DE3915421A1 - Verfahren und vorrichtung zur periodischen, alternierenden monochromatisierung eines polychromatischen lichtstrahls und zur fluoreszenzmessung an biologischen zellen - Google Patents

Verfahren und vorrichtung zur periodischen, alternierenden monochromatisierung eines polychromatischen lichtstrahls und zur fluoreszenzmessung an biologischen zellen

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Description

Die Erfindung betrifft eine optische Anordnung zur schnellen, periodischen Monochromatisierung eines Pri­ märlichtstrahls bei verschiedenen, diskreten Wellen­ längen. Die Anordnung besteht prinzipiell aus einer Filterumschalteinrichtung zur Monochromatisierung des Primärlichtstrahles an den vorgegebenen Wellenlängen. Der polychromatische Primärlichtstrahl kann entweder durch eine technische Lichtquelle erzeugt werden, oder stammt von einem Meßobjekt, das photometrisch in Trans­ mission, Remission, oder mit Hilfe der Streulichterfas­ sung oder der Methode der Fluoreszenzanregung untersucht wird.
Außerdem betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Be­ trieb dieser Einrichtung, bei dem die Fluoreszenzanre­ gung biologischer Zellen bei verschiedenen Wellenlängen gemessen wird.
Derartige Anordnungen zur periodischen Monochromatisie­ rung finden Anwendung bei der dynamischen Untersuchung von schnell ablaufenden, photometrisch erfaßbaren Vor­ gängen bei verschiedenen diskreten Wellenlängen, insbe­ sondere bei der alternierenden Fluoreszenzanregung von farbstoffmarkierten, biologischen Zellen, aber auch bei der zeitlichen Untersuchung von chemischen Reaktionsvor­ gängen, um Aussagen über reaktionskinetische Daten zu erhalten. In diesem Zusammenhang betrifft die Erfindung auch ein Verfahren zum schnellen Lösungswechsel in einer Meßkammer, wie es für die Messung kinetischer Vorgänge mit hoher zeitlicher Auflösung erforderlich ist.
Stand der Technik
Zur Fluoreszenzanregung von biologischen Zellen wird häufig die Methode der Auflichtfluoreszenzmikroskopie verwendet. Damit können bestimmte Funktionen und Akti­ vitäten der biologischen Zellen, wie z.B. die Kalzium- oder pH-Regulation, meßtechnisch erfaßt werden. Dabei werden die Änderungen der Fluoreszenzeigenschaften be­ stimmter Farbstoffe bei einer Interaktion mit zellulären Bestandteilen untersucht. Einige Farbstoffe, z.B. der Fluoreszenzfarbstoff Fura 2® zur Bestimmung der intra­ zellulären Kalziumkonzentration, erlauben dabei aufgrund einer spezifischen Verschiebung des Anregungswellenlän­ genmaximums bei Interaktion mit den Zellbestandteilen eine absolute Eichung der Messung. So kann mit Hilfe von Fura 2® die intrazelluläre Kalziumkonzentration weitge­ hend unabhängig von der verwendeten Farbstoffkonzentra­ tion in der Zelle von möglichen Zellbewegungen und von der Zellgröße absolut bestimmt werden. Die Voraussetzung hierfür ist die kontinuierliche Erfassung der Lichtemis­ sion des Farbstoffs bei zwei verschiedenen Anregungswel­ lenlängen (vgl. Tsien et al., Cell Calcium 6, 145 bis 157, 1985).
Die Untersuchung sehr schneller Veränderungen der Kal­ ziumkonzentration, wie sie beispielsweise bei Herzzellen mit einer mittleren Zyklusdauer von weniger als 300 ms vorkommen, erfordern eine hohe zeitliche Auflösung der Meßtechnik und damit einen sehr schnellen Wechsel der Anregungswellenlängen. Die bisher hierfür verwendeten Systeme zum Wechsel der Anregungswellenlängen, wie Fil­ terwechsler, Filterräder und Schwing- bzw. Drehspiegel sind entweder von der zeitlichen Auflösung her stark be­ grenzt oder sehr störungsempfindlich und mit hohen Intensitätsschwankungen behaftet. Die geringe zeitliche Auflösung bei einem Filterrad resultiert aus dem relativ großen Trägheitsmoment aufgrund der großen bewegten Mas­ sen. Die maximal erreichbare Umdrehungsfrequenz liegt bei Verwendung mehrerer Filterpaare nur in der Größen­ ordnung von 10 s-1. Eine weitere Schwierigkeit bei Fil­ terrädern mit mehreren Filterpaaren liegt darin, daß die Filterpaare in ihren optischen Eigenschaften (spektrale Durchlässigkeit) genau übereinstimmen müssen. Bei einem Austausch bzw. einer Erneuerung einzelner Filter kann in der Regel diese Bedingung nicht mehr eingehalten wer­ den, so daß unter Umständen Fremdlicht mit anderen Wel­ lenlängenkomponenten erzeugt wird (Unsymmetrien bei der Aufteilung der Strahlung auf die beiden vorgegebenen al­ ternierenden Wellenlängen).
