Vorrichtung und Verfahren zur Messung von Fluoreszenz in mehreren Reaktionsräumen
Hintergrund der Erfindung
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Messung von Fluoreszenz in mindes¬ tens zwei Reaktionsräumen, mit mindestens einer Lichtquelle zur Anregung inner¬ halb der Reaktionsräume befindlicher Moleküle mit Licht einer bestimmten Wellen- länge, wobei das Licht von der Lichtquelle über zumindest eine Lichtleiteinrichtung zu den Reaktionsräumen leitbar ist. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Messung von Fluoreszenz in mindestens zwei Reaktionsräumen, bei dem inner¬ halb der Reaktionsräume befindliche Moleküle mit Licht einer bestimmten Wellen¬ länge angeregt werden, wobei das Licht über eine Lichtleiteinrichtung zu den Re- aktionsräumen geleitet wird. Die Erfindung betrifft femer eine Schaltungsanord¬ nung zur Steuerung einer Vorrichtung und/oder eines Verfahrens zur Messung von Fluoreszenz in mindestens zwei Reaktionsräumen, mit mindestens einer Steuereinrichtung zum An- und Abschalten zumindest einer Lichtquelle zur Anre¬ gung innerhalb der Reaktionsräume befindlicher Moleküle mit Licht einer bestimm- ten Wellenlänge und mindestens einer Kontrolleinrichtung zur Verarbeitung von Messsignalen.
Vorrichtungen und Verfahren der eingangs genannten Art kommen vor allem in der zellphysiologischen, biochemischen, pharmakologischen und klinischen For- schung und Entwicklung zum Einsatz. Sie dienen beispielsweise dem quantitati¬ ven Nachweis von Fluoreszenz-Markern, mit denen Signalmoleküle (z. B. Ca2+, H+, NO), signalgebende Prozesse (z. B. Membranpotentiale), Rezeptor-Ligand- Bindungen oder Zellzahlen (bei experimenteller Beeinflussung des Zellwachs¬ tums) bestimmt sowie eine Fülle von enzymatischen und immunologischen Nach- weisverfahren durchgeführt werden können. Die Fluoreszenzfarbstoffe, mittels de¬ rer biochemische oder physiologische Experimente verfolgt bzw. gemessen wer¬ den können, werden dabei mit Licht einer bestimmten Wellenlänge angeregt, um gleichzeitig die Intensität des von den Molekülen emittierten Lichts zu messen. Aus der Intensität der gemessenen Fluoreszenz kann dann auf die Menge der
Fluoreszenzfarbstoffe geschlossen und somit der Verlauf einer biochemischen Reaktion verfolgt werden. Die Fluoreszenzfarbstoffe geben dabei nach Anregung der Fluoreszenz durch Licht geeigneter Wellenlänge die absorbierte üchtenergie innerhalb von ca. 10~6 Sekunden in Form von elektromagnetischer Strahlung län- gerer Wellenlänge wieder ab. Anregung und Messung müssen daher praktisch gleichzeitig erfolgen.
Da vor allem bei zellphysiologischen und pharmakologischen Versuchsreihen eine Vielzahl von Reaktionsansätzen gleichzeitig und in kurzer Zeit getestet werden müssen, finden bei solchen Versuchsreihen vorzugsweise Behältnisse mit mehre¬ ren in einer Reihe oder in mehreren parallelen Reihen angeordneten Reaktions¬ räumen Verwendung. Für zellphysiologische Untersuchungen haben sich bei¬ spielsweise Behältnisse mit einer oder zwei Reihen mit jeweils 8 oder 12 Reakti¬ onsräumen als vorteilhaft erwiesen. Insbesondere bei HT-Analysen (HT = high troughput), bei denen eine Vielzahl von Proben in möglichst kurzer Zeit getestet werden soll, werden Behältnisse mit beispielsweise 96 oder 384 Reaktionsräumen verwendet. Bei derartigen Behältnissen spricht man in der Regel von Mehrloch¬ platten, Mikrotiterplatten oder Multiwells.
Stand der Technik
Vorrichtungen und Verfahren zur Messung von Fluoreszenz in mehreren Reakti¬ onsräumen sind bereits bekannt. Die Firma Molecular Devices Corporation aus Sunnyvale in Kalifornien (USA) vertreibt beispielsweise eine Vorrichtung der ein- gangs genannten Art, bei der die Lichtquelle aus einem Argon-Ionen-Laser be¬ steht, wobei der erzeugte Laserstrahl mittels eines halbdurchlässigen Umlenk¬ spiegels auf alle Reaktionsräume einer 96- oder 384-well-Platte gestreut wird. Das von den Fluoreszenzfarbstoffen emittierte Licht wird von einer CCD-Kamera er- fasst und für jeden Reaktionsraum separat ausgewertet. Diese bekannte Vorrich- tung hat allerdings den Nachteil, dass zur Fokussierung des emittierten Lichts je¬ des einzelnen Reaktionsraums auf den entsprechenden Chip der CCD-Kamera eine aufwendige und teure Optik erforderlich ist. Darüber hinaus ist die Auflösung für einen einzelnen Reaktionsraum zu gering um sehr kleine Änderungen der Flu-
oreszenzintensität zu erfassen und darzustellen oder die Fluoreszenzsignale bei sehr schnellen Reaktionen aufzulösen.
Aus der DE 197 55 187 A1 ist ferner eine Vorrichtung zur Messung der Fluores- zenz einer Probe bekannt, die eine Messung der Fluoreszenz in einzelnen Reakti¬ onsräumen einer Mikrotiterplatte ermöglicht. Eine Mikrotiterplatte ist dabei mit ih¬ ren nach oben offenen Reaktionsräumen auf einer verfahrbaren Einrichtung ange¬ ordnet, welche mittels dreier Schrittmotoren in drei Ebenen verstellbar ist. Die Vor¬ richtung weist ferner eine Fassung auf, in der eine stabförmige Lichtleiteinrichtung derart angeordnet ist, dass Licht zur Anregung der Fluoreszenzfarbstoffe von oben über die Öffnung in einen Reaktionsraum gelangen kann. In der Fassung ist ferner ein Lichtleiter angeordnet, der das von den Fluoreszenzfarbstoffen emittierte Licht zu einem Strahlungsdetektor leitet, bei dem es sich vorzugsweise um einen Pho- tomultiplier handelt. Um die Fluoreszenz in einem einzelnen Reaktionsraum mes- sen zu können, muss die Mikrotiterplatte mittels der verfahrbaren Einrichtung der¬ art bewegt werden, dass die einzelnen Reaktionsräume nacheinander unterhalb der Fassung und damit der Lichtleiteinrichtung und dem stabförmigen Lichtleiter ausgerichtet sind. Dies hat aber den Nachteil, dass eine aufwendige Mechanik zum Bewegen der verfahrbaren Einrichtung erforderlich ist, so dass hier eine ins- gesamt sehr voluminöse und störanfällige Vorrichtung vorliegt. Des weiteren geht die für den mechanischen Transport benötigte Zeit für die eigentliche Fluores¬ zenzmessung verloren.
