DE102004039564B4 - Vorrichtung zum optischen Screening von Oberflächen biologischer Proben in zweidimensionaler Anordnung - Google Patents

Abstract

Vorrichtung zum optischen Screening von Oberflächen biologischer Proben in zweidimensionaler Anordnung, mit Anregung über ein von einem Lichtstrahl durch mehrfache Totalreflexion innerhalb einer Glasplatte erzeugtes evaneszentes elektromagnetisches Feld und Messung der Fluoreszenz der Proben, wobei die Einzelproben simultan von dem Evaneszenzfeld angeregt werden und die Fluoreszenz aller Einzelproben gleichzeitig quantitativ erfasst,
dadurch gekennzeichnet, dass
– der einfallende Lichtstrahl mittels Strahlteiler in Teilstrahlen aufgeteilt wird,
– die Einkopplung der anregenden Teilstrahlen über ein optisch an die Glasplatte angekoppeltes transparentes Stabprisma erfolgt,
– die definierten Einzelproben durch mehrfache Totalreflexion der Teilstrahlen innerhalb der Glasplatte definierter Dicke und geringer Absorption von den evaneszenten Anteilen der Teilstrahlen optisch angeregt werden.

Description

• Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zum optischen Screening von Oberflächen biologischer Proben für die Pharmakologie (z.B. Wirkstoff-Screening) und die in vitro Diagnostik. Die zu untersuchenden Proben befinden sich üblicherweise in größerer Zahl und mit definiertem Abstand auf einem zweidimensionalen Probenträger (z.B. Mikrotiterplatte) und sollen mit hohem Durchsatz gemessen, werden („High Throughput Screening"). Neben Methoden der Colorimetrie und der Szintigraphie (Fox et al., J. Biomol. Screen., 4, 183–186, 1999) werden hierfür zunehmend fluorimetrische Methoden (Hertzberg & Pope, Curr. Opin. Chem. Biol. 4, 445–451, 2000) benutzt. Neben rein biochemischen Assays spielen zellbasierte Systeme eine wesentliche Rolle.
• Oberflächen-selektive Screening-Methoden eignen sich insbesondere für Untersuchungen von Zellmembranen und erlauben u.a. die Erfassung von membranständigen Rezeptoren, transmembranären Stoffwechselprozessen, Endo- oder Exozytosevorgängen sowie Membranfluiditäten. Gleichzeitig werden Untergrundsignale aus der Umgebung (z.B. Fluoreszenz von Reagenzien oder Zellkulturmedium) unterdrückt, so dass vor der Messung ein sonst üblicher Wechsel des Kulturmediums oder ein Waschen des Probenträgers entfallen können.
• Ein für die selektive Erfassung von Probenoberflächen (z.B. Mikrotiterplatten) geeignetes optisches Screening-System wird von Ruckstuhl et al. (Proc. SPIE, Vol. 4962, pp. 126–134, 2003) beschrieben. Es basiert auf einer Anregung dünner Schichten über ein evaneszentes elektromagnetisches Feld sowie konfokaler Detektion der Probenfluoreszenz und erlaubt keine simultane Messung der Einzelproben. Eine Anregung über ein evaneszentes elektromagnetisches Feld bei nicht konfokaler Detektion wird von Wulf ( EP 0 947 823 A2 ) beschrieben. Auch hier erfolgt jedoch die Messung der Einzelproben nicht simultan, sondern sequentiell durch Bewegung des Probenträgers. Eine simultane Anregung mehrerer Einzelproben oder Probenbereiche über ein evaneszentes elektromagnetisches Feld wird durch Mehrfachreflexion eines Lichtstrahls in einem transparenten Medium (z.B. Glasplatte) erreicht (WO 00/62042 A1). Allerdings wird auch hier keine Vorrichtung zur Anregung zweidimensional angeordneter Proben beschrieben. Eine Anregung zweidimensional geordneter Proben erfolgt hingegen in dem von Obremski und Silzel ( US 6,110,749 A ) beschriebenen System. Jedoch muss hier der Probenträger relativ zu einem Laserstrahl bewegt werden, um alle Einzelproben optisch zu erfassen und zur Fluoreszenz anzuregen. Von Brandenburg (Techn. Messen 68, 513–518, 2001) wird eine simultane optische Anregung zweidimensional angeordneter Proben über ein von einem linienförmig aufgeweiteten Strahl einer Laserdiode durch mehrfache Totalreflexion innerhalb einer Glasplatte erzeugtes evaneszentes elektromagnetisches Feld beschrieben, wobei die Fluoreszenz aller Einzelproben gleichzeitig quantitativ erfasst wird. Diese Anregung eignet sich jedoch nur für relativ kleine Probenträger (Biochips) mit unter einem definierten Winkel schräg geschnittenen Oberflächen, nicht jedoch für standardisierte Probenträger wie Mikrotiterplatten. Relativ aufwendig ist die optische Anregung zweidimensional angeordneter Proben auf einem planaren Lichtwellenleiter (Herron et al., WO 94/27137), in dessen Stirnfläche ein Laserstrahl über eine spezielle Fokussieroptik eingekoppelt wird. Hierbei sind die Auftreffpunkte des total reflektierten -Lichts auf die Glasoberfläche nicht definiert, so dass sich das System ebenfalls nicht für Untersuchungen von Einzelproben in Mikrotiterplatten eignet. Die Auskopplung von Anregungslicht aus einem planparallelen Lichtwellenleiter über ein dispersives optisches Element (z.B. optisches Gitter) kann für die Anregung von Proben in Flusszellen in ein- oder zweidimensionaler Anordnung (Kraus et al., WO 98/22799) genutzt werden. Diese Art der Auskopplung wäre jedoch für eine optische Anregung einer größeren Zahl stationärer Einzelproben extrem aufwendig. Außerdem wird in WO 98/22799 keine Lösungsmöglichkeit für die Einkopplung des Lichts in den Lichtwellenleiter aufgezeigt. Die Möglichkeit, definierte Einzelproben durch Teilung eines Laserstrahls zu beleuchten, würde von Nielsen und Andresen ( DE 19904592 A1 ) für den Fall der Rastermikroskopie beschrieben. Es wurde jedoch keine Lösungsmöglichkeit angegeben, um die Methode zur optischen Anregung von Probenoberflächen in standardisierten Probenträgern wie Mikrotiterplatten zu nutzen. Außerdem resultieren aus der in DE 19904592 A1 gewählten Anordnung wegen der unterschiedlichen Strahlversätze im teildurchlässigen Spiegel auch unterschiedliche Abstände zwischen den einzelnen Teilstrahlen, wodurch diese Anordnung zur Beleuchtung äquidistanter Einzelproben in Mikrotiterplatten nicht geeignet wäre.