Die oben erwähnten Schwing- und Drehspiegelanordnungen haben den Nachteil, daß zur alternierenden Beleuchtung des Meßobjektes mit zwei Wellenlängen aufgrund der Strahlaufteilung an der Lichtquelle zwei verschiedene Volumenelemente der Lichtquelle erfaßt werden. Dies führt bei Xenon- oder Quecksilberdampflampen aufgrund von Instabilitäten des Lichtbogens in den beiden Teil­ strahlen zu unterschiedlichen Intensitätsschwankungen und Veränderungen der spektralen Zusammensetzungen, die zu einer Verfälschung des Meßergebnisses führen. Außer­ dem sind bei Schwingspiegeln hinreichend große Schwin­ gungsamplituden bei hohen Frequenzen nur schwierig zu realisieren.
Aufgabe
Hier setzt die Erfindung an. Es liegt die Aufgabe zu­ grunde, eine Anordnung zur periodischen Monochromatisie­ rung eines Primärlichtstrahls bei alternierenden Wellen­ längen, insbesondere für die Zwecke der Auflichtfluor­ eszenzmikroskopie mit einer hohen Zeitauflösung zu ent­ wickeln, wobei systematische Meßfehler aufgrund mangeln­ der räumlicher Kohärenz der Lichtquelle und Asymetrien bei der Aufteilung und der Wiederzusammenführung der Teilstrahlen vermieden werden sollen. Außerdem sollen Energieverluste bei der Strahlaufteilung minimiert werden, um eine möglichst hohe Empfindlichkeit zu erreichen.
Allgemeine Erläuterung und Bedeutung der Erfindung
Diese Aufgabe wird ausgehend von einer Monochromatisie­ rungseinrichtung zur Erzeugung von Licht mit alternie­ renden Wellenlängen auf der Basis einer Filterumschalt­ einrichtung zur Monochromatisierung eines Primärstrahls an den vorgegebenen Wellenlängen erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß der Primärstrahl mit Hilfe dichroitischer Farbteiler in Teilstrahlen aufgespalten wird, daß die Teilstrahlen durch ein Lochblendenrad alternierend freigegeben und durch Interferenzfilter monochroma­ tisiert werden, und daß die monochromatisierten Teil­ strahlen durch Umlenkspiegel und mit Hilfe eines weiteren dichroitischen Farbteilers wieder zu einem einzigen Lichtstrahl mit alternierender Wellenlänge zusammengeführt werden.
Gemäß einer Weiterentwicklung der Erfindung wird die neue Monochromatisierungseinrichtung zur Messung der Fluoreszenzanregung biologischer Zellen bei verschie­ denen Wellenlängen in der Weise benutzt, daß der Licht­ strahl mit alternierender Wellenlänge in den Beleuch­ tungsstrahlengang eines Fluoreszenzmikroskops geführt wird und die von der biologischen Zelle stammenden elektrischen Fluoreszenzlichtsignale durch einen mit dem Wellenlängenwechsel synchronisierten Demultiplexer zwei verschiedenen Meßkanälen zugeordnet werden.
Vorzugsweise wird dabei innerhalb einer Halbperiode des Fluoreszenzlichtsignals jeweils pro Kanal ein frei de­ finierbares Zeitfenster elektronisch vorgegeben, wäh­ renddessen das Fluoreszenzlichtsignal gefiltert, inte­ griert und einem Sample- und Hold-Glied zugeführt wird, so daß an den beiden Ausgängen des Demultiplexers zwei den Anregungswellenlängen entsprechende analoge Meßsig­ nale anstehen.
Mit der Erfindung werden folgende weitere Vorteile er­ zielt:
  • - Aufgrund des symmetrischen Teilstrahlengangs für die Erzeugung der alternierenden Wellenlängen ist eine hohe räumliche Kohärenz gewährleistet.
  • - Durch den Einsatz von dichroitischen Farbteilern werden Energieverluste gering gehalten.
  • - Es wird eine hohe Zeitauflösung (<1 ms) bei hoher Frequenzstabilität erreicht.