Zusammenfassung der Erfindung
Es ist Aufgabe der Erfindung, die genannten Nachteile zu vermeiden und eine Vorrichtung der eingangs genannten Art zu schaffen, die kompakt ist und kosten¬ günstig hergestellt werden kann, sowie ein Verfahren der eingangs genannten Art zur Verfügung zu stellen, das eine sehr schnelle Messung von Fluoreszenz in ein- zelnen Reaktionsräumen mit hoher Auflösung ermöglicht.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch eine Vorrichtung der eingangs genann¬ ten Art gelöst, bei der an jedem Reaktionsraum jeweils zumindest eine Erfas¬ sungseinrichtung zur Messung von durch die Moleküle emittiertem Licht angeord-
net ist. Dadurch, dass jeder Reaktionsraum mit einer Erfassungsreinrichtung, bei¬ spielsweise einer Halbleiter-Photodiode, ausgestattet ist, kann die Fluoreszenz in jedem Reaktionsraum unabhängig von dem zweiten Reaktionsraum oder den wei¬ teren Reaktionsräumen gemessen werden. Dies ermöglicht ein paralleles und/oder sequenzielles Messen aller Reaktionsräume in sehr kurzen Zeitinterval¬ len, so dass die erfindungsgemäße Vorrichtung auch für die Messung sehr schnel¬ ler Reaktionen geeignet ist. Darüber hinaus ist weder ein Bewegen einer Erfas¬ sungseinrichtung noch der Reaktionsräume erforderlich, so dass keine aufwendi¬ ge Mechanik benötigt wird. Hierdurch wird einerseits die Geschwindigkeit aufein- anderfolgender Messungen zusätzlich erhöht und andererseits die Störanfälligkeit reduziert. Darüber hinaus ist eine sehr kompakte Bauweise möglich, so dass die erfindungsgemäße Vorrichtung einen sehr geringen Platzbedarf hat und praktisch überall aufgestellt werden kann, beispielsweise auch auf einem einfachen Labor¬ tisch. Dadurch, dass an jedem Reaktionsraum eine Erfassungseinrichtung ange- ordnet ist, werden zwischen dem jeweiligen Reaktionsraum und der Erfassungs¬ einrichtung keine anspruchsvollen optischen Einrichtungen wie beispielsweise Umlenkspiegel oder optische Linsen benötigt, so dass die Herstellungskosten für die erfindungsgemäße Vorrichtung gering gehalten werden können. Die erfin¬ dungsgemäße Vorrichtung ist universell einsetzbar und dabei insbesondere auch für Forschungs- bzw. Entwicklungseinrichtungen jeglicher Größe, aber auch für kleinere Universitätslaboratorien geeignet. Mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung können praktisch alle erdenklichen biochemischen Reaktionen, die auf der Ver¬ wendung von Fluoreszenz-Markern basieren, präzise und mit hoher Auflösung gemessen werden. Aufgrund der Ausstattung jedes einzelnen Messkanals mit ei- ner gesonderten Erfassungseinrichtung können dabei in besonders vorteilhafter Weise auch sehr schnelle Reaktionen, beispielsweise Änderungen des Membran¬ potentials lebender Zellen, gemessen und quantitativ erfasst werden.
In vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung ist vorgesehen, dass die Reaktions- räume jeweils einen lichtdurchlässigen Boden aufweisen und die jeweilige Erfas¬ sungseinrichtung unterhalb des Bodens des jeweiligen Reaktionsraumes ange¬ ordnet ist. Auf diese Weise wird unter Aufrechterhaltung der kompakten Bauweise ermöglicht, dass die Reaktionsräume von oben zugänglich bleiben, so dass ggf. noch Substanzen in den Reaktionsräumen gegeben werden können, nachdem die
Reaktionsräumθ bereits in die erfindungsgemäße Vorrichtung eingesetzt wurden. Darüber hinaus wird hierdurch grundsätzlich das Einsetzen und Entnehmen der Reaktionsräume in bzw. aus der erfindungsgemäßen Vorrichtung erleichtert.
In weiterer Ausgestaltung der Erfindung ist in vorteilhafter Weise vorgesehen, dass zwischen dem jeweiligen Reaktionsraum und der jeweiligen Erfassungsein¬ richtung zumindest eine optische Einrichtung angeordnet ist. Bei der optischen Einrichtung kann es sich beispielsweise um mindestens einen Filter, mindestens eine Blende, mindestens einen Spiegel oder mindestens eine Linse handeln. Da- bei ist es auch möglich und ggf. sinnvoll diese unterschiedlichen optischen Ele¬ mente beliebig miteinander zu kombinieren. Durch Einsetzen eines geeigneten Farbfilters (als Farbglasfilter oder Interferenzfilter) kann verhindert werden, dass das zur Anregung benutzte Licht in die Erfassungseinrichtung gelangt, so dass möglichst nur Fluoreszenzlicht detektiert wird. Das Vorsehen einer Linse zwischen dem Reaktionsraum und der Erfassungseinrichtung kann beispielsweise bei be¬ stimmten Anwendungen vorteilhaft sein, wenn das von den Fluoreszenzfarbstoffen emittierte Licht zur Erhöhung der Sensitivität gebündelt werden muss. Ist ein Spie¬ gel zwischen dem Reaktionsraum und der Erfassungseinrichtung angeordnet, so muss dieser für Licht bestimmter Wellenlänge, d. h. insbesondere das durch die Fluoreszenzfarbstoffe emittierte Licht, durchlässig sein, damit die Detektion des emittierten Lichts nicht gestört wird. Ein solcher Spiegel kann beispielsweise sinn¬ voll sein, um das von der Lichtquelle kommende Licht, d. h. das Anregungslicht, in den jeweiligen Reaktionsraum umzulenken. Wenn eine oder mehrere optische Einrichtungen zwischen dem Reaktionsraum und der Erfassungseinrichtung vor- gesehen sind, sollte die Erfassungseinrichtung vorzugsweise unmittelbar an der optischen Einrichtung angeordnet sein, damit die vorteilhafte kompakte Bauweise der erfindungsgemäßen Vorrichtung erhalten bleibt.
In einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist die Erfassungseinrichtung eine Halbleiter-Photodiode bzw. sind die Erfassungseinrich¬ tungen Halbleiter-Photodioden. Diese sind relativ kostengünstig, so dass die Her¬ stellungskosten der erfindungsgemäßen Vorrichtung insgesamt, insbesondere auch bei Ausführungsformen mit einer größeren Anzahl von Reaktionsräumen bzw. Erfassungseinrichtungen, ebenfalls gering bleiben. Dies ist ein entscheiden-
der Vorteil gegenüber der Verwendung von beispielsweise CCD-Kameras oder Photomultipliem.
In einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist die Lichtquelle seitlich zu den Reaktionsräumen angeordnet, so dass diese im Sinne der kompakten Bauweise der erfindungsgemäßen Vorrichtung in räumlicher Nähe zu den Reaktionsräumen angebracht werden kann, ohne die Detektion des emit¬ tierten Lichts und die Zugänglichkeit zu den Reaktionsräumen von oben zu stören. Das Licht sollte dabei vorzugsweise senkrecht oder quer zur Achse zwischen der Erfassungseinrichtung und dem Reaktionsraum in den jeweiligen Reaktionsraum leitbar sein. Dies hat den Vorteil, dass der Anregungslichtstrahl so ausgerichtet werden kann, dass das Auftreffen von Streulicht auf die Erfassungseinrichtung verhindert bzw. minimiert wird. Darüber hinaus ist diese Ausführungsform für be¬ sondere Verwendungen der erfindungsgemäßen Vorrichtung von Vorteil, bei- spielsweise für die Verwendung bei zellphysiologischen Untersuchungen mit so¬ genannten Hang-ins, vorauf weiter unten noch näher eingegangen wird.
Alternativ kann das Licht in vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung auch parallel zur Achse zwischen Erfassungseinrichtung und Reaktionsraum in den jeweiligen Reaktionsraum leitbar sein. Wenn beispielsweise physiologische Untersuchungen an lebenden Zellen durchgeführt werden, die am Boden des Reaktionsraums an¬ haften, dann muss auch die Einstrahlung des Anregungslichts in den Reaktions¬ raum von unten, d. h. parallel zur Detektionsrichtung erfolgen. Das kann bei¬ spielsweise dadurch realisiert werden, dass ein halbdurchlässiger Umlenkspiegel zwischen der Lichtleiteinrichtung und dem Reaktionsraum angeordnet ist. Dieser Umlenkspiegel lenkt den Anregungslichtstrahl von einer seitlich zu den Reaktions¬ räumen angeordneten Lichtquelle in den jeweiligen Reaktionsraum und lässt gleichzeitig das von den Fluoreszenzfarbstoffen emittierte Licht passieren. Vor¬ zugsweise wird das Licht in diesem Fall von einer zwischen der Lichtleiteinrichtung und dem Reaktionsraum angeordneten Linse gebündelt und parallelisiert, um stö¬ rendes Streulicht zu vermeiden. Durch das Vorsehen eines Farbfilters zwischen der Lichtleiteinrichtung und dem Reaktionsraum kann beispielsweise auch die Wellenlänge des Anregungslichts gewählt bzw. verändert werden. Eine oder meh¬ rere in den Strahlengang eingearbeitete Blende(n) bewirkt bzw. bewirken eine Op-
timierung des Interferenzprozesses beim Einsatz von Interferenzfiltern, eine Opti¬ mierung der Fokussierung durch eine Sammellinse und/oder die Reduzierung von auftretendem Streulicht. In Abhängigkeit von den Erfordernissen können selbst¬ verständlich auch mehrere der genannten optischen Elemente oder eine beliebige Kombination derselben vorgesehen sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist die Lichtleiteinrichtung als einfacher Kanal oder röhrenförmig ausgebildet. Die Licht¬ leiteinrichtung kann alternativ aber auch beispielsweise mindestens eine Lichtleit- faser, vorzugsweise eine Glasfaser oder Kunststofffaser, sein. Dies ist insbeson¬ dere dann von Vorteil, wenn nur eine Lichtquelle vorgesehen ist, da in diesem Fall das von der Lichtquelle kommende Licht mittels mehrerer Lichtleitfasern auf die unterschiedlichen Reaktionsräume verteilt werden kann.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist an jedem Re¬ aktionsraum jeweils zumindest eine Lichtquelle angeordnet. Dies hat den Vorteil, dass jeder Reaktionsraum auch bezüglich des Anregungslichts von den anderen Reaktionsräumen bzw. dem anderen Reaktionsraum unabhängig ist, was sich vor¬ teilhaft auf die Geschwindigkeit aufeinanderfolgender Messungen auswirkt. Bei dieser Ausführungsform ist also jeder Reaktionsraum mit einer Anregungslicht¬ quelle und einer Erfassungseinrichtung ausgestattet, so dass eine separate Mes¬ sung für jeden Reaktionsraum möglich ist. Diese vollständige Trennung einzelner, autarker Messkanäle hat den Vorteil, dass die erfindungsgemäße Vorrichtung sehr variabel einsetzbar ist und darüber hinaus sehr schnelle Messfolgen ermöglicht.
