. Die laterale Verschiebung kann leicht durch eine softwaremäße Verschiebung der Pixelzuordnungen korrigiert werden. Vorteil dieses Verfahrens ist, dass man den Speckle-Hintergrund über die gesamte Detektorfläche hinweg als intrinsischen Phasenstandard nutzen kann, und somit keine zusätzlichen Referenzierungsgitter benötigt werden.
Zu den hier erklärten Ausführungsbeispielen sind einzeln oder in Kombination noch die im Folgenden erklärten Verallgemeinerungen möglich. In den obigen Ausführungsformen sind zum besseren Verständnis Realisierungen mit konkreten Design-Entscheidungen illustriert. Diese Beispiele sind aber ohne Beschränkung der Allgemeinheit zu verstehen, und können dementsprechend abgeändert werden, ohne die grundlegenden Funktionsprinzipien der verschiedenen Ausführungsformen zu beeinflussen.
- Zum Beispiel können Einkoppelgitter EKG und/oder Referenzgitter RG nicht nur auf der Unterseite des Wellenleiters W sondern genauso auf der Oberseite des Wellenleiters W ausgeführt werden.
- Statt der Anregung von Biogitter BG und/oder Referenzgitter RG über im Wellenleiter W propagierendes Licht L, kann die Anregung ebenso durch einen an der Grenzfläche des Biochips BC totalreflektierten Lichtstrahl erfolgen. An dieser Grenzfläche befinden sich die Biogitter BG und Referenzgitter RG. Das evaneszente elektrische Feld des totalreflektierten Lichts wechselwirkt dann völlig analog zur Variante mit Anregung über den Wellenleiter mit den jeweiligen Gittern.
- Als Detektor D kann anstatt einer Kamera (also einem 2D-Array von Fotodetektoren) auch ein flächiger Einzeldetektor je Detektionsort und eine Blende mit dem Durchmesser des Messfeldes, also dem Durchmesser der Messmode, eingesetzt werden.
- Als Phasenschieber ist in der Literatur auch ein senkrecht zum Strahl verschiebbares Beugungsgitter bekannt, da in dessen Beugungsordnungen die Phase abhängig von der Position der Stege und Lücken relativ zum Strahl variiert. Alternativ kann auch ein beispielsweise per Piezoaktuator bewegter Spiegel den Strahlweg des Referenzstrahls variieren, um die Phase zu variieren.
Polarisiert man die Referenzwelle z.B. über ein in den Referenzstrahl eingebrachtes, passend orientiertes l/2-Plättchen senkrecht zur Mess-Welle, kann man über einen drehbaren Polarisationsfilter vor dem Detektor auswählen, welche Strahlanteile man beobachten möchte. Parallel zur Polarisation der Referenz- bzw. Mess-Welle wird dann nur die jeweilige Welle gemessen, bei einer Einstellung zwischen 0° und 90° relativ zur Polarisation der Referenzwelle kann man die relative Stärke der beiden Teilwellen so einstellen, dass man optimalen Interferenzkontrast (s.o.) erhält, und diese so zur Interferenz auf dem Detektor bringen.
- Zudem können bei allen Varianten Trennstege zwischen den einzelnen Detektionsorten eingebracht werden, um ein Übersprechen zu verhindern.
Die Detektorauflösung und der Fokusdurchmesser des Biogitters BG sollten so gewählt sein, dass der Fokusdurchmesser sich im Bereich von 5-50 Pixeln bewegt.
Die Detektorauflösung und der Streifenabstand im Trägerwellenverfahren sollten so gewählt sein, dass der Streifenabstand sich im Bereich von 5 - 50 Pixeln bewegt.
Die Referenzgitter RG können im Trägerwellenverfahren sowohl vor (wie im ersten Ausführungsbeispiel gezeigt) als auch nach dem Biogitter BG in x-Richtung versetzt aufgebracht werden. Auch eine Anordnung mit Versatz in y-Richtung oder Kombinationen hiervon sind möglich. Vorteil eines Versatzes nur in y-Richtung zum Biogitter BG ist, dass die optische Weglänge im Wellenleiter W für Referenz- und Biogitter RG, BG identisch lang ist, was Drift in der Phase zwischen Referenz und Biogitter minimiert. Bringt man jeweils ein Referenzgitter vor und nach dem Biogitter in x-Richtung auf, kann die Phasendrift auch rechnerisch kompensiert werden, indem jeweils einmal mit einem der beiden Referenzgitter die Phasendifferenz zum Biogitter berechnet wird. Phasendrift der beiden Referenzgitter verhält sich gegenläufig und kann so korrigiert werden.
Des Weiteren kann ein Referenzgitter RG (z.B. durch Überlagerung zweier zueinander verdreht ausgeführter Gitterstrukturen oder Erzeugung einer stark divergenten Welle) auch Referenzwellen für mehrere umliegende Biogitter BG erzeugen. Die Blendenstruktur darunter wählt aus den erzeugten Referenzwellen die passende Teilwelle für das jeweilige Biogitter BG aus.
- Statt der beweglichen Shutter (S) können auch elektronisch schaltbare Elemente wie LCDs zur Blockierung bzw. Freigabe von
Lichtbündeln verwendet werden.