  • - Bei einem Übergang auf andere Nutzwellenlängen kön­ nen die Interferenzfilter im Strahlengang und gege­ benenfalls auch die dichroitischen Farbteiler ohne aufwendige optische Nachjustierungen ausgetauscht werden. Die Apparatur kann also ohne allzu großen Aufwand auf andere Meßwellenlängen umgerüstet wer­ den. Im Gegensatz dazu mußten z.B. bei Verwendung eines Filterrades alle Filterpaare ausgetauscht und optisch aufeinander abgestimmt werden.
  • - Der langwellige, nicht zur Messung herangezogene Spektralanteil der Lichtquelle kann bequem aus dem Strahlengang ausgeblendet werden, so daß eine Er­ wärmung der kritischen Interferenzfilter vermieden wird. Daraus resultiert eine höhere Wellenlängen­ konstanz und Lebensdauer der Interferenzfilter.
Detaillierte Beschreibung
Im folgenden wird ein Ausführungsbeispiel der Erfindung anhand von Zeichnungen näher erläutert.
Es zeigen:
Fig. 1 den prinzipiellen Strahlengang für die Mono­ chromatisierungseinrichtung zur Erzeugung von Licht mit zwei alternierenden Wellenlängen.
Fig. 2 die Monochromatisierungseinrichtung gemäß Fig. 1 in Verbindung mit einem Meßplatz zur Bestim­ mung der Fluoreszenzanregung von biologischen Objekten,
Fig. 3 ein Prinzipschaltbild für eine Demultiplexer- Schaltung zur elektronischen Zuordnung und Auswertung der Fluoreszenzlichtsignale,
Fig. 4 ein Diagramm zur Erläuterung der elektroni­ schen Erzeugung eines Zeitfensters bei der Auswertung der Fluoreszenzlichtsignale,
Fig. 5 den prinzipiellen Aufbau des Probengebers bei dem Meßplatz nach Fig. 2,
Fig. 6 die Vorrichtung zur Applikation einer Testlö­ sung bei dem Probengeber nach Fig. 5 und
Fig. 7 den Zeitverlauf des Fluoreszenzsignals (Response) nach einem Lösungswechsel mit Hilfe des Probengebers gemäß Fig. 5.
Monochromatisierungseinrichtung
Gemäß Fig. 1 wird das von einer Xenon-Hochdrucklampe 1 kommende Licht durch einen dichroitischen Farbteiler 2 in zwei Teilstrahlen 3 und 4 aufgespalten. Der Teil­ strahl 3 umfaßt einen Wellenlängenbereich <360 nm und der Teilstrahl 4 den Bereich <360 nm. Durch einen zweiten dichroitischen Farbteiler 5 wird dann aus dem Teilstrahl 4 der Wellenlängenbereich <410 nm als Teil­ strahl 6 ausgeblendet, während der kurzwellige Teil zwischen 360 nm und 410 nm als Teilstrahl 7 umgelenkt wird. Der Teilstrahl 6, der den nicht genutzten sicht­ baren Anteil des Spektrums der Lichtquelle umfaßt, wird durch eine Lichtfalle 8 aus dem Strahlengang ausgeblen­ det. Alternativ kann der Teilstrahl 6 aber auch dazu be­ nutzt werden, um die Lichtquelle 1 genau zu justieren.