Um die Herstellungskosten der erfindungsgemäßen Vorrichtung gering zu halten, ist die Lichtquelle vorzugsweise eine Licht-emittierende Diode (LED). Um die Qua¬ lität des Anregungslichts zu erhöhen, kann die Lichtquelle aber beispielsweise auch eine Laserdiode sein. Stehen diese nicht zur Verfügung, kann die Lichtquelle auch ein Laser sein, was beispielsweise auch dann von Vorteil ist, wenn nur eine Lichtquelle vorgesehen ist. Wenn dagegen jeder Reaktionsraum mit einer eigenen Lichtquelle versehen ist, so sollten aus Kostengründen vorzugsweise LEDs oder Laserdioden verwendet werden.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß auch durch ein Verfahren der eingangs ge¬ nannten Art gelöst, bei dem durch die Moleküle emittiertes Licht in jedem Reakti¬ onsraum unabhängig von dem anderen Reaktionsraum oder den anderen Reakti¬ onsräumen durch zumindest eine nur dem jeweiligen Reaktionsraum zugeordnete Erfassungseinrichtung gemessen wird. Das separate Erfassen des emittierten Lichts aus jedem einzelnen Reaktionsraum unabhängig von den anderen Reakti¬ onsräumen hat den Vorteil, dass die einzelnen Messkanäle gleichzeitig oder in sehr schneller Abfolge aktiviert werden können. Das erfindungsgemäße Verfahren ist daher einerseits sehr flexibel und andererseits sehr schnell, so dass es insbe- sondere für zellphysiologische Untersuchungen geeignet ist.
Die Messungen können in vorteilhafter Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens also in den einzelnen Reaktionsräumen nacheinander durchgeführt werden, wobei die Anregung in sehr schneller Abfolge sequenziell erfolgen kann. Darüber hinaus ist es aber auch möglich in zumindest zwei oder allen Reaktions¬ räumen gleichzeitig zu messen, so dass die Versuchsdauer insgesamt reduziert werden kann.
In einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vor- gesehen, dass in zumindest einem Reaktionsraum in gleichbleibenden Abständen wiederholt gemessen wird. Die pulsartige Anregung der Fluoreszenzfarbstoffe in¬ nerhalb eines Reaktionsraumes oder mehrerer Reaktionsräume ermöglicht das Messen in dem jeweiligen Reaktionsraum mit sehr hoher Frequenz, so dass hier¬ bei auch sehr schnell ablaufende Reaktionen mit hoher Auflösung verfolgt werden können. Bei der Beschränkung auf einen Reaktionsraum kann dabei die zu verar¬ beitende Datenmenge in vergleichsweise geringem Rahmen gehalten werden.
In besonders vorteilhafter Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist ferner vorgesehen, dass die in der erfindungsgemäßen Vorrichtung implementierte Erfassungseinrichtung während einer einzelnen Messung eine Vielzahl von
Messwerten erfasst und ein Mittelwert dieser Messwerte errechnet und angezeigt wird. Durch dieses Sampling-Verfahren in der Messvorrichtung werden Mess¬ schwankungen deutlich reduziert, ohne dass die im Datenverarbeitungsgerät (z. B. PC) anfallende Datenmenge vergrößert wird. Das Sampling Verfahren in der
Messvorrichtung benimmt natürlich nicht die Möglichkeit, insbesondere bei lang¬ samen Kinetiken, im PC eine weitere Mittlung vorzunehmen.
In einer besonderen Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird je- dem Reaktionsraum eine Lichtquelle zugeordnet und die Messung in einem Reak¬ tionsraum parallel zum Einschalten der jeweiligen Lichtquelle eingeleitet. Dadurch, dass jeder Reaktionsraum mit einer Lichtquelle und einer Erfassungseinrichtung ausgestattet wird, kann eine vollständige apparative und elektronische Trennung der einzelnen Messkanäle durchgeführt werden. Hierdurch sind sehr flexible und schnelle Verfahrensabläufe möglich. Durch das Synchronisieren der Anregung und der Messung wird das erfindungsgemäße Verfahren darüber hinaus ökono¬ misch und die anfallende Datenmenge reduziert, da in jedem Kanal nur dann ge¬ messen wird, wenn auch eine Anregung der Licht-emittierenden Moleküle erfolgt. Dabei können die Lichtquellen zur Anregung der Fluoreszenzfarbstoffe wiederholt nacheinander an- und abgeschaltet und/oder in ihrer Amplitude verändert werden, so dass ein sequenzielles Anregen der Moleküle in den verschiedenen Reaktions¬ räumen erfolgt. Diese Art der saltemierend-sequentiellen Anregung liefert diskon¬ tinuierlich, aber mit hoher Taktrate, Fluoreszenzmessdaten, so dass eine quasi¬ analoge Darstellung der Messdaten möglich wird. Durch diese Art einer salternie- rend-sequentiellen Anregung der Fluoreszenz kann Photobleaching und ein Auf¬ heizen der Probe effektiv minimiert werden.
Alternativ können auch alle Reaktionsräume durch eine Lichtquelle mit Licht ver¬ sorgt werden, wobei das Licht mittels separater Lichtleiteinrichtungen gleichmäßig auf die unterschiedlichen Reaktionsräume verteilt wird. Ein solches Verfahren ist vor allem dann vorteilhaft, wenn eine einzige, aber qualitativ hochwertige Licht¬ quelle verwendet werden soll oder muss.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß ebenfalls durch eine Schaltungsanordnung der eingangs genannten Art gelöst, bei der die Kontrolleinrichtung mit mindestens zwei Erfassungseinrichtungen zur Messung von durch die Moleküle emittiertem Licht, welche jeweils unabhängig voneinander an einem Reaktionsraum angeord¬ net sind, verbunden ist. Es liegt also nicht nur eine optische, sondern auch eine vollständige elektronische Trennung der unterschiedlichen Messkanäle vor, so
dass die Messung in jedem einzelnen Messkanal, d. h. in jedem Reaktionsraum, unabhängig gesteuert werden kann. Das Auslesen der Messdaten kann sowohl sequenziell als auch parallel erfolgen, so dass die erfindungsgemäße Schaltungs¬ anordnung einen sehr flexiblen Verfahrensablauf ermöglicht. Der Vorteil der erfin- dungsgemäßen Schaltungsanordnung, die vorzugsweise in die erfindungsgemäße Vorrichtung integriert ist, liegt also darin, dass eine exakte elektronische Kanal¬ trennung vorliegt, so dass Messungenauigkeiten durch Kanalübersprechen ver¬ mieden werden.