Claims

Ansprüche
1. Diffraktiver Biosensor zum selektiven Nachweis von Biomolekülen, mit einem Substrat (S) und einem auf dem Substrat (S) angeordneten optischen Biogitter (BG), wobei das Biogitter (BG) periodisch angeordnete Rezeptoren für die Biomoleküle aufweist, und wobei die Effizienz einer Beugung von einfallendem Licht (L) und damit die Intensität eines in einem Detektor (D) eintreffenden Mess-Lichtbündels (ML) von einer Massenbelegung des Biogitters (BG) mit den nachzuweisenden Biomolekülen abhängt, dadurch gekennzeichnet, dass der Biosensor eine Einrichtung (RG, ST1 ) zur Erzeugung eines auf den Detektor (D) gerichteten Referenz-Lichtbündels (RL) aufweist, mit dem die Phasenlage von im Detektor (D) eintreffendem Streulicht relativ zum Mess-Lichtbündel (ML) bestimmbar ist.
2. Diffraktiver Biosensor nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Einrichtung zur Erzeugung des Referenz-Lichtbündels (RL) ein Referenzgitter (RG) oder ein Strahlteiler (ST1 ) ist, von dem ein Teil des einfallenden Lichts (L) als Referenz-Lichtbündel (RL) zum Detektor (D) ablenkt wird.
3. Diffraktiver Biosensor nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass entweder mittels eines beweglichen Elements (S, S1 , S2) mit transparenten Bereichen (SO) und Licht (L) blockierenden Bereichen (SB) oder mittels einer elektronisch schaltbaren Blende eine wahlweise Blockierung des Referenz-Lichtbündels (RL) oder des Mess-Lichtbündels (ML) ermöglicht ist.
4. Diffraktiver Biosensor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Biogitter (BG) auf einem Wellenleiter (W) aufgebracht ist, der flächig auf dem Substrat (SUB) angeordnet ist.
5. Diffraktiver Biosensor nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Referenzgitter (RG) im Wellenleiter (W) seitlich des Biogitters (G) angeordnet ist.
6. Diffraktiver Biosensor nach einem der Ansprüche 1 - 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Einrichtung zur Erzeugung des Referenz- Lichtbündels (RL) ein erster Strahlteiler (ST1 ) ist, der einen Teil des einfallenden Lichts (L) als Referenz-Lichtbündel (RL) zu einem zweiten Strahlteiler (ST2) oder einem Ablenkelement ablenkt, von dem das Referenz-Lichtbündel (RL) mit dem Mess-Lichtbündel (ML) zur Überlappung gebracht und zum Detektor (D) ablenkt wird.
7. Diffraktiver Biosensor nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass im Strahlengang des Mess-Lichtbündels (ML) nach dem Biogitter (BG) und vor dem zweiten Strahlteiler (ST2) bzw. dem Ablenkelement ein erstes und zweites Objektiv (01 , 02) angeordnet ist, und dass in einer Fourierebene zwischen dem ersten und zweiten Objektiv (01 , 02) eine Fourierblende (FB) angeordnet ist.
8. Diffraktiver Biosensor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Licht (L) mehrerer Einrichtungen (RG, ST1 ) zur Erzeugung von auf den Detektor (D) gerichteten Referenz- Lichtbündeln (RL) und mehrerer Biogitter (BG) über ein Linsenarray mit mehreren Sammellinsen (SL), die im Raster der Biogitter (BG) angeordnet sind, auf den Detektor (D) gelenkt wird.
9. Verfahren zur Bestimmung einer Phasendrift zwischen einem Referenz- Lichtbündel (RL) und einem Mess-Lichtbündel (ML) in einer Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass ein räumlich und zeitlich stabiler Speckle-Hintergrund als intrinsischer Phasenstandard verwendet wird.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass zu verschiedenen Zeitpunkten ein Phasenversatz zwischen dem Speckle- Hintergrund und dem Referenz-Lichtbündel (RL) und/oder dem Mess- Lichtbündel (ML) ermittelt wird, und daraus ein Kompensationswert für die Phasendrift ermittelt wird, mit dem interferometrische Stabilität zwischen dem Referenz-Lichtbündel (RL) und Mess-Lichtbündel (ML) hergestellt wird.
PCT/EP2019/059853 2018-07-18 2019-04-16 Diffraktiver biosensor WO2020015872A1 (de)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201980047841.9A CN112424584A (zh) 2018-07-18 2019-04-16 衍射生物传感器
US17/261,259 US20210270736A1 (en) 2018-07-18 2019-04-16 Diffractive biosensor
JP2021502488A JP7278363B2 (ja) 2018-07-18 2019-04-16 回折バイオセンサ
EP19719788.2A EP3824272A1 (de) 2018-07-18 2019-04-16 Diffraktiver biosensor