• Der vorliegenden Erfindung liegt nun die Aufgabe zugrunde, die Oberfächen aller zu untersuchenden, zweidimensional angeordneten Einzelproben, auch auf größeren Probenträgern wie Mikrotiterplatten, gleichzeitig über ein evaneszentes elektromagnetisches Feld und ohne mechanische Bewegung der Lichtquelle oder des Probenträgers anzuregen sowie ihre Fluoreszenz simultan und quantitativ zu messen. Diese Aufgabe wird durch die in Anspruch 1 angegebenen Merkmale gelöst. Hierbei wird der einfallende Lichtstrahl mittels Strahlteilern und Spiegeln so aufgeteilt, dass der jeweilige Abstand der Teilstrahlen dem Abstand der zu untersuchenden Einzelproben, z.B. in einer handelsüblichen Mikrotiterplatte, entspricht. Durch die Wahl eines Glasträgers mit geeigneter Dicke und geringer Absorption kann eine Totalreflexion der Teilstrahlen in einem regelmäßigen Abstand, der wiederum dem Abstand der Einzelproben in einer Mikrotiterplatte entspricht, erreicht werden. Damit lassen sich die zweidimensional und in definiertem Abstand angeordneten Einzelproben mit annähernd identischen Intensitäten eines evaneszenten elektromagnetischen Feldes anregen. Die optische Anregung erfolgt von der Probenunterseite her, wie vom US 6,110,749 A bekannt, jedoch wurde durch Verwendung eines transparenten Stabprismas für die Lichteinkopplung eine für die Beleuchtung von Mikrotiterplatten mit mehreren Teilstrahlen besonders günstige Anordnung gefunden. Diese Wahl der Lichteinkopplung ermöglicht es, auch die Fluoreszenz der Proben von der Plattenunterseite her zu messen, da eine Fluoreszenzdetektion von oben durch Streulicht aus den Wänden der einzelnen Kavitäten verfälscht würde. Eine vorteilhafte Erweiterung des Aufbaus besteht in einer Reflexion. des Anregungslichts am Ende der Mikrotiterplatte. Hierbei wird die Bestrahlungsstärke an der Probenoberfläche erhöht und eine eventuelle Abnahme der Bestrahlungsstärke mit zunehmendem Lichtweg kompensiert. Eine Nutzung des reflektierten Lichtanteils wird in WO 94/27137 für eine spezielle Probengeometrie beschrieben. Da diese Anordnung jedoch für die verwendeten Probenträger nicht nutzbar ist, erfolgt zunächst eine Auskopplung der Teilstrahlen über ein weiteres transparentes Stabprisma, eine Reflexion an einem Spiegel und eine Wiedereinkopplung über dasselbe Stabprisma.
• Die Vorrichtung wird anhand der 1 (Seitenansicht) und 2 (Aufsicht auf die Strahlteilung) näher erläutert. Der Parallelstrahl eines Argonionenlasers 1 wird zunächst über ein Strahlteilersystem (bestehend aus den Teilern 2, 3, 4 sowie den Spiegeln 5, 6, 7) in acht Teilstrahlen (8a–8h) gleicher Intensität aufgespalten. Jeder Strahlteiler hat in der gewählten Anordnung einen Transmissionsgrad und einen Reflexionsgrad von jeweils 0,50. Da jeder Teilstrahl alle 3 Teiler durchläuft und in jedem Fall entweder reflektiert oder durchgelassen wird, beträgt seine Intensität (1/2)³ = 1/8 der Ausgangsintensität. Durch Parallelversatz der Spiegel 5, 6, 7 (s. 2) kann der Abstand der Teilstrahlen 8a–8h so gewählt werden, dass er dem Probenabstand auf der Mikrotiterplatte (senkrecht zur Strahlausbreitungsrichtung) entspricht. Über den einstellbaren Spiegel 9, das transparente Stabprisma 10 (mit rechteckigem Querschnitt) sowie eine auf diesen aufgebrachte Immersionsflüssigkeit werden die Teilstrahlen so in die Glasplatte 11 eingekoppelt, dass sie unter einem Winkel von ca. 66° auf dessen Oberfläche auftreffen und dort total reflektiert werden. Die Dicke der Glasplatte 11 ist mit 2 mm so gewählt, dass die Teilstrahlen 8a–8h in regelmäßigen Abständen, die den Abständen der Einzelproben in der Mikrotiterplatte 12 (in Strahlausbreitungsrichtung) entsprechen, auf die Glasoberfläche auftreffen. Die Einzelproben befinden sich am Fuß der Kavitäten 13 der Mikrotiterplatte und werden an ihrer Oberfläche in einer Schichtdicke von jeweils ca. 100 nm durch das evaneszente elektromagnetische Feld zur Fluoreszenz angeregt. Die Absorption in der Glasplatte 11 wird durch Verwendung eines gering absorbierenden Glases (Optiwhite^®) so gering gehalten, dass alle Einzelproben mit annähernd derselben Lichtintensität bestrahlt werden. Eine verbleibende geringe Abnahme der Bestrahlungsstärke entlang der Glasplatte 11 wird durch Reflexion des Lichts an deren Ende kompensiert, so dass jede Einzelprobe vom einfallenden und reflektierten Lichtstrahl mit derselben Gesamtintensität beleuchtet wird. Die Reflexion aller Teilstrahlen erfolgt über das transparente Stabprisma 14 (mit rechteckigem Querschnitt und aufgebrachter Immersionsflüssigkeit) und den justierbaren Spiegel 15. Die in der Oberfläche aller Einzelproben angeregte Fluoreszenzstrahlung wird mit einer hochempfindlichen Kamera 16 unter Verwendung einer Vorsatzoptik 17, eines Farbfilters 18 und einer Strahlumlenkung 19 simultan detektiert. Es werden handelsübliche Mikrotiterplatten verwendet, die 8 × 12 Kavitäten, aber keinen Boden besitzen. Als Boden dient hingegen die Glasplatte 11, die unter Verwendung eines nicht zytotoxischen Klebstoffs, z.B. eines Silikon-Elastomers, aufgebracht wird. Die mögliche Verwendung eines Klebstoffs wurde bereits in WO 98/22799 beschrieben, jedoch wurden dort keine Maßnahmen getroffen, um dessen Zytotoxizität auszuschließen. Messungen an Zell-Monolayern mit dem beschriebenen Aufbau bestätigen den linearen Zusammenhang zwischen Fluoreszenzintensität und Konzentration eines verwendeten Membranmarkers sowie zwischen Fluoreszenzintensität und Zellzahl.