In besonderer Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Schaltungsanordnung ist vorgesehen, dass die Kontrolleinrichtung über mindestens eine Verstärkereinheit und/oder mindestens eine Verteilereinrichtung und/oder mindestens einen Analog- /Digital-Wandler mit den Erfassungseinrichtungen verbunden ist. Diese elektroni¬ schen Bauelemente gewährleisten, dass ausreichend starke und rauscharme Messsignale erzeugt und verarbeiten werden können und darüber hinaus eine eindeutige Zuordnung zu den einzelnen Messkanälen erfolgen kann. Wenn eine Verteilereinrichtung, beispielsweise ein Multiplexer, vorgesehen ist, kann die Schaltungsanordnung deutlich vereinfacht werden, da beispielsweise nur noch ein Analog-/Digital-Wandler erforderlich ist. Allerdings ist in diesem Fall dann kein pa- ralleles Messen in mehreren Kanälen möglich.
In vorteilhafter Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Schaltungsanordnung ist vorgesehen, dass eine Übermittlung der Messsignale von den Erfassungseinrich¬ tungen zur Kontrolleinrichtung mittels der Verteilereinrichtung durch die Kontroll- einrichtung steuerbar ist. Über die Verteilereinrichtung kann die Kontrolleinrichtung also steuern, welcher Messkanal aktiviert wird, d. h. aus welcher Erfassungsein¬ richtung Messdaten ausgelesen werden. Dies hat den Vorteil, dass nur der Mess¬ kanal aktiv ist, an dem tatsächlich Messdaten ermittelt werden, d. h. es wird nur jeweils die Erfassungseinrichtung ausgelesen, die dem Reaktionsraum zugeordnet ist, in dem die Fluoreszenzfarbstoffe angeregt werden. Die anderen Messkanäle werden dagegen nicht ausgelesen, so dass insgesamt die zu verarbeitende Da¬ tenmenge reduziert wird.
In besonders vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung ist vorgesehen, dass die Kontrolleinrichtung mit der Steuereinrichtung oder den Steuereinrichtungen ver¬ bunden ist und/oder dass die Steuereinrichtung(en) mittels eines Triggersignals schaltbar und gleichzeitig in ihrer Amplitude veränderbar ist bzw. sind. Die Kon- trolleinrichtung steuert in dieser Ausführungsform also nicht nur das Auslesen der Messdaten aus den einzelnen Messkanälen, sondern auch das An- und Abschal¬ ten sowie die Amplitudenmodulation der Anregungslichtquellen. Auf diese Weise kann die Anregungsintensität sowie das Einschalten der Anregungslichtquelle für einen bestimmten Reaktionsraum optimal mit dem Auslesen der Messdaten aus der entsprechenden Erfassungseinrichtung synchronisiert werden. Die Steuerein¬ richtungen sind vorzugsweise elektronische Steuereinrichtungen, beispielsweise Transistoren.
Die Erfindung umfasst ferner zumindest ein Programmelement, das mit einer elektronischen Datenverarbeitungseinrichtung lesbar und ausführbar ist und das, wenn es ausgeführt wird, dazu geeignet ist, die erfindungsgemäße Vorrichtung, das erfindungsgemäßen Verfahren und/oder die erfindungsgemäße Schaltungs¬ anordnung zu steuern. Die Erfindung umfasst ferner ein entsprechendes Spei¬ chermedium, das mittels einer elektronischen Datenverarbeitungseinrichtung les- bar ist und auf dem die genannten Programmelemente gespeichert sind. Erfin¬ dungsgemäß ist ein Programmelement in der Kontrolleinrichtung implementiert, so dass die erfindungsgemäße Vorrichtung bzw. Schaltungsanordnung völlig autark, d. h. ohne die Anbindung an ein externes Datenverarbeitungsgerät (z. B. einen PC), betrieben werden kann. Es ist ferner ein weiteres Programmelement vorge- sehen, das auf einem externen Datenverarbeitungsgerät (z. B. PC) installiert ist und unter einem mit einem gängigen Betriebssystem arbeitenden Anwendungs¬ programm läuft. Die beiden erfindungsgemäßen Programmelemente korrespon¬ dieren und sind aufeinander abgestimmt, so dass alle Messparameter einfach ein¬ gestellt werden können. Darüber hinaus sind die bei einer Messung anfallenden Datenmengen so gering (ca. 100 kB für 12 Messkanäle bei 60 min. Messdauer), dass diese in einem in der erfindungsgemäßen Vorrichtung angeordneten Spei¬ cher abgelegt werden können und erst nach Abschluss des Experiments zur wei¬ teren Verarbeitung auf einen externen Speicher (z.B. in einem PC) übertragen werden müssen. Die erfindungsgemäße Vorrichtung bzw. Schaltungsanordnung
kann also auch während einer Messung ohne die Anbindung an ein externes Da¬ tenverarbeitungsgerät (z. B. einen PC) betrieben werden, so dass ein sehr flexib¬ ler und unproblematischer Einsatz möglich ist.
Die Erfindung wird im Weiteren anhand der Figuren beispielhaft näher erläutert.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
Es zeigt:
Figur 1 eine perspektivische Ansicht einer erfindungsgemäßen Vorrichtung mit 12 Messkanälen und Lichtanregung quer zur Detektionsrichtung,
Figur 2 eine perspektivische Ansicht einer erfindungsgemäßen Vorrichtung mit 8 Messkanälen und einem Kontrollkanal sowie Lichtanregung quer zur Detektionsrichtung,
Figur 3 einen Längsschnitt durch einen Messkanal einer besonderen Aus¬ führungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung mit Anregung pa- rallel zur Detektionsrichtung,
Figur 4 einen Längsschnitt durch einen Messkanal einer weiteren Ausfüh¬ rungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung mit Anregung quer zur Detektionsrichtung,
Figur 5a ein Ablaufdiagramm einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens vom Einschalten der erfindungsgemäßen Vorrichtung bis zum Start der Messung,
Figur 5b ein Ablaufdiagramm einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens vom Start der Messung bis zum Programmende,
Figur 6 ein Prinzip-Blockdiagramm einer besonderen Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Schaltungsanordnung und
Figur 7 ein beispielhaftes Messprotokoll eines mit einer erfindungsgemäßen
Vorrichtung durchgeführten zellphysiologischen Experiments.
Beschreibung verschiedener und bevorzugter Ausführungsformen der Erfindung
Figur 1 zeigt eine perspektivische Ansicht einer erfindungsgemäßen Vorrichtung 1 mit 12 Messkanälen. Die Vorrichtung 1 besteht aus einem Gehäuse 2, das in ers¬ ter Linie der Aufnahme der erfindungsgemäßen Schaltungsanordnung und der Er¬ fassungseinrichtungen dient. Da die erfindungsgemäße Vorrichtung 1 keine be- wegbaren Teile enthält und somit keine aufwendige Mechanik erforderlich ist, ist das Gehäuse 2 bzw. die Vorrichtung 1 sehr kompakt und kann praktisch überall, beispielsweise auch in S1-, S2- oder Isotopen-Labors, aufgestellt werden. Die er¬ findungsgemäße Vorrichtung 1 kann dabei so kompakt hergestellt werden, dass sie kleiner als ein herkömmlicher Schuhkarton ist. Die erfindungsgemäße Vorrich- tung 1 weist ferner einen ersten Block 3 und einen zweiten Block 4 auf, welche je¬ weils auf das Gehäuse 2 aufgeschraubt werden können. Die erfindungsgemäße Vorrichtung 1 umfasst ferner einen hier nicht dargestellten Deckel, der den oberen Bereich des Gehäuses 2 und insbesondere den ersten Block 3 und den zweiten Block 4 abdeckt, damit kein Tageslicht auf die Erfassungseinrichtungen treffen kann. In vorteilhafter Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Vorrichtung 1 kann der Deckel lichtundurchlässige Öffnungen aufweisen, über die Substanzen bzw. Lösungen in die einzelnen Reaktionsräume gegeben werden können. Diese Aus¬ führungsform ist vor allem dann vorteilhaft, wenn sehr schnelle Reaktionen ge¬ messen werden sollen, da hier eine durch das Schließen des Deckels bedingte Verzögerung zwischen der Zugabe der Substanzen und dem Beginn der Messung vermieden werden kann. Darüber hinaus ermöglicht diese besondere Ausgestal¬ tung des Deckels eine Zugabe von Substanzen während einer laufenden Mes¬ sung.