Der Teilstrahl 3 fällt auf einen Umlenkspiegel 9 und wird durch die Linse 10 auf die Spaltflächen 11 (Loch­ blenden) eines mit einer Frequenz von 1000 Hz umlaufen­ den Chopperrades 12 fokussiert (Chopper-Motor 13). Die Chopper-Anordnung ist so gewählt, daß die Lochscheibe 12 abwechselnd die Teilstrahlen 3 und 7 frei gibt bzw. abdunkelt. Der Teilstrahl 7 wird in analoger Weise durch die Linse 14 auf den Lochspalt 11 fokussiert. Anschlie­ ßend werden die beiden Teilstrahlen 7 und 3 durch die Linsen 15 und 16 parallel ausgerichtet. Das parallele Licht des Teilstrahls 3 durchsetzt dann ein Interferenz­ filter 17 mit einem Durchlässigkeitsmaximum bei 340 nm, während das durch die Linse 16 erzeugte Parallelstrah­ lenbündel des Teilstrahls 7 durch das lnterferenzfilter 18 mit einem Durchlässigkeitsmaximum bei 380 nm gefil­ tert wird. Nach Umlenkung durch einen Spiegel 19 trifft der bei 380 nm monochromatisierte Teilstrahl 7 nach Umlenkung durch den Spiegel 19 auf die Rückseite eines dritten dichroitischen Farbteilers 20, der für die Wel­ lenlänge 360 nm durchlässig ist. Auf der anderen Seite wird der Teilstrahl 3 mit der Wellenlänge 340 nm durch den Spiegel 21 umgelenkt und trifft auf die Vorderseite des Farbteilers 20, an der er deckungsgleich mit dem Teilstrahl 7 reflektiert wird. Der Farbteiler 20 wird also hier dazu benutzt, um die beiden Teilstrahlen 3, 7 wieder in ein einziges Strahlenbündel 22 zusammenzu­ führen. Der austretende Lichtstrahl 22, dessen Wellen­ länge mit einer durch die Chopper-Umdrehungszahl vor­ gegebenen Frequenz zwischen 340 nm und 380 nm hin und her wechselt, kann nun zur Beleuchtung eines Meßobjektes benutzt werden, dessen physikalische Eigenschaften, z.B. Remission oder Fluoreszenz, bei verschiedenen diskreten Wellenlängen untersucht werden sollen. Bei dieser Anord­ nung können ohne Schwierigkeiten Lichtwechselfrequenzen von 1000 s-1 erreicht werden, so daß die Beleuchtungs­ einrichtung für Meßvorgänge geeignet ist, bei denen eine Zeitauflösung von 1 ms und weniger gefordert wird.
Meßplatz für Auflichtfluoreszenzmikroskopie
Gemäß Fig. 2 wird die beschriebene Monochromatisierungs- Anordnung 23 als Beleuchtungseinrichtung in einer Appa­ ratur für die Auflichtfluoreszenzmikroskopie zur Fluo­ reszenzanregung eines kalzium-sensitiven Farbstoffes bei 340 nm und 380 nm verwendet. Zu diesem Zweck wird der von der Beleuchtungseinrichtung 23 kommende Lichtstrahl 22 mit alternierenden Wellenlängen über einen weiteren Farbteiler 24 in den Objektivstrahlengang eines inversen Mikroskops 25 geführt. Der Farbteiler 24 ist für Wellen­ längen <410 nm durchlässig, während die beiden UV-Kom­ ponenten des Lichtstrahls 22 an der Vorderseite reflek­ tiert werden. Das vom biologischen Objekt 26 (Objekt­ tisch 27) emittierte Fluoreszenzlicht wird vom Mikro­ skopobjektiv 28 nach dem Durchtritt durch ein Sperr­ filter 29 mit einem Durchlässigkeitsmaximum bei 510 nm mittels eines halbdurchlässigen Spiegels 30 einerseits zu einem Okular 31 und andererseits zu einem Photomul­ tiplier 32 als lichtempfindlichen Detektor geführt. Das Fluoreszenzlichtsignal des Photomultipliers 30 wird durch einen mit dem Chopper 12, 13 synchronisierten Demultiplexer 33 synchron zur Frequenz des Wellenlängen­ wechsels auf zwei Meßkanäle aufgeteilt und zur Auswer­ tung an einen Rechner 34 weitergeleitet. Der Rechner 34 übernimmt auch die Steuerung des Objekttisches 27 mit­ tels eines Schrittmotors und eines automatisierten Pro­ bengebers 35.
Die Monochromatisierungs-Einrichtung 23 kann prinzipiell auch in den Detektorstrahlengang (s. Fig. 2) eingesetzt werden. In diesem Fall wird das Meßobjekt im Normalfall polychromatisch beleuchtet, während der in die Monochro­ matisierungseinrichtung eintretende Primärstrahl mit dem Meßlicht identisch ist.
Elektronische Meßsignalverarbeitung
Im folgenden soll anhand der Fig. 3 und 4 die Funk­ tion des Demultiplexers 33 näher beschrieben werden.
Aufgabe des Demultiplexers ist die Trennung der sequen­ tiellen alternierend anstehenden Meßsignale für 340 nm und 380 nm und deren elektronische Aufarbeitung sowie die zur Verfügungstellung zweier analoger Ausgangskanäle A, B der beiden Fluoreszenzsignale für die weitere rechnerische Verarbeitung.