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102018212013 2018-07-18
DE102018212013.7 2018-07-18

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2020015872A1 true WO2020015872A1 (de) 2020-01-23

Family

ID=66290388

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2019/059853 WO2020015872A1 (de) 2018-07-18 2019-04-16 Diffraktiver biosensor

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20210270736A1 (de)
EP (1) EP3824272A1 (de)
JP (1) JP7278363B2 (de)
CN (1) CN112424584A (de)
DE (1) DE102019205527A1 (de)
WO (1) WO2020015872A1 (de)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022063451A1 (de) * 2020-09-24 2022-03-31 Dr. Johannes Heidenhain Gmbh Vorrichtung und verfahren zur simultanen abbildung zweier objektebenen
EP3759470B1 (de) * 2018-03-01 2023-06-28 F. Hoffmann-La Roche AG System zur verwendung beim nachweis von bindungsaffinitäten
EP4306940A1 (de) 2022-07-15 2024-01-17 lino Biotech AG Vorrichtung zur verwendung bei der detektion von bindungsaffinitäten
ES2958785A1 (es) * 2023-07-17 2024-02-14 Univ Valencia Politecnica Dispositivo de medida para el analisis de la respuesta optica de materiales biosensibles difractivos

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102020212031A1 (de) * 2020-09-24 2022-03-24 Dr. Johannes Heidenhain Gmbh Vorrichtung und Verfahren zur Bestimmung der Intensität des in einem planaren Wellenleiter geführten Lichts IWG(x, y)
WO2023187074A1 (en) * 2022-03-30 2023-10-05 Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG In situ-combined functionalization and readout in optical biomolecule interaction analysis