Das Gehäuse 2 weist an seiner oberen Wand 5 eine Ausnehmung 6 und insge¬ samt 12 Filter 7.1 - 7.12 auf. Die Ausnehmung 6, die im zusammengesetzten Zu¬ stand von dem ersten Block 3 abgedeckt wird, dient der Aufnahme der Elektronik für die Anregungslichtquellen, beispielsweise einer entsprechenden Platine. Die Filter 7.1 - 7.12, bei denen es sich um Farbfilter, beispielsweise Farbglasfilter als
Langpass oder Interferenzfilter als Bandpass, handelt, decken Öffnungen ab, durch welche das von Fluoreszenzfarbstoffen emittierte Licht zu den hier nicht sichtbaren Erfassungseinrichtungen gelangt. Die Filter 7.1 - 7.12 sind dabei, ggf. im Block, auswechselbar, so dass die Wellenlänge des zu erfassenden Lichtes (Emission) durch einfachen Filterwechsel angepasst werden kann, wenn die Wel¬ lenlänge des anregenden Lichtes (Excitation) verändert wird. Unmittelbar unter¬ halb jedes Filters 7.1 - 7.12 ist eine Erfassungseinrichtung, beispielsweise eine Halbleiter-Photodiode, angeordnet. Jeder Messkanal weist folglich eine nur ihm zugeordnete Erfassungseinrichtung auf, so dass sowohl bei der Detektion als auch bei der Excitation eine vollständige Kanaltrennung vorliegt. Der zweite Block 4 weist 12 in Reihe angeordnete Durchbrüche 8.1 - 8.12 auf, die jeweils der Auf¬ nahme eines Reaktionsraumes dienen. Der zweite Block 4 wird derart auf das Gehäuse 2 aufgeschraubt, dass die Durchbrüche 8.1 - 8.12 mit den Filtern 7.1 - 7.12 bzw. den darunter liegenden Durchbrüchen und Erfassungseinrichtungen zur Deckung kommen. Somit ist jedem Reaktionsraum in dieser Ausführungsform ex¬ akt eine Erfassungsvorrichtung zugeordnet, so dass die Messung der Fluoreszenz in einem einzelnen Reaktionsraum unabhängig von den anderen Reaktionsräu¬ men erfolgen kann. Bei den hier nicht dargestellten Reaktionsräumen handelt es sich üblicherweise um kleine Kunststoff- oder Glasgefäße, die in Form einer Reihe miteinander verbunden sind. Solche Reaktionsbehältnisse werden üblicherweise als Muliwells oder Multiwell-Strips bezeichnet. In die Durchbrüche 8.1 - 8.12 der erfindungsgemäßen Vorrichtung 1 können sowohl einzelne Reaktionsräume als auch eine Reihe von Reaktionsräumen eingesetzt werden. Der zweite Block 4 weist an seiner dem ersten Block 3 zugewandten Seite ferner Lichteintrittsöffnun- gen 9.1 - 9.12 auf, durch die das Anregungslicht in die jeweiligen Durchbrüche 8.1 - 8.12 und damit in die entsprechenden Reaktionsräume gelangen kann. Der zweite Block 4 weist ferner Lichtfallen 10.1 - 10.12 auf, bei denen es sich um Boh¬ rungen handelt, durch die das in die Reaktionsräume eingeleitete Anregungslicht wieder austreten kann. Durch diese vorteilhafte Ausgestaltung der erfindungsge- mäßen Vorrichtung 1 kann durch das Anregungslicht verursachtes Streulicht ver¬ hindert bzw. minimiert werden, so dass die Messung hiervon nicht negativ beein- flusst werden kann. Innerhalb des ersten Blocks 3 sind 12 Lichtquellen 11.1 - 11.12 in Reihe angeordnet. Bei den Lichtquellen 11.1 - 11.12 handelt es sich vor¬ zugsweise um LEDs, die kostengünstig sind und eine engbandige (beispielsweise
20 nm Halbwertsbreite) Prä-Selektion der gewünschten Lichtfarbe bei guter Licht¬ qualität liefern. Das von den Lichtquellen 11.1 - 11.12 ausgesendete Licht tritt durch die Öffnungen 12.1 - 12.12 aus dem ersten Block 3 aus und gelangt über die Lichteintrittsöffnungen 9.1 - 9.12 in die jeweiligen Reaktionsräume in den Durchbrüchen 8.1 - 8.12. Daher müssen sich die Öffnungen 12.1 - 12.12 und die Lichteintrittsöffnungen 9.1 - 9.12 beim Befestigen der Blöcke 3, 4 auf dem Gehäu¬ se 2 in Deckung befinden. Beim Befestigen des ersten Blocks 3 auf dem Gehäuse 2 muss darüber hinaus eine Verbindung zwischen den Lichtquellen 11.1 - 11.12 und der in der Ausnehmung 6 angeordneten Steuerelektronik hergestellt werden. Die Blöcke 3, 4 sind auswechselbar, so dass die erfindungsgemäße Vorrichtung 1 variabel an unterschiedliche Anwendungen angepasst werden kann. Darüber hin¬ aus sollten alle Teile der Vorrichtung 1 , die mit Licht in Berührung kommen, aus schwarz-eloxiertem Aluminium bestehen, damit Streulicht effektiv absorbiert wird.
Aus Figur 1 wird deutlich, dass die erfindungsgemäße Vorrichtung 1 sehr kompakt ist und darüber hinaus jeder einzelne Messkanal vollständig ausgestattet und so¬ mit autark ist, so dass eine apparative Trennung der einzelnen Messkanäle vor¬ liegt. In jedem Messkanal bzw. jedem Reaktionsraum kann daher die Fluoreszenz unabhängig von den anderen Reaktionsräumen gemessen werden. Selbst bei ei- ner salternierend-sequenziellen Messung, d. h. einem nacheinander erfolgenden An- und Abschalten der Lichtquellen 11.1 - 11.12 und entsprechendem Auslesen der Messdaten aus den hier nicht dargestellten Erfassungseinrichtungen, kann folglich sehr schnell und in kurzen Abständen gemessen werden, da kein mecha¬ nisches Umschalten von einem Messkanal auf den nächsten erfolgen muss und die einzelnen Bauteile oder die Reaktionsräume nicht mechanisch bewegt werden müssen. Selbstverständlich können die Messkanäle auch in zwei parallelen oder mehreren Reihen angeordnet sein, so dass auch Mehrlochplatten mit einer großen Anzahl von Reaktionsräumen mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung verwendet werden können.
Figur 2 zeigt eine perspektivische Ansicht einer weiteren Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Vorrichtung 15, die in ihrem Aufbau im wesentlichen der Vor¬ richtung 1 gemäß Figur 1 entspricht. Die Vorrichtung 15 unterscheidet sich von der Vorrichtung 1 gemäß Figur 1 im wesentlichen dadurch, dass hier nicht 12, sondern
8 Messkanäle 16.1 - 16.8 vorgesehen sind. Jeder Messkanal 16.1 - 16.8 weist dabei eine Erfassungsvorrichtung auf, so dass die Fluoreszenz in jeden Reakti¬ onsraum separat gemessen werden kann. Auch hier ist jedem Reaktionsraum ei¬ ne eigene Lichtquelle 17.1 - 17.8 zugeordnet, so dass jeder Messkanal 16.1 - 16.8 autark arbeiten und separat angesteuert werden kann. Die erfindungsgemä¬ ße Vorrichtung umfasst ferner einen zusätzlichen Messkanal 18 mit einem ent¬ sprechenden Durchbruch 19 zur Aufnahme eines zusätzlichen Reaktionsraumes und einer eigenen Lichtquelle 20. Dieser zusätzlichen Messkanal 18 dient Kon- trollmesszwecken, beispielsweise in einem zellfreien Kompartiment zur Dokumen- tation von Photobleaching oder der Stabilität des Fluoreszenzfarbstoffes.
Figur 3 zeigt einen Längsschnitt durch die Bauteile eines einzelnen Messkanals. Die Anordnung dient der Messung der Fluoreszenz von entsprechend anregbaren Molekülen innerhalb des Reaktionsraumes 25, insbesondere bei zellphysiologi- sehen Untersuchungen an adhärenten Zellen. Der Reaktionsraum 25 ist zylinder¬ förmig ausgebildet und weist eine Seitenwand 26 und einen lichtdurchlässigen Boden 27 auf. Die Seitenwand 26 und der Boden 27 bestehen vorzugsweise aus einem transparenten Material, beispielsweise Kunststoff oder Glas. Während der Boden 27 lichtdurchlässig sein muss, damit das von den Fluoreszenzfarbstoffen emittierte Licht nach unten austreten kann, könnte es für bestimmte Anwendungen alternativ vorteilhaft sein, die Seitenwand 26 aus einem lichtundurchlässigen Ma¬ terial herzustellen. Dies ist allerdings nur dann möglich, wenn wie im vorliegenden Beispiel die Einstrahlung des Anregungslichts von unten über den Boden 27 er¬ folgt.