Dem Eingang 36 wird das zu den beiden UV-Wellenlängen gehörende, vom Multiplier 32 kommende Fluoreszenzlicht­ wechselsignal zugeführt, während der andere Eingang 37 mit einer am Chopperrad 12 angeordneten Lichtschranke verbunden ist. Die von der Lichtschranke kommenden Trig­ gerimpulse werden zur Synchronisation und Aufteilung der zu den beiden Meßwellenlängen gehörenden Fluoreszenz­ lichtsignale auf die Meßkanäle A und B benötigt. Diese Zuordnung erfolgt im Kanaltrennungsbaustein 38. Die nachfolgende Signalverarbeitung ist für beide Kanäle identisch und soll daher nur für den Kanal A (obere Hälfte in Fig. 3) erläutert werden. Im Steuerbaustein 39 werden die Zeitpunkte für ein frei programmierbares Meßfenster festgelegt. Infolge der Beugung und Brechung an den optischen Komponenten, durch kleine Dejustierun­ gen bzw. Unsymmetrien in den beiden Teilstrahlen, vor allem aber durch die Abschattungseigenschaft des Loch­ blendenrades im Bezug auf die Teilstrahlen, d.h. infolge der optischen Übertragungsfunktion des Gesamtsystems wechselt das alternierende photometrische Meßsignal für die beiden Kanäle nicht rechteckig, sondern im allge­ meinen trapezförmig. Dieses reale Verhalten kann durch den Steuerbaustein 39 dadurch kompensiert werden, daß nach erfolgtem Kanaltrigger für eine einstellbare Ver­ zögerungszeit Δ t v=t₁-t₀ der noch nicht stabilisierte Meßwert verworfen wird. Nach Ablauf dieser Zeit (ca. 100 µsec) wird der 1. Meßwert in einen Sample-und Hold- Baustein 40 geschrieben und das Meßfenster mit einer einstellbaren Breite von Δ t M =t₂-t₁ geöffnet. Während der Dauer des Meßfensters (ca. 300 µsec) wird das analog anstehende Meßsignal in einem Filterbaustein 41 mit frei einstellbaren Filterkanten integriert und gefiltert, so daß nach Ablauf der Meßzeit in einer weiteren Sample- und Hold-Baugruppe 42 der gemittelte Meßwert für die Halbpe­ riode des Kanals gebildet und für die nächste Halbperio­ de festgehalten wird. Ein nachfolgendes einstellbares Bandpaßfilter 43 mit einem Frequenzbereich von 2 s-1 f 2000 s-1 eliminiert niederfrequente Störun­ gen. An den Ausgängen A und B stehen dann die aufge­ trennten analogen Meßsignale für λ=340 nm und λ=380 nm an. Der Vorteil dieser Meßwerterfassung und Verarbeitung liegt darin, daß "falsche" d.h. noch nicht stabilisierte Meßwerte ausgeblendet und durch die Dop­ pel-Filterung Störungen aus dem photometrischen System (z.B. Dunkelstrom, Pulsationen der Zelle) weitestgehend unterdrückt werden. Hierdurch wird die Meß- bzw. Nach­ weisempfindlichkeit erheblich gesteigert und die quanti­ tative Auswertung der stark verrauschten Fluoreszenzsig­ nale erheblich verbessert.
Zur Erläuterung der Erzeugung des elektronischen Zeit­ fensters ist in Fig. 4 das Fluoreszenzlichtwechselsignal und darunter das Triggersignal als Funktion der Zeit aufgetragen. Im Idealfall wäre das Meßsignal eine Recht­ eckspannung; aufgrund der optischen Übertragungsverluste ergibt sich jedoch ein trapez- bzw. annähernd sinusför­ miger Verlauf (gestrichelte Kurve in Fig. 4).
Zu den Zeitpunkten t 0 bzw. t 3 wird jeweils mit Hilfe des Triggersignals der Startpunkt des Meßfensters für die beiden Kanäle festgelegt. Nach einer frei einstellbaren Verzögerungszeit t 1-t 0 wird für die Dauer t 2-t 1 das Meßfenster für den Kanal A (340 nm) aktiviert. Die Meßzeit Δ t m =t 2-t 1, während derer das Meßsignal im Baustein 41 geglättet und gefiltert wird, ist ebenfalls frei einstellbar.
Ausgehend vom Zeitpunkt t 3 wird nach einer einstell­ baren Verzögerungszeit t 4-t 3 zum Zeitpunkt t 4 das Meßfenster für den Kanal B geöffnet. Die Meßfenster­ breite t 5-t 4 (Meßzeit für den Kanal B für die Inte­ gration und Filterung) ist analog zur Signalverarbeitung im Kanal A ebenfalls einstellbar. Am Kanal A steht dann, wie oben schon beschrieben, das analoge Ausgangssignal für die Fluoreszenzanregung mit λ=340 nm und am Kanal B das Signal für die Anregung mit λ=380 nm an. Durch die beschriebene elektronische Ausblendung von Zeit­ fenstern im Meßsignal kann das Signal-Rausch-Verhältnis und damit die Empfindlichkeit der Meßanordnung erheblich verbessert werden.