Claims (4)

1. Vorrichtung zum optischen Screening von Oberflächen biologischer Proben in zweidimensionaler Anordnung, mit Anregung über ein von einem Lichtstrahl durch mehrfache Totalreflexion innerhalb einer Glasplatte erzeugtes evaneszentes elektromagnetisches Feld und Messung der Fluoreszenz der Proben, wobei die Einzelproben simultan von dem Evaneszenzfeld angeregt werden und die Fluoreszenz aller Einzelproben gleichzeitig quantitativ erfasst, dadurch gekennzeichnet, dass – der einfallende Lichtstrahl mittels Strahlteiler in Teilstrahlen aufgeteilt wird, – die Einkopplung der anregenden Teilstrahlen über ein optisch an die Glasplatte angekoppeltes transparentes Stabprisma erfolgt, – die definierten Einzelproben durch mehrfache Totalreflexion der Teilstrahlen innerhalb der Glasplatte definierter Dicke und geringer Absorption von den evaneszenten Anteilen der Teilstrahlen optisch angeregt werden.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass die Glasplatte als Boden einer Mikrotiterplatte verwendet und über einen nicht zytotoxischen Klebstoff mit dieser verbunden wird.
3. Vorrichtung nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass die anregende Lichtquelle ein Laser ist.
4. Vorrichtung nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass alle Teilstrahlen am Ende der Glasplatte unter Verwendung eines justierbaren Spiegels und eines weiteren transparenten Stabprismas in sich selber reflektiert werden, um eine effizientere und gleichmäßige Ausleuchtung der Einzelproben zu erzielen.