Seitlich und unterhalb vom Reaktionsraum 27 ist eine Lichtquelle 28 angeordnet, bei der es sich im vorliegenden Ausführungsbeispiel um eine Licht-emittierende Diode (LED) handelt. Das von der Lichtquelle 28 emittierte Licht tritt durch den Fil¬ ter 29, die Blende 30 und die Linse 31 in die Lichtleiteinrichtung 32 aus. Bei dem Filter 29 kann es sich beispielsweise um einen Farbfilter handeln, der eine Aus¬ wahl der Wellenlänge des anregenden Lichts ermöglicht. Mittels der Linse 31 wird das von der Lichtquelle 28 emittierte Licht parallelisiert, so dass die Messung stö¬ rendes Streulicht minimiert wird. Bei der Lichtleiteinrichtung 32 handelt es sich im vorliegenden Ausführungsbeispiel um einen einfachen Kanal, der vorzugsweise
zumindest an seinen Innenflächen schwarz gefärbt ist, damit ggf. auftretendes Streulicht absorbiert wird. Das von der Lichtquelle 28 emittierte Licht wird in der Lichtleiteinrichtung 32 durch einen Spiegel 33 umgelenkt und durch die Blende 34 von unten in den Reaktionsraum 25 geleitet. Das Anregungslicht tritt dabei durch das Schutzglas 35 und den Boden 27 hindurch. Das Schutzglas 35 dient dem Schutz der optischen Elemente unterhalb des Reaktionsraums 25, beispielsweise vor einem Eindringen von Flüssigkeit. Das Schutzglas 35 und der Boden 27 sind in Bezug auf die Längsachse des Reaktionsraumes 25 geneigt angeordnet, so dass das einfallende Licht nicht senkrecht, sondern schräg auf die äußeren Ober- flächen des Schutzglases 35 und des Bodens 27 trifft. Durch diese Maßnahme können Reflektionen an den genannten Oberflächen in eine Richtung gelenkt wer¬ den, die von der Erfassungseinrichtung nicht erfassbar ist. So kann beispielsweise bei einer Neigung mindestens einer der genannten Oberflächen in einem Winkel von 5° - 15°, vorzugsweise 8° - 10°, die Reflektion um mehr als zwei Drittel redu- ziert werden. Eine weitere Verminderung störender Reflektionen kann durch eine Anti-Reflexbeschichtung der genannten Oberflächen erreicht werden.
Das in den Reaktionsraum 25 geleitete Licht hat eine bestimmte Wellenlänge, bei¬ spielsweise 488 nm, so dass geeignete Moleküle innerhalb des Reaktionsraums 25 zur Fluoreszenz angeregt werden. Das durch die Anregung der Fluoreszenz¬ farbstoffe emittierte Licht tritt u. a. durch den Boden 27 und das Schutzglas 35 nach unten aus dem Reaktionsraum 25 aus. Da es sich bei dem Spiegel 33 um einen halbdurchlässigen Spiegel handelt, kann das von den Fluoreszenzfarbstof¬ fen emittierte Licht durch die Erfassungseinrichtung 36 detektiert werden. Das zu messende Licht tritt dabei zuvor durch den Filter 37, bei dem es sich beispielswei¬ se um einen Farbglasfilter als Langpass oder einen Interferenzfilter als Bandpass handelt. Bei der Erfassungseinrichtung 36 handelt es sich vorzugsweise um eine einfachen Halbleiter-Photodiode. Da jeder Messkanal eine eigene Erfassungsein¬ richtung aufweist, sollten diese relativ preisgünstig sein, damit die Herstellungs- kosten für die gesamte Vorrichtung gering bleiben. Bei der dargestellten Ausfüh¬ rungsform wird das von der Lichtquelle ausgesendete Licht, d. h. das Anregungs¬ licht, parallel zu der Achse zwischen Erfassungseinrichtung 36 und Reaktionsraum 25 von unten in den Reaktionsraum 25 geleitet. Die Richtung des Anregungslichts verläuft also genau entgegengesetzt zur Detektionsrichtung. Auf diese Weise wird
eine Störung der Messung durch das Anregungslicht vermieden. Darüber hinaus wird durch die gezeigte Anordnung das Auftreten von störendem Streulicht deut¬ lich minimiert. Dadurch dass die Erfassungseinrichtung 36 unmittelbar unterhalb der optischen Einrichtungen, d. h. insbesondere des Filters 37 und des Spiegels 33, angeordnet ist und sich die Lichtquelle 28 ebenfalls in unmittelbarer Nähe des Spiegels 33 seitlich zur Achse zwischen Erfassungseinrichtung 36 und Reaktions¬ raum 25 befindet, sind die optischen Signalverluste sowohl bei der Anregung der Fluoreszenzfarbstoffe als auch bei der Detektion des emittierten Lichts sehr gering und es entsteht eine sehr kompakte Anordnung, so dass die erfindungsgemäße Vorrichtung sehr sensitiv ist und insgesamt ebenfalls sehr kompakt gebaut werden kann. Darüber hinaus ist in dem hier dargestellten Ausführungsbeispiel der Mess¬ kanal komplett ausgestattet, d. h. sowohl mit einer eigenen Erfassungseinrichtung 36 als auch einer eigenen Lichtquelle 28 versehen. Hierdurch ist eine vollständige Trennung zwischen den einzelnen Messkanälen möglich. Jeder Messkanal kann völlig autark betrieben werden, so dass die erfindungsgemäße Vorrichtung insge¬ samt sehr schnell, genau und flexibel messen kann.
Figur 4 zeigt einen Längsschnitt durch einen Messkanal einer alternativen Ausfüh¬ rungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung, bei der das Anregungslicht ortho- gonal zur Detektionsrichtung in den Reaktionsraum 25 geleitet wird. Der Reakti¬ onsraum 25 wird durch die Seitenwand 26 und den Boden 27 gebildet und ent¬ spricht somit dem Reaktionsraum 25 gemäß Figur 3. In den Reaktionsraum 25 ist zusätzlich ein Zellkultureinsatz 40 eingehängt, welcher eine filterartige Bodenflä¬ che 41 aufweist. Auf der filterartigen Bodenfläche 41 können lebende Zellen wachsen und einen sogenannten Monolayer (geschlossenen Zellrasen) bilden. Mit Hilfe eines solchen Zellkultureinsatzes 40, einem sogenannten Hang-in, kann bei¬ spielsweise der Transport von Tracermolekülen durch Endothel-Monolayer unter¬ sucht werden, wobei diese Tracermoleküle sowohl aufgrund ihrer Größe und Form einer regulierten Diffusion unterliegen als auch aufgrund einer Markierung mit ei- nem Fluoreszenzfarbstoff 42 zur Fluoreszenz angeregt werden können. Unter be¬ stimmten Bedingungen gelangen dabei diese Tracermoleküle mit den Fluores¬ zenzfarbstoffen 42 durch den Zellrasen und die filterartige Bodenfläche 41 in den Reaktionsraum 25 und können dort mittels der erfindungsgemäßen Vorrichtung detektiert werden. Zu diesem Zweck ist seitlich vom Reaktionsraum 25 eine Licht-
quelle 43 angeordnet, im vorliegenden Ausführungsbeispiel eine LED. Die Licht¬ quelle 43 emittiert Licht, das durch den Filter 44, die Blende 45 und die, zumindest an dieser Stelle lichtdurchlässige, Seitenwand 26 in den Reaktionsraum 25 ge¬ langt. Durch dieses Licht können im Reaktionsraum 25 befindliche Fluoreszenz- farbstoffe 42 angeregt werden. Das Anregungslicht tritt auf der der Blende 45 ge¬ genüberliegenden Seite des Reaktionsraumes 25 durch die Öffnung 46 wieder aus und gelangt in eine sogenannte Lichtfalle, bei der es sich beispielsweise um einen einfachen dunklen Kanal handeln kann. Überraschenderweise hat sich näm¬ lich herausgestellt, dass eine solche Lichtfalle geeignet ist, das Auftreten von Streulicht innerhalb des Messsystems und somit die störenden Einflüsse des An¬ regungslichts effektiv zu verringern.