Probengeber
Nachfolgend werden Aufbau und Funktion des Probengebers 35 anhand der Fig. 5 und 6 näher erläutert. Der Pro­ bengeber 35 besteht einerseits aus einem in vertikaler Richtung verfahrbaren Mikromanipulator 44, der an seiner Spitze eine Halterung zur Aufnahme von herkömmlichen Pi­ pettenspitzen 45 und zum Befestigen einer Glaskapillare 46 besitzt und andererseits aus einer Dosiereinrichtung 47 zur Aufnahme von gebräuchlichen Einmalspritzen 48. Die Pipettenspitze 45 und die Glaskapillare 46 an der Spitze des Mikromanipulators 44 können mit Hilfe eines Schrittmotors 49 und einer daran angeordneten Spindel 50 in vertikaler Richtung präzise und reproduzierbar ge­ hoben bzw. abgesenkt werden.
Die ebenfalls zum Probengeber 35 gehörende Dosierein­ richtung 47 besteht aus der schon erwähnten konventio­ nellen medizinischen Spritze 48, deren Kolben mittels einer von einem zweiten Schrittmotor 51 angetriebenen Spindel 52 betätigt wird. Die Spritze 48 und die Pipet­ tenspitze 45 bzw. die Glaskapillare 46 am Mikromanipula­ tor 44 sind über eine bewegliche Schlauchverbindung 53 miteinander verbunden. Beim Zudosieren einer Testlösung aus der Spritze 48 wird die Spindel 52 durch den Schrittmotor 51 in definierter und reproduzierbarer Weise nach unten abgesenkt, wodurch ein vorgegebenes Volumen der Testlösung aus der Spritze 48 herausgedrückt wird. Umgekehrt kann durch ein Anheben der Spindel 52 und des mit ihm verbundenen Spritzenkolbens die Lösung wieder abgesaugt werden. Der Schrittmotor 49 des Mikro­ manipulators 44 und der Schrittmotor 51 der Dosiervor­ richtung 47 werden von dem Rechner 34 gesteuert.
Über die Schlauchverbindung 53 können die Pipettenspit­ zen 45 gezielt gefüllt oder entleert werden. Die verti­ kale Bewegung des Mikromanipulators 44 erlaubt dabei in Verbindung mit dem motorisierten Mikroskoptisch 27 (Fig. 2) das Anfahren von beliebigen Positionen des Tisches oder der Meßkammer 54, auf deren Boden die zu untersu­ chende biologische Probe 26 angeordnet ist. Die Meßkam­ mer 54 ist i.a. mit einer Badflüssigkeit 55 gefüllt. Der Mikromanipulator 44 erlaubt in Kombination mit der Do­ siervorrichtung 47 sowohl die genaue Abgabe einer Test­ lösung in unmittelbarer Nähe der biologischen Probe 26 als auch die automatische Aufnahme einer neuen Lösung. Auf diese Weise können Substanztestungen in Verbindung mit der Rechnersteuerung vollautomatisch durchgeführt werden.
Im Rahmen der pharmakologischen und physiologischen Mes­ sungen an isolierten Zellen besteht häufig die Anforde­ rung, die Nährlösung, die die Zellen umgibt, sehr schnell gegen eine Testlösung auszutauschen, der in ge­ eigneter Dosierung die zu untersuchenden Substanzen zu­ gegeben wurden. Der Austausch der Lösungen an der Ober­ fläche der Zellen sollte dabei möglichst in weniger als 1 sec zu mehr als 90% vollzogen sein, ohne die kontinu­ ierliche Messung zu beeinträchtigen oder die Zellen durch hohe Strömungsgeschwindigkeiten zu schädigen. Für einen solch schnellen Lösungswechsel scheidet ein Aus­ tausch des Gesamtvolumens der Meßkammer 54 von mehreren 100 µl im allgemeinen aus, da die benötigten, hohen Vo­ lumenströme zu einer sofortigen Schädigung und Zerstö­ rung der Zellen führen würden. Bei diesem Verfahren be­ stehen weiterhin besonders die Probleme einer gleichmä­ ßigen Durchmischung und konstanten Thermostatisierung der Meßkammer 54. In den bisher verwendeten Meßanordnun­ gen können diese Probleme nur durch eine drastische Ver­ längerung der Austauschzeiten (auf viele Sekunden oder gar Minuten) gelöst werden.