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5572598A (en) * 1991-08-22 1996-11-05 Kla Instruments Corporation Automated photomask inspection apparatus
US20030059855A1 (en) * 2000-10-30 2003-03-27 Sru Biosystems, Llc Method and instrument for detecting biomolecular interactions
US7008794B2 (en) 2000-03-22 2006-03-07 Axela Biosensors Inc. Method and apparatus for assay for multiple analytes
EP2618130A1 (de) 2012-01-17 2013-07-24 F. Hoffmann-La Roche AG Vorrichtung zur Verwendung bei der Bindeaffinitätserkennung
EP2757374A1 (de) 2013-01-17 2014-07-23 F. Hoffmann-La Roche AG Verfahren zur Herstellung einer äußeren Oberfläche eines planaren Wellenleiters zur Bindung von Zielproben entlang einer Vielzahl festgelegter Linien sowie planarer Wellenleiter
WO2015004264A1 (en) 2013-07-12 2015-01-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Device for use in the detection of binding affinities
EP2929326A1 (de) 2012-12-04 2015-10-14 F. Hoffmann-La Roche AG Vorrichtung zur verwendung beim nachweis von bindungsaffinitäten

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4537861A (en) * 1983-02-03 1985-08-27 Elings Virgil B Apparatus and method for homogeneous immunoassay
DE10162180A1 (de) * 2001-12-18 2003-07-03 Bosch Gmbh Robert Interferometrische Messvorrichtung
US7123363B2 (en) * 2003-01-03 2006-10-17 Rose-Hulman Institute Of Technology Speckle pattern analysis method and system
US10732104B2 (en) * 2015-07-07 2020-08-04 Furuno Electric Co., Ltd. Measuring chip, measuring device and measuring method
WO2018020331A1 (en) * 2016-07-29 2018-02-01 Semiconductor Energy Laboratory Co., Ltd. Display device, input/output device, and semiconductor device
US10274807B2 (en) * 2016-12-08 2019-04-30 Northwestern University Optical quantification of interfacial charge states
CN107219590B (zh) * 2017-06-05 2018-12-25 峻立科技股份有限公司 具有监控分光路径的光学元件

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5572598A (en) * 1991-08-22 1996-11-05 Kla Instruments Corporation Automated photomask inspection apparatus
US7008794B2 (en) 2000-03-22 2006-03-07 Axela Biosensors Inc. Method and apparatus for assay for multiple analytes
US20030059855A1 (en) * 2000-10-30 2003-03-27 Sru Biosystems, Llc Method and instrument for detecting biomolecular interactions
EP2618130A1 (de) 2012-01-17 2013-07-24 F. Hoffmann-La Roche AG Vorrichtung zur Verwendung bei der Bindeaffinitätserkennung
EP2929326A1 (de) 2012-12-04 2015-10-14 F. Hoffmann-La Roche AG Vorrichtung zur verwendung beim nachweis von bindungsaffinitäten
EP2757374A1 (de) 2013-01-17 2014-07-23 F. Hoffmann-La Roche AG Verfahren zur Herstellung einer äußeren Oberfläche eines planaren Wellenleiters zur Bindung von Zielproben entlang einer Vielzahl festgelegter Linien sowie planarer Wellenleiter
WO2015004264A1 (en) 2013-07-12 2015-01-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Device for use in the detection of binding affinities

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANGELEY D G: "Optical transduction technique utilizing gratings with a potential application towards biosensing", PROC. SPIE 4958, ADVANCED BIOMEDICAL AND CLINICAL DIAGNOSTIC SYSTEMS, 22 July 2003 (2003-07-22), pages 1 - 12, XP002330601, DOI: 10.1117/12.476132 *
GATTERDAM V ET AL: "Focal molography is a new method for the in situ analysis of molecular interactions in biological samples", NATURE NANOTECHNOLOGY, vol. 12, no. 11, 25 September 2017 (2017-09-25), GB, pages 1089 - 1095, XP055490061, ISSN: 1748-3387, DOI: 10.1038/nnano.2017.168 *
S. WANG, OPTIK, vol. 124, 2013, pages 1897 - 1901
TAKEDA, J. OPT. SOC. AM., vol. 72, no. 1, 1982