Unmittelbar unter dem Boden 27 des Reaktionsraums 25 ist eine Erfassungsein¬ richtung 47 angeordnet. Das von den Fluoreszenzfarbstoffen 42 innerhalb des Reaktionsraumes 25 emittierte Licht tritt durch den transparenten Boden 27, die Blende 48 und den Filter 49 aus und wird durch die Erfassungsvorrichtung 47 de- tektiert. Anhand der Intensität der hier gemessenen Fluoreszenz kann also bei¬ spielsweise die Konzentration der durch einen Zellmonolayer hindurch diffundier¬ ten fluoreszierenden Tracermoleküle (Fluxmarker) bestimmt werden. Durch die besondere Anordnung der Lichtquelle 43 und des Photodetektors 47 ist auch bei dieser Ausführungsform eine kompakte Bauweise gewährleistet. Darüber hinaus sind, wie auch bei der Ausführungsform gemäß Figur 3, die Strahlungswege so¬ wohl des Anregungslichts als auch des emittierten Fluoreszenzlichts sehr kurz, was sich positiv auf die Sensitivität der Fluoreszenzmessung auswirkt und eine deutliche Reduzierung des Streulicht bewirkt.
Ein besonderer Vorteil der erfindungsgemäßen Vorrichtung liegt darin, dass ein Benutzer durch den einfachen Austausch einzelner Bauteile, beispielsweise der Blöcke 3, 4 gemäß Figur 1 , der Filter 7.1 - 7.12 gemäß Figur 1 oder des Teiler- kopfes mit dem halbdurchlässigen Spiegel 33 gemäß Figur 3, die Lichtfarbe für die Fluoreszenzfarbstoffe oder den Betriebsmodus (Anregung quer zur Detekt- ionsrichtung gemäß den Figuren 1 , 2 und 4 oder Anregung parallel zur Detektions- richtung gemäß Figur 3) wechseln kann. Hierdurch ist die erfindungsgemäße Vor¬ richtung sehr flexibel und trägt zur Kostenminimierung bei.
Figur 5a zeigt ein Ablaufdiagramm einer Ausführungsform des erfindungs¬ gemäßen Verfahrens für den Zeitraum vom Einschalten einer erfindungsgemäßen Vorrichtung bis zum Start der Fluoreszenzmessung. Im ersten Schritt 50 wird zu¬ nächst die erfindungsgemäße Vorrichtung eingeschaltet. In Schritt 51 läuft dann eine (nstallationsroutine ab, bei der beispielsweise auch die zuletzt verwendeten Einstellungen aufgerufen werden können. In Schritt 52 wird die benötigte Software geladen. Dabei werden zuletzt verwendete Parameter aus einer Initialisierungsda¬ tei ausgelesen und über eine COM-Schnittstelle zur erfindungsgemäßen Vorrich¬ tung übertragen. Optional können in Schritt 53 gespeicherte Messparameter auf- gerufen werden. Alternativ können in Schritt 54 ebenfalls optional die aktuellen Messparameter geändert werden. Nach dem Einstellen der Messparameter wird in Schritt 55 die erfindungsgemäße Vorrichtung mit den Reaktionsgefäßen, d. h. den mit den Messproben gefüllten Reaktionsräumen, bestückt. Dies geschieht vor¬ zugsweise durch das Einsetzen einer Multiwellplatte oder eines Multiwell-Strips in die entsprechenden Durchbrüche der erfindungsgemäßen Vorrichtung. Danach kann in Schritt 56 die Messung gestartet werden.
Figur 5b zeigt den weiteren Verlauf einer Ausführungsform des erfindungs¬ gemäßen Verfahrens für den Zeitraum zwischen dem Start der Messung und de- ren Ende. Nach dem Start der Messung in Schritt 56 wird in Schritt 57 zunächst die Lichtquelle für den ersten Messkanal angeschaltet. In Schritt 58 wird dann während der Anregung die Fluoreszenz, d.h. das von den Fluoreszenzfarbstoffen emittierte Licht, durch die Erfassungseinrichtung gemessen. Dabei können bei¬ spielsweise ca. 200 Messwerte innerhalb der Anregungsdauer von beispielsweise 30 ms analog-digital gewandelt, gemittelt und als Messwert für den ersten Mess¬ kanal abgespeichert werden. In Schritt 59 wird dann die Lichtquelle für den ersten Messkanal wieder abgeschaltet und unmittelbar darauf die Lichtquelle für den zweiten Messkanal eingeschaltet. In Schritt 60 wird dann, wie in Schritt 58, wieder eine Vielzahl von Messwerten erfasst, mehrfach analog-digital-gewandelt, gemit- telt und dann als Mittelwert für den zweiten Messkanal abgespeichert. In Schritt 61 wird die Lichtquelle für den zweiten Messkanal wieder abgeschaltet und die Licht¬ quelle für den dritten Messkanal eingeschaltet. Diese Routine setzt sich weiter fort, bis der letzte Messkanal, im vorliegenden Ausführungsbeispiel der 12 Messkanal bzw. Reaktionsraum, gemessen wird (Schritte 62 und 63). Die digitalen Daten der
einzelnen Mittelwerte werden dann in Schritt 64 auf einen Computer übertragen und sowohl grafisch als auch numerisch auf einem Monitor dargestellt. Dabei ent¬ spricht ein Punkt der grafischen Darstellung einem Mittelwert des Fluoreszenz¬ lichts eines Messkanals. In Schritt 65 wird geprüft, ob die Routine beendet oder fortgesetzt werden soll. Wenn das Ende der Messung erreicht ist, wird die Routine in Schritt 66 abgebrochen. Sollen noch weitere Messwerte ermittelt werden, so geht die Routine von Schritt 65 über die Schleife 67 zurück zu Schritt 57, so dass alle Messkanäle nochmals gemessen werden. Durch das wiederholte Messen al¬ ler Messkanäle kann dann die Fluoreszenzintensität über die Zeit verfolgt und gra- fisch dargestellt werden. Im vorliegenden Ausführungsbeispiel werden die einzel¬ nen Kanäle bzw. Reaktionsräume sequenziell gemessen, d. h. einerseits werden die Lichtquellen der einzelnen Messkanäle nacheinander ein- und abgeschaltet und andererseits die Erfassungseinrichtungen der einzelnen Reaktionsräume nacheinander ausgelesen. Alle 12 Messkanäle (ein 12-well-strip) können dabei beispielsweise mit einer Frequenz von 1 Hz gemessen werden. Das bedeutet im vorliegenden Ausführungsbeispiel, dass die dargestellte Routine einmal pro Se¬ kunde durchlaufen wird. Durch das Abschalten der Lichtquellen zwischen dem Er¬ fassen der einzelnen Messwerte können dabei für die Fluoreszenzfarbstoffe schädliche Auswirkungen des Anregungslichts, beispielsweise das sogenannte Photobleaching oder eine Aufheizung der Probe durch zu starke Lichteinstrahlung, vermieden werden. Für sehr schnelle biochemische Reaktionen kann alternativ auch ein einzelner Messkanal mit einer Frequenz von 10 Hz oder mehr gemessen werden. Eine solche Auslegung des Fluoreszenzsignals ist beispielsweise dann erforderlich, wenn sehr schnelle Reaktionen gemessen werden müssen, bei- spielsweise schnelle Änderungen der Membranpotentiale von lebenden Zellen. Bei der Verwendung von geeigneten Fluoreszenz-Markern können dann solche Membranpotentiale praktisch in Echtzeit abgebildet werden, d. h. das Fluores¬ zenzsignal ist in seinem kinetischen Verlauf eine getreue Abbildung des elektro- physiologisch bestimmten Membranpotentials.