Durch die Verwendung einer Glaskapillare 46 gemäß Fig. 6 mit einem Innendurchmesser von ca. 100 bis 1500 µm und einer Wandstärke von ca. 1000 µm, die senkrecht zum Boden der Meßkammer 54 in einem Abstand von ca. 10 µm über dem Boden konzentrisch zu den untersuchten Zellen 26 gehalten wird, entsteht im Bereich der gemessenen Zellen 26 ein von der übrigen Meßkammer völlig abge­ grenzter Lösungsraum 56 mit einem Volumen von nur weni­ gen µl. Ein Lösungswechsel in der Meßkammer 54 hat unter diesen Bedingungen keinen Einfluß auf die zu messenden Zellen. Durch Anlegen eines Überdruckes kann aus der Öffnung der Glaskapillare 46 eine geringe Volumenmenge (ca. 10 µl) herausgedrückt und damit auf die in der Ka­ pillare 46 weiter oben befindliche Testlösung 57 gewech­ selt werden. Bei einer gut zentrierten Glaskapillare mit einem exakt Boden-parallelen Öffnungsrand können dabei überraschenderweise sehr hohe Strömungsgeschwindigkeiten (bis zu 40 µl/sec) benutzt werden, ohne die Zellen zu schädigen. Die Ursache hierfür liegt in der günstigen Verteilung der Strömung an der Öffnung der Kapillare 46, da unter dem Rand der Kapillare Bereiche mit einer sehr hohen Strömungsgeschwindigkeit entstehen, während sich in der Mitte der Öffnung in der Umgebung der Zellen ein Gebiet mit sehr geringen Strömungsgeschwindigkeiten aus­ bildet. Es lassen sich auf diese Weise kurze Austausch­ zeiten von kleiner 300 msec erzielen. Desgleichen wird die Messung auch während des Austausches der Lösungen nicht gestört.
Ein typischer Zeitverlauf bei einem Lösungswechsel mit Hilfe des Probengebers 35 und speziell der Kapillare 46 ist in Fig. 7 dargestellt. In dem Diagramm ist das rela­ tive Fluoreszenzsignal als Funktion der Zeit bei Zugabe und anschließendem Absaugen einer Fluoreszenzfarbstoff­ lösung aufgezeichnet. Der Kurvenverlauf zeigt den An­ stieg der Lichtemission bis zum Erreichen der für die Farbstofflösung typischen Fluoreszenzintensität während der Zugabe (markiert durch den linken Balken unterhalb der Meßspur) und den anschließenden Abfall auf das Kon­ trollniveau nach dem Absaugen der Farbstofflösung (rech­ ter Balken). Die Wechselzeiten betrugen in diesem Expe­ riment ca. 500 ms.
Ein unkontrolliertes Vermischen von Kontroll- und Test­ lösung innerhalb der Kapillare vor dem Lösungswechsel wird durch eine Einschnürung 58 der Kapillare 46 auf ca. 10% ihres Querschnittes an der Grenze beider Lösungen verhindert.
Zum Befüllen der Kapillare 46 wird zunächst die Testlö­ sung (ca. 10 bis 100 µl) aufgesaugt und anschließend wird so viel Kontrollösung aufgesaugt, daß die Grenz­ fläche zwischen Kontroll- und Testlösung im Bereich der Einschnürung liegt. Befüllen und Freisetzen der Lösungen wird über die mit dem Schlauch 53 angeschlossene, rech­ nergesteuerte Dosiereinrichtung 47 vorgenommen. Die einzelnen Schritte zum Befüllen der Kapillare 46 und Zu­ geben der Testlösung können so programmgesteuert automa­ tisch ausgeführt werden.
Ein weiterer Vorteil der beschriebenen Vorrichtung zum Lösungswechsel liegt in der Möglichkeit des einfachen Auswaschens der Testlösung. Dadurch sind Versuche mit einer nur kurzanhaltenden Exposition (von ca. 1 sec) der Testlösung möglich. Dies wird durch Absaugen eines ge­ ringfügig größeren als des zugegebenen Volumens er­ reicht. Die Testlösung wird zurück in die Kapillare 46 gesaugt und die nachströmende Kontrollösung 55 aus der umgebenden Meßkammer 54 wäscht die Umgebung der Zellen von der Testlösung frei und stellt die Kontrollbedingung wieder her. Auch beim Absaugen bildet sich das für die Zellen günstige Strömungsprofil mit geringen Strömungs­ geschwindigkeiten im Zentrum der Öffnung aus. Beim vor­ herigen Austausch der Lösung in der gesamten Meßkammer 54, der auch langsam erfolgen kann, könnte während des Absaugens der Testlösung auch auf eine weitere, von der vorgenannten unterschiedliche, Testlösung gewechselt werden.