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3759470B1 (de) * 2018-03-01 2023-06-28 F. Hoffmann-La Roche AG System zur verwendung beim nachweis von bindungsaffinitäten
US11946930B2 (en) 2018-03-01 2024-04-02 Hoffmann-La Roche Inc. Device for use in the detection of binding affinities
WO2022063451A1 (de) * 2020-09-24 2022-03-31 Dr. Johannes Heidenhain Gmbh Vorrichtung und verfahren zur simultanen abbildung zweier objektebenen
EP4306940A1 (de) 2022-07-15 2024-01-17 lino Biotech AG Vorrichtung zur verwendung bei der detektion von bindungsaffinitäten
ES2958785A1 (es) * 2023-07-17 2024-02-14 Univ Valencia Politecnica Dispositivo de medida para el analisis de la respuesta optica de materiales biosensibles difractivos

Also Published As

Publication number Publication date
JP2021531459A (ja) 2021-11-18
EP3824272A1 (de) 2021-05-26
US20210270736A1 (en) 2021-09-02
CN112424584A (zh) 2021-02-26
JP7278363B2 (ja) 2023-05-19
DE102019205527A1 (de) 2020-01-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3824272A1 (de) Diffraktiver biosensor
EP0618439B1 (de) Bildgebender optischer Aufbau zur Untersuchung stark streuenden Medien
EP2137514B1 (de) Integriert-optischer sensor
EP0617273A2 (de) Optisches Verfahren und Vorrichtung zur Analyse von Substanzen an Sensoroberflächen
DE19721843C1 (de) Interferometrische Meßvorrichtung
EP0834066A1 (de) Verfahren und einrichtung zum nachweis physikalischer, chemischer, biologischer oder biochemischer reaktionen und wechselwirkungen
WO2008012091A2 (de) Verfahren und vorrichtung zum bestimmen einer abweichung einer tatsächlichen form von einer sollform einer optischen oberfläche
DE19511869A1 (de) Verfahren und Anordnung zur Responseanalyse von Halbleitermaterialien mit optischer Anregung
DE102008044522A1 (de) Verfahren und Vorrichtung zur Erfassung von Konturdaten und/oder optischen Eigenschaften eines dreidimensionalen semitransparenten Objekts
DE102015201561A1 (de) Messkopf einer endoskopischen Vorrichtung und Verfahren zur Inspektion und Messung eines Objektes
DE102011085599B3 (de) Vorrichtung und Verfahren zur interferometrischen Vermessung eines Objekts
EP2856096A2 (de) Optisches messsystem mit polarisationskompensation, sowie entsprechendes verfahren
EP1507137B1 (de) Verfahren und Vorrichtung zur polarisationsabhängigen und ortsaufgelösten Untersuchung einer Oberfläche oder einer Schicht
DE102012007452B4 (de) Optische Verschiebungsmesseinrichtung
DE10308016A1 (de) Verschiebungsmessgerät mit Interferenzgitter
EP0112399B1 (de) Interferometrisches Messverfahren für Oberflächen
DE102010037207B3 (de) Rauheits-Messvorrichtung und -Messverfahren
DE102021200109A1 (de) Verfahren zur flächenhaften Bestimmung einer Karte wenigstens eines Strukturpara-meters einer strukturierten Oberfläche eines diffraktiven optischen Elements
DE102017219125A1 (de) Optische Positionsmesseinrichtung
DE2710795C3 (de) Verfahren und Vorrichtung zum Messen von Verschiebungen oder Schwingungen einer Oberfläche
DE102008029970A1 (de) Projektionsbelichtungsanlage für die Mikrolithographie sowie Verfahren zum Überwachen einer lateralen Abbildungsstabilität
DE102006016053B4 (de) Verfahren zur interferometrischen Bestimmung einer optischen Weglänge zwischen der Oberfläche eines Objekts und einer Referenzfläche und Interferometeranordnung
WO2015011201A1 (de) Vorrichtung und verfahren zur aufnahme und auswertung von mikroskopischen und/oder speckle-bildern von proben oder oberflächen einer probenebene mit einem auflichtaufbau sowie deren verwendung
WO2018060420A1 (de) Interferometer mit mehrfachem versatz
DE10362349B3 (de) Verfahren zur Herstellung eines Sensors für optische Strahlung

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 19719788

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2021502488

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2019719788

Country of ref document: EP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2019719788

Country of ref document: EP

Effective date: 20210218