Figur 6 zeigt ein Prinzip-Blockdiagramm einer besonderen Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Schaltungsanordnung 70 mit 12 Messkanälen. Die zentralen Bauteile der erfindungsgemäßen Schaltungsanordnung 70 sind die Lichtquellen 71 und die Erfassungseinrichtungen 72. Bei den Lichtquellen 71 handelt es sich
um herkömmliche LEDs, mittels welcher in den Reaktionsräumen 73 befindliche Fluoreszenzfarbstoffe 74 angeregt werden können. Das durch die angeregten Fluoreszenzfarbstoffe 74 emittierte Licht wird durch die Erfassungseinrichtungen 72 erfasst und somit gemessen. Bei den Erfassungseinrichtungen 72 handelt es sich im vorliegen Ausführungsbeispiel um Halbleiter-Photodioden. Die Fluores¬ zenzmessung wird innerhalb der erfindungsgemäßen Schaltungsanordnung 70 durch die Kontrolleinrichtung 75 gesteuert. Bei der Kontrolleinrichtung 75 handelt es sich vorzugsweise um einen herkömmlichen Microcontroller, beispielsweise ei¬ nen 8-Bit RISC-Microcontroller. Die Kontrolleinrichtung 75 ist anregungsseitig mit einem Digital-/Analog-Wandler 76 verbunden, der zum einen den Wandler und zum anderen Steuereinrichtungen, d.h. Halbleiter-Treiber-Stufen, zur Ansteuerung der Lichtquellen 71 beinhaltet. Der Digital-/Analog-Wandler 76 wird über die Kon¬ trolleinrichtung 75 mit digitalen Steuersignalen initialisiert. Hierdurch können die Lichtquellen 71 gezielt an- und abgeschaltet und im An-Zustand in ihrer Amplitude variiert werden. Die Steuersignale werden vorzugsweise so gewählt, dass jeder einzelne Messkanal separat ansteuerbar ist. Auf Seiten der Detektion werden die Signale der Erfassungseinrichtungen 72 den zugehörigen Verstärkereinheiten 78 zugeführt. Ferner ist detektionsseitig die Kontrolleinrichtung 75 mit einer Verteiler¬ einrichtung 77, hier einem sogenannten Multiplexer, verbunden. Mittels eines Steuerwortes der Kontrolleinrichtung 75 kann ein bestimmter Kanaleingang des Multiplexers geöffnet und einem Analog-/Digital-Wandler 79 zugeführt werden. Welcher Kanaleingang geöffnet wird, ist davon abhängig, welcher Kanal des Digi- tal-/Analog-Wandlers 76 gerade aktiv ist, d. h. welche Lichtquelle 71 gerade ange¬ schaltet ist. Dies gewährleistet, dass immer nur ein freigeschalteter Multiplexerka- nal mit einem aktivierten Anregungskanal korrespondiert. Von dem Multiplexer werden die Messdaten über den Analog-/Digital-Wandler 79 in den Arbeitsspei¬ cher 80 der Kontrolleinrichtung 75 übertragen. Nach Errechnung der Mittelwerte aus den einzelnen Messwerten werden diese dann über die Schnittstelle 81 von der Kontrolleinrichtung 75 beispielsweise auf einen herkömmlichen PC übertra- gen, so dass die Messdaten ausgewertet und grafisch dargestellt werden können.
Bei dieser vorteilhaften Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Schaltungsanord¬ nung 70 steuert die Kontrolleinrichtung 75 gleichzeitig das Schalten der Lichtquelle 71 für einen Reaktionsraum 74 und das Auslesen der Daten aus der entsprechen-
den Erfassungseinrichtung 72. Auf diese Weise ist sichergestellt, dass immer nur der Messkanal bzw. die Erfassungseinrichtung 72 ausgelesen wird, die dem Reak¬ tionsraum 73 zugeordnet ist, in dem die Fluoreszenzfarbstoffe angeregt werden. Die nicht angeregten Kanäle werden dann nicht ausgelesen. Die Kontrolleinrich- tung 75 führt also eine Synchronisation von Anregung und Detektion durch. Auf diese Weise wird die anfallende Datenmenge deutlich reduziert. Darüber hinaus werden durch das Abschalten der Lichtquellen zwischen dem Erfassen der einzel¬ nen Messwerte für die Fluoreszenzfarbstoffe schädliche Auswirkungen des Anre¬ gungslichts, beispielsweise das sogenannte Photobleaching, oder auch ein Kanal- übersprechen vermieden werden. Im hier dargestellten Ausführungsbeispiel ist kein paralleles Messen in mehreren Kanälen möglich, da nur ein Analog-/Digital- Wandler vorhanden ist. Wenn dagegen keine Verteilereinrichtung 77 vorgesehen und jeder Erfassungseinrichtung 72 ein Analog-/Digital-Wandler 79 zugeordnet ist, kann paralleles Messen in mehreren Kanälen durchgeführt werden.
Figur 7 zeigt beispielhaft ein Messprotokoll eines zellphysiologischen Experiments, das mit einer erfindungsgemäßen Vorrichtung durchgeführt wurde. Das gezeigte Messprotokoll repräsentiert die graphische Darstellung des zeitlichen Verlaufs der relativen Fluorenszenzintensität in 5 Messkanälen, d.h. 5 Reaktionsräumen. Für dieses Experiment wurden CHO-Zellen (CHO = Chinese Hamster Ovary) mit DNA transfiziert, die für das humane SUR1 -Protein (SUR1 = Sulphonylurea-Rezeptor, Typ 1) und das Kir6.2-Prot.ein (Kir6.2 = Kalium-Kanal inward rectifier, Typ 6.2) ko¬ diert. Die Zellen wurden in 12-well-strips in α-MEM-Medium bis zur Konfluenz kul¬ tiviert. Eine Stunde vor Beginn des Experiments wurden die Zellen mit 5 μM des Membranpotential-Markers DiBAC4 (3) im Brutschrank vorinkubiert. In 5 Reakti¬ onsräumen wurden zu den Zellen dann 3 bis 7 Minuten nach Beginn der Messung 1.0, 3.0, 10.0, 30.0 oder 100.0 μM einer Testsubstanz (K+-Kanal-Öffner) gegeben. Die Zugabe der Testsubstanz führt zu einer Hyperpolarisation der Zellmembranen, was sich im vorliegenden Experiment in einer momentanen Abnahme der Fluores- zenzintensität niederschlägt, wobei die Kinetik bei höheren Dosen erwartungsge¬ mäß wesentlich schneller verläuft. Nach 15 Minuten wurden jeweils 10 μM Gli¬ benclamid (K+-Kanal-Blocker) zugegeben, wodurch die Hyperpolarisation der Zellmembranen wieder aufgehoben wurde. Dies wird durch den momentanen An¬ stieg der Fluoreszenzintensität belegt. Das Messprotokoll zeigt also, dass mit der
erfindungsgemäßen Vorrichtung bzw. Schaltungsanordnung und mit Hilfe des er¬ findungsgemäßen Verfahrens physiologische Vorgänge mit hoher Genauigkeit und zeitlicher Auflösung gemessen bzw. verfolgt werden können. Hier wird auch deutlich, dass die Messung bei hohem Signal-Rauschabstand klare Messsignale und einen kompletten kinetischen Verlauf einer Rezeptor-Ligand-gesteuerten Re¬ aktion wiederspiegelt.
Bezuqszeichenliste:
1 Vorrichtung
2 Gehäuse
3 erster Block
4 zweiter Block
5 Wand
6 Ausnehmung
7.1 - 7.12 Filter
8.1 - 8.12 Durchbrüche
9.1 - 9.12 Lichteintrittsöffnung
10.1 - 10.12 Lichtfallen
11.1 - 11.12 Lichtquellen
12.1 - 12.12 Öffnungen
15 Vorrichtung
16.1 - 16.8 Messkanäle
17.1 - 17.8 Lichtquellen
18 Messkanal
19 Durchbruch
20 Lichtquelle
25 Reaktionsraum
26 Seitenwand
27 Boden
28 Lichtquelle
29 Filter
30 Blende
31 Linse
32 Lichtleiteinrichtung
33 Spiegel
34 Blende
35 Schutzglas
36 Erfassungseinrichtung
37 Filter
40 Zellkultureinsatz
41 Bodenfläche
42 Fluoreszenzfarbstoff
43 Lichtquelle
44 Filter
45 Blende
46 Öffnung
47 Erfassungseinrichtung
48 Blende
49 Filter
50 - 66 Schritte
67 Schleife
70 Schaltungsanordnung
71 Lichtquelle
72 Erfassungseinrichtung
73 Reaktionsraum
74 Fluoreszenzfarbstoff
75 Kontrolleinrichtung
76 Digital-/Analog-Wandler
77 Verteilereinrichtung
78 Verstärkereinheit
79 Analog-/Digital-Wandler
80 Arbeitsspeicher
81 Schnittstelle