Für pharmakologische Untersuchungen besteht ein weiterer Vorteil der beschriebenen Vorrichtung in dem äußerst ge­ ringen Volumen der Testlösung (von minimal 10-20 µl), die zur Applikation und Testung einer Substanz benötigt werden. Die automatisierte Zugabe erlaubt darüber hinaus leicht die Testung von vielen verschiedenen Substanzen, wie dies im pharmakologischen Screening erforderlich ist.
Der Rechner mit der dazugehörigen Software ermöglicht eine einfach Bedienung und Steuerung des Meßvorganges sowie die Erfassung, Kalibrierung, Auswertung und gra­ phische Darstellung der Meßergebnisse. Auch die Identi­ fizierung und anschließende sequentielle Positionierung und Messung verschiedener biologischer Proben (Zellen) sowie eine statistische Auswertung der durchgemessenen Zellpopulationen ist mit den erstellten Programmen mög­ lich.
Der beschriebene Meßplatz (Fig. 2) kann zur Untersuchung von ganz verschiedenartigen Zellen verwendet und für den Einsatz verschiedener Fluoreszenzfarbstoffe durch einfa­ ches Austauschen der dichroitischen Farbteiler und Fil­ ter umgerüstet werden. Auch eine Erweiterung zur syn­ chronen Erfassung verschiedener Farbstoffe in einer Zel­ le kann damit verhältnismäßig leicht realisiert werden. Das beschriebene Meßsystem ist insbesondere durch die Kombination einer Meßtechnik mit hoher zeitlicher Auf­ lösung und der Möglichkeit des schnellen Lösungswechsels im Bereich der Zellphysiologie und -pharmakologie für eine breite und generelle Anwendung geeignet.

Claims (5)

1. Anordnung zur schnellen periodischen Monochromati­ sierung eines Primärstrahls bei verschiedenen dis­ kreten Wellenlängen, bestehend aus einer Filterum­ schalteinrichtung zur Monochromatisierung des Pri­ märstrahls an den vorgegebenen Wellenlängen, da­ durch gekennzeichnet, daß der Primärstrahl mit Hil­ fe eines dichroitischen Farbteilers (2) in Teil­ strahlen (3, 7) aufgespalten wird, daß die Teil­ strahlen (3, 7) durch ein Lochblendenrad (12) (Chopper) alternierend freigegeben bzw. abgedunkelt werden und durch Interferenzfilter (17, 18) mono­ chromatisiert werden und daß die monochromatisier­ ten Teilstrahlen (3, 7) durch Umlenkspiegel (19, 21) und mit Hilfe eines weiteren dichroitischen Farbteilers (20) zu einem einzigen Lichtstrahl (22) mit alternierender Wellenlänge zusammengeführt wer­ den.
2. Verfahren zur Messung der Fluoreszenzanregung bio­ logischer Zellen bei verschiedenen Wellenlängen un­ ter Verwendung der Monochromatisierungseinrichtung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Lichtstrahl (22) mit alternierender Wellenlänge in den Beleuchtungsstrahlengang eines Fluoreszenzmi­ kroskops (24) geführt wird und daß die von der bio­ logischen Zelle (26) stammenden Fluoreszenzlicht­ signale durch einen mit dem Wellenlängenwechsel synchronisierten Demultiplexer (33) zwei Meßkanälen A, B zugeordnet werden.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß innerhalb einer Halbperiode der Fluoreszenz­ lichtsignale frei definierbare Zeitfenster vorgege­ ben werden, während derer das Fluoreszenzlichtsig­ nal gefiltert, integriert (41, 41*) und einem Scample- und Hold-Glied (42, 42*) zugeführt wird, so daß an den beiden Ausgängen A, B, des Demulti­ plexers (33) zwei den Anregungswellenlängen ent­ sprechende analoge Meßsignale anstehen.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekenn­ zeichnet, daß mit Hilfe einer offenen, unmittelbar über dem Meßkammerboden mit der zu untersuchenden biologischen Zelle (26) endenden Kapillare (46) mit einer lichten Weite von 100 µm bis 1500 µm Test- bzw. Kontrollösungen am Ort der biologischen Zelle (26) zudosiert werden.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß mehrere Test- bzw. Kontrollösungen in der Kapillare (46) durch eine Einschnürung (58) räum­ lich voneinander getrennt bereitgehalten und nach­ einander am Ort der biologischen Zelle (26) appli­ ziert werden.
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